CN111500686A - 以磁性材料与核酸外切酶iii构建的癌胚抗原电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，该电化学传感器由磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs‑S1‑S2‑S3在核酸外切酶III辅助下构建得到的；其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列。本发明电化学传感器检测癌胚抗原无需进行电极修饰，能够快速、准确的检测癌胚抗原，对癌胚抗原具有较高的选择性，解决了现有的电化学检测方法需进行复杂的电极修饰、过程繁琐、成本高和电极再生困难的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，更具体地，涉及一种以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器及其用于检测癌胚抗原的方法。
背景技术
癌胚抗原是一种具有人类胚胎抗原特征的酸性糖蛋白，已被确定为一种广谱肿瘤标志物用以指示多种肿瘤的存在和进展，如结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等。癌胚抗原浓度的增加甚至发生在疾病的临床和放射学症状出现之前，因此，对癌胚抗原的灵敏检测对于癌症的早期临床诊断和预后评估具有重要意义。由于癌胚抗原本身不产生检测信号，对其进行定量检测需要进行信号转换。至今，已被用于检测癌胚抗原的方法有：电化学发光免疫法、化学发光法、表面增强拉曼散射法、比色法、荧光法等等，但是这些检测方法均存在灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。
近年来，癌胚抗原电化学检测方法具有操作简单、检测速度快、成本低、可构建便携设备等优点，因此受到越来越多的关注。但是，目前现有的电化学检测方法检测癌胚抗原存在下述缺点：(1)需要先将电极表面进行复杂的材料修饰，才能够实现对目标物的特异性、灵敏性检测，过程较为复杂，耗时，且成本高；(2)表面修饰过的电极其表面积有限，并且电极的再生过程更加复杂耗时。
发明内容
本发明的目的是提供一种以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器及其用于检测癌胚抗原的方法，本发明电化学传感器检测癌胚抗原无需进行电极修饰，能够快速、准确的检测癌胚抗原，对癌胚抗原具有较高的选择性，解决了现有的电化学检测方法需进行复杂的电极修饰、过程繁琐、成本高和电极再生困难的技术问题。
本发明提供一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，该电化学传感器由磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3在核酸外切酶III辅助下构建得到的；其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列。
所述磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3的构建方法为：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3。
该生物传感器的构建方法为：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3；
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；
c)电化学生物传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将每个含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器。
磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，包括如下步骤：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子(表示为Fe3O4@Au NPs)上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3；
其中，S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上的方法为：将修饰有巯基的S1链与Fe3O4@Au纳米粒子在PBS(pH 7.4)缓冲液中室温孵育120min。
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；
c)电化学生物传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将每个含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器；G-四链体是由S1在钾离子存在的情况下形成的，血红素可插入其中；
d)未知浓度样品的检测：将未知浓度的癌胚抗原样品加入磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中，按上述步骤b)-c)的方法检测，测得未知浓度的癌胚抗原样品的DPV信号，并根据上述标准曲线得到癌胚抗原样品的浓度。
其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列，当S1,S2和S3互补结合时，核酸外切酶III从S1和S3的3’端开始切割双链。
所述的S1中富G序列为23个碱基，与癌胚抗原适配体S2的互补配对序列为15个碱基。
更优选地，S1具有SEQ ID NO：1所示序列，并且S1序列上修饰有SH-C6，S2具有SEQID NO：2所示序列，S3具有SEQ ID NO：3所示序列，如表1所示。
表1
步骤a)中，所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4制备得到，所述Fe3O4纳米粒子与HAuCl4质量比为1:3～1:7。
步骤a)中，所述将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上时，S1在反应体系中的终浓度为0.1-1.0μM，Fe3O4@Au纳米粒子在反应体系中的终浓度为0.2-0.8g L-1；所述修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育时，S1、S2和S3的浓度比为1:1:1；所述共孵育的孵育时间为30-150min，孵育温度为35-40℃。
步骤b)中，所述癌胚抗原的浓度范围为0.1-200ng mL-1。优选的，多个癌胚抗原的浓度依次为0，0.1ng mL-1，10ng mL-1，20ng mL-1，60ng mL-1，100ng mL-1，130ng mL-1，170ngmL-1，200ng mL-1。加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育的孵育条件为:孵育时间为30-90min，孵育温度为20-30℃。
步骤b)中，所述加入的核酸外切酶III的终浓度为20-200U mL-1；再孵育时的孵育温度为35-40℃，孵育时间为40-50min。
步骤c)中，加入血红素至血红素的终浓度为5-25μM，加入钾离子至钾离子的终浓度为0-100mM；孵育反应的条件为在室温下孵育15-90min；所述测定G-四链体/血红素复合物的DPV信号时电压为-0.7～-0.3V。
步骤a)中，所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4制备得到，所述Fe3O4纳米粒子与HAuCl4质量比为1:3～1:7。所述Fe3O4@Au纳米粒子的制备方法具体为：(1)先采用溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子，取4.7215g FeCl3·6H2O，80mL水于250mL三颈瓶中，超声溶解，800rmp min-1搅拌，待温度达到80℃时，加入1.7256g FeCl2·4H2O，通N2除氧，逐滴加入氨水10mL，续反应30min后，停止加热，冷却水洗至中性，分散于无水乙醇中；(2)取上述100mg Fe3O4纳米粒子，加入2mL of 10％(v/v)APTES无水乙醇溶液搅拌12h，得到APTES修饰的Fe3O4纳米粒子(Fe3O4NPs-NH2)，磁性分离，用乙醇清洗，并分散在无水乙醇中。随后，取0.8mg制备好的Fe3O4 NPs-NH2、0.24μL 1％的HAuCl4以及10mL的蒸馏水超声混合，然后逐滴加入0.5mL 25mmol L-1NaBH4直至颜色由棕黄色变成紫黑色，得到Fe3O4@Au纳米粒子。
本发明使用了核酸外切酶III，在癌胚抗原存在时，S2与之结合从dsDNA脱落，该DNA酶无法从S1的3’端开始切割。本发明中，Fe3O4@Au作为载体的同时便于磁性分离和电极的磁性诱导吸附，S2作为识别元件，S3的引入提高dsDNA的刚性，G-四链体/血红素复合物作为信号分子，通过其电化学信号的高低反映癌胚抗原的含量，实现对目标物的定量检测。
本发明方法的检测机理为：磁性Fe3O4@Au纳米粒子为载体固定S1，S1内含富G序列和癌胚抗原适配体互补序列，与癌胚抗原适配体S2以及S3互补杂交形成双链(Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3)，氯化血红素(Hemin)作为电化学信号分子能够在K+存在下对G-四链体具有明显的结构选择性，形成G-四链体/血红素复合物，并产生强的电流输出。如果加入目标物，癌胚抗原与S2特异性结合，S1-S2-S3的双链互补结构打开，S1的3’端暴露。此时核酸外切酶III的加入将不能对S1产生切割，同时S3由于其3’平末端而依旧被核酸外切酶III切割，Fe3O4@Au纳米粒子上仅剩下完整的S1链，加入K+和血红素与之共孵育。反应结束后，复合材料通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定G-四链体/血红素复合物的DPV信号，G-四链体/血红素电化学信号的高低与体系中癌胚抗原的浓度相关，实现电化学传感检测癌胚抗原，本发明磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的原理图如图1所示。
本发明中的磁性Fe3O4@Au纳米粒子是一种优秀的电化学催化和导电材料，不仅具有良好的磁性能，而且易于表面修饰，巯基修饰的DNA链可以通过金硫键稳定地固定在其表面；同时，磁性Fe3O4@Au纳米粒子的大比表面积极大地增加了被修饰物的载量。磁性Fe3O4@Au纳米粒子通过简单的磁分离也可以减少溶液中的干扰信号，而且还可以采用磁场诱导自组装的方法构建免修饰电极的电化学检测系统。
本发明中的核酸外切酶III作用于双链DNA，沿3'-羟基末端向5'端的方向逐渐催化单核苷酸的清除，核酸外切酶III的最优底物为3’平末端或3’凹末端，在单链DNA或者含有3’凸末端的双链DNA上没有切割功能。由于对底物序列要求不高，核酸外切酶III辅助信号放大策略更适合构建通用生物传感器平台。
本发明中的G-四链体是由富含鸟嘌呤的核酸序列组成的独特的高阶结构，通过Hoogsteen氢键和碱金属阳离子等一价阳离子形成稳定的鸟苷碱基平面排列。本发明中的氯化血红素对G-四链体具有明显的结构选择性，可形成G-四链体/血红素复合物，并产生强的电流输出。
本发明与现有技术相比，具有如下显著优点：
(1)本发明电化学传感器检测癌胚抗原无需进行电极修饰，能够快速、准确的检测癌胚抗原，对癌胚抗原具有较高的选择性，解决了现有的电化学检测方法需进行复杂的电极修饰、过程繁琐、成本高和电极再生困难的技术问题。
(2)本发明无需进行复杂的电极修饰，利用磁性诱导就能够将待测的复合纳米材料吸附到磁性玻碳电极表面进行检测，利用磁控诱导自组装在磁性玻碳电极表面形成磁控软膜，该过程可在几分钟内完成，简单快速，在扩大电极表面积，增加测定范围，同时在去除磁芯后可快速完成电极的再生；并且磁性分离可以很好地纯化检测体系，避免干扰信号的产生，使检测结果更加灵敏准确，测定过程简单方便。
(3)本发明不仅引入了核酸外切酶III，极大地提高了体系的灵敏度，而且引入癌胚抗原适配体，提高了体系的选择性，实现了癌胚抗原的高选择性高灵敏度检测。
附图说明
图1示出了本发明磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的原理图。
图2示出了本发明实施例1中含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号峰电流的标准曲线图；其中，曲线由下至上依次表示加入浓度为0，0.1ng mL-1，10ngmL-1，20ng mL-1，60ng mL-1，100ng mL-1，130ng mL-1，170ng mL-1，200ng mL-1癌胚抗原溶液时G-四链体/血红素复合物的DPV信号的标准曲线图。
图3示出了本发明测试例1中CEA、HAS、HB、L-cys和BSA的DPV信号测试结果对比图。
具体实施方式
下述实施例中核酸外切酶III购自于英杰贸易有限公司(上海)，血红素购自于国药集团化学试剂有限公司(上海)，氯化钾购自于国药集团化学试剂有限公司(上海)，磁性玻碳电极购自天津英科尔联合科技有限公司(天津)。
实施例1
一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，步骤为：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，S1在反应体系中的终浓度为0.1μM，Fe3O4@Au纳米粒子在反应体系中的终浓度为的终浓度为0.2g L-1，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与癌胚抗原适配体S2和富G序列的互补序列S3在37℃共孵育120min，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3；所述S1与S2、S3的浓度比为1:1:1；所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4按质量比1:6合成；
上述的将S1修饰到磁性Fe3O4@Au纳米粒子的方法为：将修饰有巯基的S1链与Fe3O4@Au NPs在PBS(pH 7.4)缓冲液中室温孵育120min。
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入1mL浓度为0.1ng mL-1，10ng mL-1，20ng mL-1，60ng mL-1，100ng mL-1，130ng mL-1，170ng mL-1，200ng mL-1的癌胚抗原在25℃孵育60min，孵育后再加入终浓度为20U mL-1的核酸外切酶III在37℃再孵育45min；
c)电化学生物传感器的构建：上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和氯化钾，血红素的终浓度为5μM，氯化钾中钾离子的终浓度为10mM，在室温下孵育15min后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将各含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，在-0.7～-0.3V电压下测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器。含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号峰电流的标准曲线图如图2所示；
d)未知浓度样品的检测：将血清样品1(血清样品1从东南大学附属中大医院获得)加入磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中，按上述步骤b)-c)的方法检测，测得未知浓度的癌胚抗原样品的DPV信号，并根据上述标准曲线得到癌胚抗原样品的浓度。
根据步骤c)构建的标准曲线计算血清样品1中癌胚抗原的浓度，计算公式为I(μA)＝0.0084C(μg L-1)+0.0101(R2＝0.9919)，检测结果为血清样品1中癌胚抗原的浓度为1.45ng mL-1，说明本发明方法可灵敏准确地检测血清样品中的癌胚抗原。
上述使用到的DNA序列：S1的序列为5’-SH-C6-CTA CTA GGG TTG GGC GGG ATGGGA AGC TGG TAT AAG CA-3’(SEQ ID NO：1)，S2的序列为5’-TGC TTA TAC CAG CTT ATTCAA TT-3’(SEQ ID NO：2)，S3的序列为5’-CCC ATC CCG CCC AAC CCT AGT AG-3’(SEQ IDNO：3)，DNA浓度均为100μM。
实施例2
一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，步骤为：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到磁性Fe3O4@Au纳米粒子上，S1在反应体系中的终浓度为1.0μM，Fe3O4@Au纳米粒子在反应体系中的终浓度为的终浓度为0.8g L-1，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与癌胚抗原适配体S2和富G序列的互补序列S3在37℃共孵育150min，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3；所述S1与S2、S3的浓度比为1:1:1；所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4按质量比1:3合成；
上述的将S1修饰到磁性Fe3O4@Au纳米粒子的方法为：将修饰有巯基的S1链与Fe3O4@Au NPs在PBS(pH 7.4)缓冲液中室温孵育120min。
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入1mL浓度为0.1ng mL-1，10ng mL-1，20ng mL-1，60ng mL-1，100ng mL-1，130ng mL-1，170ng mL-1，200ng mL-1癌胚抗原在20℃孵育30min，孵育后再加入终浓度为200U mL-1的核酸外切酶III在35℃再孵育50min；
c)电化学生物传感器的构建：上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和氯化钾，血红素的终浓度为25μM，氯化钾中钾离子的终浓度为100mM，在室温下孵育50min后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将各含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，在-0.7～-0.3V电压下测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器；
d)未知浓度样品的检测：将血清样品2(血清样品2从东南大学附属医院中大获得)加入磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中，按上述步骤b)-c)的方法检测，测得未知浓度的癌胚抗原样品的DPV信号，并根据上述标准曲线得到癌胚抗原样品的浓度。
根据步骤c)构建的标准曲线计算血清样品2中癌胚抗原的浓度，计算公式为I(μA)＝0.0084C(μg L-1)+0.0101(R2＝0.9919)，检测结果为血清样品1中癌胚抗原的浓度为2.03ng mL-1，说明本发明方法可灵敏准确地检测血清样品中的癌胚抗原。
上述使用到的DNA序列：S1的序列为5’-SH-C6-CTA CTA GGG TTG GGC GGG ATGGGA AGC TGG TAT AAG CA-3’(SEQ ID NO：1)，S2的序列为5’-TGC TTA TAC CAG CTT ATTCAA TT-3’(SEQ ID NO：2)，S3的序列为5’-CCC ATC CCG CCC AAC CCT AGT AG-3’(SEQ IDNO：3)，DNA浓度均为100μM。
实施例3
一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，步骤为：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到磁性Fe3O4@Au纳米粒子上，S1在反应体系中的终浓度为0.5μM，Fe3O4@Au纳米粒子在反应体系中的终浓度为的终浓度为0.5g L-1，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与癌胚抗原适配体S2和富G序列的互补序列S3在30℃共孵育30min，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3；所述S1与S2、S3的浓度比为1:1:1；所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4按质量比1:7合成；
上述的将S1修饰到磁性Fe3O4@Au纳米粒子的方法为：将修饰有巯基的S1链与Fe3O4@Au NPs在PBS(pH 7.4)缓冲液中室温孵育120min。
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入1mL浓度为0.1ng mL-1，10ng mL-1，20ng mL-1，60ng mL-1，100ng mL-1，130ng mL-1，170ng mL-1，200ng mL-1癌胚抗原在30℃孵育45min，孵育后再加入终浓度为120U mL-1的核酸外切酶III在40℃再孵育40min；
c)电化学生物传感器的构建：上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和氯化钾，血红素的终浓度为15μM，氯化钾中钾离子的终浓度为50mM，在室温下孵育90min后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将各含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，在-0.7～-0.3V电压下测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器；
d)未知浓度样品的检测：将血清样品3(血清样品3从东南大学附属中大医院获得)加入磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中，按上述步骤b)-c)的方法检测，测得未知浓度的癌胚抗原样品的DPV信号，并根据上述标准曲线得到癌胚抗原样品的浓度。
根据步骤c)构建的标准曲线计算血清样品3中癌胚抗原的浓度，计算公式为I(μA)＝0.0084C(μg L-1)+0.0101(R2＝0.9919)，检测结果为血清样品3中癌胚抗原的浓度为2.18ng mL-1，说明说明本发明方法可灵敏准确地检测血清样品中的癌胚抗原。
上述使用到的DNA序列：S1的序列为5’-SH-C6-CTA CTA GGG TTG GGC GGG ATGGGA AGC TGG TAT AAG CA-3’(SEQ ID NO：1)，S2的序列为5’-TGC TTA TAC CAG CTT ATTCAA TT-3’(SEQ ID NO：2)，S3的序列为5’-CCC ATC CCG CCC AAC CCT AGT AG-3’(SEQ IDNO：3)，DNA浓度均为100μM。
实施例4
一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，步骤为：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到磁性Fe3O4@Au纳米粒子上，S1在反应体系中的终浓度为0.8μM，Fe3O4@Au纳米粒子在反应体系中的终浓度为的终浓度为0.5g L-1，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与癌胚抗原适配体S2和富G序列的互补序列S3在37℃共孵育100min，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3；所述S1与S2、S3的浓度比为1:1:1；所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4按质量比1:4合成；
上述的将S1修饰到磁性Fe3O4@Au纳米粒子的方法为将修饰有巯基的S1链与Fe3O4@Au NPs在PBS(pH 7.4)缓冲液中室温孵育120min。
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入1mL浓度为0.1ng mL-1，10ng mL-1，20ng mL-1，60ng mL-1，100ng mL-1，130ng mL-1，170ng mL-1，200ng mL-1的癌胚抗原在28℃孵育90min，孵育后再加入终浓度为100U mL-1的核酸外切酶III在38℃再孵育45min；
c)电化学生物传感器的构建：上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和氯化钾，血红素的终浓度为20μM，氯化钾中钾离子的终浓度为25mM，在室温下孵育20min后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将各含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，在-0.7～-0.3V电压下测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器；
d)未知浓度样品的检测：将血清样品4(血清样品4为东南大学附属中大医院获得)加入磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中，按上述步骤b)-c)的方法检测，测得未知浓度的癌胚抗原样品的DPV信号，并根据上述标准曲线得到癌胚抗原样品的浓度。
根据步骤c)构建的标准曲线计算血清样品1中癌胚抗原的浓度，计算公式为I(μA)＝0.0084C(μg L-1)+0.0101(R2＝0.9919)，检测结果为血清样品4中癌胚抗原的浓度为0.04ng mL-1，说明说明本发明方法可灵敏准确地检测血清样品中的癌胚抗原。
上述使用到的DNA序列：S1的序列为5’-SH-C6-CTA CTA GGG TTG GGC GGG ATGGGA AGC TGG TAT AAG CA-3’(SEQ ID NO：1)，S2的序列为5’-TGC TTA TAC CAG CTT ATTCAA TT-3’(SEQ ID NO：2)，S3的序列为5’-CCC ATC CCG CCC AAC CCT AGT AG-3’(SEQ IDNO：3)，DNA浓度均为100μM。
实施例5
实施例1-实施例4中所述的磁性Fe3O4@Au纳米粒子是由质量比为1:3～1:7的Fe3O4纳米粒子与HAuCl4制备得到。磁性Fe3O4@Au纳米粒子的制备方法具体为：
(1)先采用溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子，取4.7215g FeCl3 .6H2O，80mL水于250mL三颈瓶中，超声溶解，800rmp min-1搅拌，待温度达到80℃时，加入1.7256g FeCl2 .4H2O，通N2除氧，逐滴加入氨水10mL，续反应30min后，停止加热，冷却水洗至中性，分散于无水乙醇中；
(2)取上述100mg Fe3O4纳米粒子，加入2mL of 10％(v/v)APTES无水乙醇溶液搅拌12h，得到APTES修饰的Fe3O4纳米粒子(Fe3O4 NPs-NH2)，磁性分离，用乙醇清洗，并分散在无水乙醇中。随后，取0.8mg制备好的Fe3O4 NPs-NH2、0.24μL 1％的HAuCl4以及10mL的蒸馏水超声混合，然后逐滴加入0.5mL 25mmol L-1NaBH4直至颜色由棕黄色变成紫黑色，得到Fe3O4@Au纳米粒子。
实施例6
采用本发明实施例1检测方法对血清样本中癌胚抗原进行加标回收检测，检测的具体步骤为：
取两份3mL血清样本(均从东南大学附属中大医院获得)，分别命名为血清1和血清2，通过实施例1的检测方法分别检测血清1和血清2中含有的癌胚抗原的浓度，检测得到血清1中含有的癌胚抗原的浓度为0.30ng mL-1，检测得到血清2中含有的癌胚抗原的浓度为1.50ng mL-1。
将血清1分为三份，每份1mL，将血清2分为三份，每份1mL，以血清中癌胚抗原含量为基准，在三份血清1中分别加入0.20ng mL-1、0.30ng mL-1和0.40ng mL-1的癌胚抗原标准品；在三份血清2中分别加入1.0ng mL-1、1.5ng mL-1和2.0ng mL-1的癌胚抗原标准品；将上述加入标准品后的三份血清1和三份血清2分别混合均匀，每份血清均作为未知浓度的癌胚抗原样品按照实施例1的检测方法进行检测。每份血清重复测定3次。
将三份血清1和三份血清2测试得到的DPV信号分别代入实施例1建立的标准曲线中，得到上述6份血清样本中的癌胚抗原浓度。每份血清重复测定3次取平均值，计算RSD及回收率，血清样本中癌胚抗原加样回收率结果如表2所示。
表2血清样本中癌胚抗原加样回收率(n＝3)
结果表明，本发明磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器具有较好的准确性，可用于实际样品中癌胚抗原的检测，利用本发明的电化学传感器检测癌胚抗原的检测结果较为准确。
测试例1高选择性测试
本发明磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法对于癌胚抗原的高选择性进行测试：分别采用本发明实施例1的检测方法对癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、l-半胱氨酸(L-cys)和血红蛋白(HB)进行检测，分别测定CEA 、HAS、HB、L-cys和BSA的DPV信号；其中，进行检测的HAS、HB、L-cys和BSA的浓度均为100μg L-1，CEA的浓度为10μg L-1，将5种物质的DPV信号测试结果进行对比，结果如图3所示，HAS、HB、L-cys和BSA的电流信号均无明显变化，癌胚抗原(CEA)表现出非常高的电流响应。因此，本发明磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法对于癌胚抗原具有较高的选择性。
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctactagggt tgggcgggat gggaagctgg tataagca 38
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcttatacc agcttattca att 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (10)
1.一种以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，其特征在于，该电化学传感器由磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3在核酸外切酶III辅助下构建得到的；其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列。
2.根据权利要求1所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，其特征在于，所述磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3的构建方法为：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3。
3.根据权利要求1所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，其特征在于，该电化学传感器的构建方法为：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3；
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；
c)电化学生物传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将各含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到癌胚抗原电化学传感器。
4.一种权利要求1或3所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3；
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；
c)电化学传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将每个含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到癌胚抗原电化学传感器；
d)未知浓度样品的检测：将未知浓度的癌胚抗原样品加入磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3中，按上述步骤b)-c)的方法检测，测得未知浓度的癌胚抗原样品的DPV信号，并根据上述标准曲线得到癌胚抗原样品的浓度。
其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列，当S1,S2和S3互补结合时，核酸外切酶III从S1和S3的3’端开始切割双链。
5.根据权利要求4所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，所述的S1中富G序列为23个碱基，与癌胚抗原适配体S2的互补配对序列为15个碱基。
6.根据权利要求4所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，步骤a)中，所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4制备得到，所述Fe3O4纳米粒子与HAuCl4质量比为1:3～1:7。
7.根据权利要求4所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，步骤a)中，所述将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上时，S1在反应体系中的终浓度为0.1-1.0μM，Fe3O4@Au纳米粒子在反应体系中的终浓度为0.2-0.8gL-1；所述修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育时，S1、S2和S3的浓度比为1:1:1；所述共孵育的孵育时间为30-150min，孵育温度为35-40℃。
8.根据权利要求4所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，步骤b)中，所述癌胚抗原的浓度范围为0.1-200ng mL-1，加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育的孵育条件为:孵育时间为30-90min，孵育温度为20-30℃。
9.根据权利要求4所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，步骤b)中，所述加入的核酸外切酶III的终浓度为20-200U mL-1；再孵育时的孵育温度为35-40℃，孵育时间为40-50min。
10.根据权利要求4所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，步骤c)中，加入血红素至血红素的终浓度为5-25μM，加入钾离子至钾离子的终浓度为0-100mM；孵育反应的条件为在室温下孵育15-90min；所述测定G-四链体/血红素复合物的DPV信号时电压为-0.7～-0.3V。
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