KR101809905B1 - 싱글 사이토신을 이용한 은 이온 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 싱글 사이토신을 이용한 은 이온 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서는 DNA를 구성하는 하나의 염기인 싱글 사이토신을 이용함으로써 은 이온 하나 하나에 대한 출력 신호를 기대할 수 있어 극 저농도 검출이 가능하며, 고감도 및 고선택서을 가지는바 현장 모니터링에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서는 DNA를 구성하는 하나의 염기인 싱글 사이토신을 이용함으로써 은 이온 하나 하나에 대한 출력 신호를 기대할 수 있어 극 저농도 검출이 가능하며, 고감도 및 고선택서을 가지는바 현장 모니터링에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 싱글 사이토신을 이용한 은 이온 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 산업 분야나 과학 분야에서 나노 크기의 재료의 사용이 급증하고 있으며, 이 나노 크기의 재료가 인체와 환경에 미치는 악영향이 보고되고 있다. 대표적인 중금속 나노 물질로는 은, 알루미늄, 구리, 아연, 카드뮴 등으로서, 이들은 다양한 산업 및 과학 분야에서 널리 사용되고 있다.
특히, 은 나노물질은 최근 항균 효과로 각광을 받으면서, 의류, 정수기, 세탁기, 치약 등 인체에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 분야에 널리 사용되어 왔다. 또한, 산업적 폐기 및 방사로부터 환경으로 방출되는 은은 연간 대략 2500 톤으로 추산되고 있으며, 그 중 150 톤은 폐수의 슬러지로 들어가고 80 톤은 표층수로 방출되고 있다. 또한, 은 나노입자는 쉽게 이온화되어 하수도, 강 및 상수도 등으로 확산된다.
은 이온(Silver ion, Ag+)은 박테리아, 바이러스, 조류 및 곰팡이 등에 고도로 독성이고, 설프히드릴 효소(Sulfhydryl enzyme)가 불활성화되도록 하여 세포 변성을 일으키며, 인체 내에도 축적된다. 또한, 최근 연구 결과에 따르면, 이러한 나노 크기의 물질은 세포 괴사, 암, 파킨슨병, 알츠하이머와 같은 심각한 질병을 초래하는 것으로 보고되고 있다.
이와 같이, 최근 은 이온의 위험성이 크게 부각되고 있는바, 은 이온에 대한 높은 감도 및 선택성을 가지며, 빠른 속도로 은 이온을 검출할 수 있는 방법에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다.
종래 은 이온의 검출 방법으로는, 원자 흡광 분석, 플라즈마 발광 분광법, 유도 결합 플라즈마-질량 스펙트럼 및 형광 분광법 등이 개발되었으나, 이들은 고도로 정교한 장비와 복잡한 제조 공정을 필요로 하는바 실용화에 어려움이 있다.
한편, DNA 합성 기술이 발전함에 따라, 최근, 사이토신-사이토신(C-C) 미스매치(mismatch)의 특이적 상호작용, 즉 은 이온과 2 개의 사이토신들이 특이적으로 결합할 수 있고, C-C 미스매치를 촉진하여 안정한 염기쌍을 형성한다는 것이 밝혀졌으며, C-Ag+-C 배위 화학을 사용하여 은 이온을 검출하는 형광센서가 보고된 바 있다(Ono, S. Cao, H. Togashi, M. Tashiro, T. Fujimoto, T. Machinami, S. Oda, Y. Miyake, I. Okamoto, Y. Tanaka, Chemical Communications, 2008).
그러나, 상기 DNA를 이용한 형광센서는 정량적인 분석이 어려워 현장 진단에 적용하기가 힘들며, 은 이온 검출시 또 다른 독성 물질이 배출된다는 치명적 단점을 가지고 있다. 또한, DNA를 전극에 고정화시키기 위해 사이토신이 풍부하고 아민 말단기 등의 기능기를 가진 DNA를 사용해야 하는바 공정이 복잡하고 비용이 많이 든다는 단점이 있으며, 여전히 검출한계를 만족시키지 못한다는 문제가 있다.
따라서, 보다 경제적이면서도 수 환경에서 극 저농도 검출이 가능하며, 현장 진단 능력과, 고감도 및 고선택성을 가진 은 이온 검출 시스템에 대한 개발이 절실히 필요한 실정이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명에서는 싱글 사이토신(single cytosine, SC)을 이용한 은 이온 검출용 바이오센서를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 은 이온 검출용 바이오센서의 작업 전극을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 은 이온 검출용 바이오센서를 이용하여 은 이온을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
작업 전극, 기준 전극 및 상대 전극을 포함하는 은 이온 검출용 바이오센서로서, 상기 작업 전극의 상부에는 자기조립단층막(self-assembled monolayer, SAM)이 형성되어 있고, 상기 자기조립단층막은 싱글 사이토신과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 자기조립단층막과 싱글 사이토신의 결합은 아마이드 결합일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 자기조립단층막은 3-머캅토프로피온 에시드(3-mercaptopropionic acid), 아미노티오페놀(4-aminothiophenol), 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 티옥틱 에시드(thioctic acid), 4-머캅토페닐아세틱 에시드(4-mercapto phenylacetic acid), 4-머캅토 벤조익 에시드(4-mercapto benzoic acid), 4-머캅토 프로파노익 에시드(4-mercapto propanoic acid), 티오말릭 에시드(2-thiomalic acid), 티올라틱 에시드(2-thiolactic acid), 12-머캡토 도데카노익 에시드(12-mercaptododecanoic acid), 시스테아민(cysteamine), 6-아미노-2-머캅토벤조티아졸(6-amino-2-mercaptobenzothiazole) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 자기조립단층막 형성용 화합물에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 작업 전극과 상기 상대전극은 금(Au) 전극일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 기준 전극은 은/염화은(Ag/AgCl) 전극일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 상대 전극은 백금(Pt) 전극일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
(a) 금 전극 표면에 자기조립단층막(self-assembled monolayer, SAM)을 형성시키는 단계;
(b) 상기 자기조립단층막이 형성된 금 전극을 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide), NHS(N-hydroxysuccinimide ester), 숙시닉 언하이드라이드(succinic anhydride) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 가교제에 노출시키는 단계; 및
(c) 상기 가교제에 노출된 전극을 싱글 사이토신 용액에 침지시켜, 상기 자기조립단층막에 상기 싱글 사이토신을 결합시키는 단계;를 포함하는 은 이온 검출용 바이오센서의 작업전극 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 자기조립단층막 형성은 자기조립단층막 형성물질을 상기 금 전극 표면에 도포하거나, 자기조립단층막 형성물질에 상기 금 전극을 침지시켜 형성할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 자기조립단층막 형성물질은 3-머캅토프로피온 에시드(3-mercaptopropionic acid), 아미노티오페놀(4-aminothiophenol), 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 티옥틱 에시드(thioctic acid), 4-머캅토페닐아세틱 에시드(4-mercapto phenylacetic acid), 4-머캅토 벤조익 에시드(4-mercapto benzoic acid), 4-머캅토 프로파노익 에시드(4-mercapto propanoic acid), 티오말릭 에시드(2-thiomalic acid), 티올라틱 에시드(2-thiolactic acid), 12-머캡토 도데카노익 에시드(12-mercaptododecanoic acid), 시스테아민(cysteamine), 6-아미노-2-머캅토벤조티아졸(6-amino-2-mercaptobenzothiazole) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
(a) 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 작업 전극을 은 이온을 포함하는 시료 및 싱글 사이토신 용액과 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 은 이온 검출용 바이오센서의 전기화학적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 은 이온 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계를 통해 사이토신-Ag+-사이토신 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계의 전기화학적 신호를 측정하는 방법은 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV), 사각파전압전류법(Square wave voltammetry, SWV), 정상펄스전압전류법 (normal pulse voltammetry), 또는 펄스차이전압전류법 (differential pulse voltammetry)일 수 있다.
본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서는 DNA를 구성하는 하나의 염기인 싱글 사이토신을 이용함으로써 은 이온 하나 하나에 대한 출력 신호를 기대할 수 있어 극 저농도 검출이 가능하며, 고감도 및 고선택성을 가지는바 현장 모니터링에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 상면 및 단면에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 제조 공정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서 작업 전극의 제조 공정 및 이를 이용하여 은 이온을 검출하는 원리를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 작업 전극 표면에서의 싱글 사이토신의 고정화 여부 확인을 위한 순환전압전류 곡선을 나타낸 그래프이다(Sample 1 : 금 전극, Sample 2 : MPA 처리된 전극, Sample 3 : 싱글 사이토신이 고정된 전극, Sample 4 : 사이토신-Ag+-사이토신 복합체가 형성된 전극).
도 5는 도 4의 결과로부터 도출한 샘플별 피크 전류를 나타낸 그래프이다.
도 6은 작업 전극 표면에서의 은 이온 결합을 확인하기 위한 EDX 결과로서, (a)는 은 이온 결합 전, (b)는 은 이온 결합 후의 전극 표면의 화학 조성을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 작업 전극에 결합된 싱글 사이토신의 농도에 따른 순환전압전류 곡선을 나타낸 그래프이다
도 8은 도 7의 결과로부터 도출한 금전극과 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 나타낸 그래프이고, 삽입된 그림은 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 확대한 그래프이다.
도 8은 도 7의 결과로부터 도출한 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의, 은 이온의 농도에 따른 SWV 다이어그램를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의, 은 이온의 농도에 따라 측정된 전류 교정 곡선(Calibration curve)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 제조 공정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서 작업 전극의 제조 공정 및 이를 이용하여 은 이온을 검출하는 원리를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 작업 전극 표면에서의 싱글 사이토신의 고정화 여부 확인을 위한 순환전압전류 곡선을 나타낸 그래프이다(Sample 1 : 금 전극, Sample 2 : MPA 처리된 전극, Sample 3 : 싱글 사이토신이 고정된 전극, Sample 4 : 사이토신-Ag+-사이토신 복합체가 형성된 전극).
도 5는 도 4의 결과로부터 도출한 샘플별 피크 전류를 나타낸 그래프이다.
도 6은 작업 전극 표면에서의 은 이온 결합을 확인하기 위한 EDX 결과로서, (a)는 은 이온 결합 전, (b)는 은 이온 결합 후의 전극 표면의 화학 조성을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 작업 전극에 결합된 싱글 사이토신의 농도에 따른 순환전압전류 곡선을 나타낸 그래프이다
도 8은 도 7의 결과로부터 도출한 금전극과 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 나타낸 그래프이고, 삽입된 그림은 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 확대한 그래프이다.
도 8은 도 7의 결과로부터 도출한 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의, 은 이온의 농도에 따른 SWV 다이어그램를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의, 은 이온의 농도에 따라 측정된 전류 교정 곡선(Calibration curve)을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
종래 개시된 은 이온 검출 기술들은 모두 센서 제조 공정이 복잡하거나, 비용이 많이 들고, 검출한계를 만족시키지 못하는 등 실용화에 큰 어려움이 있었다. 이에, 본 발명에서는 보다 경제적이면서도 수 환경에서 극 저농도 검출이 가능하며, 현장 진단 능력과, 고감도 및 고선택성을 가진 은 이온 검출 시스템을 제공하고자 한다.
이에, 본 발명은 작업 전극(working electrode, WE), 기준 전극(reference electrode, RE) 및 상대 전극(counter electrode, CE)을 포함하는 은 이온 검출용 바이오센서로서, 상기 작업 전극의 상부에는 자기조립단층막(self-assembled monolayer, SAM)이 형성되어 있고, 상기 자기조립단층막은 싱글 사이토신과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서를 제공한다(도 1).
본 명세서에서 사용된 "자기조립단층막((self-assembled monolayer, SAM)"은 기질의 표면에 자발적으로 입혀진 규칙적으로 잘 정렬된 유기 분자막을 의미하며, 자기조립물질은 기질 표면에서 자기조립단층막을 형성하여 기질의 표면의 성질을 바꾸거나 표면의 반응성을 변화시키는 역할을 한다.
본 발명에 있어서, 하기 실시예 및 도 3에 나타난 바와 같이 상기 자리조립단층막은 상기 싱글 사이토신에 존재하는 아민기와 아마이드 결합을 통해 결합될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 자기조립단층막은 3-머캅토프로피온 에시드(3-mercaptopropionic acid), 아미노티오페놀(4-aminothiophenol), 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 티옥틱 에시드(thioctic acid), 4-머캅토페닐아세틱 에시드(4-mercapto phenylacetic acid), 4-머캅토 벤조익 에시드(4-mercapto benzoic acid), 4-머캅토 프로파노익 에시드(4-mercapto propanoic acid), 티오말릭 에시드(2-thiomalic acid), 티올라틱 에시드(2-thiolactic acid), 12-머캡토 도데카노익 에시드(12-mercaptododecanoic acid), 시스테아민(cysteamine), 6-아미노-2-머캅토벤조티아졸(6-amino-2-mercaptobenzothiazole) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 자기조립단층막 형성용 화합물에 의해 형성될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 작업 전극과 상기 상대 전극은 금(Au) 전극인 것이 바람직하고, 상기 기준 전극은 은/염화은(Ag/AgCl) 전극인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
(a) 금 전극 표면에 자기조립단층막(self-assembled monolayer, SAM)을 형성시키는 단계;
(b) 상기 자기조립단층막이 형성된 금 전극을 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide), NHS(N-hydroxysuccinimide ester), 숙시닉 언하이드라이드(succinic anhydride) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 가교제에 노출시키는 단계; 및
(c) 상기 가교제에 노출된 전극을 싱글 사이토신 용액에 침지시켜, 상기 자기조립단층막에 상기 싱글 사이토신을 결합시키는 단계;를 포함하는 은 이온 검출용 바이오센서의 작업전극 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 (a) 단계의 자기조립단층막 형성은 상기 금 전극 표면에 자기조립단층막 형성물질을 도포하거나, 상기 금 전극을 침지시켜 상기 금 전극 표면에 자기조립단층막을 형성시키는 등 전극상에 단분자층을 형성시킬 수 있는 방법이면 모두 사용가능한바, 전극의 형태나 크기에 관계없이 전극 표면 상에 단분자층을 용이하게 형성시킬 수 있다.
또한, 상기 자기조립단층막 형성물질은 3-머캅토프로피온 에시드(3-mercaptopropionic acid), 아미노티오페놀(4-aminothiophenol), 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 티옥틱 에시드(thioctic acid), 4-머캅토페닐아세틱 에시드(4-mercapto phenylacetic acid), 4-머캅토 벤조익 에시드(4-mercapto benzoic acid), 4-머캅토 프로파노익 에시드(4-mercapto propanoic acid), 티오말릭 에시드(2-thiomalic acid), 티올라틱 에시드(2-thiolactic acid), 12-머캡토 도데카노익 에시드(12-mercaptododecanoic acid), 시스테아민(cysteamine), 6-아미노-2-머캅토벤조티아졸(6-amino-2-mercaptobenzothiazole) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) 제1항에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 작업 전극을 은 이온을 포함하는 시료 및 싱글 사이토신 용액과 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 은 이온 검출용 바이오센서의 전기화학적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 은 이온 검출방법을 제공한다.
이때, 상기 (a) 단계를 통해 상기 작업 전극에 고정된 사이토신은, 첨가된 은 이온 및 사이토신과 특이적으로 결합할 수 있고, 사이토신-사이토신의 미스매칭에 의해 안정한 염기쌍을 형성하게 되는바, 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 사이토신-Ag+-사이토신 복합체를 형성할 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계의 전기화학적 신호를 측정하는 방법은 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV), 사각파전압전류법(Square wave voltammetry, SWV), 정상펄스전압전류법 (normal pulse voltammetry), 또는 펄스차이전압전류법 (differential pulse voltammetry)일 수 있다.
결과적으로 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서는 DNA를 구성하는 하나의 염기인 싱글 사이토신을 이용함으로써, 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 은 이온 하나 하나에 대한 출력 신호를 기대할 수 있는바 극 저농도 검출이 가능하며, 고감도 및 고선택성을 가지는바 현장 모니터링에 유용하게 적용될 수 있다.
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
1. 재료
황산(98%), 30 wt%의 과산화수소, 3-머캡토프로피온산(3-mercaptopropionic acid, MPA), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl) carbodiimide, EDC), 염화 칼륨(KCl), 페르시안화 칼륨(K3[Fe(CN)6]), AgNO3, 싱글 사이토신, tris-EDTA (TE) 버퍼 및 다른 금속들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구매하였다. N-히드록시숙신이미드에스터(N-hydroxysuccinimide ester, NHS) 는 Alfa Aesar (Ward Hill, USA)에서, 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 는 GIBCO (Carlsbad, USA)에서 구매하였다. 40 mM MPA 용액은 99 % 에탄올과 탈 이온수의 혼합 용매에서 제조하였다. 75 Mm의 EDC 용액 및 30 mM NHS 용액을 가교제로 준비하였다. 전기화학적 측정은 10 mM K3[Fe(CN)6]를 함유한 3M KCl 용액에서 수행하였다. 다른 화학 물질들은 추가 정제없이 사용하였다.
2.
은 이온 검출을
위한 전극 제조
본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서에 사용된 3 개의 전극은 5 mm 직경의 금 작업 전극, 0.5 mm 금 상대 전극 및 0.25 mm 염화 은 기준전극(Ag/AgCl)을 포함하는 4 inch의 유리 웨이퍼 상에서 제조하였다.
바람직하지 않은 영역에서의 생체 분자 고정화를 방지하고, 확실한 전극 영역을 정의하기 위해, 플라즈마 강화 화학 기상 증착(plasma-enhanced chemical vapor deposition, PECVD)를 이용하여 200 nm 이산화규소(SiO2) 및 300 nm의 질화층으로 전체 전극을 부동태화(passivate) 시키고, 상기 질화층 및 이산화규소를 각각 반응성 이온 에칭(reactive ion etching, RIE) 및 완충 산화물 에칭(buffered oxide etchant, BOE) 용액을 이용하여 에칭하였다. 피라나(piranha) 용액(3:1 = H2SO4 : H2O2) 으로 15 분 동안 세척한 후, 밤새 40 mM MPA의 자가 조립 단분자막(self-assembled monolayer, SAM)으로 개질된 금 전극을 75 mM EDC 및 30 mM NHS 용액에 노출시켰다. 개질된 전극을 싱글 사이토신을 함유한 TE 버퍼 용액에 2시간 동안 침지하여 싱글 사이토신의 아민기와 아마이드 결합을 형성시켰다. 얻어진 전극을 TE 버퍼 용액으로 세정하고, 실온에서 건조시켰다. 그리고 나서, 사이토신-Ag+-사이토신 형태를 얻기 위해 은 이온 및 싱글 사이토신 용액을 각각 사이토신 개질된 전극에 떨어뜨렸다. 얻어진 전극을 PBS 용액으로 세정하였다.
3. 특성화
본 발명에 따라, 은이 결합된 작업 전극의 형태를 SEM(S-4300, Hitachi Ltd., Japan)을 이용해서 관찰하였고, 전극의 화학적 조성은 현미경 결합된 EX-200 분광계를 이용하여 에너지 분산 X선 분광 분석(energy dispersive x-ray analysis, EDX)을 통해 결정하였다. 263A potentiostat/galvanostat (Princeton Applied Research, USA)를 이용하여 전기 화학적 분석을 실시하였다. 전기 측정치를 기록하기 위하여, 하기 변수들이 사용되었다: 순환전압잔류(CV)(스캔속도= 100 mV/s), 사각파 전압전류(SWV)(step potential = 1 mV, 사각파 진폭 = 2 mV, 주파수 = 10 kHz, 스캔 속도 = 50 mV/s).
4. 결과
도 4는 본 발명에 따른 작업 전극 표면에서의 싱글 사이토신의 고정화 여부 확인을 위한 순환전류전압 곡선을 나타낸 그래프이고(Sample 1 : 금 전극, Sample 2 : MPA 처리된 전극, Sample 3 : 싱글 사이토신이 고정된 전극, Sample 4 : 사이토신-Ag+-사이토신 복합체가 형성된 전극), 도 5는 도 4의 결과로부터 도출한 샘플별 피크 전류를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 싱글 사이토신의 안정적인 고정 여부 식별을 위한 전기 화학적 특성은 순환전압전류법을 이용하여 수행하였다. 각 샘플의 CV는 100 100 mV/s에서 10mM K3[Fe(CN)6]을 함유한 3 M KCl 용액에서 측정하였다. 고정화의 효과를 조사하기 위해 우선 CV 값을 통해 비피복 금 전극의 전류값을 확인한 결과, 466 uA가 나옴을 확인할 수 있었다. 산처리 및 SC 고정된 전극들은 금 전극보다 낮은 음극 및 양극 전류값을 가진다. 전류값이 감소하는 이러한 결과는, 전기촉매 활동에 의한 직접적인 전자 전달이, 각각 MPA와 SC의 고정에 의해 저하된다는 것을 암시한다. 고정화 단계에 따른 전극의 전자 전달력을 비교하기 위해, 이상적인 전극의 판단 척도로 사용되는 피크 포텐셜 분리(ΔE)을 도 4에서 계산하여 살펴보았다. 금전극의 양극피크(Epa = 0.336 V) 와 음극피크(Epc = 0.269 V) 사이의 ΔE는 70 mV 이하로 이상적인 전극의 모습을 보여주었다. 산처리된 전극의 양극피크(Epa = 0.339 V) 와 음극피크(Epc = 0.264 V) 사이의 ΔE는 약 75 mV였고, SC 고정된 전극의 ΔE(Epa = 0.356 V, Epc = 0.246 V)는 110 mV였다. ΔE는 전자 전달 속도의 함수인바, 높은 ΔE를 가진 MPA 처리된 전극과 SC고정된 전극의 전자 전달은 금 전극보다 느리다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 금 전극 위에 SC의 고정화와 은 나노 물질의 결합이 안정적으로 이루어졌음을 암시한다.
다음으로, 작업 전극에서의 은 나노입자의 결합을 더욱 자세히 확인하기 위하여, 전극의 화학 조성을 EDX 미량 분석에 의해 측정하였다. 도 6은 작업 전극 표면에서의 은 이온 결합을 확인하기 위한 EDX 결과로서, (a)는 은 이온 결합 전, (b)는 은 이온 결합 후의 전극 표면의 화학 조성을 나타내며, 이들의 화학 조성은 하기 표 1에 나타나 있다.
분석 결과, 금 전극 샘플의 O : Na : Si : Au의 원자 비율은 44.92 : 8.01 : 38.71 : 8.36 이었다. 한편, 은 이온이 결합된 본 발명에 따른 작업 전극의 C : Ag : Au 의 원자 비율은 59.22 : 1.43 : 39.35 이었다. 이러한 결과는 싱글 사이토신이 고정된 본 발명에 따른 작업 전극에 은 나노입자가 안정적으로 결합되었다는 것을 증명한다.
다음으로, 고효율의 은 이온 검출을 위한, 싱글 사이토신의 최적 농도를 결정하기 위하여 본 발명에 따른 작업전극의 자기조립단층막에 결합된 싱글 사이토신의 농도에 따른 순환전압전류 곡선을 측정하였다. 도 7은 본 발명에 따른 작업 전극에 결합된 싱글 사이토신의 농도에 따른 순환전압전류 곡선을 나타낸 그래프이고, 도 8은 도 7의 결과로부터 도출한 금전극과 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 나타낸 그래프이고, 삽입된 그림은 싱글 사이토신 농도별 피크 전류를 확대한 그래프이다. 도 8의 삽입된 그림을 살펴보면, 1 mM 이상의 농도에서 전류값의 변화가 작아지는 변곡점을 확인한 바, 이를 통해 싱글 사이토신의 농도는 0.1 내지 5 mM인 것이 바람직하고, 1 mM인 것이 가장 바람직하다는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 상기 도출된 최적 조건 하에서, 본 발명에 따른 바이오센서의 은 이온 검출 능력을, 사각파전압전류법(Square wave voltammetry, SWV)을 통해 측정하였다. 먼저, 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 작업 전극을 100 pM 에서 1 mM까지의 다양한 농도의 은 이온을 포함한 용액과, 사이토신 함유 용액의 혼합 용액에 2 시간 동안 침지시켰다. 이때, 사이토신 함유 용액은 Ag+ 미스매치 상호작용을 형성하는 사이토신- Ag+-사이토신 복합체의 수득을 위해 사용되었다.
사각파 전압전류 곡선은 10mM K3[Fe(CN)6]을 함유한 3 M KCl 용액에서 측정하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, SWV의 피크 전류는 본 발명에 따라 사이토신이 고정화된 전극에서 은 이온의 총량과 함께 증가하였는데, 이는 전극 계면에서의 전하 이동 저항이 은 이온에 의해 감소되기 때문이다. 은 이온은 전극 계면에서의 전하 이동 저항의 감소를 도와주는 역할을 한다. 도 10은 전형적인 교정 곡선을 나타낸다. 피크 전류와 은 이온 검출 시스템의 농도의 대수사이의 관계는 교정 곡선에 의해 결정되었다. 5 nM 에서 1 mM 범위에서의 본 발명에 따른 은 이온 검출 시스템의 선형성은 R2= 0.9814 이며, 검출 한계는 20 pM이었다. 이러한 결과들은 본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서를 이용하여 은이온을 검출하는 기술이 고감도, 우수한 선형성 및 낮은 검출 한계를 가진다는 것을 증명한다. 특히, 종래 발표된 대부분의 연구들은 nM의 검출 한계를 가지는 것에 비해, 본 발명에 따른 SC 시스템은 pM의 검출 한계를 가지는바, 매우 낮은 검출 한계를 가지는 우수한 시스템임을 알 수 있다(Yang, Q. Li, F. Huang, Y. Xu, H. Tang, L. Wang, L. Fan, C., Analyst, 2013).
5. 결론
본 발명에서는 싱글 사이토신이 고정화된 센서를 이용함으로써 은 이온을 성공적으로 검출하였다. 은 나노 입자들은 Ag+ 미스매치 상호작용 형성을 통해 본 발명에 따른 작업 전극의 표면에 안정적으로 결합하였다.
본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서는 종래 개시된 은 이온 검출 기술들과 비교해볼 때, 비용 효율성, 넓은 측정 범위, 단순성, 신속성 및 특히, 낮은 검출한계(LOD) 등 다양한 장점을 제공한다. 본 발명에 따른 바이오센서의 낮은 LOD에는 2 가지 이유가 있다. 첫째, 결합된 은 이온이 전자 전달을 위한 직접적인 경로 역할을 수행하기 때문이며, 둘째, 본 발명은 DNA를 사용한 시스템보다 작은 사슬 길이를 가지고 있는바, 사슬 길가 감소할수록, 전자 이동 속도가 증가하는 효과에 기인하는 것이다.
본 발명에 따른 은 이온 검출용 바이오센서는 매우 낮은 검출한계를 가지는바, 현장 검출에 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 수은, 아연, 카드뮴, 납 등의 각종 나노 입자 검출 시스템에 효과적으로 적용될 것으로 기대된다.
Claims (11)
- 작업 전극, 기준 전극 및 상대 전극을 포함하는 은 이온 검출용 바이오센서로서,
상기 작업 전극의 상부에는 자기조립단층막(self-assembled monolayer, SAM)이 형성되어 있고,
상기 자기조립단층막은 싱글 사이토신과 결합되어 있으며,
상기 결합된 싱글 사이토신의 농도는 0.1 내지 5 mM이고,
상기 싱글 사이토신과 결합하는 은 이온은 작업 전극의 계면에서의 전하 이동 저항을 감소시키는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서. - 제1항에 있어서,
상기 자기조립단층막과 싱글 사이토신의 결합은 아마이드 결합인 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서. - 제1항에 있어서,
상기 자기조립단층막은 3-머캅토프로피온 에시드(3-mercaptopropionic acid), 아미노티오페놀(4-aminothiophenol), 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 티옥틱 에시드(thioctic acid), 4-머캅토페닐아세틱 에시드(4-mercapto phenylacetic acid), 4-머캅토 벤조익 에시드(4-mercapto benzoic acid), 4-머캅토 프로파노익 에시드(4-mercapto propanoic acid), 티오말릭 에시드(2-thiomalic acid), 티올라틱 에시드(2-thiolactic acid), 12-머캡토 도데카노익 에시드(12-mercaptododecanoic acid), 시스테아민(cysteamine), 6-아미노-2-머캅토벤조티아졸(6-amino-2-mercaptobenzothiazole) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 자기조립단층막 형성용 화합물에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서. - 제1항에 있어서,
상기 작업 전극과 상기 상대 전극은 금(Au) 전극인 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서. - 제1항에 있어서,
상기 기준 전극은 은/염화은(Ag/AgCl) 전극인 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서. - 제1항에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 작업전극 제조방법으로서,
(a) 금 전극 표면에 자기조립단층막(self-assembled monolayer, SAM)을 형성시키는 단계;
(b) 상기 자기조립단층막이 형성된 금 전극을 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide), NHS(N-hydroxysuccinimide ester), 숙시닉 언하이드라이드(succinic anhydride) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 가교제에 노출시키는 단계; 및
(c) 상기 가교제에 노출된 전극을 싱글 사이토신 용액에 침지시켜, 상기 자기조립단층막에 상기 싱글 사이토신을 결합시키는 단계;를 포함하고,
상기 싱글 사이토신 용액의 농도는 0.1 내지 5 mM이고,
상기 싱글 사이토신과 결합하는 은 이온은 작업 전극의 계면에서의 전하 이동 저항을 감소시키는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서의 작업전극 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (a) 단계의 자기조립단층막 형성은 자기조립단층막 형성물질을 상기 금 전극 표면에 도포하거나, 자기조립단층막 형성물질에 상기 금 전극을 침지시켜 형성하는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서의 작업전극 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 자기조립단층막 형성물질은 3-머캅토프로피온 에시드(3-mercaptopropionic acid), 아미노티오페놀(4-aminothiophenol), 캘릭스크라운(calixcrown), 11-머캅토언데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 티옥틱 에시드(thioctic acid), 4-머캅토페닐아세틱 에시드(4-mercapto phenylacetic acid), 4-머캅토 벤조익 에시드(4-mercapto benzoic acid), 4-머캅토 프로파노익 에시드(4-mercapto propanoic acid), 티오말릭 에시드(2-thiomalic acid), 티올라틱 에시드(2-thiolactic acid), 12-머캡토 도데카노익 에시드(12-mercaptododecanoic acid), 시스테아민(cysteamine), 6-아미노-2-머캅토벤조티아졸(6-amino-2-mercaptobenzothiazole) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출용 바이오센서의 작업전극 제조방법. - (a) 제1항에 따른 은 이온 검출용 바이오센서의 작업 전극을 은 이온을 포함하는 시료 및 싱글 사이토신 용액과 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 은 이온 검출용 바이오센서의 전기화학적 신호를 측정하는 단계;를 포함하고,
상기 은 이온은 작업 전극의 계면에서의 전하 이동 저항을 감소시키는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출방법. - 제9항에 있어서,
상기 (a) 단계를 통해 사이토신-Ag+-사이토신 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 은 이온 검출방법. - 제9항에 있어서,
상기 (b) 단계의 전기화학적 신호를 측정하는 방법은 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV), 사각파전압전류법(Square wave voltammetry, SWV), 정상펄스전압전류법 (normal pulse voltammetry), 또는 펄스차이전압전류법 (differential pulse voltammetry)인 것을 특징으로 하는 은 이온 검출방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR20190082599A (ko) * | 2018-01-02 | 2019-07-10 | 한국화학연구원 | Nadh 측정을 위한 바이오센서용 전극 및 그의 제조방법 |
| CN114381257A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-22 | 吉林大学 | 一种基于硫代乳酸保护的近红外发光金纳米簇比率型荧光探针及其在银离子检测中的应用 |
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2016
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