CN112315056A - 用于呼吸道病毒采集和检测的拉曼免疫探针的特种检测口罩及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于呼吸道病毒采集和检测的拉曼免疫探针的特种检测口罩及方法。在口罩内侧的熔喷布层附有一个喷有拉曼免疫探针的区域或者附件，该区域或者附件位于正对应口鼻的位置；拉曼免疫探针吸附有拉曼标志物和针对呼吸道病毒的单克隆抗体或多克隆抗体，拉曼免疫探针的溶液直接喷在口罩中间的熔喷布层或者附件上，口罩的内侧设有可开口位置，喷有拉曼免疫探针的附件通过无纺布结合粘扣带可拆卸地装在可开口位置，拉曼免疫探针是由特殊制备方法获得。

Description

用于呼吸道病毒采集和检测的拉曼免疫探针的特种检测口罩 及方法
技术领域
本发明涉及呼吸道病原体检测技术领域的一种口罩及检测方法，具体涉及一种用于呼吸道病毒采集和检测的拉曼免疫探针的特种检测口罩及方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒SARS-CoV-2感染所致的传染性疾病。目前防控疫情的重中之重在于准确识别出病毒感染者，尤其是轻症和无症状患者，需及时进行隔离。该疾病的确诊手段主要是在鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等标本中检
测病毒核酸。研究显示SARS-Cov-2主要感染下呼吸道，通过鼻咽拭纸和支气管的样本检测。然而下呼吸道样本的采集需要专门的装置和专业的技术人员。既往研究表明，RT-PCR确诊患者的痰液样本的阳性率为74.4％-88.9％；鼻拭纸样本额阳性率为53.6％-73.3％；发病后大于8天的咽拭纸检测阳性率极低。由于病毒主要感染位置在下呼吸道，采集的不同呼吸道样本引起了很高的阴性率。
表面增强拉曼光谱免疫分析(SERSIA)是一种结合了表面增强拉曼光谱的高灵敏度和免疫分析的高特异性的超灵敏分析技术。由于表面增强拉曼光谱技术的灵敏性和选择性，目前已经被广泛应用于生物系监测，尤其在临床医学领域发挥更加重要的作用。
口罩是一种日常防护用品，在生活中经常会用到。口罩除了具有传统的防护性能外，同时还具备一定的呼吸道病毒或其它病原体的取样功能，通过佩戴口罩提取呼吸道或咽部病毒或其它病原体标本的方式，具有简便易行、可以多次取样、灵活调节取样量等特点，不仅方便患者的疾病诊断，可以减轻医护人员的工作量，同时由于口罩的使用具有长期佩戴的特点，便于对康复患者实行动态跟踪监测。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提出了一种可用于采集和检测呼吸道病毒样本的拉曼免疫探针的特种检测口罩及方法。
本发明的具体技术方案如下：
一、一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩：
在口罩内侧的熔喷布层附有一个喷有拉曼免疫探针的区域或者附件，该区域或者附件位于正对应口鼻的位置；所述的拉曼免疫探针吸附有拉曼标志物和针对呼吸道病毒的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述的拉曼免疫探针为一种纳米金颗粒，大小在20-100nM。
所述的纳米金颗粒是一种红色的均一的胶体溶液。
所述的喷有拉曼免疫探针的附件通过粘性物质固定于口罩内侧的熔喷布层表面，为方形或圆形。附件具体可以采用熔喷无纺布材质或硝酸聚酯纤维素膜。
所述口罩的内侧设有可开口位置，喷有拉曼免疫探针的附件通过无纺布结合粘扣带可拆卸地装在可开口位置，打开无纺布结合粘扣带从可开口位置取出喷有拉曼免疫探针的附件，并用于后续拉曼光谱的测定。
原本的口罩本体为医用外科口罩，所述的特种检测口罩为在医用外科口罩上改造制成。
所述的喷有拉曼免疫探针的区域在熔喷布层本身上，为长方形、椭圆形或圆形。
所述口罩本体包括沿着朝向佩戴者面部一侧依次设置的第一层无纺布层、熔喷布层和第二层无纺布层，所述拉曼免疫探针的区域或者附件设置在熔喷布层朝向佩戴者面部的一侧表面。
所述口罩的拉曼免疫探针，是由拉曼免疫探针的溶液直接喷在口罩中间的熔喷布层或者附件上。
所述的拉曼免疫探针采用以下方法制备获得：
1)纳米金颗粒的制备
1.1)将柠檬酸钠加热沸腾后，加入HAuCl4，溶液的颜色变为粉红色，获得种子溶液；
1.2)然后将种子溶液的温度降到为90℃后再加入HAuCl4水溶液，等20～30min后反应完成；
1.3)重复步骤1.2)两次后，获得反应溶液；
1.4)在反应溶液中加入超纯水和柠檬酸钠，将此溶液再作为种子溶液回到步骤1.2)代替种子溶液进行反应；
1.4)重复上述步骤1.2)～1.4)数次以获得不同大小的纳米金颗粒(GNPs)；
2)拉曼标记免疫探针的制备
2.1)将纳米金颗粒，用碳酸钾调整pH至9.0后，逐滴加入含有抗SARS-Cov-2-N蛋白的单克隆抗体的碳酸盐缓冲溶液，搅拌后置于4℃冰箱静置；
2.2)再加入拉曼标记物MBA，搅拌后置于4℃冰箱静置；
2.3)再加入质量分数为1％的BSA溶液，搅拌后置于冰箱中，再在4℃低温离心后收集底部沉积物，最后将底部沉积物和等体积的PB缓冲液混合均匀后获得拉曼免疫探针的溶液。
二、应用于特种检测口罩的呼吸道病毒采集和检测方法：
需要进行呼吸道病毒采集和检测时，佩戴者带上所述口罩，在一段时间佩戴后，将喷有拉曼免疫探针的区域或者附件通过可开口位置取出，使用激光拉曼光谱仪检测，若激光拉曼光谱仪检测到的峰值与未结合病毒的拉曼探针底峰的峰值之间相差超多预设阈值，且与结合核衣壳蛋白标准品的拉曼探针的峰图谱中峰形一致，则佩戴者为呼吸道病毒感染。
所述的一段时间是指2-8h。
所述的呼吸道病毒为新型冠状病毒。具体实施中，所述的呼吸道病毒为SARS-Cov-2或者COVID-19。
本发明用于呼吸道病毒病原样本的采集和检测的口罩在口罩内侧朝向佩戴者面部的一侧设有用于吸附佩戴者口鼻中呼出的病原体的附件，附件与口罩本体为可拆卸的设置。该附件为一种在表面附着有拉曼免疫探针的熔喷布或硝酸纤维素膜，该探针为吸附有针对呼吸道病毒的抗体和拉曼标记物的纳米金颗粒，拉曼免疫探针是由特别制备方法获得。
在佩戴者使用后，可取出该附件，使用拉曼光谱便携装置快速检测。这样本发明不仅可替代常用的咽拭子等呼吸道标志物取样检测，减轻医护工作者的取样和检测压力，同时也便于对康复患者的监测。
本发明的有益效果是：在新冠病毒较强的传染性及无症状感染者存在的情况下，使得样本采集及疫情的监控变得困难。在此基础上，本发明以防护用的口罩为基础，加入具有高灵敏度的拉曼免疫探针；由于口罩佩戴的长期性和新型冠状病毒以咽鼻拭子的呼吸道样本为主要检测样本的特性；本发明能很好的解决呼吸道样本收集的问题，并对该样本实行立即检测，免除了后续通过常规的RT-PCR检测的繁琐步骤，同时，采样的便捷减轻了医护人员的工作压力，也减小了医护人员的本感染的风险。
附图说明
图1为本发明拉曼免疫探针的制备流程图；
图2为本发明特种检测口罩的结构示意图；
图3为本发明特种检测口罩的检测流程示意图。
图中：口罩本体1、左耳带2、右耳带3，拉曼免疫探针区域4，可开口位置5。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施对本发明作进一步说明。
实施例1
1)纳米金颗粒的制备
取2.2mM 150mL的柠檬酸钠于250mL的三口烧瓶中加热。沸腾后，加入1mL 25mM的HAuCl4，10min内溶液的颜色变为粉红色。此溶液作为种子液，在同一个反应容器内，待溶液的温度降到为90℃后加入1mL 25mM的HAuCl4。水溶液20.30min后反应完成。此过程重复2次。此后，取出55mL反应溶液加入53mL超纯水和2mL 60mM柠檬酸钠。此溶液再作为种子溶液进行上述反应，重复数次以获得不同大小的纳米金颗粒(GNPs)。
2)拉曼标记免疫探针的制备
取10mL上述制备的纳米金颗粒，用0.1M的碳酸钾调整pH至9.0后，逐滴加入500μL含有适量的抗SARS-Cov-2-N蛋白的单克隆抗体的碳酸盐缓冲溶液，保持搅拌15min后置于4℃冰箱静置1h，再加入适量的1mM拉曼标记物MBA，搅拌15min后置于4℃冰箱静置1h，再加入1mL质量分数1％BSA搅拌15min后置于冰箱中1h，4℃低温5,000r/min离心10min后收集底部沉积物约800μL和等体积的0.01M PB缓冲液混合均匀后置于4℃冰箱保存待用获得拉曼免疫探针的溶液。拉曼免疫探针如图1所示。
3)基于拉曼免疫探针的口罩的组装
口罩如图所2所示，包括口罩本体1、左耳带2和右耳带3，口罩本体1的两侧外层为纺粘无纺布，内层熔喷布层，熔喷布层设置拉曼免疫探针区域4，拉曼免疫探针区域4喷上步骤2)获得的拉曼免疫探针的溶液。
具体实施中内层纺粘无纺布设计布置可开口位置5，可开口位置为四周粘扣带设计，使用完口罩后，可打开粘扣带，取出熔喷布层上的拉曼免疫探针区域4，用于后续拉曼光谱的检测。
4)基于拉曼免疫探针的口罩的检测
当佩戴者出现发热等症状时，怀疑新型冠状病毒感染，佩戴者自行带上该口罩，在一段时间佩戴后，将该口罩交由医护人员。医护人员将该拉曼免疫探针区域通过可开口装置取出，以便携式RamTracer 200H S A 35150系列高灵敏度激光拉曼光谱仪检测，该佩戴者是为新型冠状病毒感染。
实施例2新型冠状病毒拉曼光谱标准品、空白及样本的检测
取新型冠状病毒的核衣壳蛋白标准品滴于已经制备好的干态的金纳米颗粒(拉曼免疫探针)的无纺布上，等待其自然干燥。把上述结合核衣壳蛋白的拉曼探针用于拉曼光谱检测，得到一个标准品的谱图。
将制备好的干态的金纳米颗粒(拉曼免疫探针)的无纺布上，将该只有拉曼探针的金纳米颗粒用于拉曼光谱检测，得到空白的基底谱图。
取新型冠状病毒疑似感染者佩戴2-8h后的口罩，取出其中的拉曼光谱免疫探针的附件，用于拉曼光谱的检测。将该检测峰的谱图与空白的基底谱图及标准品的谱图进行比较，如该检测峰的谱图与空白有明显的却别，且与标准品的检测峰的谱图相似，则认为该病人为新冠病毒阳性感染；该检测峰的谱图与空白有明显的却别，且与标准品的检测峰的谱图不相似，则认为非新冠病毒感染；该检测峰的谱图与空白基底谱图一致，则认为是新冠病毒阴性。
本发明公开了一种基于拉曼光谱的特种检测口罩，可用于呼吸道病毒样本的采集和检测的口罩，包括口罩本体、测试条、耳带。在口罩本体的内罩面上(即贴附口鼻一侧)增加了检测区域，检测区域为标记抗呼吸道病毒的单克隆抗体或多克隆抗体，具有收集和保存呼吸道和咽部产生的病毒的功能，检测区域可以从口罩上取下，用于拉曼光谱的检测，
本发明不仅解决了传统从呼吸道取样方式(如咽拭子或鼻拭子等方式)的困难，同时还可以随时监测呼吸道排出物中是否含有呼吸道病毒，以此判断是否具有传染性及病情发展程度，可依据结果进行有效的诊断和治疗，本发明在保留原有尘埃和病原体防护的同时增加了新型冠状病毒的检验功能，拓展了传统口罩的使用功能。
应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩，其特征是：在口罩内侧的熔喷布层附有一个喷有拉曼免疫探针的区域或者附件，该区域或者附件位于正对应口鼻的位置；所述的拉曼免疫探针吸附有拉曼标志物和针对呼吸道病毒的单克隆抗体或多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩，其特征是：所述的喷有拉曼免疫探针的附件通过粘性物质固定于口罩内侧的熔喷布层表面，为方形或圆形。
3.根据权利要求2或3所述的一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩，其特征是：所述口罩的内侧设有可开口位置，喷有拉曼免疫探针的附件通过无纺布结合粘扣带可拆卸地装在可开口位置。
4.根据权利要求1所述的一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩，其特征是：所述的喷有拉曼免疫探针的区域在熔喷布层本身上。
5.根据权利要求1所述的一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩，其特征是：所述口罩本体包括沿着朝向佩戴者面部一侧依次设置的第一层无纺布层、熔喷布层和第二层无纺布层，所述拉曼免疫探针的区域或者附件设置在熔喷布层朝向佩戴者面部的一侧表面。
6.根据权利要求1所述的一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩，其特征是：所述口罩的拉曼免疫探针，是由拉曼免疫探针的溶液直接喷在口罩中间的熔喷布层或者附件上。
7.根据权利要求1所述的一种拉曼光谱的呼吸道病毒采集和检测的特种检测口罩，其特征是：所述的拉曼免疫探针采用以下方法制备获得：
1)纳米金颗粒的制备
1.1)将柠檬酸钠加热沸腾后，加入HAuCl4，溶液的颜色变为粉红色，获得种子溶液；
1.2)然后将种子溶液的温度降到为90℃后再加入HAuCl4水溶液，等20～30min后反应完成；
1.3)重复步骤1.2)两次后，获得反应溶液；
1.4)在反应溶液中加入超纯水和柠檬酸钠，将此溶液再作为种子溶液回到步骤1.2)代替种子溶液进行反应；
1.4)重复上述步骤1.2)～1.4)数次以获得不同大小的纳米金颗粒；
2)拉曼标记免疫探针的制备
2.1)将纳米金颗粒，用碳酸钾调整pH至9.0后，逐滴加入含有抗SARS-Cov-2-N蛋白的单克隆抗体的碳酸盐缓冲溶液，搅拌后置于4℃冰箱静置；
2.2)再加入拉曼标记物MBA，搅拌后置于4℃冰箱静置；
2.3)再加入质量分数为1％的BSA溶液，搅拌后置于冰箱中，再在4℃低温离心后收集底部沉积物，最后将底部沉积物和等体积的PB缓冲液混合均匀后获得拉曼免疫探针的溶液。
8.应用于权利要求1-7任一所述特种检测口罩的呼吸道病毒采集和检测方法，其特征是：需要进行呼吸道病毒采集和检测时，佩戴者带上所述口罩，在一段时间佩戴后，将喷有拉曼免疫探针的区域或者附件取出，使用激光拉曼光谱仪检测，若激光拉曼光谱仪检测到的峰值与未结合病毒的拉曼探针底峰的峰值之间相差超多预设阈值，且与结合核衣壳蛋白标准品的拉曼探针的峰图谱中峰形一致，则佩戴者为呼吸道病毒感染。
9.根据权利要求8所述的呼吸道病毒采集和检测方法，其特征是：
所述的一段时间是指2-8h。
10.根据权利要求8所述的呼吸道病毒采集和检测方法，其特征是：
所述的呼吸道病毒为新型冠状病毒。
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