CN105954210A - 一种以压敏涂料为信号读出的便携检测atp含量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法。将能构成ATP适配体的两段DNA分别修饰上嵌有纳米铂颗粒的二氧化硅球和磁珠。在ATP存在的情况下，由于这两段DNA与ATP的特异性识别并结合，能够形成三明治夹心结构，从而将纳米铂固定在磁珠上，通过分离磁珠与溶液，并将清洗过的磁珠在密闭容器中与过氧化氢溶液反应，过氧化氢催化所产生的氧气积累能够提高氧分压，利用不同氧分压对压敏涂料的荧光猝灭程度不同，间接检测ATP的浓度。该技术成功地应用于人体血清中ATP浓度检测。这种检测使用荧光分光光度计做为检测手段，也可直接用裸眼进行比色检测，具有检测成本低、操作简单、定量结果准确，能即时检测，便携等优点。

Description

一种以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法
技术领域
本发明涉及一种以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，属于分析化学领域。
技术背景
便携式即时检测器由于具有仪器小型、检测成本低、操作简单、定量结果准确、能即时检测等特点，现已引起了广泛的关注，并得以相应的发展应用。相比于传统的分析检测手段，便携式即时检测器在一定程度上摆脱检测分析过程中在时间、空间、设备成本和操作技能上的制约，能够完成低成本、及时、简单、准确的分析检测，是一种对实验检测条件及操作者没有太高要求的分析技术。常见的便携式即时检测器有温度计，湿度计，压力计，红外线二氧化碳测定仪以及可燃性气体检测仪等手持式即时检测器，这些仪器一般都只对应某一种检测对象，如：温度，湿度，二氧化碳，和可燃性气体，目标单一。如果能将便携式即时检测器和传生物传感技术相结合，则能拓展便携即时检测器的应用范围，同时大大地降低分析检测成本。在总多的便携式检测器中，最成功的例子之一就是血糖仪，这种血糖检测器体积小、方便携带、检测成本低、定量结果准确、操作简便，病人自己根据说明书就可以随时随地地进行血糖的检测。为弥补其仅能用于还原性糖类（如血糖）的检测的缺点，LU课题组将其与生物传感技术结合，使其能够用于检测乙型肝炎病毒（Yu Xiang ；Yi Lu，UsingCommercially Available Personal Glucose Meters forPortable Quantification ofDNA.Analytical Chemistry[J]，2012，84(4): 1975–1980）、铅离子和铀离子（Yu Xiang ；Yi Lu，An invasive DNA approach toward a general method for portablequantification of metal ions using a personal glucose meter[J].ChemicalCommuni -cations，2013, 49, 585-587）。杨则通过过氧化氢在自制的条状管道中分解引起气体膨胀来对可卡因进行定量测定（Zhi Z hu, Zhichao Guan, ShashaJia，Au@PtNanoparticle Encapsulated Target-Responsive Hydrogel with Volumetric Bar-Chart Chip Readout for Quantitative Point-of-CareTesting[J]. Angewandte -Chemie，2014, 53, 12503 –12507）。
压敏涂料，一种起源于上世纪80年代的测压技术，通常用于飞行器风洞试验当中。由于是通过非接触式测量，能真实测地反映检测对象的表面压力分布，且具有空间高分辨率以及节约时间和低廉的经济成本等优势，现已得到广泛的应用。压敏涂料的工作原理是基于易被氧猝灭的荧光剂在不同气压环境中，氧分压的不同导致了荧光剂被猝灭的程度不同，通过检查荧光强度即可得到相应的压力。
三磷酸腺苷（ATP）是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源和主要来源，它能够储存和传递化学能，参与合成蛋白质、脂肪、糖和核苷酸，而且能够促使机体各种细胞的修复和再生，增强细胞代谢活性，对治疗各种疾病均有较强的针对性。因此，定量检测ATP的含量对于科学研究和临床诊断具有重要的实际意义。目前检测ATP的传感器有比色传感器（Jose D. A., Mishra S., Ghosh A., et al. Org. Lett., 2007, 9:1979-1982.），电化学适配体传感器（Du Y., Li B. Y., Wei H., et al. Anal.Chem., 2008,80:5110-5117.; Zuo X. L., Xiao Y., Plaxco K. W.. J. Am. Chem. Soc., 2009,131:6944-6945.; Yao W., Wang L., H. Wang Y., et al.. Biosens. Bioelectron., 2009,24:3269-3274.; Liu X. Q., Shi L. H., Niu W. X., et al. Angew. Chem., Int.Ed., 2007, 46:421-424.; Lin Z. Y., Luo F., et al. Chem. Commun., 2011, 47,8064–8066.）等。但是这些传感器的一个普遍缺点是需要用到实验室里的仪器设备，这类仪器设备操作复杂，而且不方便携带，无法实现现场检测。
发明内容
本发明目的在于开发了一种以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，使ATP的检测能够在低成本的条件下简单快捷准确的完成。该方法的的灵敏度高、特异性好，检测成本低。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种便携式检测ATP含量的方法包括以下步骤：
(1)将200 μL、0.05 mg/mL压敏涂料涂于2毫升的离心管内壁，并将该离心管作为信号读出工具；
(2)制备以硅球为纳米铂颗粒载体的催化剂：以正硅酸乙酯为硅源合成二氧化硅球，再用原位生长法在其表面嵌入纳米铂颗粒使其具有一定的催化性能；最后再修饰上氨基基团以便于该材料的后续使用；
(3)以Sulfo-SMCC为交联剂，将步骤（2）催化剂即嵌有纳米铂的二氧化硅球修饰到DNA链上；
(4)将修饰有链霉亲合素的磁珠分散于PBS缓冲溶液中，加入100 μL修饰有生物素的DNA，室温振荡30分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物；
(5)将步骤（3）修饰有嵌有纳米铂的二氧化硅球的DNA化合物与步骤（4）修饰在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待测样品，室温培育1.5小时，形成磁珠—ATP—催化剂三明治结构型物质；
(6)用磁铁分离步骤（5）中的磁珠—ATP—催化剂与其他物质，用磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠三次后，加入10 μL磷酸盐缓冲溶液，重新分散，得到与目标位浓度成相关关系的磁珠—ATP—催化剂混合液；
(7)将上述所得全部液体加入到含有300 μL浓度为2.0 mol/L的过氧化氢的离心管中，并将该离心管置于（1）中的内壁涂有压敏涂料的离心管中进行检测；检测方法用目视法直接比色，或用荧光分光光度计进行准确检测；
(8)以已知浓度的ATP溶液为横坐标，以相对应的荧光强度作为纵坐标，绘制曲线，得到ATP浓度—荧光强度线性方程: ΔIG=A+BlgC，然后根据线性方程和待测样品的荧光值计算相对应的待测样品中的目标位浓度, 其中ΔIG为反应前后荧光强度变化值；C为其所对应的ATP浓度，单位为nmol/L。
具体步骤为：
（1）将压敏涂料(200 μL，0.05 mg/mL)涂于2毫升的离心管内壁，并将该离心管作为信号读出工具。
（2）按照参考文献（Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Elsevier:London, 2008，B. G. T. Cheng-Yu Lai, Dusan M. Jeftinija, Ksenija Jeftinija,Shu Xu, and a. V. S.-Y. L. Srdija Jeftinija, J. Am. Chem. Soc, 2002, 125,4451和R. M. R. Hyunjoon Song, James D. Hoefelmeyer, Russell Komor, and M. G.Krisztian Niesz, Peidong Yang, and Gabor A. Somorjai, J. Am. Chem. Soc, 2005,128, 3027.）制备嵌有纳米铂颗粒的二氧化硅球，并将其修饰与DNA链上，具体步骤如下：
①、先将0.25 g的CTAB溶于120 mL的去离子水中，同时加入1 mL的NaOH溶液（2.00mol/L），加热至353 K，加入TEOS 2.5 mL 和MPTMs 245μL，搅拌2小时，即得到二氧化硅球；
②、将0.5 g的上述二氧化硅球与26.6 mg的PVP和124.3 μg的氯金酸同时加入到400mL体积分数为90 %的甲醇溶液中回流3 h，即得到嵌有纳米铂颗粒的二氧化硅球；
（3）以Sulfo-SMCC为交联剂，将上述嵌有纳米铂颗粒的二氧化硅球修饰于DNA链上制备修饰有催化剂的DNA化合物。
（4）取浓度为1 mg/mL修饰有链霉亲合素的磁珠0.6 mL用PBS缓冲溶液洗涤并重新分散于0.6 mL PBS缓冲液，加入100 μL修饰有生物素的DNA，室温振荡30分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物。
（5）将步骤（3）上修饰有嵌有纳米铂的二氧化硅球的DNA化合物与步骤（4）修饰在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待测样品，室温培育1.5小时。
（6）用磁铁分离步骤（5）中的磁珠与混合溶液，用磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠三次后，加入10 μL磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L pH=7.3）。
（7）将步骤（6）所得液体加入到含有300 μL浓度为2.0 mol/L的过氧化氢的离心管（500 μL）中，并将该离心管置于（1）中的内壁涂有压敏涂料的离心管中进行检测。检测方法用目视法直接比色，或用荧光分光光度计进行准确检测。
（8）以已知浓度的ATP溶液为横坐标，以相对应的荧光强度作为纵坐标，绘制曲线，得到ATP浓度—荧光强度线性方程: ΔIG=A+BlgC，然后根据线性方程和待测样品的荧光值可以计算相对应的待测样品中的目标位浓度, 其中ΔIG为反应前后荧光响应强度；C为其所对应的ATP浓度，单位为nmol/L。
步骤（3）中所述的修饰有转化酶的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：HS-(CH2)6-ACCTGGGGGAGTAT。
步骤（4）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：TGCGGAGGAAGGT-生物素。
步骤（5）中所述的修饰有催化剂的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物的摩尔比为1:1。
步骤（5）中所述的含ATP的待测样品的加入量为3 μL。
一种以压敏涂料为信号读出工具检测ATP技术包括：
所用的压敏涂料为PtTFPP，是一种中心配位离子为铂的卟啉衍生物，激发波长为415纳米，吸收波长为645纳米。
本发明的显著优点在于：
（1）制备过程简单，无需先进的检测仪器。
（2）信号读出工具能够多次重复利用，大大减低了检测成本。
（3）该方法定量结果准确、信号即可通过荧光检测器获得，也可直接通过裸眼目视对比。
附图说明
图1为利用本发明中的信号读出工具检测不同浓度的ATP荧光响应值及相关相片。
具体实施方式
一种便携式检测ATP含量的方法包括以下步骤：
(1)将200 μL、0.05 mg/mL压敏涂料涂于2毫升的离心管内壁，并将该离心管作为信号读出工具；
(2)制备以硅球为纳米铂颗粒载体的催化剂：以正硅酸乙酯为硅源合成二氧化硅球，再用原位生长法在其表面嵌入纳米铂颗粒使其具有一定的催化性能；最后再修饰上氨基基团以便于该材料的后续使用；
(3)以Sulfo-SMCC为交联剂，将步骤（2）催化剂即嵌有纳米铂的二氧化硅球修饰到DNA链上；
(4)将修饰有链霉亲合素的磁珠分散于PBS缓冲溶液中，加入100 μL修饰有生物素的DNA，室温振荡30分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物；
(5)将步骤（3）修饰有嵌有纳米铂的二氧化硅球的DNA化合物与步骤（4）修饰在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待测样品，室温培育1.5小时，形成磁珠—ATP—催化剂三明治结构型物质；
(6)用磁铁分离步骤（5）中的磁珠—ATP—催化剂与其他物质，用磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠三次后，加入10 μL磷酸盐缓冲溶液，重新分散，得到与目标位浓度成相关关系的磁珠—ATP—催化剂混合液；
(7)将上述所得全部液体加入到含有300 μL浓度为2.0 mol/L的过氧化氢的离心管中，并将该离心管置于（1）中的内壁涂有压敏涂料的离心管中进行检测；检测方法用目视法直接比色，或用荧光分光光度计进行准确检测；
(8)以已知浓度的ATP溶液为横坐标，以相对应的荧光强度作为纵坐标，绘制曲线，得到ATP浓度—荧光强度线性方程: ΔIG=A+BlgC，然后根据线性方程和待测样品的荧光值计算相对应的待测样品中的目标位浓度, 其中ΔIG为反应前后荧光强度变化值；C为其所对应的ATP浓度，单位为nmol/L。
步骤（3）中所述的修饰有转化酶的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：HS-(CH2)6-ACCTGGGGGAGTAT。
步骤（4）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：TGCGGAGGAAGGT-生物素。
步骤（5）中所述的修饰有催化剂的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物的摩尔比为1:1。
步骤（5）中所述的含ATP的待测样品的加入量为3 μL。
实施例1
以下实施例结合附图来说明应用本发明所述方法应用于人血清样品中ATP浓度的检测的操作过程：
1、将0.2 mL浓度为0.05 mg/mL 的PtTFPP甲苯溶液涂于2 mL的PE离心管内壁，烘干即可得到信号读出工具。
2、修饰有二氧化硅球的DNA化合物的合成。参考文献（Hermanson, G. T.Bioconjugate Techniques; Elsevier: London, 2008）。具体步骤如下：
A、将30 μmol/L修饰有巯基的DNA与60 μmol/L TCEP于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀，室温培育1小时；
B、将1.00 mg嵌有纳米铂的二氧化硅球与0.5 mg Sulfo-SMCC于缓冲溶液（0.01 mol/LPBS，PH=7.3，0.1 mol/L NaCl）中混合5 min，室温下置于摇床上振动1小时，再将混合物离心分离，弃去清液，保留沉淀物；
C、将A与B制备的物质混合，室温下反应48小时。
3、修饰有催化剂的磁珠的制备与ATP的检测，具体步骤如下：
（1）将修饰有链霉亲和素的磁珠（0.6 mL，1 mg/mL）溶于由0.1 mol/L NaCl、0.01 mol/L pH=7.3的PBS、0.05% 吐温-20组成的缓冲溶液中，加入100 μL浓度为100 μM修的饰有生物素的DNA，室温振荡30分钟。
（2）将步骤2中制备的20 μM修饰有二氧化硅球的DNA化合物与步骤3（1）中20 μM修饰在磁珠上的DNA化合物以摩尔比1：1混合均匀，加入含ATP的待测样品（ATP浓度从低到高分别为1×10-14、3.16×10-14、1×10-13、3.16×10-13、1×10-12和3.16×10-12 mol/L），室温培育1.5小时，发生适配体和ATP的特异性结合反应，生成三明治夹心结构物质。
（3）用磁铁分离步骤（2）中的磁珠与混合溶液，用由0.1 M NaCl、0.01 M PH=7.3的PBS、0.05% 吐温-20组成的缓冲溶液洗涤磁珠三次并向磁珠中加入该缓冲溶液，然后将该溶液与过氧化氢溶液同时加入到离心管（500 μL）中，并将该离心管置于步骤1中的内壁涂有压敏涂料的离心管中反应15分钟后进行检测。
（4）可以用荧光分光光度计进行准确测量，记录读数，并拟合相关线性方程。如图1所示，随着ATP浓度升高，相对应的荧光值下降，裸眼也可看出其亮度逐渐减弱。
实施例2
1、人血清中ATP浓度的检测，具体步骤如下：
向修饰有二氧化硅球的DNA化合物与饰在磁珠上的DNA化合物的混合物中加入人血清，室温培育1.5个小时后，用磁铁分离混合物，然后用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，并加入10 μL该缓冲液。最后将该混合液与300 μL浓度为2.0 mol/L的过氧化氢溶液同时加入到离心管（500 μL）中，并将该离心管置于步骤1中的内壁涂有压敏涂料的离心管中反应15分钟，最后将涂有压敏涂料的离心管置于荧光分光光度计中进行检测。记录数据，算出该人血清样品中ATP的含量。
2、本发明所述方法对ATP检测的特异性，具体步骤如下：为检测本发明所述方法的特异性，将实施例1，步骤3中所使用的ATP换成其他干扰物质，分别为CTP、UTP、GTP和ATP，且浓度均为1×10-10 mol/L。结果表明，本发明所述方法对ATP具有较好的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实例，凡本发明专利范围所做的变化、相关催化剂的使用以及压敏涂料在生物传感中的相关应用皆属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acctggggga gtat 14
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcggaggaa ggt 13

Claims (7)

1.一种以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将200 μL、0.05 mg/mL压敏涂料涂于2毫升的离心管内壁，并将该离心管作为信号读出工具；
(2)制备以硅球为纳米铂颗粒载体的催化剂：以正硅酸乙酯为硅源合成二氧化硅球，再用原位生长法在其表面嵌入纳米铂颗粒使其具有催化性能；最后再修饰上氨基基团以便于该材料的后续使用；
(3)以Sulfo-SMCC为交联剂，将1 mL浓度为0.10 mg/mL的催化剂，即步骤（2）中所制备的嵌有纳米铂的二氧化硅球修饰到100 μL、100 μM DNA链上；
(4)将修饰有链霉亲合素的磁珠分散于PBS缓冲溶液中，加入100 μL 浓度为100 μM修饰有生物素的DNA，室温振荡30分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物；
(5)将步骤（3）修饰有嵌有纳米铂的二氧化硅球的DNA化合物与步骤（4）修饰在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待测样品，室温培育1.5小时，形成磁珠—ATP—催化剂三明治结构型物质；
(6)用磁铁分离步骤（5）中的磁珠—ATP—催化剂与其他物质，用磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠三次后，加入10 μL磷酸盐缓冲溶液，重新分散，得到与目标位浓度成相关关系的磁珠—ATP—催化剂混合液；
(7)将上述所得全部液体加入到含有300 μL浓度为2.0 mol/L的过氧化氢的离心管中，并将该离心管置于（1）中的内壁涂有压敏涂料的离心管中进行检测；检测方法用目视法直接比色，或用荧光分光光度计进行准确检测；
(8)以已知浓度的ATP溶液为横坐标，以相对应的荧光强度作为纵坐标，绘制曲线，得到ATP浓度—荧光强度线性方程: ΔIG=A+BlgC，然后根据线性方程和待测样品的荧光值计算相对应的待测样品中的目标位浓度, 其中ΔIG为反应前后荧光强度变化值；C为其所对应的ATP浓度，单位为nmol/L。
2.根据权利要求1所述的以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于步骤（1）中所用的压敏涂料为具有强荧光性且易被氧气猝灭的PtTFPP，是一种中心配位离子为铂的卟啉衍生物，激发波长为415纳米，吸收波长为645纳米。
3.根据权利要求1所述的以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于：步骤（3）中所述的修饰有催化剂的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：HS-(CH2)6-ACCTGGGGGAGTAT。
4.根据权利要求1所述的以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于：步骤（4）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：TGCGGAGGAAGGT-生物素。
5.根据权利要求1所述的以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于：步骤（5）中所述的修饰有催化剂的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物的摩尔比为1:1；步骤（5）中所述的含ATP的待测样品的加入量为3 μL。
6.根据权利要求1所述的以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于：步骤（7）中每次只需更换反应器：500 μL的离心管。
7.根据权利要求1所述的以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于：步骤（8）中，在实验室检测时，用荧光分光光度计进行准则检测，在没有荧光仪的条件下直接进行目视比色检测。
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