CN114381257B - 一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针及其在银离子检测中的应用 - Google Patents

Abstract

一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针及其在银离子检测中的应用，属于荧光探针技术领域。是将HAuCl₄·3H₂O和NaOH混合并且搅拌均匀，然后向其中加入硫代乳酸和超纯水，最后将得到的混合溶液在110～120℃条件下反应90～120min，得到AuNCs@TLA比率型荧光探针；再向其中加入牛血清白蛋白，得到AuNCs@TLA‑BSA比率型荧光探针，加入BSA提高金纳米簇的发光性质并且降低荧光探针的检出限。该金纳米簇比率型荧光探针能够对银离子产生比率型荧光响应，并对其它金属离子不产生这种响应，能够特异性检测银离子。

Description

一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探 针及其在银离子检测中的应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针及其在银离子检测中的应用。

背景技术

银因其优异的物理和化学性能而被广泛应用于珠宝、首饰、钱币、医疗、影像、电气和电子设备等。然而，由于含银产品处理不当，银离子污染已成为主要的环境问题。作为一种能使巯基酶失活的重金属离子，银离子对鱼类和水生微生物有剧毒；对人类来说，过量摄入银离子会导致银沉积，最终导致银中毒。此外，银离子对免疫系统、神经系统、消化系统等多个系统有广泛的影响。在动物实验中，银离子几乎分布在被研究的生物体的所有器官中。目前，多种仪器已被用于检测银离子，包括电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体光发射光谱(ICP-OES)，但这些昂贵的设备无法应用于银离子的实时和现场监测。为了解决这个问题，开发了许多基于纳米材料的传感器，如电化学传感器和光学传感器，但大多数传感器的成本效益不够高。所以建立一种简单、快速、高灵敏度和选择性的方法来检测银离子具有重要意义。

相比于传统的检测方法，荧光探针技术由于具有高灵敏度、快速检测、廉价、简单以及实用性强等特点，被认为是检测痕量污染物的有效手段。至今为止，很多荧光材料(尤其是纳米荧光材料)已经被设计、合成并应用于银离子检测。金纳米团簇(AuNCs)作为新兴的荧光纳米材料，具有光学稳定性好、生物相容性好、低毒等优点，在分析化学领域具有巨大的应用潜力。比率型荧光探针作为一种实用性最好的荧光检测方法，近年来受到越来越多的关注，因为它具有比单一荧光探针具有更突出的抗干扰能力和检测准确性。尤其是比率型荧光响应依赖于待测物诱导的两个或更多的荧光强度(FL)的变化，可以大幅度消除环境中各种无关因素(仪器效率、探针浓度、环境干扰等)的影响，大大提高检测的灵敏度和抗干扰能力。

发明内容

本发明提供了一种基于硫代乳酸(TLA)保护的近红外发光金纳米簇 (AuNCs@TLA)比率型荧光探针及其在银离子检测中的应用。该金纳米簇比率型荧光探针的最强激发波长为570nm，最强发射波长为800nm。该金纳米簇比率型荧光探针能够对银离子产生比率型荧光响应，并对其它金属离子不产生这种响应，能够特异性检测银离子。比率型荧光探针对银离子的检测具有双重线性检测范围，小范围可以提高检测灵敏度，大范围有利于在较大的浓度范围对银离子检测。通过BSA(牛血清白蛋白)的引入可以改善AuNCs@TLA的发光性质并放大探针对银离子的响应信号，因此，通过BSA与AuNCs@TLA构筑成检测平台检测银离子会获得更低的检出限。结果发现：AuNCs@TLA对银离子的检测线性范围为0～4.0μM，检出限为40nM；AuNCs@TLA-BSA对银离子的检测线性范围为0～1.0μM，检出限为10nM。与此同时，这种荧光探针成功地在血清中对银离子进行检测并具有良好的回收率，说明该荧光探针能够用于检测活体内的银离子残留。

本发明采用水热法合成AuNCs@TLA，以HAuCl₄·3H₂O作为Au源，以TLA (硫代乳酸)作为配体，采用一步水热合成法制备金纳米簇：首先将HAuCl₄·3H₂O 和NaOH混合3～5min并且搅拌均匀，然后向其中加入硫代乳酸(TLA)和超纯水，最后将得到的混合溶液在110～120℃条件下反应90～120min，从而得到本发明所述的硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针(AuNCs@TLA)；然后再向其中加入牛血清白蛋白(BSA)，得到AuNCs@TLA-BSA比率型荧光探针，加入BSA提高金纳米簇的发光性质并且降低荧光探针的检出限，表现为：对Ag⁺的检测更为灵敏；超纯水中，HAuCl₄·3H₂O的浓度为1mM，NaOH的浓度为10～11mM，HAuCl₄·3H₂O与TLA的摩尔用量比例为1：6～7，BSA的浓度为 5～7μM。

附图说明

图1：AuNCs@TLA的荧光发射强度随实验条件变化的柱形图：(a)水热温度(100～130℃)，(b)反应时间(30～180min)，(c)HAuCl₄·3H₂O与TLA摩尔比例(1：5～7.5)，(d)NaOH的浓度(10～14mM)。

图2：(a)AuNCs@TLA的荧光激发谱和发射谱，(b)AuNCs@TLA和硫代乳酸(TLA)的傅里叶红外变换光谱图，(c)AuNCs@TLA的透射电镜(HR-TEM) 图，(d)AuNCs@TLA的粒径尺寸分布图。

图3：(a)硫代乳酸(TLA)保护的金纳米簇荧光探针溶液的荧光强度与不同浓度的牛血清蛋白(BSA)相互作用的关系曲线图；(b)硫代乳酸(TLA)保护的金纳米簇荧光探针溶液的荧光强度与BSA的响应时间关系图。

图4：(a)在荧光发射光谱中，Ag⁺浓度与AuNCs@TLA荧光强度的关系曲线图；(b)在荧光发射光谱中，Ag⁺浓度与AuNCs@TLA-BSA荧光强度的关系曲线图。

图5：(a)随Ag⁺浓度(0～10μM)增加，AuNCs@TLA-Ag⁺在610nm比800nm (I_610/800)处的响应范围关系图(R²＝0.9951)；(b)随Ag⁺浓度(0～4μM)增加， AuNCs@TLA-Ag⁺在610nm比800nm(I_610/800)处的线性响应关系图(R²＝0.9927)； (c)随Ag⁺浓度(10～150μM)增加，AuNCs@TLA-Ag⁺在670nm(I₆₇₀)处的响应范围关系图(R²＝0.9947)；(d)随Ag⁺浓度(10～50μM)增加，AuNCs@TLA-Ag⁺在670nm(I₆₇₀)处的线性响应关系图(R²＝0.9960)。

图6：(a)随Ag⁺浓度(0～10μM)增加，AuNCs@TLA-BSA-Ag⁺在610nm 比800nm(I_610/800)处的响应范围关系图(R²＝0.9940)；(b)随Ag⁺浓度(0～1.0μM) 增加，AuNCs@TLA-BSA-Ag⁺在610nm比800nm(I_610/800)处的线性响应关系图 (R²＝0.9950)；(c)随Ag⁺浓度(10～120μM)增加，AuNCs@TLA-BSA-Ag⁺在 670nm(I₆₇₀)处的响应范围关系图(R²＝0.9996)；(d)随Ag⁺浓度(10～60μM) 增加，AuNCs@TLA-BSA-Ag⁺在670nm(I₆₇₀)处的线性响应关系图(R²＝0.9951)。

图7：AuNCs-BSA对Ag⁺荧光响应的选择性的荧光强度比值(I_610/800)的柱形图(a)；AuNCs-BSA对Ag⁺荧光响应的抗干扰测试的荧光强度比值(I_610/800) 的柱形图(b)。

图1对应实施案例1～4；图2对应实施案例5；图3对应实施案例6、7；图 4～图6对应实施案例8、9；图7对应实施案例10；表1对应实施案例11。

具体实施方式

本发明中使用的硫代乳酸(TLA)、牛血清白蛋白(BSA)、吗啉乙磺酸-水合物(MES)购买于上海阿拉丁试剂公司。三水合氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)购买于上海国药集团。氢氧化钠(NaOH)购买于天津光复试剂公司。胎牛血清溶液(其中含有BSA)购买于北京索莱宝科技有限公司。MES缓冲溶液用于研究分析 AuNCs@TLA对pH值的稳定性，用200mM NaOH溶液调节pH值。所有的化学药品均是分析纯，且没有再纯化。超纯水用于整个实验过程。

实施例1：

将HAuCl₄·3H₂O与NaOH充分混匀4min后，加入到TLA和超纯水中，充分混匀，然后将混合物放入20mL高压反应釜中，分别在100℃、110℃、120℃和130℃下水热反应90min，得到不同水热温度条件下硫代乳酸保护的金纳米簇 (AuNCs@TLA)。超纯水中，HAuCl₄·3H₂O的浓度为1mM，NaOH的浓度为 11mM，TLA的浓度为6.5mM。如图1(a)所示，结果表明当反应温度为110～120℃时荧光强度较高，反应温度为110℃时AuNCs@TLA的荧光强度最高。

实施例2：

将HAuCl₄·3H₂O与NaOH充分混匀4min后，加入到TLA和超纯水中，然后将混合物放入20mL高压反应釜中，在110℃下分别采用反应时间为30、60、 90、120、150和180min，得到不同反应时间条件下，硫代乳酸保护的金纳米簇 (AuNCs@TLA)。超纯水中，HAuCl₄·3H₂O的浓度为1mM，NaOH的浓度为 11mM，TLA的浓度为6.5mM。如图1(b)所示，结果表明当反应时间为90～120min 时荧光强度较高，当反应时间为90min时AuNCs@TLA的荧光强度最高。

实施例3：

将HAuCl₄·3H₂O与NaOH充分混匀4min后，加入到TLA和超纯水中，然后将混合物放入20mL高压反应釜中，110℃水热反应90min，得到不同Au对TLA 摩尔比条件下，硫代乳酸保护的金纳米簇(AuNCs@TLA)。超纯水中， HAuCl₄·3H₂O的浓度为1mM，NaOH的浓度为11mM，TLA的浓度分别为5、5.5、 6、6.5、7、7.5mM。如图1(c)所示，结果表明当Au对TLA的摩尔比为1：6～7 时(即反应溶液中TLA为6～7mM)AuNCs@TLA的荧光强度较高；当Au对TLA 的摩尔比为1：6.5时(即反应溶液中TLA为6.5mM)，AuNCs@TLA的荧光强度最高。

实施例4：

将HAuCl₄·3H₂O与NaOH充分混匀4min后，加入到TLA和超纯水中，然后将混合物放入20mL高压反应釜中，110℃水热反应90min，得到不同浓度NaOH 条件下，硫代乳酸保护的金纳米簇(AuNCs@TLA)。超纯水中，HAuCl₄·3H₂O 的浓度为1mM，NaOH的浓度为10、11、12、13、14mM，TLA的浓度为6.5mM。如图1(d)所示，结果表明当NaOH浓度为10～11mM时AuNCs@TLA的荧光强度较高；当NaOH浓度为11mM时AuNCs@TLA的荧光强度最高。

实施例5：

基于实施例1-4，将HAuCl₄·3H₂O和NaOH均匀混合4min后加入到TLA和超纯水中，最后将混合物放入20mL高压反应釜中，110℃水热反应90min，得到荧光强度最高的硫代乳酸保护的金纳米簇(AuNCs@TLA)。超纯水中， HAuCl₄·3H₂O的浓度为1mM，NaOH的浓度为11mM，TLA的浓度为6.5mM。

如图2(a)所示，本实施制备得到的AuNCs@TLA最强激发波长为570nm，最强发射波长为800nm；如图2(b)所示，在FT-IR光谱图中可以看出，位于 2500cm^-1的-SH峰消失，表明AuNCs@TLA的成功合成；如图2(c)所示，进一步采用HR-TEM对制备的AuNCs@TLA进行形貌表征，从图中可以看出纳米颗粒的分散性较高、且粒径较为均一；如图2(d)所示，通过对大约200个颗粒进行系统分析后发现粒径平均尺寸为～1.8nm。

实施例6：

建立TLA保护的金纳米簇与BSA之间的定量关系：将实施例5中制备的金纳米簇荧光探针用MES缓冲液稀释至2倍体积，然后分别取0.5mL的该荧光探针溶液，向每0.5mL的荧光探针溶液中分别加入不同体积的BSA溶液使其终浓度分别为0～12.0μM(0、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μM)，利用荧光光谱仪记录荧光探针溶液对不同浓度的BSA响应的荧光发射光谱(激发波长 570nm)获得AuNCs@TLA-BSA的最佳荧光强度。如图3(a)所示，随着BSA浓度增大，金纳米簇的发光强度逐渐增强；当BSA浓度为6.0μM时，AuNCs@TLA 具有最高的荧光强度。

实施例7：

将实施例5中得到的AuNCs@TLA溶于MES缓冲溶液中，向体系中加入BSA 溶液，使BSA终浓度为6μM，确定AuNCs@TLA与BSA的响应时间。如图3 (b)所示，由于BSA的加入，AuNCs@TLA的荧光发射强度迅速增强，当响应时间约为5min时，荧光发射强度基本保持不变，说明荧光增强响应已经达到饱和。所以AuNCs@TLA与BSA的响应时间在4～6min。

实施例8：

将实施例5中得到的AuNCs@TLA溶于MES缓冲溶液中，向体系中加入银离子，利用荧光发射光谱考察其对金纳米簇发光性质的影响。如图4(a)所示，随着Ag⁺浓度的增加，荧光探针在800nm处的荧光强度随之下降，先在610nm 处产生发射峰并随Ag⁺浓度增加，荧光强度增强；接着增加Ag⁺浓度，在670nm 处产生新的荧光发射峰并随Ag⁺浓度增加，荧光强度也增强。研究表明荧光发射光谱在610和800nm的荧光强度比(I_610/800)与Ag⁺浓度成一定的线性关系，且在670nm处的荧光强度与Ag⁺浓度也存在线性关系。如图5所示，对于Ag⁺的线性响应在0～4μM(R²＝0.9927)和10～50μM(R²＝0.9960)范围内，并且计算得到对Ag⁺的最低检测限为40nM(信噪比S/N＝3)。

实施例9：

将实施例5中得到的AuNCs@TLA溶于MES缓冲溶液中，并加入终浓度为 6.0μM的BSA构建AuNCs@TLA-BSA检测平台。向体系中加入银离子，利用荧光发射光谱考察其对金纳米簇发光性质的影响。如图4(b)所示，与向金纳米簇中直接加入Ag⁺时响应相似，随着Ag⁺浓度的增加，先在610nm处产生发射峰并伴随800nm处的荧光强度逐渐下降；接着在670nm处产生新的荧光发射峰并逐渐增强。研究发现荧光发射光谱在610和800nm的荧光强度比(I_610/800)与Ag⁺浓度成一定的线性关系，且在670nm处的荧光强度与Ag⁺浓度也存在线性关系。如图6所示，对于Ag⁺的线性响应在0～1.0μM(R²＝0.9950)和10～60μM(R²＝0.9951) 范围内，并且计算得到对Ag⁺的最低检测限为36nM(信噪比S/N＝3)。

实施例10：

为了研究AuNCs@TLA-BSA对Ag⁺的选择性，将实施例5中制备的金纳米簇荧光探针用MES缓冲液稀释至2倍体积，分别取0.5mL的该荧光探针溶液，每0.5mL分别加入以下金属阳离子Ag⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、 Fe²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、Ni²⁺、Pb²⁺和Zn^{2 +}(Blank组为不加入任何金属阳离子)，使金属阳离子的终浓度均为8μM，所有的荧光测试均在室温下进行。如图7(a)所示，结果表明除Ag⁺外，其它金属离子均不会对 AuNCs@TLA-BSA检测平台产生比率型荧光响应。

我们进一步检测了该探针平台对Ag⁺检测的抗干扰性，先将金属阳离子 (Ca²⁺、Cd^{2 +}、Ce³⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、 NH₄ ⁺、Ni²⁺、Pb²⁺和Zn²⁺)分别与Ag⁺混合，然后实施例5中制备的金纳米簇荧光探针用MES缓冲液稀释至2倍体积，且向每0.5mL的该荧光探针溶液加入混合后的不同金属阳离子组合(Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、Ni²⁺、Pb²⁺和Zn²⁺之一与Ag⁺的组合，Blank组为不加入任何金属阳离子)，使金属阳离子的终浓度均为10μM(即Ag⁺的浓度为 10μM，其他金属阳离子的浓度也为10μM)，所有的荧光测试均在室温下进行。如图7(b)所示，结果表明其它金属离子都不会影响该检测平台对Ag⁺的荧光比率响应，说明该方法能够应用于实际样品中Ag⁺的准确检测。

实施例11：

该探针在血清中的应用性能检测：将实施例5中制备的金纳米簇荧光探针用MES缓冲液稀释至2倍体积，取胎牛血清溶液加入荧光探针溶液中，使二者的体积比为1：125，制备AuNCs@TLA的血清溶液。然后将六种不同含量的Ag⁺(0.8、 1.0、2.0、40、50、70μM)分别加入到的血清溶液中(记为1#～6#)。孵育4h后，进行荧光光谱测试。如表1所示，结果表明Ag⁺的回收率(在已知浓度样品中加入药物，与标准曲线相对应浓度的百分比)在95.0％～105.0％之间，相对标准偏差(RSDs)均低于5％，说明AuNCs@TLA能够应用于血清中Ag⁺的实际检测。

表1：AuNCs@TLA荧光探针在血清中检测Ag⁺的检测值和回收率。

还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针，其特征在于：是将HAuCl₄∙3H₂O和NaOH混合3~5min并且搅拌均匀，然后向其中加入硫代乳酸和超纯水，最后将得到的混合溶液在110~120℃条件下反应90~120min，从而得到硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针AuNCs@TLA；超纯水中，HAuCl₄∙3H₂O的浓度为1mM，NaOH的浓度为10~11mM，HAuCl₄∙3H₂O与TLA的摩尔用量比例为1：6~7。

2.一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针，其特征在于：是将HAuCl₄∙3H₂O和NaOH混合3~5min并且搅拌均匀，然后向其中加入硫代乳酸和超纯水，最后将得到的混合溶液在110~120℃条件下反应90~120min，再向其中加入牛血清白蛋白，从而得到硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针AuNCs@TLA-BSA；超纯水中，HAuCl₄∙3H₂O的浓度为1mM，NaOH的浓度为10~11mM，HAuCl₄∙3H₂O与TLA的摩尔用量比例为1：6~7，BSA的浓度为5~7μM。

3.权利要求1或2所述的一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针在作为银离子检测探针中的应用，所述应用不涉及以有生命的人体或动物体为直接实施对象，用于诊断病因或治疗疾病的用途。

4.如权利要求3所述的一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针在作为银离子检测探针中的应用，其特征在于：AuNCs@TLA对银离子的检测线性范围为0~4.0μM，检出限为40nM；AuNCs@TLA-BSA对银离子的检测线性范围为0~1.0μM，检出限为10nM。