CN112410330A - 一种dna探针、通用电化学传感平台及其检测方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA探针、通用电化学传感平台及其检测方法与应用。利用MB标记的DNA，首次研究了基于该传感平台的DNA链的扩散行为。设计具体的方案来检测和分析核酸酶作用后的DNA残基，从而评价核酸酶的活性，确定核酸酶的终止位点。将构建的G4‑DNA/NPG/AuE传感平台与酶辅助的DNA均相识别放大反应相结合，研制出高灵敏度的DNA传感器，实现对ExoⅢ和microRNA‑21的电化学检测。

Description

一种DNA探针、通用电化学传感平台及其检测方法与应用
技术领域
本公开属于电化学检测技术领域，具体涉及一种DNA探针、通用电化学传感平台及其制备方法与应用，涉及基于G4-DNA功能化纳米多孔金传感平台对不同DNA扩散差异的电化学研究以及对Exonuclease III(Exo III)和microRNA等疾病标志物的通用电化学检测方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
DNA传感器利用DNA分子与目标分子(如DNA、RNA、蛋白质、生物小分子等)之间的相互作用，实现对目标分子或生物过程的特异性检测，在分子分析、疾病诊断、基因治疗等领域具有重要应用。电极作为电化学DNA传感器的关键元件，其材料和结构对传感器的分析性能具有重要影响。随着纳米技术的快速发展，纳米结构的电极被广泛地应用于电化学DNA传感器中，纳米多孔金(nanoporous gold，NPG)作为一种极具代表性的纳米材料，以其独特的内部结构、良好的生物相容性和优异的电化学性能在电化学DNA生物传感器领域显示出巨大的潜力。
DNA是一大类特殊的生物分子，其长度、组成、形状均可变可调，具有独特的可编程性。除了单链核酸(如DNA、RNA、PNA等)之间的特异性碱基互补配对反应，适配体(aptamer)的出现，将DNA传感器的分析应用范畴拓展至蛋白质、细胞、金属离子、药物小分子、有机污染物等。近年来，各种核酸酶(如外切酶、切刻酶、聚合酶、甲基化酶等)的应用，进一步拓展了DNA传感器的性能提升空间、检测模式和应用范畴。尽管核酸酶对核酸水解具有特定的要求，但是随着水解的发生，DNA的组成和构型将不断变化，而且具体的终止作用位点并不确定。然而，据本公开发明人所知，目前尚无对不同DNA在NPG中的扩散差异进行相关研究，DNA分子的扩散机制尚不清楚。系统地研究不同长度、不同构型的DNA分子在纳米电极内部的传输机制，明确核酸酶的终止作用位点，对优化DNA传感器设计、更好地发挥核酸酶的作用、提高电化学DNA传感器的综合分析性能具有重要的参考价值和指导意义。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种DNA探针、通用电化学传感平台及其检测方法与应用。通过构建功能化纳米多孔金传感平台，研究不同DNA基于此平台的扩散差异，以评估核酸酶的活性以及确定特定条件下核酸酶作用的终止位点。最后，将构建的G4-DNA/NPG/AuE功能化纳米多孔金电化学传感平台与酶辅助的均相识别放大反应相结合，研制高灵敏度、高选择性抗干扰的通用电化学传感器。
为解决以上技术问题，本发明的以下一个或多个实施例提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种DNA探针，为富含鸟嘌呤的DNA单链，且能够形成G-四链体。
MB分子和G-四链体的π系统之间有较强的末端堆叠作用，可以形成稳定的G-四链体/MB复合物，能够加快信号响应，提高灵敏度。
第二方面，本发明提供一种通用电化学传感平台，包括所述DNA探针、纳米多孔金和金电极，DNA探针通过Au-S键与纳米多孔金连接，纳米多孔金通过萘酚与金电极连接。
第三方面，本发明提供所述通用电化学传感平台的制备方法，包括如下步骤：
以Au/Ag合金叶片为原料，蚀刻脱银制得纳米多孔金电极；
在预处理的裸金电极上滴加萘酚溶液，并将制得的纳米多孔金电极覆在裸金电极上，得NPG/AuE电极；
将NPG/AuE电极放入所述DNA探针溶液，培育后，得到电化学传感平台。
第四方面，本发明提供所述通用电化学传感平台在对MB、MB标记的DNA链、ExoⅢ或miRNA-21检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的以上一个或多个技术方案取得了以下有益效果：
提供了一种通用的电化学传感平台G4-DNA/NPG/AuE。利用MB标记的DNA，首次研究了基于该传感平台的DNA链的扩散行为。能够评价核酸酶的活性，确定核酸酶的终止位点。将构建的G4-DNA/NPG/AuE传感平台与酶辅助的DNA均相识别放大反应相结合，研制出高灵敏度的DNA传感器，实现对ExoⅢ和microRNA-21的电化学检测。采用该传感器进行通用电化学检测具有较高的灵敏度，ExoⅢ的检测限低至0.042U/mL，microRNA-21的检测限低至12.4aM。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中构建通用传感平台以及基于此平台扩散差异研究的原理示意图；
图2为实施例中G4-DNA/NPG/AuE传感平台与酶辅助的DNA均相识别放大反应相结合，研制出高灵敏度的DNA传感器，实现酶活评价，确定特定条件下酶反应终止位点以及对疾病标志物通用电化学检测的原理示意图；
图3为实施例中制备的功能化纳米多孔金电化学传感平台的表征。A为纳米多孔金(NPG)以及G4-DNA功能化的纳米多孔金(G4-DNA/NPG)的扫描电镜图，其中a为NPG的扫描电镜图，b为NPG的扫描电镜图；B、C分别为NPG和G4-DNA/NPG的P2p、O1s的光电子能谱分峰拟合图；制备的功能化纳米多孔金电化学传感平台的化学阻抗谱图(EIS)，a为裸AuE,b为NPG/AuE,c为G4-DNA/NPG/AuE在含有5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-的0.1M KCl交流阻抗，插图是Nyquistplots的等效电路；
图4为实施例中MB扩散响应研究，不同电极状况对应不同MB的富集响应，A为MB基于NPG/AuE随时间的信号响应；B为MB基于不同传感平台随时间的信号响应，a为AuE,b为NPG/AuE，c为G4-DNA/NPG/AuE；C为构建的传感平台进行性能优化，G4-DNA的固定浓度分别为0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0和7.0μM；D为不同传感平台富集MB的1小时后的DPV信号，a为AuE,b为NPG/AuE,c为G4-DNA/NPG/AuE。
图5为实施例中MB标记的不同长度、不同构型的DNA基于G4-DNA/NPG/AuE随时间的扩散信号响应，A为G4-DNA/NPG/AuE分别在1mL含有1μM MB标记的不同长度的DNA((a)MB，(b)ssDNA(5)-MB，(c)ssDNA(6)-MB，(d)ssDNA(8)-MB，(e)ssDNA(10)-MB和(f)ssDNA(22)-MB)的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中随时间的DPV信号；B是A的局部放大图；C为G4-DNA/NPG/AuE分别在1mL含有1μM MB标记的不同构型的DNA((a)G4-MB,(b)HP-MB,(c)ssDNA(22)-MB和(d)dsDNA-MB)的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中随时间的DPV信号。
图6为实施例中G4-DNA/NPG/AuE对DNA链长度评价及酶活性评价，A为G4-DNA/NPG/AuE与100μL 1μM MB标记的不同长度的DNA((a)MB,(b)ssDNA(5)-MB,(c)ssDNA(6)-MB,(d)ssDNA(8)-MB,and(e)ssDNA(10)-MB)培育1小时后，传感器在1mL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中的DPV响应。
图7为实施例中构建的传感平台对疾病标志物的通用电化学检测，A为不同浓度ExoⅢ(10-5,10-4,10-3,10-2,0.1,1和5U/μL)下的DPV信号，B为对应的校准曲线，C为不同浓度microRNA-21(110-13,10-12,10-10,10-8和10-7M)下的DPV信号，D为对应的校准曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
第一方面，本发明提供一种DNA探针，为富含鸟嘌呤的DNA单链，且能够形成G-四链体。
在一些实施例中，所述DNA探针的一端修饰有巯基。巯基的修饰，便于与纳米多孔金电极连接。
进一步的，所述DNA探针为：CTG GGA GGG AGG GAG GGA TTT T-C6-(SH)2。
MB分子和G-四链体的π系统之间有较强的末端堆叠作用，可以形成稳定的G-四链体/MB(亚甲基蓝)复合物，能够加快信号响应，提高灵敏度。
第二方面，本发明提供一种通用电化学传感平台，包括所述DNA探针、纳米多孔金电极和金电极，DNA探针通过Au-S键与纳米多孔金电极连接，纳米多孔金电极通过萘酚与金电极连接。
第三方面，本发明提供所述通用电化学传感平台的制备方法，包括如下步骤：
以Au/Ag合金叶片为原料，蚀刻脱银制得纳米多孔金电极；
在预处理的裸金电极上滴加萘酚溶液，并将制得的纳米多孔金电极覆在裸金电极上，得NPG/AuE电极；
将NPG/AuE电极上放入所述DNA探针溶液，培育后，得到电化学传感平台。
在一些实施例中，所述纳米多孔金电极的制备方法，具体为：将Au/Ag合金叶片剪成小片，在浓硝酸中蚀刻设定时间，去除银，清洗后，即得。
进一步的，所述Au/Ag合金叶片的厚度为20-500nm。
进一步的，蚀刻的温度为25-35℃，蚀刻的时间为25-35min。
在一些实施例中，NPG/AuE电极在DNA探针溶液中培育的时间为10-14h。
进一步的，DNA探针溶液的浓度为1-7μM。
在一些实施例中，裸金电极的预处理方法，包括如下步骤：采用抛光剂对金电极进行抛光，抛光后冲洗，然后在硫酸溶液中进行电化学清洗，最后采用超纯水清洗。
所述超纯水，又称UP水，为电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。
进一步的，电化学清洗时，电位扫描范围为-0.2V-1.6V。
在一些实施例中，所述萘酚溶液的质量百分浓度为0.3％-0.8％。
第四方面，本发明提供所述通用电化学传感平台在对MB、MB标记的DNA链、ExoⅢ或miRNA-21检测中的应用。
基于构建的通用电化学传感平台对ExoⅢ和microRNA进行电化学检测
所述的ExoⅢ检测是将不同浓度的ExoⅢ与特定的底物进行培育后，ExoⅢ对底物进行水解，获得水解产物，将上述通用传感平台对水解产物进行富集，洗涤，然后进行电化学检测。
所述底物为ssDNA(22)-MB和CsDNA。
其中，ssDNA(22)-MB：TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A–MB；CsDNA：TAG CTT ATCAGA CTG ATG*T*T*G*A，*代表磷酸化。
microRNA检测是将待测microRNA与MB标记的互补DNA探针特异性结合，加入DSN酶共同培育，获得水解产物，将上述通用传感平台对水解产物进行富集，洗涤，然后进行电化学检测。
在一些实施例中，所述检测时的溶液体系为Tris-HCl缓冲液。
第五方面，本发明提供所述通用电化学传感平台在对核酸酶的活性评估、核酸酶作用的终止位点中的应用。
在一些实施例中，将待测的核酸酶与底物混合培育后，将电化学传感平台进入培育后的溶液中，培育后，取出电极，洗涤后，进行电化学检测。
进一步的，电化学检测为差分脉冲伏安法。
更进一步的，差分脉冲伏安法的条件为扫描范围为-0.6V～0V，振幅为50±5mV，脉冲宽度为50±5ms，脉冲周期为0.5±0.01s。
在一些实施例中，所述酶为外切酶Ⅲ(ExoⅢ)、双链特异性核酸外切酶(DSN)以及RecJf外切酶(RecJf Exo)。
鉴于DNA的链扩散差异尚未见电化学相关研究，同时考虑到DNA分子的电化学响应不明显，无法同时满足评估核酸酶的活性以及确定特定条件下的核酸酶作用的终止位点，为了优化DNA传感器设计、更好地发挥核酸酶的作用、提高电化学DNA传感器的综合分析性能，本公开提出了构建通用电化学传感平台G4-DNA/NPG/AuE，系统研究DNA分子的长度和构型对其内部传输的影响设计具体方案来分析检测核酸酶作用后的DNA残留，以评估核酸酶的活性以及确定特定条件下的核酸酶作用的终止位点。最后，将构建的G4-DNA/NPG电化学传感平台与酶辅助的DNA均相识别放大反应相结合，研制高灵敏度、高选择性抗干扰的DNA传感器，实现对Exonuclease III(Exo III)和microRNA-21(miRNA-21)的电化学检测。
利用上述电化学生物传感器，通过将构建的通用电化学平台浸入含有MB的的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中，每10分钟进行一次电化学测试，可以测试MB的电化学行为。
不同长度/构型DNA链基于G4-DNA/NPG的扩散行为：考虑到DNA链的电化学响应不明显，使用MB标记的DNA链。将构建的G4-DNA/NPG浸入1mL含有1μM MB标记的DNA链(HP-MB、dsDNA-MB、ssDNA(22)-MB、ssDNA(10)-MB、ssDNA(8)-MB、ssDNA(6)-MB、ssDNA(5)-MB和MB)的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中。每十分钟进行一次电化学测试。
为了进一步降低背景信号，减少用量，更好地对酶反应残留物进行定性和定量分析。首先，将制备好的G4-DNA/NPG/AuE浸入100μL含有1μM MB标记的DNA链的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中。孵育1小时后，取出电极，用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，最后在缓冲液中进行电化学测试。
检测核酸酶作用后的DNA残留,以评估核酸酶的活性以及确定特定条件下的核酸酶作用的终止位点的检测方法，将待测的酶与特定的底物培育1小时，将G4-DNA/NPG/AuE电极分别浸入到100μL上述反应后的溶液溶液中，培育1小时后，取出电极，用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，然后进行电化学测试。
基于通用电化学传感平台G4-DNA/NPG/AuE对ExoⅢ和microRNA-21的通用电化学检测。
将待测的ExoⅢ加入特定的底物，培育1小时后获得ExoⅢ作用后MB标记的残基，然后将G4-DNA/NPG/AuE电极浸入到100μL上述反应后的溶液中，培育1小时后，取出电极，用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，最后进行电化学测试。
将待测的microRNA-21与MB标记的DNA特异性结合，加入双链特异性核酸外切酶后培育1小时后，然后将G4-DNA/NPG/AuE电极浸入到100μL上述反应后的溶液中，培育1小时后，取出电极，用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，最后进行电化学测试。
电化学检测为差分脉冲伏安法，差分脉冲伏安法采用的溶液为Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)，差分脉冲伏安法的条件为扫描范围为-0.6V～0V，振幅为50±5mV，脉冲宽度为50±5ms，脉冲周期为0.5±0.01s。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例
试剂与材料
高效液相色谱纯化的DNA和miRNA(表1所示)购自中国上海生工生物科技有限公司。Au/Ag合金叶片(厚度:100nm；50:50,w/w)购自常熟贵金属有限公司。甲胎蛋白(AFP)从中国上海灵超生物技术有限公司获得。双特异性核酸酶(DSN)从深圳牛邦生物科技有限公司获得。RecJf外切酶(RecJf Exo)从新英格兰生物抗体有限公司(中国北京)获得。外切酶(Exo)从大连TaKaRa生物技术有限公司获得。亚甲基蓝(MB)和三(2-羧基)膦盐酸盐(TCEP)购自阿拉丁(上海，中国)。以0.01M磷酸氢二钠、0.01M磷酸二氢钠和0.9％氯化钠配制磷酸盐缓冲盐(PBS)。用10mM Tris-HCl、50mM NaCl和10mM MgCl2制备Tris缓冲液(pH＝7.4)。其他试剂均为分析级，无需进一步纯化即可使用。消耗品用0.1％的DEPC处理，高压蒸汽灭菌。所有溶液所使用的超纯水从优普净水系统(电阻率＝18.25MΩ·cm)获得。
表1本实施例中使用的核酸序列信息
Figure BDA0002742298330000101
Figure BDA0002742298330000111
注：*代表磷酸化
仪器
电化学阻抗谱(EIS)和微分脉冲伏安(DPV)在CHI 660E电化学工作站(上海晨华，中国)进行。用DYCP-31DN电泳仪(北京六一仪器有限公司)进行琼脂糖凝胶电泳。采用Tanon-2500 R凝胶成像系统对琼脂糖凝胶进行成像。用SU8010扫描电子显微镜5.0kV加速电压下对NPG的形态进行了表征。利用Thermo Scientific Escalab 250Xi光电子能谱仪进行了x射线光电子能谱(XPS)研究。
构建功能化NPG电化学传感平台，并游离MB基于此平台的电化学行为进行研究。
以Au/Ag合金叶片为原料，脱银制得NPG。简单地说，将Au/Ag合金叶片剪成小片(8mm×8mm)，在30℃浓硝酸中蚀刻30min，用超纯水清洗三次后，所得NPG浮在超纯水上备用。在预处理的裸金电极上加入1.2μL 0.5％Nafion，静置30分钟，将制备的NPG覆在金电极(AuE)上。自然干燥12小时后，向NPG/AuE电极上滴加G4-DNA，于4℃孵育12h。用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)清洗，得到功能化的NPG电化学传感平台，G4-DNA/NPG/AuE。置于4℃备用。
将制备的电极浸入1mL含有1μM MB的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中，每10分钟记录一次MB分子的电化学响应，研究MB分子基于NPG/AuE和G4-DNA/NPG/AuE传感平台的扩散响应。
不同长度/构型DNA链基于G4-DNA/NPG的扩散行为研究
考虑到DNA链的电化学响应不明显，本项目拟使用MB标记的DNA链。简单地说，将构建的G4-DNA/NPG浸入1mL含有1μM MB标记的DNA链(如HP-MB、dsDNA-MB、ssDNA(22)-MB、ssDNA(10)-MB、ssDNA(8)-MB、ssDNA(6)-MB、ssDNA(5)-MB和MB)的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中。每十分钟进行一次DPV测试。
为了进一步降低背景信号，减少用量，更好地对酶反应残留物进行定性和定量分析。首先，将制备好的G4-DNA/NPG/AuE浸入100μL含有1μM MB标记的DNA链的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中。孵育1小时后，取出电极，用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，然后在1mLTris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行DPV测试。
酶促反应评价
酶促反应评价实验,ExoⅢ的反应溶液(包含1μM ssDNA-MB和1μM CsDNA),DSN的反应溶液(包含1μM ssDNA-MB和1μM microRNA-21)或RecJf Exo的反应溶液(包含1μM ssDNA-MB和1μM CsDNA)，各自加酶培育1h。将G4-DNA/NPG/AuE电极分别浸入到100μL上述反应后的溶液溶液中，培育1小时后，取出电极，用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，然后在1mL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行DPV电化学测量。
生物标记物的通用电化学检测
基于均匀识别放大反应的电化学传感器具有操作简单、识别效率高、抗干扰性好等优点。将G4-DNA/NPG/AuE通用电化学传感平台与酶辅助的均相识别放大反应相结合，能够充分发挥均相反应的高效优势和纳米多孔金的结构优势，从而达到降低背景信号，提高检测的可靠性和灵敏度的目的。分别具体设计各种酶辅助的目标循环放大策略，通过和构建的通用G4-DNA/NPG/AuE传感平台构建相结合，实现ExoⅢ和miRNA-21的灵敏检测。
ExoⅢ的定量检测。将G4-DNA/NPG/AuE电极浸入到100μL ExoⅢ的反应溶液(包含1μM ssDNA-MB、1μM CsDNA和不同浓度的ExoⅢ)中。在37℃培育一小时后,将电极取出,用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)清洗,然后在1mL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行DPV电化学测试。
miRNA-21的定量检测。将G4-DNA/NPG/AuE电极浸入到100μL miRNA-21的反应溶液(1μM ssDNA-MB、0.005U/μL DSN和不同浓度的microRNA-21)中。在55℃培育一小时后，将电极取出，用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)洗涤，然后在1mL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行DPV电化学测量。
电化学测试
电化学测量采用三电极系统。DPV是在室温下用电化学工作站CHI660进行的。参数取值为0～-0.6V，脉冲幅值为0.05V，脉冲宽度为0.5s。EIS在含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-的0.1M KCl溶液中测量，频率范围为0.1Hz到100kHz。
结果与讨论
G4-DNA/NPG/AuE表征
用SEM对G4-DNA/NPG/AuE的制备进行了表征。NPG具有三维结构，孔径在30-50nm范围内(图3A(a))。固定G4-DNA后，与NPG相比，孔径变小了(图3A(b))。
为了进一步证明G4-DNA成功固定在纳米多孔金上，对制备的传感平台进行了XPS表征。经峰拟合后，与NPG相比，在131.9eV出现P2p峰(图3B)，对应于DNA中的主要结构成分磷酸。此外，在531eV时观察到有机O1s峰(图3C)，这是DNA成功固定在NPG表面的可靠指标。
利用EIS在含有5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-的0.1M KCl溶液中进一步表征G4-DNA/NPG/AuE的成功构建。(a)AuE，(b)NPG/AuE，(c)G4-DNA/NPGF/AuE的奈奎斯特图，如图3D所示。一般电路(图1的插图d)是利用目前的阻抗数据系统，其中RΩ表示溶液阻力，Rct是电子转移电阻、ZW华宝元素，Cd是固定相元素。裸金电极的电阻拟合值大约为152.4Ω。用纳米多孔金覆盖后，观察到一个小半圆且电阻拟合值下降到20.11Ω，说明由于纳米多孔金使得电极的导电性得到了改善。固定G4-DNA后，电极的电阻拟合值增加到1161Ω,这是由于带负电荷的DNA和(Fe(CN)6)3-/4-之间存在静电斥力。EIS表征进一步证实了G4-DNA/NPGF/AuE传感平台的成功构建。
自由MB的电化学行为
考虑到DNA分子本身的电化学响应信号不明显，我们将MB作为信标来实现电化学信号的输出。用DPV在三电极体系中研究了NPG/AuE捕获MB的电化学行为。首先，将NPG/AuE浸入在1mL含有1μM MB的Tirs-HCl缓冲液(pH＝7.4)中，记录MB随时间的电化学响应。电化学响应随时间增加(图4A)，说明NPG的双通道结构有利于MB分子的扩散。AuE的电化学响应随时间变化不大(图4B)，说明AuE对MB没有明显的富集作用，当NPG/AuE固定G4-DNA时，电流响应大于NPG/AuE(图4B)。这是因为MB分子与鸟嘌呤四复合体PI系统之间具有较强的末端堆积效应，使其能够形成稳定的g四复合体/MB络合物。这说明g-四链与MB分子之间的静电相互作用和分子间的相互作用可以加速MB分子在电极中的扩散和富集，提高检测速度和灵敏度。G4-DNA对MB有良好的富集作用。
进一步研究了G4-DNA的浓度，以优化传感器性能。通过在NPG/AuE表面固定不同浓度的G4-DNA，研究了G4-DNA浓度对传感器响应的影响。固定G4-DNA(0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0或7.0μM)过夜，清洗电极，将得到的G4-DNA/NPG/AuE浸入1mL含有的1μM MB的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中，培育1小时，进行DPV电化学测试，评价G4-DNA浓度对传感器响应的影响。如图4C所示，在低浓度范围内，随着G4-DNA浓度的增加，电流响应显著增加。然而，当G4-DNA浓度在5.0μM以上时，信号响应明显下降，原因是高密度的DNA会造成空间障碍，使MB难以弥散。因此，将G4-DNA浓度为5μM用于传感平台构建。与AuE相比，NPG/AuE的信号响应提高了约7.8倍，G4-DNA/NPG/AuE的信号响应提高了约23.8倍(如图4D所示)。这说明G4-DNA功能化可以提高MB的利用率，提高检测的灵敏度。
DNA链的长度/结构对扩散的影响
由于磷酸盐阴离子的积累，DNA骨架携带的负电荷量理论上与DNA链的长度成正比。同时，DNA链越短，尺寸越小。在此基础上，采用DPV研究了MB标记DNA链在G4-DNA/NPG/AuE上的扩散行为。记录DPVs，评估DNA链长度对传感器响应的影响。随着DNA链长度的增加，电流响应显著降低，在相同的量浓度下，短链的DPV响应强于长链(图5A)。G4-DNA/NPG/AuE对MB标记的短DNA链是敏感的。
除了ssDNA的长度外，还对DNA链的构型进行了评估。推测不同构型的DNA链可能由于大小效应导致不同的可达性。相同条件下，不同构型的DNA链在相同的浓度被评估。不同构型的DNA链产生不同的信号变化(图5C)。观察到发夹DNA(HP-DNA)和双链DNA(dsDNA)，由于其刚性结构，电化学电流小于ssDNA链。特别是MB标记的G4-DNA的电化学电流大于ssDNA链，因为MB与G4-DNA相互作用，可以在表面积累。
DNA链长度及酶促反应测定
虽然核酸酶对DNA的水解有特定的要求，但随着水解的发生，DNA的组成和构型会发生变化，具体的终止位点不能确定。为了评价酶促反应，非特异性DNA对该传感器的可及性差异是很重要的。因此，评估了DNA链长度对扩散的影响。为了进一步降低背景信号，通过降低剂量来节约成本，在反应和清洗后的缓冲液中测量电化学信号。简单地说，G4-DNA/NPG/AuE浸入100μL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中，其中含有1μM MB标记的DNA(0、5、6、8或10个碱基)，培育1小时，清洗电极。在相同的量浓度下，MB标记的短DNA链的DPV响应强于长DNA链(图6A)。当DNA链长度在0到10个核苷酸之间，且浓度为1μM时，近似呈现非线性趋势(图6B)。MB标记DNA长度的非线性相关性得到一个方程，Ip(μA)＝-0.00782+3.3453/(1+exp((N+1.62103)/1.97263)，相关系数为0.9999，N为碱基数。G4-DNA/NPG/AuE对MB标记的短DNA链敏感。
用于酶促反应评价
为了准确地量化酶解残留物，进行DPV以记录最高信号。由图4C可以看出，ExoⅢ、DSN和RecJf Exo水解物的DPV最高响应分别为1.0260μA,0.5131μA和0μA。说明在一定的实验条件下，ExoⅢ可以完全水解MB标记的DNA；在一定的实验条件下，DSN可以部分水解MB标记的DNA，水解后的MB标记DNA链残基为6-7nt；RecJf Exo不完全水解MB标记DNA，在一定的实验条件下，残留的MB标记DNA链水解后仍超过或等于10个碱基。它可以为更好的利用核酸酶提供理论参考和设计酶辅助循环放大反应。
核酸酶活性检测
核酸酶活性检测。构建的G4-DNA/NPG/AuE传感平台用于检测Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中不同浓度的ExoⅢ(0-5U/μL)。DPV信号随着ExoⅢ浓度的增加而增加(图7A)。对应的校准曲线在ExoⅢ浓度为0.0001U/μL到5U/μL Exo呈良好的线性关系(图7B)。通过ExoⅢ分析得到的线性相关性方程为:Ip(μA)＝0.0188log(CExoⅢ(U/μL))+0.8253，相关系数为0.999。本实施例检出限为0.042U/mL。可以看到，与之前的报告相比，开发的传感器检测限相对较低。
核酸检测
核酸检测。构建的G4-DNA/NPG/AuE传感平台用于检测Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中不同浓度的microRNA-21(100fM-100nM)。DPV信号随着microRNA-21浓度的增加而增加(图7C)。对应的校准曲线在microRNA-21浓度为100fM到100nM之间呈现良好的线性关系(图7D)。通过microRNA-21分析得到的线性相关性方程为:Ip(μA)＝0.00284log(CR-21(M))+0.0521，相关系数为0.998。在这种情况下，检测限为12.4aM。可以看到，与之前的报告相比，该传感器显示了较低的检测限。
综上，本发明提供了一种G4-DNA功能化的NPG传感平台G4-DNA/NPG/AuE，用来研究DNA分子的扩散行为。通过对ExoⅢ、DSN和RecJf Exo酶水解的DNA残基进行检测分析，评价核酸酶的活性，确定核酸酶的终止位点。传导机制的系统研究的DNA分子与纳米电极的不同长度和配置和核酸酶的识别终止网站优化有重要的参考价值和指导意义的设计DNA传感器,以更好地发挥核酸酶的作用，提高综合分析DNA电化学传感器的性能。此外，初步试验表明，G4-DNA/NPG/AuE检测平台不仅可以用于检测核酸酶的活性；也可用于核酸检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种DNA探针，其特征在于：为富含鸟嘌呤的DNA单链，且能够形成G-四链体，所述DNA探针的一端修饰有巯基。
2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于：所述DNA探针由5’端到3’端的序列为：CTG GGA GGG AGG GAG GGA TTT T-C6-(SH)2。
3.一种通用电化学传感平台，其特征在于：包括权利要求1或2所述DNA探针、纳米多孔金电极和金电极，DNA探针通过Au-S键与纳米多孔金电极连接，纳米多孔金电极通过萘酚与金电极连接。
4.权利要求3所述通用电化学传感平台的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
以Au/Ag合金叶片为原料，蚀刻脱银制得纳米多孔金电极；
在预处理的裸金电极上滴加萘酚溶液，并将制得的纳米多孔金电极覆在裸金电极上，得NPG/AuE电极；
将NPG/AuE电极上放入所述DNA探针溶液，培育后，得到电化学传感平台。
5.根据权利要求4所述的通用电化学传感平台的制备方法，其特征在于：所述纳米多孔金电极的制备方法，具体为：将Au/Ag合金叶片剪成小片，在浓硝酸中蚀刻设定时间，去除银，清洗后，即得；
进一步的，所述Au/Ag合金叶片的厚度为20-500nm；
进一步的，蚀刻的温度为25-35℃，蚀刻的时间为25-35min。
6.根据权利要求4所述的通用电化学传感平台的制备方法，其特征在于：NPG/AuE电极在DNA探针溶液中培育的时间为10-14h；
进一步的，DNA探针溶液的浓度为1-7μM；
在一些实施例中，裸金电极的预处理方法，包括如下步骤：采用抛光剂对金电极进行抛光，抛光后冲洗，然后在硫酸溶液中进行电化学清洗，最后采用超纯水清洗；
进一步的，电化学清洗时，电位扫描范围为-0.2V-1.6V；
在一些实施例中，所述萘酚溶液的质量百分浓度为0.3％-0.8％。
7.权利要求3所述通用电化学传感平台在对MB、MB标记的DNA链、ExoⅢ或miRNA-21检测中的应用；
在一些实施例中，所述检测时的溶液体系为Tris-HCl缓冲液。
8.权利要求3所述通用电化学传感平台对MB、MB标记的DNA链、ExoⅢ或miRNA-21的检测方法，其特征在于：
对MB进行检测时，通过将电化学生物传感器浸入含有MB的缓冲液中，每过设定时间进行一次电化学测试；
对MB标记的DNA链进行检测时，通过将电化学生物传感器浸入MB标记的不同长度/构型的DNA溶液中，进行电化学测试；
对miRNA-21进行检测时，待测的microRNA-21与MB标记的DNA特异性结合，加入双链特异性核酸外切酶后培育，然后将G4-DNA/NPG/AuE电极浸入，培育，取出电极，洗涤，最后进行电化学测试。
9.权利要求3所述通用电化学传感平台在对核酸酶的活性评估、核酸酶作用的终止位点中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：将待测的核酸酶与底物混合培育后，获得ExoⅢ作用后MB标记的残基，将电化学传感平台进入培育后的溶液中，培育后，取出电极，洗涤后，进行电化学检测；
进一步的，电化学检测为差分脉冲伏安法；
更进一步的，差分脉冲伏安法的条件为扫描范围为-0.6V～0V，振幅为50±5mV，脉冲宽度为50±5ms，脉冲周期为0.5±0.01s；
在一些实施例中，所述酶为外切酶Ⅲ、双链特异性核酸外切酶以及RecJf外切酶。
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