CN111007053B - 用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光适体传感器领域，特别是指用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用。本申请基于核酸适体功能化的纳米金和荧光检测技术灵敏度高的优点，将40nm的金作为淬灭基团与探针Ⅰ的5端通过Au‑S连接起来，FAM做为荧光基团标记在探针Ⅱ的3端，构建了一种用于检测银离子浓度的荧光适体传感器，并对水环境中不同浓度的银离子进行检测，从而验证该传感器的检测性能。实验结果表明，该传感器检测的线性范围在10‑60nmol/L，检出限为10nmol/L。

Description

用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光适体传感器领域，特别是指用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用。
背景技术
银凭借其独特的性能，在医疗材料、摄影、电子、成像等行业中应用广泛。然而，银离子被列为最具毒性的重金属离子之一。当银离子随工业废水排入土壤和水源后，就会被动植物吸收，接着又随食物链进入人体与人体内的蛋白质、酶发生相互作用，严重威胁人类的健康。因此，检测水环境中银离子浓度对保护人类生命健康至关重要。
目前检测银离子浓度的方法主要依赖于电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法和电感耦合等离子体/原子发射光谱法。尽管这些方法检测精度比较高，但仪器耗资昂贵、运行费用高、操作要求多，检测比较费时、费力，而且测量时需萃取、浓缩富集或抑制干扰等复杂前处理过程。而生物传感器，凭借其具有选择性高、分析速度快和仪器价格低廉等特点，引起研究者的极大关注，目前研究工作大都致力于研制荧光、比色或电化学传感器。其中，荧光分析技术具有灵敏度高、精度高、检测速度快等优点在各种分子检测中应用广泛。
Long利用NaYF4:Yb3+、Tm3+上转换纳米颗粒（UCNPS）设计了一种定量检测银离子的荧光传感器，检出限为33nmol/L。Yan Lu等人基于Ag+与谷胱甘酸（GSH）的相互作用，研究了检测银离子的金属配位聚合物荧光传感器，检出限为50nmol/L。以上检测银离子的方法中荧光传感器主要利用化学的方法来捕获重金属离子，检出限难以达到测量需求。一些研究者为了提高传感器的灵敏性，利用核酸适体和银离子的相互作用来检测银离子。Hua Lv等人提出了以两个离子作为输入而荧光作为输出的可逆氧化石墨烯抑制逻辑门来检测Ag+和I-。该传感器的检出限达到10nM，虽然具有较高的灵敏度和较低的背景干扰，但引入了有毒物质AgI。YuFengZhu等人利用银离子能使核酸适体从随机线圈结构变成G-四重结构来检测银离子，检出为0.64nM。虽然具有较高的灵敏性，但引入了有毒溶剂EDTA，会对水环境产生额外的影响。Kang Mao等人使用单层的MoS2作为荧光淬灭剂，并结合银离子与核酸适体中不匹配碱基C的相互作用来检测银离子，检出限为1nmol/L。虽然具有良好的灵敏性，但是MoS2的制备过程繁琐，并引入了EDTA有毒溶剂。可见利用核酸适体构建的荧光传感器灵敏度有所提高，但是现有相关研究中多数引进了有毒物质，不利于推广应用。
本申请基于核酸适体功能化的纳米金和荧光检测技术灵敏度高的优点，将40nm的金作为淬灭基团与探针Ⅰ的5端通过Au-S连接起来，FAM做为荧光基团标记在探针Ⅱ的3端，构建了一种用于检测银离子浓度的荧光适体传感器，具有操作简单、灵敏和不引入有毒溶剂等优点。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用，利用银离子能与核酸适体中不匹配的C碱基形成C-Ag+-C的复合结构，以及在银离子存在时FAM标记的DNA和纳米金修饰的DNA能发生互补配对从而拉近纳米金和FAM之间的距离，发生荧光能量共振转移的现象的原理。
本发明的技术方案是这样实现的：
用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将探针Ⅰ和探针Ⅱ分别加入TCEP溶液中活化2h，得核酸适体溶液和HDNA-FAM溶液；
（2）将纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液混合并振荡培养12h，得混合液；
（3）向步骤（2）的混合液中加入NaCl溶液，振荡培养24h后，离心、去除上清液并将沉淀分散于Tris-CH3COOH缓冲液中，最后加入步骤（1）的HDNA-FAM溶液，即得荧光适体传感器溶液。
所述步骤（1）中探针Ⅰ的DNA序列为5’-SH-CTACCCTAGC-3’；探针Ⅱ的DNA序列为5’-GCTACCCTAG-FAM-3’。
所述核酸适体溶液中探针Ⅰ的终浓度为5μM、HDNA-FAM溶液中探针Ⅱ的终浓度为5μM。
所述TCEP溶液的浓度为100mM，TCEP溶液中含有20mMTris-CH3COOH。
所述步骤（2）中纳米金溶液的浓度为12.5μg/mL，纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液的体积比为（1-8）：1。
所述步骤（3）中NaCl溶液的浓度为2mol/L，Tris-CH3COOH缓冲液的浓度为10mmol/L、pH为7，Tris-CH3COOH缓冲液的体积不小于600μL。
加入NaCl溶液的具体操作为：每隔3h加一次，最终使NaCl的浓度达到0.1-0.4mol/L；离心的条件为14000rpm离心20min。
所述荧光适体传感器溶液中探针Ⅰ和探针II的物质的量比为1：1。
上述方法所制备的荧光适体传感器，所述荧光适体传感器基于荧光共振能量转移原理，将DNA功能化的纳米金作为能量受体，修饰在核酸适体上的FAM作为能量供体。
所述的荧光适体传感器在灵敏、特异性的检测水环境中的银离子浓度的应用，检测步骤为：向荧光适体传感器溶液中加入100μL待测样本，于30℃孵化40min，取出600μL放入荧光光谱仪，检测荧光强度值，代入线性回归方程y=-0.87419x+235.5907，R2=0.994997，即可得出待测样本中银离子浓度。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请构建了一种用于检测水环境中银离子浓度的荧光适体传感器，纳米金和修饰有巯基的核酸适体通过Au-S连接在一起，当不存在银离子时，尽管两条DNA链有7个碱基互补配对，但3个碱基对之间的氢键力被强静电斥力抵消，所以两条DNA序列不能杂交；当存在银离子时，两条DNA链会通过C-Ag+-C进行特异性结合，拉近了FAM与纳米金之间的距离引起荧光淬灭，淬灭的程度与银离子的浓度有关。
2、本发明为了提高传感器的灵敏度，优化了荧光适体传感器的各项制备参数，并在纳米金与核酸适体的体积比为5：1，NaCl的浓度为260mmol/L，溶液呈中性，且培养的温度在30℃的参数下检测不同浓度的银离子。实验结果表明，该传感器检测的线性范围在10-60nmol/L，检出限为10nmol/L。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为检测银离子浓度的原理图。
图2为传感器的响应特性。
图3为AuNPs和aptamer不同体积时的光谱图和折线图。
图4为不同NaCl浓度下的光谱图和折线图。
图5为不同温度下的荧光光谱图和折线图。
图6为不同pH下的荧光光谱图和折线图。
图7为银离子浓度在10-60nmol/L时溶液的荧光光谱和折线图。
图8为传感器的特异性检测柱状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例:传感器的构成及检测原理
1、装置和材料
Ｆ-7000型荧光分光光度计（日本ＨITACHI公司）；GL-16Ⅱ型离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子天平和pH计（梅特勒－托利多仪器有限公司）；07HWS-2型数显恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）；恒温振荡培养箱（北京东联海尔仪器有限公司）。
银离子的核酸适体序列分别为：探针Ⅰ：5’-SH-CTACCCTAGC-3’；探针Ⅱ：5’-GCTACCCTAG-FAM-3’（上海生工生物科技有限公司）；40nm纳米金0.05mg/L(中科雷鸣)；2mol/LNaCl；100mM TCEP(包含20mMTris-CH3COOH)；10mMTris-CH3COOH缓冲液；AgNO3储备液（1mmol/L）：称取ATP溶于超纯水中；实验用水为18.2MΩ·cm的去离子水。
2、工作溶液的的制备
工作溶液的制备主要指的是Au@aptamer偶联体和HDNA-FAM的混合溶液。主要制备流程如下：首先将核酸适体在100mM的TCEP溶液(包含20mMTris-CH3COOH)中活化2h，然后将12.5μg/mL的纳米金和5μM的核酸适体混合并振荡培养12h。接着向溶液中加入2mol/LNaCl，每隔3h加一次，最终使NaCl的浓度达到0.26mol/L。振荡培养24h后，以14000rpm离心20min，去除上清液并将沉淀分散于600μL 10mmol/L 的Tris-CH3COOH缓冲液中并加入5μM，20μL的HDNA-FAM，4℃下保存备用。
3、银离子的检测
将上述制备好的620μL的AuNPS@aptamer@HDNA-FAM中加入100μL不同浓度的银离子30℃孵化40min，然后取出600μL放入荧光光谱仪进行检测，绘制不同银离子浓度下的荧光光谱图。
4、检测原理与可行性
图1为检测银离子浓度的原理示意图。纳米金和修饰有巯基的核酸适体通过Au-S连接在一起，当不存在银离子时，尽管两条DNA链有7个碱基互补配对，但3个碱基对之间的氢键力被强静电斥力抵消，所以两条DNA序列不能杂交；当存在银离子时，两条DNA链会通过C-Ag+-C进行特异性结合，拉近了FAM与纳米金之间的距离引起荧光淬灭，淬灭的程度与银离子的浓度有关。
为检测该传感器对银离子浓度的响应特性，分别检测加入银离子前后荧光适体传感器的荧光强度如图2所示。a为没加入银离子时的荧光光谱图，b和c为加入银离子时的荧光光谱图，可见加入银离子后出现了淬灭的现象，并且随着银离子浓度增大淬灭现象越明显，验证了该传感器的可行性。
5、实验条件的优化
纳米金和核酸适体的比例会影响纳米金表面核酸适体的密度，当纳米金过少时，纳米金的表面修饰过多的核酸适体，在加入银离子时部分互补链不能挤进去与核酸适体结合；当纳米金过多时，每个纳米金上修饰的核酸适体过少，核酸适体会包裹在纳米金的表面，影响其与互补链的结合。因此Au和aptamer的比例会影响传感器的灵敏度。除此之外，纳米金和核酸适体的静电排斥力也会阻止核酸适体修饰在纳米金的表面，因此需要添加合适的NaCl的浓度来减少核酸适体和纳米金之间的静电排斥力并且不使纳米金发生聚集。除了纳米材料的浓度会对影响传感器的灵敏度以外，外界的环境（pH、温度）也会影响到传感器的稳定性以及灵敏度。因此对Au和aptamer的比例，NaCl的浓度优化，培养温度和pH进行了优化。
6、Au和aptamer的比例优化
实验采用浓度为12.5μg/ml的纳米金，把核酸适体的体积固定在20μL，改变纳米金的体积，探究了Au和aptamer的体积比在（1-8）：1范围内，对Au@aptamer@HDNA-FAM的影响，图3为Au和aptamer在不同体积比下的荧光强度值，当体积比在（1-5）：1时，荧光强度随着纳米金浓度的增加而逐渐增大；当体积比超过5：1时，纳米金的体积过量，核酸适体包裹在纳米金的表面，部分FAM的荧光直接被纳米金淬灭，荧光强度逐渐下降。为了保证纳米金表面修饰适量的核酸适体，选择Au和aptamer的体积比为5：1进行后续实验。
7、NaCl的浓度优化
分别向工作溶液中加入0.6μL，3μL，6.3μL，13.3μL，17.9μL，21.1μL，30μL的NaCl（2mol/L）使NaCl的最终浓度分别为0.01 mol/L，0.05mol/L，0.1mol/L，0.2mol/L，0.26mol/L，0.3mol/L，0.4mol/L，探究了NaCl的浓度在0.1-0.4mol/L范围内，对Au@aptamer@FAM-HDNA的影响。由图5可知，随着NaCl浓度的增加，纳米金和核酸适体的静电排斥力逐渐减小，使得纳米金表面修饰的核酸适体增多，荧光强度有所增加，而NaCl的浓度超过260mmol/L时，过多的NaCl使纳米金发生聚集，荧光强度又逐渐下降。因此选择NaCl浓度为260mmol/L。
8、工作溶液培养温度的优化
为了确定传感器溶液的最佳温度，分别测量了Au@aptamer@FAM-HDNA在25-50℃范围内的荧光强度，结果如图7所示。在25-30℃范围内，随着温度的升高，纳米结构的稳定性逐渐增强，荧光强度逐渐升高，而温度大于30℃以后，随着温度的升高荧光强度反而降低，分析认为高温破坏纳米结构的稳定性。因此，选择30℃进行后续实验。
9、pH的优化
FAM对pH非常敏感，为了优化工作溶液的pH。实验采用Tris-CH3COOH来调节溶液的pH值，在pH5.5-9范围内考察pH对Au@aptamer@HDNA-FAM的影响。由图6所示，pH值在5.5-7范围内，随着pH值的增大荧光强度逐渐增大，主要因为低pH会抑制FAM的活性；当pH值在7-9范围时，随着pH的升高，荧光强度逐渐升高，但是在碱性环境下Ag+会与氢氧根发生反应，不利于检测银离子，因此选择pH=7的缓冲液进行后续实验。
实施效果例
1、检测不同浓度的Ag+
在优化的实验条件下，向工作溶液中加入100μL，浓度为10nM，20 nM，40 nM，50nM，60 nM的银离子，得到不同浓度银离子的荧光强度值。如图7所示，随着银离子浓度增加，C-Ag+-C的复合结构增加，更多的FAM被拉到AuNPs的近端，因此随着银离子浓度的增大，荧光强度值不断减小。其中银离子浓度与荧光强度的线性回归方程为y=-0.87419x+235.5907（y为荧光强度，x为银离子浓度），R2=0.99497，检测范围为10-60nmol/L，检出限为10nmol/L。
2、特异性
为了评价该传感器的特异性，在最优的实验条件下，向实验中加入100μL，50nmol/L的Ag+，尿素，葡萄糖，Mg2+，K+溶液，分别检测了加入Ag+，尿素，葡萄糖，Mg2+，K+的荧光强度变化。如图6所示，与Ag+相比，其它离子的响应可以忽略不计，验证了该荧光适体传感器对银离子的特异性检测。
3、结论
本文构建了一种用于检测水环境中银离子浓度的荧光适体传感器，主要利用银离子能与核酸适体中不匹配的C碱基形成C-Ag+-C的复合结构，以及在银离子存在时FAM标记的DNA和纳米金修饰的DNA能发生互补配对从而拉近纳米金和FAM之间的距离，发生荧光能量共振转移的现象的原理。此外，为了提高传感器的灵敏度，优化了荧光适体传感器的各项制备参数，并在最优的参数下对银离子的浓度进行了检测。该方法检测范围为10-60nmol/L，检出限为10nmol/L，可实现银离子浓度的检测并具有一定的抗干扰能力，能满足水环境中银离子浓度的检测要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）将探针Ⅰ和探针Ⅱ分别加入TCEP溶液中活化2h，得核酸适体溶液和HDNA-FAM溶液；
（2）将纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液混合并振荡培养12h，得混合液；
（3）向步骤（2）的混合液中加入NaCl溶液，振荡培养24h后，离心、去除上清液并将沉淀分散于Tris-CH3COOH缓冲液中，最后加入步骤（1）的HDNA-FAM溶液，即得荧光适体传感器溶液；
所述步骤（1）中探针Ⅰ的DNA序列为5’-SH-CTACCCTAGC-3’；探针Ⅱ的DNA序列为5’-GCTACCCTAG-FAM-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述核酸适体溶液中探针Ⅰ的终浓度为5μM、HDNA-FAM溶液中探针Ⅱ的终浓度为5μM。
3.根据权利要求2所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述TCEP溶液的浓度为100mM，TCEP溶液中含有20mMTris-CH3COOH。
4.根据权利要求1所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中纳米金溶液的浓度为12.5μg/mL，纳米金溶液与步骤（1）的核酸适体溶液的体积比为（1-8）：1。
5.根据权利要求1所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中NaCl溶液的浓度为2mol/L，Tris-CH3COOH缓冲液的浓度为10mmol/L、pH为7，Tris-CH3COOH缓冲液的体积不小于600μL。
6.根据权利要求5所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：加入NaCl溶液的具体操作为：每隔3h加一次，最终使NaCl的浓度达到0.1-0.4 mol/L；离心的条件为14000rpm离心20min。
7.根据权利要求6所述的用于检测银离子浓度的荧光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述荧光适体传感器溶液中探针Ⅰ和探针II的物质的量比为1：1。
8.权利要求1-7任一项所述的 方法所制备的荧光适体传感器，其特征在于：所述荧光适体传感器基于荧光共振能量转移原理，将DNA功能化的纳米金作为能量受体，修饰在核酸适体上的FAM作为能量供体。
9.权利要求8所述的荧光适体传感器在灵敏、特异性的检测水环境中的银离子浓度的应用，其特征在于，检测步骤为：向荧光适体传感器溶液中加入100μL待测样本，于30℃孵化40min，取出600μL放入荧光光谱仪，检测荧光强度值，代入线性回归方程y=-0.87419x+235.5907， R2=0.994997，即可得出待测样本中银离子浓度。
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