CN104535555A

CN104535555A - 一种基于表面增强拉曼散射技术对多分析物的自分类检测方法

Info

Publication number: CN104535555A
Application number: CN201510018812.3A
Authority: CN
Inventors: 殷俊; 何亚光; 史声宇; 吴云柱
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2015-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2035-01-14
Also published as: CN104535555B

Abstract

本发明涉及一种基于表面增强拉曼散射技术对多分析物的自分类检测方法，其是以三种表面带有拉曼活性分子和能够特异性识别目标分析物的水溶性聚合物集成的纳米金混合溶液为探针，分别或同时将含有Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺的水溶液与其混合，通过拉曼散射光谱的增强进行检测，这种检测对Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺具有高效的自分类选择性，从而能够同时鉴定三种离子及其相应含量。本发明操作简便、灵敏度高，在生物医学、环境监测等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种基于表面增强拉曼散射技术对多分析物的自分类检测方法

技术领域

本发明属于纳米应用领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼散射技术的离子检测探针的制备，以及该探针在水溶液中自分类检测Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺及其含量的应用。

背景技术

重金属污染是指重金属或其化合物造成的环境污染，主要有汞、铬、镉、铅和类金属砷等大类。其中铅是普通环境中常见的重金属，具有高毒性。由于铅在环境中无法被降解，会在环境中长期存留，必然会对动植物产生毒害，并直接或间接对人体健康造成危害。铅对神经、血液、消化和肾脏具有毒害，环境中的铅经过食物和呼吸等途径进入人体后，会引发消化、神经、呼吸和免疫系统极性或慢性毒性影响，并诱发一系列相关病症，严重时可发生脑病甚至导致死亡。

铅进入人体的途径主要有三种，分别是食物、水和空气。其中以水为载体的方式最为常见和最为严重。因此，实现环境或生物体中的铅离子的实时检测以及原位快速检测，并同时具有高的灵敏度具有重要意义。

长久以来，银作为一种天然的消毒灭菌剂，在人们的日常生活中具有广泛应用。同时银也是人体组成的微量元素，少量的银离子人体无害。然而，现在的研究表明，银离子能够在人体尤其是皮肤、粘膜等处聚集，对人体健康产生危害。它能够与体内的巯基酶相结合，使其失活，同时，银还可以与胺、咪唑、羧酸等多种生理代谢产物相互作用而导致各种疾病。随着银在现代工业中的广泛使用，含银离子废液的排放对于水源和土壤的污染日益严重，而且越来越多的银离子在人体内富集，对人体造成危害。因此，发展高效银离子检测方法是非常有必要的。

铜离子是动植物的必需元素，也是人体重要的必需元素之一。然而，过高浓度的铜离子会引起水体细菌和藻类的死亡，也会引起人体肝脏和肾脏的损伤以及肠胃功能的紊乱。因此，铜离子已经被认定为一种环境污染物，并引起人们的关注。对铜离子的检测在环境保护和人体健康方面具有重要意义。

对于铅离子，银离子和铜离子各自的检测都已经有很多成熟的方法。例如，铜离子的检测方法有：原子吸收光谱法、原子发射光谱法以及电化学检测等；银离子的检测方法有：荧光光谱法、电化学法、光电化学法等；铅离子的检测方法有：原子吸收光谱法、X射线荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法等。但是上述这些方法都只能针对一种单一的离子进行测试，当这些方法用于实际体系中时，还存在许多问题。例如，环境颜色对原子吸收光谱法会有很大的干扰，待检测物质中的有机深色团和杂性原子对荧光光谱法会产生很大干扰。

因此，一种可以同时检测多种离子的方法亟待发现。

发明内容

本发明旨在提供一种基于表面增强拉曼散射技术对Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺的自分类检测方法，以期可以简单、高效的同时实现对Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺定性检测和定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明基于表面增强拉曼散射技术对多分析物的自分类检测方法，其特点在于按如下步骤进行：

(1)令表面带有水溶性聚合物PAPAA和拉曼活性分子BGLA的纳米金AuBGLA/PAPAA的溶液为溶液A；令表面带有水溶性聚合物PPyEAMA和拉曼活性分子NPT的纳米金AuNPT/PPyEAMA的溶液为溶液B；令表面带有水溶性聚合物PPyAM和拉曼活性分子IR-792的纳米金AuIR-792/PPyAM的溶液为溶液C；在溶液A中AuBGLA/PAPAA的摩尔浓度、在溶液B中AuNPT/PPyEAMA的摩尔浓度及在溶液C中AuIR-792/PPyAM的的摩尔浓度皆为50-500nM；

将溶液A、溶液B和溶液C混合，获得纳米金混合溶液探针，在所述纳米金混合溶液探针中AuBGLA/PAPAA、AuNPT/PPyEAMA和AuIR-792/PPyAM的摩尔量相等；

所述水溶性聚合物PAPAA的结构式如式(1)所示，所述水溶性聚合物PPyEAMA的结构式如式(2)所示，所述水溶性聚合物PPyAM的结构式如式(3)所示，所述拉曼活性分子BGLA的结构式如式(4)所示，所述拉曼活性分子NPT的结构式如式(5)所示，所述拉曼活性分子IR-792的结构式如式(6)所示：

(2)分别绘制Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线：

以0nM为浓度起点、以50-100nM为浓度梯度，在纳米金混合溶液探针中加入Pb²⁺，配制含不同浓度Pb²⁺的纳米金混合溶液样品s个，s≥10；对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，确定各样品在1615cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；以浓度为横坐标、以样品在1615cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Pb²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线；Pb²⁺的最低检测限为350nM。

以0nM为浓度起点、以50-100nM为浓度梯度，在纳米金混合溶液探针中加入Ag⁺，配制含不同浓度Ag⁺的纳米金混合溶液样品t个，t≥10；对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，确定各样品在365cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；以浓度为横坐标、以样品在365cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Ag⁺的浓度与特征拉曼散射峰的峰值的标准关系曲线；Ag⁺的最低检测限为400nM。

以0nM为浓度起点、以50-100nM为浓度梯度，在纳米金混合溶液探针中加入Cu²⁺，配制含不同浓度Cu²⁺的纳米金混合溶液样品r个，r≥10；对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，确定各样品在1023cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；以浓度为横坐标、以样品在1023cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Cu²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线；Cu²⁺的最低检测限为250nM。

三种标准关系曲线的绘制中，拉曼散射光谱检测的检测条件相同，且都是在水相中进行检测；

(3)将待测物与纳米金混合溶液探针按体积比1:5～20混合获得混合溶液，然后在与步骤(2)相同的检测条件下进行拉曼散射光谱检测，获得待测物的拉曼散射光谱，从而获得待测物的特征拉曼散射峰位置，若待测物在1615cm^-1处出现特征拉曼散射峰，则证明待测物中含有Pb²⁺，若待测物在365cm^-1处出现特征拉曼散射峰，则证明待测物中含有Ag⁺，若待测物在1023cm^-1处出现特征拉曼散射峰，则证明待测物中含有Cu²⁺；

(4)若待测物中含有Pb²⁺、Ag⁺和/或Cu²⁺，再根据所含的相应离子所对应的特征拉曼散射峰的峰值，分别与相应的标准关系曲线相比较，确定相应离子在混合溶液中的浓度，然后计算获得相应离子在待测物中的浓度。

本发明中Pb²⁺、Ag⁺和/或Cu²⁺所分别对应的特征拉曼散射峰的位置是按如下方法进行确定的：

配制a、b、c、d四份2mL、50nmol/L的纳米金混合溶液探针，其中a中不含其他金属离子，b中含有350nM的Pb²⁺，c中含有350nM的Pb²⁺和400nM的Ag⁺，d中含有350nM的Pb²⁺、400nM的Ag⁺和250nM的Cu²⁺，分别对4个样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，对比4各样品的拉曼散射光谱，依次确定Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺各自对应的特征拉曼散射峰，可知1615cm^-1处为检测Pb²⁺的特征拉曼散射峰、365cm^-1处为检测Ag⁺的特征拉曼散射峰、1023cm^-1处为检测Cu²⁺的特征拉曼散射峰。

本发明中所述溶液A按如下方法进行制备：

在氮气保护下将单体t-BPEA、自由基引发剂2,2'-二巯基双[1-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)]乙烷(DTBE)和DMF加到反应瓶中，然后用氮气脱气30min，再加入CuCl和六甲基三亚乙基四胺(Me6TREN)，获得混合物；将混合物用氮气脱气5min，再在25℃下搅拌反应15h，然后加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到P(t-BPEA)；将P(t-BPEA)溶于THF中，在0℃下缓慢加入LiOH，反应2h，加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PAPAA-SH；将PAPAA-SH和拉曼活性分子BGLA加入到纳米Au溶液中，在室温下反应24h，将反应物离心去除上清液(上清液中为未反应完的PAPAA-SH和BGLA)，得到表面带有水溶性聚合物PAPAA和拉曼活性分子BGLA的纳米金AuBGLA/PAPAA溶液，对AuBGLA/PAPAA的溶液加水稀释至AuBGLA/PAPAA浓度(以Au计)为50-500nM，即得溶液A；

所述PAPAA-SH的制备过程如图1所示，其中“-SH”位于聚合物的末端，它能够与Au反应生成Au-S键，从而使得聚合物接枝到Au的表面。所述PAPAA-SH的M_n＝15000-20000，PDI＝1.05-1.20。所用原料DTBE和Me6TREN的结构通式分别如式(7)和式(8)所示：

在所述AuBGLA/PAPAA中，PAPAA在Au表面的密度为0.3-0.8chain/nm²。

所述溶液B按如下方法进行制备所示，：

在氮气保护下将单体PyEAMA、自由基引发剂2,2'-二巯基双[1-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)]乙烷(DTBE)和DMF加到反应瓶中，然后用氮气脱气30min，再加入CuCl和六甲基三亚乙基四胺(Me6TREN)，获得混合物；将混合物用氮气脱气5min，再在25℃下搅拌反应15h，然后加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyEAMA；将PPyEAMA溶于THF中，在0℃下缓慢加入NaBH₄，反应2h，加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyEAMA-SH；将PPyEAMA-SH和拉曼活性分子NPT加入到纳米Au溶液中，在室温下反应24h，将反应物离心去除上清液(上清液中为未反应完的PPyEAMA-SH和NPT)，得到表面带有水溶性聚合物PPyEAMA和拉曼活性分子NPT的纳米金AuNPT/PPyEAMA溶液，对AuNPT/PPyEAMA溶液加水稀释至AuNPT/PPyEAMA浓度(以Au计)为50-500nM，即得溶液B；

所述PPyEAMA-SH的制备过程如图2所示，其中“-SH”位于聚合物的末端，它能够与Au反应生成Au-S键，从而使得聚合物接枝到Au的表面。

所述PPyEAMA-HS的M_n＝15000-20000，PDI＝1.05-1.20。

所述AuNPT/PPyEAMA中，PPyEAMA在Au表面的密度为0.3-0.8chain/nm²。

所述溶液C按如下方法进行制备：

在氮气保护下将单体PyAM、RAFT试剂二苄基三硫代碳酸酯(DBTTC)和DMF加到反应瓶中，用氮气脱气30min，在70℃下搅拌反应15h停止，然后加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyAM；将PPyAM溶于THF中，在0℃下缓慢加入NaBH₄，反应2h，加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyAM-SH；将PPyAM-SH和拉曼活性分子IR-792加入到纳米Au溶液中，在室温下反应24h，将反应物离心去除上清液(上清液中为未反应完的PPyAM-SH和IR-792)，得到表面带有水溶性聚合物PPyAM和拉曼活性分子IR-792的纳米金AuIR-792/PPyAM溶液，对AuIR-792/PPyAM溶液加水稀释至AuIR-792/PPyAM浓度(以Au计)为50-500nM，即得溶液C。

所述PPyAM-SH的制备过程如图3所示，其中“-SH”位于聚合物的末端，它能够与Au反应生成Au-S键，从而使得聚合物接枝到Au的表面。

所述PPyAM-HS的M_n＝12000-15000，PDI＝1.08-1.15。

所用原料DBTTC的结构通式如式(9)所示：

所述AuIR-792/PPyAM中，PPyAM在Au表面的密度为0.3-0.8chain/nm²。

本发明的工作原理如图4所示。中心球体表示纳米金颗粒，球体表面的线性结构表示纳米金颗粒表面的聚合物，球体表面的星型结构表示纳米金颗粒表面的拉曼活性分子，其中四角星表示BGLA，五角星表示NPT，七角星表示IR-792。三种纳米金颗粒通过所带的拉曼活性分子加以区分。

在混合溶液探针中，AuBGLA/PAPAA对Pb²⁺具有特异性识别作用。具体为：当溶液中不存在Pb²⁺时，AuBGLA/PAPAA都处于分散状态，此时，没有表面增强拉曼信号；当存在Pb²⁺的时候，PAPAA的结构单元中含有的COOH基团能够和Pb²⁺发生络合；若邻近的纳米金颗粒上的多条PAPAA链同时与Pb²⁺发生络合作用，聚合物链的相互缠绕会使得纳米金颗粒间的距离缩短，从而导致纳米金颗粒的聚集。聚集的纳米金颗粒的间隙由于局部表面等离子体共振作用使得间隙间的电磁场急剧增强，又会使得在间隙中的BGLA的拉曼信号得到极大的放大。通过现有的拉曼检测仪器可以得到具体的增强拉曼信号值。

同理，AuNPT/PPyEAMA对Ag⁺具有特异性识别作用，这是由于PPyEAMA的结构单元中含有咔唑基团，它能够与Ag⁺发生络合；AuIR-792/PPyAM对Cu²⁺具有特异性识别作用，这是由于PPyAM的结构单元中含有吡啶基团，它能够与Cu²⁺发生络合。

金纳米颗粒表面的PAPAA、PPyEAMA和PPyAM三种聚合物分别对Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺的络合相互不干扰，BGLA、NPT和IR-792三种拉曼活性分子的增强信号也都能够特异性区分，因此混合溶液探针对Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺的检测具有同时独立性。

与现有技术相比较，本发明的优点在于：

(1)本发明是基于表面增强拉曼散射对Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺的同时检测方法，不仅可以同时对Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺定性分析而且还可以进行定量检测，且操作简便、效率高，克服了许多现有技术中的不足，在生物学、医药等领域具有广阔的应用前景。

(2)由于拉曼光谱不受背景颜色的干扰，使得纳米金混合溶液探针能够在有色背景下进行检测，而这些都是传统方法(紫外吸收光谱法和荧光光谱法)无法实现的；且能够实现对样品的无损检测。

(3)本发明利用现有的便携式的拉曼光谱仪，可以对样品进行实时、实地检测，测试数据的及时性和准确性更高。

(4)在使用本发明的方法检测完毕后，通过离心可以将探针回收，避免残留探针引起的二次污染。

附图说明

图1为PAPAA-SH的制备过程示意图；

图2为PPyEAMA-SH的制备过程示意图；

图3为PPyAM-SH的制备过程示意图；

图4为本发明的原理图；

图5为本发明实施例1中所制备的PAPAA-SH的核磁谱图；

图6为本发明实施例1中所制备的PPyEAMA-SH的核磁谱图；

图7为本发明实施例1中所制备的PPyAM-SH的核磁谱图；

图8为本发明实施例2的拉曼散射谱图，1615cm^-1处为检测Pb²⁺的特征拉曼散射峰，365cm^-1处为检测Ag⁺的特征拉曼散射峰，1023cm^-1处为检测Cu²⁺的特征拉曼散射峰；

图9为本发明实施例3-(1)中不同浓度Pb²⁺的拉曼散射谱图；

图10为本发明实施例3-(1)的拉曼散射谱图中1615cm^-1处峰值对应于Pb²⁺浓度的线性相关图；

图11为本发明实施例3-(2)不同浓度Ag⁺对应的拉曼散射谱图；

图12为本发明实施例3-(2)的拉曼散射谱图中365cm^-1处峰值对应于Ag⁺浓度的线性相关图；

图13为本发明实施例3-(3)不同浓度Cu²⁺对应的拉曼散射谱图；

图14为本发明实施例3-(3)的拉曼散射谱图中1023cm^-1处峰值对应于Cu²⁺浓度的线性相关图；

图15为本发明实施例4中检测自来水中Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺的拉曼散射谱图；

图16为本发明实施例5中检测受污染水中Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺的拉曼散射谱图；

图17为本发明实施例6中有色背景(a)和在有色背景下检测受污染水中Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺(b)的拉曼散射谱图；

图18为本发明实施例6中有色背景(c)和在有色背景下检测受污染水中Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺(d)的紫外吸收谱图。

具体实施方式

实施例1

本实施例按如下步骤制备纳米金混合溶液探针：

1、三种亲水性纳米金颗粒混合溶液的制备：

A：取一个放有磁力搅拌子的干燥无水无氧反应瓶，在氮气保护下将事先准备好的t-BPEA(243mg，1mmol)、DTBE(4.5mg，0.01mmol)和4mL DMF加入到10mL反应瓶中，然后用氮气脱气30min，再将CuCl(0.99mg，0.01mmol)和Me6TREN(2.3mg，0.01mmol)加入反应液中，将混合物用氮气脱气5min后，在25℃下搅拌反应15h停止，加入1mL乙醚淬灭，使聚合物析出，以5000r/min离心十分钟得到固体产物，用4mL乙醚洗涤3次，真空干燥至质量不变，得到P(t-BPEA)。

取一个放有磁力搅拌子单口反应瓶，将20mg P(t-BPEA)溶于5mL THF中，在0℃下缓慢加入2mg LiOH，反应2h，加入3mL乙醚淬灭，使聚合物析出，以5000r/min离心十分钟得到固体产物，用5mL乙醚洗涤3次，真空干燥至质量不变，得到PAPAA-SH。取样用凝胶渗透色谱测得PAPAA-SH的分子量为Mn＝16500，分子量分布系数为PDI＝1.12。核磁分析结果如图5。

取一个放有磁力搅拌子单口反应瓶，将1mL 0.1mM的PAPAA-SH的THF溶液、1mL0.01mM的BGLA的THF溶液和10mL 500nM的纳米Au水溶液加入到反应瓶中，室温下反应24h，将反应物以5000r/min离心十分钟除去未反应完的PAPAA-SH和BGLA，得到表面带有水溶性聚合物PAPAA和拉曼活性分子BGLA的纳米金(AuBGLA/PAPAA)，其中PAPAA在Au表面的密度为0.45chain/nm²；对AuBGLA/PAPAA加水稀释至AuBGLA/PAPAA浓度(以Au计)为50nM，即得溶液A；

B：取一个放有磁力搅拌子的干燥无水无氧反应瓶，在氮气保护下将事先准备好的PyEAMA(267mg，1mmol)、DTBE(4.5mg，0.01mmol)和4mL DMF加入到10mL反应瓶中，然后用氮气脱气30min，再将CuCl(0.99mg，0.01mmol)和Me6TREN(2.3mg，0.01mmol)加入反应液中，将混合物再用氮气脱气5min后，在25℃下反应15h停止，加入1mL乙醚淬灭，使聚合物析出，以5000r/min离心十分钟得到固体产物，用4mL乙醚洗涤3次，真空干燥至质量不变，得到PPyEAMA。

取一个放有磁力搅拌子单口反应瓶，将20mg PPyEAMA溶于5mL THF中，在0℃下缓慢加入3mgNaBH₄，反应2h，加入3mL乙醚淬灭，使聚合物析出，以5000r/min离心十分钟得到固体产物，用5mL乙醚洗涤3次，真空干燥至质量不变，得到PPyEAMA-SH。取样用凝胶渗透色谱测得分子量为Mn＝18300，分子量分布系数为PDI＝1.15。核磁分析结果如图6。

取一个放有磁力搅拌子单口反应瓶，将1mL 0.1mM的PPyEAMA-SH的THF溶液、1mL0.01mM NPT的THF溶液和10mL 500nM的纳米Au水溶液加入到反应瓶中，室温下反应24h，将反应物以5000r/min离心十分钟除去未反应完的PPyEAMA-SH和NPT，得到表面带有水溶性聚合物PPyEAMA和拉曼活性分子NPT的纳米金(AuNPT/PPyEAMA)。其中PPyEAMA在Au表面的密度为0.55chain/nm²。对AuNPT/PPyEAMA加水稀释至AuNPT/PPyEAMA浓度(以Au计)为50nM，即得溶液B；

C:取一个放有磁力搅拌子干燥无水无氧反应瓶，在氮气保护下将事先准备好的PyAM(131mg，0.5mmol)、DBTTC(2.9mg，0.01mmol)和溶剂3mL DMF加到反应瓶中，然后用氮气脱气30min，在70℃下反应15h停止，加入1mL乙醚淬灭，使聚合物析出，以5000r/min离心十分钟得到固体产物，用5mL乙醚洗涤3次，真空干燥至质量不变，得到PPyAM。

取一个放有磁力搅拌子单口反应瓶，将20mg PPyAM溶于5mL THF中，在0℃下缓慢加入3mgNaBH₄，反应2h，加入3mL乙醚淬灭，使聚合物析出，以5000r/min离心十分钟得到固体产物，用5mL乙醚洗涤3次，真空干燥至质量不变，得到PPyAM-SH。取样用凝胶渗透色谱测得PPyAM-SH的分子量为Mn＝13600，分子量分布系数为PDI＝1.09。核磁分析结果如图7。

取一个放有磁力搅拌子单口反应瓶，将1mL 0.1mM的PPyAM-SH的THF溶液、1mL0.01mM的IR-792的THF溶液和纳米Au水溶液加入到反应瓶中，室温下反应24h,将反应物离心(5,000r，10min)除去未反应完的PPyAM-SH和IR-792，得到表面带有水溶性聚合物PPyAM和拉曼活性分子IR-792的纳米金(AuIR-792/PPyAM)。其中PPyEAMA在Au表面的密度为0.52chain/nm²。对AuIR-792/PPyAM加水稀释至AuIR-792/PPyAM浓度(以Au计)为50nM，即得溶液C。

将溶液A、溶液B及溶液C按照摩尔比AuBGLA/PAPAA:AuNPT/PPyEAMA:AuIR-792/PPyAM＝1：1：1混合，即得纳米金混合溶液探针。

实施例2：

按如下步骤确定Pb²⁺、Ag⁺和/或Cu²⁺所分别对应的特征拉曼散射峰的位置：

按照实施例1的方式配制a、b、c、d四份2mL 50nmol/L的纳米金混合溶液探针，其中a中不含其他金属离子，b中含有350nM的Pb²⁺，c中含有350nM的Pb²⁺和400nM的Ag⁺，d中含有350nM的Pb²⁺、400nM的Ag⁺和250nM的Cu²⁺，分别对4个样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，结果如图8所示，其中曲线a、b、c、d分别对应a、b、c、d4个样品。

对4各样品的拉曼散射光谱进行交叉对比，依次确定Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺各自对应的特征拉曼散射峰，可知1615cm^-1处为检测Pb²⁺的特征拉曼散射峰、365cm^-1处为检测Ag⁺的特征拉曼散射峰、1023cm^-1处为检测Cu²⁺的特征拉曼散射峰。

此外，图中曲线b和c中1615cm^-1处峰值大小一样，表明Ag⁺对Pb²⁺的检测没有干扰；而d和c中1615cm^-1处和365cm^-1处峰值大小一样，表明Cu²⁺对Ag⁺和Pb²⁺的检测没有干扰。从而表明该纳米金混合溶液探针能够自分类检测Pb²⁺，Ag⁺和Cu²⁺。

实施例3：

分别绘制Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线：

(1)绘制Pb²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线：

在50nmol/L纳米金混合溶液探针中加入Pb²⁺，配制Pb²⁺浓度为0nM、100nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM及700nM的样品；

对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，如图9所示，从图中确定各样品在1615cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；然后以Pb²⁺浓度为横坐标、以样品在1615cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Pb²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线，如图10所示。

(2)绘制Ag⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线：

在50nmol/L纳米金混合溶液探针中加入Ag⁺，配制Ag⁺浓度为0nM、100nM、200nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、700nM及800nM的50nmol/L的样品；

对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，如图11所示，从图中确定各样品在365cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；然后以Ag⁺浓度为横坐标、以样品在365cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Ag⁺的浓度与特征拉曼散射峰的峰值的标准关系曲线，如图12所示。

(3)绘制Cu²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线：

在50nmol/L纳米金混合溶液探针中加入Cu²⁺，配制Cu²⁺浓度为0nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、600nM的50nmol/L的样品；

对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，如图13所示，从图中确定各样品在1023cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；然后以Cu²⁺的浓度为横坐标、以样品在1023cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Cu²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线，如图14所示。

三种标准关系曲线的绘制中，拉曼散射光谱检测的检测条件要保持一致。

通过本实施例获得的标准关系曲线，Pb²⁺的最低检测限为350nM，Ag⁺的最低检测限为400nM，Cu²⁺的最低检测限为250nM。

实施例4：

检测自来水中的Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺。

向2mL 50nmol/L的纳米金混合溶液探针中加入200μL自来水，混合均匀后，进行拉曼散射光谱检测，得到如图15所示的拉曼谱图，从图中可以看出所测自来水中不含Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺。

实施例5：

检测受污染水里的Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺：

向2mL 50nmol/L的纳米金混合溶液探针中加入200μL受污染中的水，混合均匀后，进行拉曼散射检测，得到如图16所示的拉曼谱图，表明所测受污染水中同时含有Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺。根据图16，1615cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为3308，与图10进行对比，可得Pb²⁺的浓度为550nM；365cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为3055，与图12进行对比，可得Ag⁺的浓度为450nM；1023cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为3398，与图14进行对比，可得Cu²⁺的浓度为380nM。

实施例6：

在有色环境下测试受污染水里的Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺：

向2mL 50nmol/L的混合纳米金溶液中加入100μL 1mM的RPMI-1640溶液(一种红色细胞培养液)，混合均匀后，进行拉曼散射检测和紫外吸收检测，分别得到如图17所示的拉曼谱图a和如图18所示的紫外吸收曲线c；然后再加入200μL受污染的水，混合均匀后，进行拉曼散射检测和紫外吸收检测，得到如图17所示的拉曼谱图b和如图18所示的紫外吸收曲线d，图17表明所测受污染的水中同时含有含Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺，且它们的检测不受环境颜色的影响。较之传统的原子吸收光谱法有更大的优势。

由以上结果表明，该基于表面增强拉曼散射技术的自分类检测方法分别对Pb²⁺、Ag⁺和Cu²⁺具有很好的选择性和特异性，操作简单，结果灵敏，实用性强。同样的原理可以推广到其他多种离子的自分类检测中，应用前景广泛。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种基于表面增强拉曼散射技术对多分析物的自分类检测方法，其特征在于按如下步骤进行：

以0nM为浓度起点、以50-100nM为浓度梯度，在纳米金混合溶液探针中加入Pb²⁺，配制含不同浓度Pb²⁺的纳米金混合溶液样品s个，s≥10；对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，确定各样品在1615cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；以浓度为横坐标、以样品在1615cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Pb²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线；

以0nM为浓度起点、以50-100nM为浓度梯度，在纳米金混合溶液探针中加入Ag⁺，配制含不同浓度Ag⁺的纳米金混合溶液样品t个，t≥10；对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，确定各样品在365cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；以浓度为横坐标、以样品在365cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Ag⁺的浓度与特征拉曼散射峰的峰值的标准关系曲线；

以0nM为浓度起点、以50-100nM为浓度梯度，在纳米金混合溶液探针中加入Cu²⁺，配制含不同浓度Cu²⁺的纳米金混合溶液样品r个，r≥10；对各样品进行拉曼散射光谱检测，获得各样品的拉曼散射光谱，确定各样品在1023cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值；以浓度为横坐标、以样品在1023cm^-1处的特征拉曼散射峰的峰值为纵坐标，绘制Cu²⁺的浓度与特征拉曼散射峰峰值的标准关系曲线；

在三种标准关系曲线的绘制中，拉曼散射光谱检测的检测条件相同；

(4)若待测物中含有Pb²⁺、Ag⁺和/或Cu²⁺，再根据相应离子所对应的特征拉曼散射峰的峰值，分别与相应的标准关系曲线相比较，确定相应离子在混合溶液中的浓度，然后计算获得相应离子在待测物中的浓度。

2.根据权利要求1所述的自分类检测方法，其特征在于：

所述溶液A按如下方法进行制备：

在氮气保护下将单体t-BPEA、自由基引发剂2,2′-二巯基双[1-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)]乙烷和DMF加到反应瓶中，然后用氮气脱气30min，再加入CuCl和六甲基三亚乙基四胺，获得混合物；将混合物用氮气脱气5min，再在25℃下搅拌反应15h，然后加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到P(t-BPEA)；将P(t-BPEA)溶于THF中，在0℃下加入LiOH，反应2h，加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PAPAA-SH；将PAPAA-SH和拉曼活性分子BGLA加入到纳米Au溶液中，在室温下反应24h，将反应物离心去除上清液，得到表面带有水溶性聚合物PAPAA和拉曼活性分子BGLA的纳米金AuBGLA/PAPAA溶液，对AuBGLA/PAPAA的溶液加水稀释至AuBGLA/PAPAA浓度为50-500nM，即得溶液A；

所述溶液B按如下方法进行制备：

在氮气保护下将单体PyEAMA、自由基引发剂2,2′-二巯基双[1-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)]乙烷和DMF加到反应瓶中，然后用氮气脱气30min，再加入CuCl和六甲基三亚乙基四胺，获得混合物；将混合物用氮气脱气5min，再在25℃下搅拌反应15h，然后加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyEAMA；将PPyEAMA溶于THF中，在0℃下加入NaBH₄，反应2h，加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyEAMA-SH；将PPyEAMA-SH和拉曼活性分子NPT加入到纳米Au溶液中，在室温下反应24h，将反应物离心去除上清液，得到表面带有水溶性聚合物PPyEAMA和拉曼活性分子NPT的纳米金AuNPT/PPyEAMA溶液，对AuNPT/PPyEAMA溶液加水稀释至AuNPT/PPyEAMA浓度为50-500nM，即得溶液B；

所述溶液C按如下方法进行制备：

在氮气保护下将单体PyAM、RAFT试剂二苄基三硫代碳酸酯和DMF加到反应瓶中，用氮气脱气30min，在70℃下搅拌反应15h停止，然后加入乙醚淬灭，使产物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyAM；将PPyAM溶于THF中，在0℃下缓慢加入NaBH₄，反应2h，加入乙醚淬灭，使聚合物析出，离心得到固体产物，用乙醚洗涤、真空干燥至恒重，得到PPyAM-SH；将PPyAM-SH和拉曼活性分子IR-792加入到纳米Au溶液中，在室温下反应24h，将反应物离心去除上清液，得到表面带有水溶性聚合物PPyAM和拉曼活性分子IR-792的纳米金AuIR-792/PPyAM溶液，对AuIR-792/PPyAM溶液加水稀释至AuIR-792/PPyAM浓度为50-500nM，即得溶液C。