CN111579614A - 基于磁性生物复合材料的dna酶和杂交链式反应的电化学生物传感器检测铅离子的方法 - Google Patents

基于磁性生物复合材料的dna酶和杂交链式反应的电化学生物传感器检测铅离子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法：(a)、构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs‑S1；(b)、铅离子依赖性DNA酶的酶切作用；(c)、杂交链式反应的放大作用：步骤(b)得到的产物与发卡DNA链H1和H2共孵育；(d)、电化学生物传感器的构建：步骤(c)得到的产物与MB孵育反应得到样品，样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；(e)、样品检测：未知浓度的铅离子样品按步骤(a)‑步骤(d)测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中铅离子浓度。本发明能够快速、高灵敏高选择性的检测铅离子。

Description

基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应的电化学生 物传感器检测铅离子的方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，涉及一种基于电化学生物传感器检测铅离子的方法，更具体 地，涉及一种基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感 器检测铅离子的方法。
背景技术
重金属污染是导致环境恶化的重要因素。即使微量的重金属进入人体，也会对人体造成 极大的危害。铅离子是毒性最强的重金属离子之一，可引起多种严重疾病，包括神经系统疾 病、心血管疾病、肾脏疾病和内分泌系统疾病等。2019年7月，我国生态环境部将铅列入 了第一批有毒有害水污染名录。因此，开发一种高灵敏度、可靠的铅离子检测方法具有重要 意义。
目前，检测铅离子的方法主要有原子力吸收光谱法、X射线荧光光谱法、电感藕合等离 子体质谱等。上述方法通常需要昂贵的检测设备。近年来，研究人员开发了各种新型的铅离 子检测传感系统，包括比色法、荧光法和电化学技术。其中，电化学传感器具有检测速度 快、灵敏度高、易于携带等优点。但是电化学方法大多需要进行复杂的电极修饰，对实验条 件、环境要求严格，从而限制了广泛应用。因此，亟需设计一个简单、准确、灵敏的电化学 方法用于铅离子的检测。
磁性Fe3O4@Au纳米材料的磁性特征满足在实验过程简单快速的磁性分离，避免耗时较 长的超滤离心操作，而且在测定时通过磁控诱导在电极表面成膜，利用磁性纳米材料吸附固 定在磁性玻碳电极表面，而且去除磁芯后可使磁性材料自行脱落，省去了漫长的抛光打磨电 极的过程，具有自清洁的特点。另外，它具有较大的比表面积，可以通过表面修饰与DNA 材料结合得到生物纳米材料。
DNA分子除了具有基因的遗传特性外，同时也是一个结构精巧的一维纳米线，包括适 配体、DNA酶、适配体和DNA酶复合物(Aptazyme)。DNA由于具有序列设计灵活、合成 方法成熟、价格适宜的优势，成为目前研究的热门材料。其中，DNA酶特异性识别目标 物，提高选择性。金属离子依赖性DNA酶是一段特定的单链DNA序列，在二价金属离子 辅助下具有切割底物酶活性，和底链互补后在特定的位点将底链分解成两部分。
发明内容
本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺 点，提供一种基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感 器检测铅离子的方法，该方法能够快速、高灵敏高选择性的检测铅离子。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检 测铅离子的方法，包括如下步骤：
步骤(a)、构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1：将Fe3O4@Au纳米粒与酶底物链S1共孵育，再加入6-巯基己醇共孵育；
步骤(b)、铅离子依赖性DNA酶的酶切作用：步骤(a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1、铅离子依赖性DNA酶S2、不同浓度的铅离子溶液共孵育；
步骤(c)、杂交链式反应的放大作用：步骤(b)得到的产物与发卡DNA链H1和发卡DNA 链H2共同孵育反应；
步骤(d)、构建电化学生物传感器：步骤(c)得到的产物与亚甲蓝(MB)孵育反应得到样 品，通过磁性诱导将样品吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；
步骤(e)、样品检测：按照步骤(a)-步骤(d)测得未知浓度的待测铅离子样品的DPV信 号，代入标准曲线得到样品中铅离子浓度；
其中，酶底物链S1为核酸序列，其序列中包含铅离子依赖性DNA酶S2的底物序列以及杂交链式反应的引发序列，从而使得酶底物链S1被铅离子依赖性DNA酶酶切时，杂交 链式反应的引发序列从磁性生物复合材料上脱落，杂交链式反应无法被触发。
本发明的检测机理为：Fe3O4@Au纳米粒(Fe3O4@Au NPs)作为载体用于固定酶底物链 S1，同时便于磁性分离和电极的磁性诱导吸附。酶底物链S1内含杂交链式反应的引发序列，铅离子依赖性DNA酶S2作为识别元件，发卡DNA链H1、H2的引入提高反应体系的 灵敏度，加入H1和H2时，杂交链式反应被触发，形成长链双链DNA，MB作为电化学信 号分子能够吸附到DNA上，大量MB可以吸附在双链上。如果加入目标物铅离子，铅离子 依赖性DNA酶S2被激活，酶底物链S1被切割，S1中的杂交链式反应的引发序列从磁性材 料上脱落，杂交链式反应无法被触发，那么吸附的MB减少，电信号降低。反应结束后，复 合材料通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号。MB电化学信号的 高低与体系中铅离子的浓度相关，实现电化学传感检测铅离子。
本领域技术人员可以根据上述机理设计酶底物链S1的序列，根据本发明优选实施方 式，酶底物链S1序列为32个碱基，铅离子依赖性DNA酶S2序列为33个碱基，发卡 DNA链H1和发卡DNA链H2均为20个碱基。
具体优选的，酶底物链S1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-SH-C6-GTAGAGAAGGATATCACTCAATCGATAACTCA-3’(SEQ ID NO：1)；SH- C6(SH表示巯基，C6表示苯基)为修饰在S1的5’端的基团，为了使S1可以接到 Fe3O4@Au NPs表面；5’端起第11位为腺嘌呤核糖核苷酸。
铅离子依赖性DNA酶S2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
5’-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC-3’(SEQ ID NO：2)。
发卡DNA链H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
5’-GACATAACACTGAGTTATCG-3’(SEQ ID NO：3)。
发卡DNA链H2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：
5’-GTGTTATGTCCGATAACTCA-3’(SEQ ID NO：4)。
步骤(a)-步骤(d)中，以pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液为反应溶剂。
步骤(a)-步骤(c)中，每次孵育后磁性分离出产物。
步骤(a)中，Fe3O4@Au纳米粒通常由Fe3O4-APTES与HAuCl4制得。
Fe3O4@Au纳米粒的制备方法可为本领域公知的方法，具体制备方法如下：取FeCl3· 6H2O溶于水中，超声溶解，搅拌，待温度达到80℃时，加入FeCl2·4H2O，制得混合水溶 液；往混合水溶液中通入N2除氧，逐滴加入氨水，滴加完毕后继续保温反应20～40min，停止加热，冷却至室温，通过外加磁场磁性分离出Fe3O4纳米粒，水洗至中性；取Fe3O4纳 米粒，加入APTES无水乙醇溶液搅拌10～15h，得到经APTES修饰的Fe3O4-APTES，磁性 分离，依次经无水乙醇和超纯水清洗；将Fe3O4-APTES与质量分数1％的HAuCl4溶液、超 纯水超声混合，逐滴加入25mmol·L-1NaBH4直至颜色由棕黄色变成紫红色，磁性分离，得 到Fe3O4@Au纳米粒；其中，FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O的摩尔比为3:1～1:1，FeCl3·6H2O 在混合水溶液的体积浓度为0.1～0.25mmol/mL，每100mL混合水溶液加入10～15mL氨 水；Fe3O4纳米粒和APTES的质量体积比为1mg:0.1～0.2mL；Fe3O4-APTES与HAuCl4的 质量比为1:4～1:7；Fe3O4-APTES和超纯水的质量比为1:12000～13000。
步骤(a)中，酶底物链S1的浓度为0.05～0.5μM；Fe3O4@Au纳米粒的固含量为0.2～0.6 mg/mL。酶底物链S1和Fe3O4@Au纳米粒的孵育时间为2h，温度为37℃。
6-巯基己醇的浓度为0.05～0.5mM，6-巯基己醇和Fe3O4@Au纳米粒的孵育时间为1h， 室温。加入6巯基己醇封闭金包四氧化三铁表面未接上酶底物链S1的金，避免后续DNA在金上的非特异性吸附
步骤(b)中，铅离子依赖性DNA酶S2的浓度为0.05～0.5μM，酶底物链S1与铅离子依赖性DNA酶S2的浓度比为1:0.25～3，优选为1:1。
磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1、铅离子依赖性DNA酶S2和铅离子的孵育时间为10～50min，温度为35～40℃，优选为37℃。
铅离子的终浓度为0～1000nM；根据本发明具体实施方式，多个铅离子的浓度依次为 0.05nM,1nM,5nM,10nM,50nM,100nM,500nM,1000nM。
步骤(c)中，发卡DNA链H1的浓度为0.05～0.5μM，发卡DNA链H1和发卡DNA链 H2的浓度相同；酶底物链S1与发卡DNA链H1的浓度比为1:1～5。
加入发卡DNA链H1与发卡DNA链H2后，孵育时间为30～130min，温度为35～ 40℃，优选为37℃。
步骤(d)中，MB的浓度为0.05mM～0.5mM，优选为0.1mM，测定MB的电压可根据需 要确定，优选为-0.6～0.2V。
与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
1、本发明无需进行复杂的电极修饰，利用磁性诱导将待测的复合纳米材料吸附到磁性 玻碳电极表面，测定过程简单方便。
2、本发明中不仅引入杂交链式反应，极大地提高了体系的灵敏度，而且引入铅离子依 赖性DNA酶，提高了体系选择性，实现铅离子的高选择性高灵敏度检测。
3、基于本发明的传感策略，仪器设备简单便携，操作简单、快速，有利于发明的推广 应用。
附图说明
图1为本发明基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物 传感器检测铅离子的原理图。
图2A为实施例1所构建的检测体系中不同浓度铅离子的电流响应值；图2B为实施例1 所构建的检测体系中不同浓度铅离子对DPV峰电流的标准曲线图。图2A中曲线由上至下 依次表示铅离子浓度为：0.05nM,1nM,5nM,10nM,50nM,100nM,500nM,1000nM。
图3为本发明实施例1所构建的检测体系对于铅离子的选择性比较图。
具体实施方式
通过结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行更详细的描述。虽然以下为本发 明的优选具体实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实 施方式所限制。
实施例1
步骤(a)、构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1：
合成Fe3O4@Au纳米粒：溶剂热法制备Fe3O4：取4.7215g FeCl3·6H2O、80mL水于250mL三颈瓶中，超声溶解，800rmp·min-1搅拌，待温度达到80℃时，加入1.7256g FeCl2·4H2O，通N2除氧，逐滴加入10mL氨水，滴加完毕后继续80℃反应30min，停止加 热，冷却至室温，通过外加磁场分离出Fe3O4纳米粒，水洗至中性。
取2.4mg Fe3O4纳米粒，加入240μL APTES，无水乙醇定容至2400μL，搅拌12h，得 到APTES修饰的Fe3O4-APTES，磁性分离，依次用无水乙醇清洗一遍，超纯水清洗三遍。
取2.4mg Fe3O4-APTES、0.72μL质量分数1％的HAuCl4溶液(HAuCl4的质量为14.4mg，Fe3O4-APTES和HAuCl4质量比为1:6)以及30mL超纯水超声混合，然后逐滴加入0.6mL 25mmol·L-1NaBH4，颜色由棕黄色变成紫红色，磁性分离，得到Fe3O4@Au纳米粒。
采用pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液将酶底物链S1配制成浓度为100μM的溶液，取5μL酶底物链S1溶液和0.4mg Fe3O4@Au纳米粒，pH 7.4,20mM Tris- HCl,100mM NaCl的缓冲液定容至体积1mL，37℃孵育2h；磁性分离，加入1mM 6-巯基己 醇100μL，pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液定容至体积1mL，室温孵育1h， 磁性分离，得到磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1；
步骤(b)、铅离子依赖性DNA酶的酶切作用：采用pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mMNaCl 的缓冲液将铅离子依赖性DNA酶S2配制成浓度为100μM的溶液；取5μL铅离子依赖性DNA酶S2溶液和步骤(a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1、不同浓度的铅离子溶液 (由pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液配制)，pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液定至体积1mL(体系中铅离子的终浓度分别为0.05nM,1nM,5nM,10nM, 50nM,100nM,500nM,1000nM)，在铅离子依赖性DNA酶S2的酶切作用下37℃共孵育 40min；磁性分离，去除溶液；以不添加铅离子为空白对照；
步骤(c)、杂交链式反应的放大作用：采用pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲 液分别将发卡DNA链H1和H2配制成浓度为100μM的溶液；取步骤(b)得到的产物、5μL发卡DNA链H1溶液、5μL发卡DNA链H2溶液，pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的 缓冲液定至体积1mL，37℃共同孵育反应90min；磁性分离，去除溶液；
步骤(d)、电化学生物传感器的构建：取步骤(c)得到的产物和亚甲蓝，pH7.4,20mMTris- HCl,100mM NaCl的缓冲液定至体积1mL，使得亚甲蓝的浓度为0.1mM，室温孵育20分钟 得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，在电压为-0.6V～0V下测定MB 的DPV信号(图2A)，建立标准曲线(图2B)：ΔI＝0.8610lgC+1.5263(R2＝0.9998)，C表示铅离子浓度(nM)；
步骤(d)、样品检测：将未知浓度的铅离子样品，按步骤(a)-步骤(d)测得DPV信号，代 入标准曲线得到样品中的铅离子浓度。
本实施例使用到的DNA序列：
酶底物链S1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-SH-C6-GTAGAGAAGGATATCACTCAATCGATAACTCA-3’(SEQ ID NO：1)；SH- C6(SH表示巯基，C6表示苯基)为修饰在S1的5’端的基团；5’端起第11位为腺嘌呤核 糖核苷酸。
铅离子依赖性DNA酶S2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
5’-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC-3’(SEQ ID NO：2)。
发卡DNA链H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
5’-GACATAACACTGAGTTATCG-3’(SEQ ID NO：3)。
发卡DNA链H2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：
5’-GTGTTATGTCCGATAACTCA-3’(SEQ ID NO：4)。
对比例1
步骤(a)、按照实施例1步骤(a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1；
步骤(b)、步骤(b)、铅离子依赖性DNA酶的酶切作用：采用pH 7.4,20mM Tris-HCl,100 mM NaCl的缓冲液将铅离子依赖性DNA酶S2配制成浓度为100μM的溶液；取5μL铅离 子依赖性DNA酶S2溶液和步骤(a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1、铅离子溶液 (由pH7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液配制)，pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液定至体积1mL(体系中铅离子的终浓度为1000nM)，在铅离子依赖性DNA 酶S2的酶切作用下37℃共孵育40min；磁性分离，去除溶液；
步骤(c)、电化学生物传感器的构建：取步骤(b)得到的产物和亚甲蓝，pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液定至体积1mL，使得亚甲蓝的浓度为0.1mM，室温孵育20 分钟得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，在电压为-0.6V～0V下测定 MB的DPV信号，MB的DPV值在0.33μA。而实施例1相同铅离子浓度的电化学生物传感 器中，MB的DPV值增大到1.96μA，即发卡DNA链H1、H2的加入显著提高了电流的响 应值，增大了传感器的灵敏度。
实施例3
在纯水中加入铅离子标准品，使样品中铅离子浓度为100nM；采用纯水分别配制其他干 扰离子(Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ag+、Cu2+、Cd2+、Hg2+、Ca2+)标准品溶液，浓度均为1000 nM。
测定上述样品的DPV信号，包括以下步骤：
步骤(a)、按照实施例1步骤(a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1：
步骤(b)、铅离子依赖性DNA酶的酶切作用：采用pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mMNaCl 的缓冲液将铅离子依赖性DNA酶S2配制成浓度为100μM的溶液；取5μL铅离子依赖性DNA酶S2溶液和步骤(a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1、100μL样品溶液，pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲液定至体积1mL，37℃共孵育40min；磁性分离，去 除溶液；
步骤(c)、杂交链式反应的放大作用：采用pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的缓冲 液分别将发卡DNA链H1和H2配制成浓度为100μM的溶液；取步骤(b)得到的产物、5μL发卡DNA链H1溶液、5μL发卡DNA链H2溶液，pH 7.4,20mM Tris-HCl,100mM NaCl的 缓冲液定至体积1mL，37℃共同孵育反应90min；磁性分离，去除溶液；
步骤(d)、电化学生物传感器的构建：取步骤(c)得到的产物和亚甲蓝，pH7.4,20mMTris- HCl,100mM NaCl的缓冲液定至体积1mL，使得亚甲蓝的浓度为0.1mM，室温孵育20分钟 得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，在电压为-0.6V～0V下测定MB 的DPV信号。如图3所示，本发明方法对铅离子具有较高的选择性。
实施例4
以自来水样本进行测定，以50pM加入量为基准，在自来水中分别加入基准量50％、100％、200％的铅离子标准品。取100μL样品溶液，按照实施例1步骤(a)-步骤(d)测定DPV信号，代入实施例1建立的标准曲线得到样品中的铅离子浓度，每份样品重复测定3次取平均值，计算RSD及回收率如表1。
表1：自来水中铅离子加样回收率(n＝3)
Figure BDA0002492277390000071
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于 所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的 普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应的电化学生物传感器检测铅离子的方法
<141> 2020-05-14
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtagagaagg atatcactca atcgataact ca 32
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagtgataa agctggccga gcctcttctc tac 33
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacataacac tgagttatcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgttatgtc cgataactca 20

Claims (10)

1.一种基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(a)、构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1：将Fe3O4@Au纳米粒与酶底物链S1共孵育，再加入6-巯基己醇共孵育；
步骤(b)、铅离子依赖性DNA酶的酶切作用：步骤(a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1、铅离子依赖性DNA酶S2、不同浓度的铅离子溶液共孵育；
步骤(c)、杂交链式反应的放大作用：步骤(b)得到的产物与发卡DNA链H1和发卡DNA链H2共同孵育反应；
步骤(d)、构建电化学生物传感器：步骤(c)得到的产物与亚甲蓝孵育反应得到样品，通过磁性诱导将样品吸附到磁性玻碳电极表面，测定亚甲蓝的DPV信号，建立标准曲线；
步骤(e)、样品检测：按照步骤(a)-步骤(d)测得未知浓度的待测铅离子样品的DPV信号，代入标准曲线得到样品中铅离子浓度；
其中，酶底物链S1为核酸序列，其序列中包含铅离子依赖性DNA酶S2的底物序列以及杂交链式反应的引发序列，从而使得酶底物链S1被铅离子依赖性DNA酶酶切时，杂交链式反应的引发序列从磁性生物复合材料上脱落，杂交链式反应无法被触发。
2.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(a)-步骤(d)中，以pH 7.4,20mMTris-HCl,100mM NaCl的缓冲液为反应体系；步骤(a)-步骤(c)中，每次孵育后磁性分离出产物。
3.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于酶底物链S1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
铅离子依赖性DNA酶S2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
发卡DNA链H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
发卡DNA链H2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(a)中，Fe3O4@Au纳米粒由Fe3O4-APTES与HAuCl4制得。
5.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(a)中，酶底物链S1的浓度为0.05～0.5μM；Fe3O4@Au纳米粒的固含量为0.2～0.6mg/mL；酶底物链S1和Fe3O4@Au纳米粒的孵育时间为2h，温度为37℃；
6-巯基己醇的浓度为0.05～0.5mM，6-巯基己醇和Fe3O4@Au纳米粒的孵育时间为1h，室温。
6.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(b)中，铅离子依赖性DNA酶S2的浓度为0.05～0.5μM，酶底物链S1与铅离子依赖性DNA酶S2的浓度比为1:0.25～3，优选为1:1。
7.根据权利要求1或6所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(b)中，磁性生物复合材料Fe3O4@Au NPs-S1、铅离子依赖性DNA酶S2和铅离子的孵育时间为10～50min，温度为35～40℃，优选为37℃。
8.根据权利要求1或6所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于铅离子的终浓度为0～1000nM。
9.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(c)中，发卡DNA链H1的浓度为0.05～0.5μM，发卡DNA链H1和发卡DNA链H2的浓度相同；酶底物链S1与发卡DNA链H1的浓度比为1:1～5；
加入发卡DNA链H1与发卡DNA链H2后，孵育时间为30～130min，温度为35～40℃，优选为37℃。
10.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(d)中，亚甲蓝的浓度为0.05mM～0.5mM，优选为0.1mM；测定亚甲蓝的电压为-0.6～0.2V。
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