CN109612977A - 基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，含有以下步骤：⑴制备银纳米颗粒并修饰标记抗体；⑵构建三明治免疫夹心结构；⑶制备纳米金及双功能化表面增强拉曼光谱纳米探针；⑷生物标志物标准品及实际样品的表面增强拉曼光谱检测；本发明以金属Ag+代替酶作为放大手段，实现了基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物的检测，用末端炔与SERS探针分子共同修饰纳米金，得到了能与Ag+响应又能获得SERS信号的双功能化纳米探针，提高了检测灵敏度，降低了检出限；用化学反应替代了传统的酶催化过程，能节省检测时间，能提高检测体系稳定性，降低检测成本，对将化学反应引入到生物标志物检测体系中有积极意义。

Description

基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，涉及利用Ag+引起双功能化的纳米金聚集，使探针分子得到增强的拉曼信号，并将这一原理应用到生物标志物的检测中。具体地说，是采用含有末端炔基的有机分子和表面增强的拉曼探针分子对纳米金进行双功能化处理，含有末端炔基的有机分子与Ag+反应会引起双功能化纳米金的聚集，使探针分子得到的拉曼信号明显增强，并将此原理应用于生物标志物的检测中。
背景技术
目前，生物标志物的常用检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)。该检测方法基于抗原与抗体的特异性结合，通过引入酶标抗体检测酶催化反应的程度，从而能实现对抗原或抗体的定量检测。该检测方法的不足是：检测限比较高，酶促反应耗时较长。更为重要的是，酶的活性会随着外部条件的变化而时刻变化，温度、pH等条件的波动对酶催化反应都会有较大的影响，会对检测结果造成较大的误差。为了克服酶的这种缺陷，各种无酶的信号放大体系应运而生。例如，由金属纳米颗粒标记抗体替代酶标抗体，它通过化学反应使金属离子溶出，再通过某种手段检测出金属离子的含量，即可实现对生物标志物的灵敏检测。
表面增强拉曼光谱(SERS)是一项重要的光谱检测技术，它在生物检测方面展现出了特别的优势。其一，以粗糙的金属表面作为表面增强拉曼光谱的基底，能使SERS信号的涨幅达到106～1014，满足对微量和痕量分析物的超灵敏检测；其二，与荧光分析法或其他检测方法相比，表面增强拉曼光谱标记物不仅具有更简单、更广泛、更尖锐的“指纹”信号，还不会发生自猝灭和光漂白现象；其三，以纳米金、纳米银作为表面增强拉曼光谱基底，不仅制备方法简单、信号增大能力强，还具有良好的生物相容性。基于这些显著的优势，表面增强拉曼光谱的技术在免疫分析、单分子、生物医学等领域的应用越来越广泛。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，其主要含有两个特点：⑴设计了一种采用含有末端炔基有机分子及表面增强拉曼光谱探针分子修饰的双功能化纳米金，Ag+能引起该双功能化纳米金聚集而使探针分子的表面增强拉曼光谱信号得到极大的增强。⑵将所述设计的双功能化纳米金应用到生物标志物的检测中，将所述双功能化纳米金作为表面增强拉曼光谱纳米探针，将含有金属银的纳米颗粒通过某种方式与免疫检测中的反应物结合在一起，使含有金属银的纳米颗粒作为反应物且通过某种化学反应产生Ag+，从而引起纳米金的聚集，使探针分子的表面增强拉曼光谱信号得到极大增强。由于不同浓度的Ag+引起功能化纳米金的聚集程度是不同的，因而探针分子产生的表面增强拉曼光谱强度也是不同的，进而能对待测物进行定量检测。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
一种基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，其特征在于，含有以下步骤：
(1)制备银纳米颗粒并修饰标记抗体
①采用一锅法合成20～100nm的银纳米颗粒，向干净的烧杯中加入9～36mg硝酸银(AgNO3)和50～200mL超纯水，加热至微沸；向所述微沸溶液中滴加1～3mL质量浓度为1％柠檬酸三钠，继续加热并保持溶液沸腾，直至溶液颜色保持不变，再继续加热10～20min，获得银纳米颗粒(AgNPs)溶液；
用紫外-可见吸收光谱对AgNPs溶液的吸收光谱进行测量；
②将所述银纳米颗粒溶液以5500～6500r/min高速离心3～10min，然后分散在浓度为1～10mM，pH＝7.4的PBS溶液中；
③向上述溶液里加入10-9～10-8M标记抗体；再将混合溶液放置于摇床上反应10～14h，然后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭10～14h，终浓度为0.1～1％；
④将混合溶液再次以5500～6500r/min高速离心3～10min；
⑤最后将与抗体相连的银纳米颗粒(AgNPs-Ab)重新分散在BSA溶液中，放置在4℃的冰箱中储存；
(2)构建三明治免疫夹心结构
①将包被抗体用的50mM、pH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液稀释500～2000倍，然后将其加到100μL载体上，4℃的冰箱中过夜；
②用移液枪除去包被抗体溶液，随后用200μL含吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3～6次，在室温下向其中加入200μL、1％的BSA溶液温育1～3h以阻断剩余蛋白质的结合位点；
③用200μL的PBST溶液洗涤3～6次，再依次加入100μL经过稀释的、从10-6g/mL至10-14g/mL的生物标志物标准品溶液；在此过程中应选择一处添加PBS缓冲液而设定为空白对照，放在37℃烘箱里温育0.5～2h；
④温育结束后，用200μL PBST溶液洗涤3～6次，再加入100μL的AgNPs-Ab溶液，然后放入37℃的烘箱温育30～40min；
⑤最后，用200μL的PBST溶液洗涤3～6次，将形成的三明治夹心结构储存在4℃的冰箱中备用；
(3)制备纳米金及双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针
①取质量浓度为0.5％～2％的氯金酸溶液，将其加入到50～200mL的纯水中，加热至沸腾，逐滴加入质量浓度为0.05～0.2％柠檬酸钠溶液，持续煮沸并搅拌10～20min，然后冷却至室温，得到稳定的红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金；
②将红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金放入离心管内4500～6500r/min高速离心3～10min，取下层纳米金用蒸馏水重新分散备用；
③取摩尔浓度比为1:1～1:10的SERS探针分子和末端炔有机分子，将其与1～10mL的纳米金混合均匀并过夜，而后将其放入离心管内4500～6500r/min高速离心3～10min，取出上清液后将底部探针重新分散，得到双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针，用拉曼光谱仪测得其SERS图谱；
(4)生物标志物标准品及实际样品的SERS检测
①采用有梯度浓度的生物标志物标准品溶液，用其制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中依次加入50μL有一定浓度的H2O2，反应一段时间，使其中的Ag+溶出；
②再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育一段时间，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，根据其特征峰的拉曼强度与生物标志物标准品的浓度得到线性校正线；
③用实际样品的生物标志物溶液制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中加入50μL有一定浓度的H2O2，反应一段时间，使其中的Ag+溶出；
④再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育一段时间，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，将得到的拉曼强度带入到校正曲线中，得到实际样品中生物标志物的浓度。
可选的，步骤(4)中生物标志物标准品溶液的浓度梯度为10-6g/mL～10-14g/mL。
可选的，步骤(4)①和③所述H2O2的浓度为1～10mM。
可选的，步骤(4)①和③中的溶出反应时间为5～20min。
可选的，步骤(4)②和④中Ag+与双功能化SERS纳米探针的孵育时间为3～10min。
本发明的积极效果是：
(1)以金属Ag+代替酶作为放大手段，实现了基于SERS的无酶信号放大生物标志物的检测方法，弥补了酶受温度、pH等外界条件影响而导致检测稳定性及准确性差的不足。
(2)用末端炔与SERS探针分子共同修饰纳米金，得到了既能与Ag+响应又能获得SERS信号的双功能化纳米探针，提高了检测的灵敏度，降低了检出限。
(3)由于不同尺寸的银纳米颗粒的比表面积不同，所吸附的抗体数目也不同，因此，应尽量选用尺寸均一的银纳米颗粒，以有利于实现检测的高重现性。
(4)利用化学反应替代传统的酶催化过程，化学溶出的过程迅速且稳定，能节省检测时间，提高检测体系的稳定性，降低检测成本，对将化学反应引入到生物标志物检测体系中有积极的意义。
附图说明
图1为本发明基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法的流程框图。
图2为银纳米颗粒的UV-vis吸收光谱图。
图3为金纳米颗粒的UV-vis吸收光谱图。
图4为探针分子加Ag+前后的表面增强拉曼光谱图谱。
具体实施方式
以下结合附图给出本发明基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法的具体实施方式。实施方式以银标抗体为例，通过双氧水腐蚀产生Ag+；以96孔聚苯乙烯板作为三明治结构的载体；以SERS探针对氨基苯硫酚(PATP)和末端炔(5-DNPA)为例，制备双功能化纳米金；分别以AFP、PSA及CEA为例，讲述其具体实施例。但是应当指出，本发明在具体实施中，可以用氧化银、氧化铜或铜的其它纳米颗粒作为标记抗体，通过酸腐蚀或其它方法产生Ag+或Cu+，另外，功能化纳米金也能用其它含有末端炔基的化合物制备；既，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例1
一种基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，含有以下步骤(参见图1)：
(1)制备银纳米颗粒并修饰标记抗体
①采用一锅法合成40nm的银纳米颗粒，向干净的烧杯中加入18mg硝酸银(AgNO3)和100mL超纯水，加热至微沸；向所述微沸溶液中滴加2mL质量浓度为1％柠檬酸三钠，继续加热并保持溶液沸腾，直至溶液颜色保持不变，再继续加热15min，获得银纳米颗粒(AgNPs)溶液；
用紫外-可见吸收光谱对AgNPs溶液的吸收光谱进行测量，测量结果参见图2。
②将所述银纳米颗粒溶液以6000r/min高速离心5min，然后分散在浓度为1mM，pH＝7.4的PBS溶液中。
③向上述溶液里加入5×10-9M标记抗体；再将混合溶液放置于摇床上反应12h，然后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭12h，终浓度为1％。
④将混合溶液再次以6000r/min高速离心5min。
⑤最后将与抗体相连的银纳米颗粒(AgNPs-Ab)重新分散在BSA溶液中，放置在4℃的冰箱中储存。
(2)构建三明治免疫夹心结构
①将包被抗体用的50mM、pH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液稀释2000倍，然后将其加到100μL载体上，4℃的冰箱中过夜。
②用移液枪除去包被抗体溶液，随后用200μL含吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次，在室温下向其中加入200μL、1％的BSA溶液温育2h以阻断剩余蛋白质的结合位点。
③用200μL的PBST溶液洗涤3次，再依次加入100μL经过稀释的、从10-6g/mL至10- 12g/mL的AFP标准品溶液；在此过程中应选择一处添加PBS缓冲液而设定为空白对照，放在37℃烘箱里温育1h。
④温育结束后，用200μL PBST溶液洗涤3次，再加入100μL的AgNPs-Ab溶液，然后放入37℃的烘箱温育40min。
⑤最后，用200μL的PBST溶液洗涤3次，将形成的三明治夹心结构储存在4℃的冰箱中备用。
(3)制备纳米金及双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针
①取质量浓度为1％的氯金酸溶液，将其加入到100mL的纯水中，加热至沸腾，逐滴加入质量浓度为0.1％柠檬酸钠溶液，持续煮沸并搅拌15min，然后冷却至室温，得到稳定的红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金(参见图3)。
②将红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金放入离心管内5400r/min高速离心5min，取下层纳米金用蒸馏水重新分散备用。
③取摩尔浓度比为1:5的SERS探针分子和末端炔有机分子，将其与5mL的纳米金混合均匀并过夜，而后将其放入离心管内5400r/min高速离心5min，取出上清液后将底部探针重新分散，得到双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针，用拉曼光谱仪测得其SERS图谱。
(4)生物标志物标准品及实际样品的SERS检测
①采用有梯度浓度的AFP标准品溶液，用其制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中依次加入50μL 10mM的H2O2，反应5min，使其中的Ag+溶出。
②再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育5min，用拉曼光谱仪测得其SERS信号(参见图4，图内直线代表加Ag+前，图内虚线代表加Ag+后)，根据其特征峰的拉曼强度与生物标志物标准品的浓度得到线性校正线。
③用AFP实际样品溶液制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中加入50μL10mM的H2O2，反应5min，使其中的Ag+溶出。
④再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育5min，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，将得到的拉曼强度带入到校正曲线中，得到实际样品中生物标志物的浓度。
实施例2
一种基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，含有以下步骤：
(1)制备银纳米颗粒并修饰标记抗体
①采用一锅法合成20nm的银纳米颗粒，向干净的烧杯中加入9mg硝酸银(AgNO3)和50mL超纯水，加热至微沸；向所述微沸溶液中滴加1mL质量浓度为1％柠檬酸三钠，继续加热并保持溶液沸腾，直至溶液颜色保持不变，再继续加热10min，获得银纳米颗粒(AgNPs)溶液；
用紫外-可见吸收光谱对AgNPs溶液的吸收光谱进行测量。
②将所述银纳米颗粒溶液以5500r/min高速离心10min，然后分散在浓度为5mM，pH＝7.4的PBS溶液中。
③向上述溶液里加入10-8M标记抗体；再将混合溶液放置于摇床上反应10h，然后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭10h，终浓度为0.1％。
④将混合溶液再次以5500r/min高速离心10min。
⑤最后将与抗体相连的银纳米颗粒(AgNPs-Ab)重新分散在BSA溶液中，放置在4℃的冰箱中储存。
(2)构建三明治免疫夹心结构
①将包被抗体用的50mM、pH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液稀释500倍，然后将其加到100μL载体上，4℃的冰箱中过夜。
②用移液枪除去包被抗体溶液，随后用200μL含吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤5次，在室温下向其中加入200μL、1％的BSA溶液温育3h以阻断剩余蛋白质的结合位点。
③用200μL的PBST溶液洗涤5次，再依次加入100μL经过稀释的、从10-8g/mL至10- 14g/mL的PSA标准品溶液；在此过程中应选择一处添加PBS缓冲液而设定为空白对照，放在37℃烘箱里温育2h。
④温育结束后，用200μL PBST溶液洗涤5次，再加入100μL的AgNPs-Ab溶液，然后放入37℃的烘箱温育35min。
⑤最后，用200μL的PBST溶液洗涤5次，将形成的三明治夹心结构储存在4℃的冰箱中备用。
(3)制备纳米金及双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针
①取质量浓度为0.5％的氯金酸溶液，将其加入到50mL的纯水中，加热至沸腾，逐滴加入质量浓度为0.05％柠檬酸钠溶液，持续煮沸并搅拌10min，然后冷却至室温，得到稳定的红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金。
②将红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金放入离心管内4500r/min高速离心10min，取下层纳米金用蒸馏水重新分散备用。
③取摩尔浓度比为1:1的SERS探针分子和末端炔有机分子，将其与1mL的纳米金混合均匀并过夜，而后将其放入离心管内4500r/min高速离心10min，取出上清液后将底部探针重新分散，得到双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针，用拉曼光谱仪测得其SERS图谱。
(4)生物标志物标准品及实际样品的SERS检测
①采用有梯度浓度的PSA标准品溶液，用其制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中依次加入50μL 1mM的H2O2，反应20min，使其中的Ag+溶出。
②再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育10min，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，根据其特征峰的拉曼强度与生物标志物标准品的浓度得到线性校正线。
③用PSA实际样品溶液制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中加入50μL1mM的H2O2，反应20min，使其中的Ag+溶出。
④再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育10min，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，将得到的拉曼强度带入到校正曲线中，得到实际样品中生物标志物的浓度。
实施例3
一种基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，含有以下步骤：
(1)制备银纳米颗粒并修饰标记抗体
①采用一锅法合成100nm的银纳米颗粒，向干净的烧杯中加入36mg硝酸银(AgNO3)和200mL超纯水，加热至微沸；向所述微沸溶液中滴加3mL质量浓度为1％柠檬酸三钠，继续加热并保持溶液沸腾，直至溶液颜色保持不变，再继续加热20min，获得银纳米颗粒(AgNPs)溶液；
用紫外-可见吸收光谱对AgNPs溶液的吸收光谱进行测量。
②将所述银纳米颗粒溶液以6500r/min高速离心3min，然后分散在浓度为20mM，pH＝7.4的PBS溶液中。
③向上述溶液里加入10-9M标记抗体；再将混合溶液放置于摇床上反应14h，然后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭14h，终浓度为0.5％。
④将混合溶液再次以6500r/min高速离心3min。
⑤最后将与抗体相连的银纳米颗粒(AgNPs-Ab)重新分散在BSA溶液中，放置在4℃的冰箱中储存。
(2)构建三明治免疫夹心结构
①将包被抗体用的50mM、pH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液稀释1000倍，然后将其加到100μL载体上，4℃的冰箱中过夜。
②用移液枪除去包被抗体溶液，随后用200μL含吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤6次，在室温下向其中加入200μL、1％的BSA溶液温育1h以阻断剩余蛋白质的结合位点。
③用200μL的PBST溶液洗涤6次，再依次加入100μL经过稀释的、从10-7g/mL至10- 13g/mL的CEA标准品溶液；在此过程中应选择一处添加PBS缓冲液而设定为空白对照，放在37℃烘箱里温育0.5h。
④温育结束后，用200μL PBST溶液洗涤6次，再加入100μL的AgNPs-Ab溶液，然后放入37℃的烘箱温育30min。
⑤最后，用200μL的PBST溶液洗涤6次，将形成的三明治夹心结构储存在4℃的冰箱中备用。
(3)制备纳米金及双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针
①取质量浓度为2％的氯金酸溶液，将其加入到200mL的纯水中，加热至沸腾，逐滴加入质量浓度为0.2％柠檬酸钠溶液，持续煮沸并搅拌20min，然后冷却至室温，得到稳定的红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金。
②将红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金放入离心管内6500r/min高速离心3min，取下层纳米金用蒸馏水重新分散备用。
③取摩尔浓度比为1:10的SERS探针分子和末端炔有机分子，将其与10mL的纳米金混合均匀并过夜，而后将其放入离心管内6500r/min高速离心3min，取出上清液后将底部探针重新分散，得到双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针，用拉曼光谱仪测得其SERS图谱。
(4)生物标志物标准品及实际样品的SERS检测
①采用有梯度浓度的CEA标准品溶液，用其制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中依次加入50μL 5mM的H2O2，反应10min，使其中的Ag+溶出。
②再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育3min，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，根据其特征峰的拉曼强度与生物标志物标准品的浓度得到线性校正线。
③用CEA实际样品溶液制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中加入50μL5mM的H2O2，反应10min，使其中的Ag+溶出。
④再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育3min，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，将得到的拉曼强度带入到校正曲线中，得到实际样品中生物标志物的浓度。
本发明以金属银离子溶出代替酶作为放大手段，实现了基于表面增强拉曼光谱(SERS)的无酶信号放大生物标志物的检测；用化学反应替代了传统的酶催化过程，不仅能节省检测时间，还能提高检测体系的稳定性，降低检测成本，对将化学反应引入到生物标志物检测体系中有积极的意义。
以上所述仅是本发吗的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明检测方法的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，其特征在于，含有以下步骤：
(1)制备银纳米颗粒并修饰标记抗体
①采用一锅法合成20～100nm的银纳米颗粒，向干净的烧杯中加入9～36mg硝酸银(AgNO3)和50～200mL超纯水，加热至微沸；向所述微沸溶液中滴加1～3mL质量浓度为1％柠檬酸三钠，继续加热并保持溶液沸腾，直至溶液颜色保持不变，再继续加热10～20min，获得银纳米颗粒(AgNPs)溶液；
用紫外-可见吸收光谱对AgNPs溶液的吸收光谱进行测量；
②将所述银纳米颗粒溶液以5500～6500r/min高速离心3～10min，然后分散在浓度为1～10mM，pH＝7.4的PBS溶液中；
③向上述溶液里加入10-9～10-8M标记抗体；再将混合溶液放置于摇床上反应10～14h，然后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭10～14h，终浓度为0.1～1％；
④将混合溶液再次以5500～6500r/min高速离心3～10min；
⑤最后将与抗体相连的银纳米颗粒(AgNPs-Ab)重新分散在BSA溶液中，放置在4℃的冰箱中储存；
(2)构建三明治免疫夹心结构
①将包被抗体用的50mM、pH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液稀释500～2000倍，然后将其加到100μL载体上，4℃的冰箱中过夜；
②用移液枪除去包被抗体溶液，随后用200μL含吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3～6次，在室温下向其中加入200μL、1％的BSA溶液温育1～3h以阻断剩余蛋白质的结合位点；
③用200μL的PBST溶液洗涤3～6次，再依次加入100μL经过稀释的、从10-6g/mL至10-14g/mL的生物标志物标准品溶液；在此过程中应选择一处添加PBS缓冲液而设定为空白对照，放在37℃烘箱里温育0.5～2h；
④温育结束后，用200μL PBST溶液洗涤3～6次，再加入100μL的AgNPs-Ab溶液，然后放入37℃的烘箱温育30～40min；
⑤最后，用200μL的PBST溶液洗涤3～6次，将形成的三明治夹心结构储存在4℃的冰箱中备用；
(3)制备纳米金及双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针
①取质量浓度为0.5％～2％的氯金酸溶液，将其加入到50～200mL的纯水中，加热至沸腾，逐滴加入质量浓度为0.05～0.2％柠檬酸钠溶液，持续煮沸并搅拌10～20min，然后冷却至室温，得到稳定的红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金；
②将红色的表面增强拉曼光谱活性基底纳米金放入离心管内4500～6500r/min高速离心3～10min，取下层纳米金用蒸馏水重新分散备用；
③取摩尔浓度比为1:1～1:10的SERS探针分子和末端炔有机分子，将其与1～10mL的纳米金混合均匀并过夜，而后将其放入离心管内4500～6500r/min高速离心3～10min，取出上清液后将底部探针重新分散，得到双功能化表面增强拉曼光谱(SERS)纳米探针，用拉曼光谱仪测得其SERS图谱；
(4)生物标志物标准品及实际样品的SERS检测
①采用有梯度浓度的生物标志物标准品溶液，用其制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中依次加入50μL有一定浓度的H2O2，反应一段时间，使其中的Ag+溶出；
②再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育一段时间，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，根据其特征峰的拉曼强度与生物标志物标准品的浓度得到线性校正线；
③用实际样品的生物标志物溶液制得具有三明治免疫夹心结构的孔板，向所述孔板中加入50μL有一定浓度的H2O2，反应一段时间，使其中的Ag+溶出；
④再将所述孔板中的溶液分别吸出放到小试管中，加入50μL步骤(3)制备的双功能化SERS纳米探针，孵育一段时间，用拉曼光谱仪测得其SERS信号，将得到的拉曼强度带入到校正曲线中，得到实际样品中生物标志物的浓度。
2.如权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(4)中生物标志物标准品溶液的浓度梯度为10-6g/mL～10-14g/mL。
3.如权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(4)①和③所述H2O2的浓度为1～10mM。
4.如权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(4)①和③中的溶出反应时间为5～20min。
5.如权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(4)②和④中Ag+与双功能化SERS纳米探针的孵育时间为3～10min。
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