CN109115845A - 基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用 - Google Patents

基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用，属于生物传感技术领域。将CdS QDs修饰到与miRNA部分互补的发卡DNA的一端，CdS QDs对光电化学材料g‑C3N4起到敏化作用。目标miRNA与其互补链的杂交配对形成刚性双螺旋结构后，CdS QDs远离g‑C3N4表面，使得CdS QDs对g‑C3N4的敏化作用减弱，导致阳极流向阴极的电子减少，引起PEFC的开路电压变化，实现miRNA的检测。该传感器检测过程中无需额外供电设备、组装简单方便、成本低廉、抗干扰能力强，DNA链的互补配对效应使该传感器具有高选择性，可实现miRNA简单、快速、灵敏、高效检测。

Description

基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用，属于生物传感技术领域。
背景技术
光电生物燃料电池(PEFC)是一种特殊的燃料电池，其能在温和条件下，利用光激发提供可持续能源，受到广泛关注。基于PEFC的自供能生物传感器，是一种以电池性能输出作为分析检测信号的一类传感器，该传感器信号与被检测分析污浓度成比例关系。与传统传感器相比，光电自供能生物传感器检测过程中无需施加额外电源，其具体优点主要表现在：(1)设备简单。检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，仅需两根电极，即PEFC的阴阳两极，便可实现检测；(2)抗干扰能力强。测试体系未施加额外电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；(3)能实现简单、快速、实时检测。检测过程中无需电化学工作站等供电设备，仅需简易电压表和适宜的光源便可实现检测，故检测设备易携带，能实现实时监测。
MicroRNA(miRNA)，约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，在多种生物过程如细胞分化、凋亡、增殖和免疫反应中具有重要作用，已成为用于检测多种癌症的诊断和预后评估的新生物标志物。目前，检测miRNA表达的方法主要有Northern印迹法、miRNA阵列和实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、电化学方法。Northern印迹法灵敏度低、费时费力、样品需求量大。微阵列检测法同样存在灵敏度较低的缺点，并且特异性较弱。RT-PCR具有高特异性与高灵敏度，但该方法操作繁琐、RNA需分离纯化。miRNA小尺寸的特点也限制了传统RT-PCR的直接应用，并且miRNA家庭成员之间高的序列同源性也使定量分析成为挑战。因此，设计制备基于生物燃料电池的自供能生物传感器，实现miRNA简单、方便、高灵敏、高特异性检测非常必要。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明构建了基于PEFC的miRNA生物传感器，核心技术便为PEFC的构建，其中以氧化石墨烯/碳纳米管/金纳米粒子(GO/CNTs/AuNPs)作为laccase的载体，构建生物阴极催化氧气；以AuNPs-g-C3N4作为光阳极检测miRNA。首先将与miRNA部分互补的发卡DNA固定到电极表面，发卡DNA一端连接电极表面，一端修饰CdS QDs。当无目标miRNA时，由于发卡DNA没有被打开，CdS QDs靠近电极表面对g-C3N4起到敏化作用，此时阳极光电流较大，流向阴极的电子较多，电池输出电压高；当目标miRNA存在时，由于miRNA打开发卡DNA，目标miRNA与互补链形成刚性双螺旋结构，使CdS QDs远离g-C3N4表面，CdS QDs对g-C3N4敏化作用减弱。目标miRNA的引入，达到使CdS QDs远离电极表面的目的，流向阴极的电子减少，电压输出信号减小，用于定量检测目标miRNA。本发明设计的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，可实现目标物简单、快速、灵敏、高效检测。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
一种基于PEFC的自供能生物传感器，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH7.4的0.1M PB缓冲体系。
所述AuNPs-g-C3N4光阳极的制备方法如图1所示，包括如下步骤：
步骤A：将三聚氰胺与尿素按质量比1:1混合，置于管式炉中，以2～8℃/min升温至500～1000℃后维持2～5h，获得的黄色块状固体即为C3N4，研磨至粉末备用；
步骤B：取一定量的步骤A中制得的C3N4，加入到100～200mL、5～10M的HNO3中100～200℃回流8～16h，将回流得到的白色产物8000～15000rpm多次离心洗涤至中性，将得到的洗涤液在3000～8000rpm下离心10～30min，取上清液得到白色泛蓝胶体，即为剥离好的g-C3N4纳米片；
步骤C：取2～8mL步骤B中制得的剥离好的g-C3N4纳米片溶解在4～8mL二次水中并超声0.5～1h，将20～50μL的HAuCl4在搅拌条件下加入到上述溶液中，超声10～30min，在室温下搅拌0.5～1h，重复加入三次HAuCl4，将100～200μL、0.01～0.1M新配制的NaBH4快速加入到上述溶液中，持续搅拌10～30min，将100～500μL、0.01～0.05M的柠檬酸钠逐滴加入到上述溶液中，持续搅拌10～40min，之后将上述溶液5000～10000rpm离心10～30min，二次水清洗一次，得到的沉淀分散于4～8mL二次水中，得到AuNPs-g-C3N4混合物；
步骤D：将20～50μL步骤C中制得的AuNPs-g-C3N4滴涂在ITO电极表面，二次水冲洗后，置于4℃下备用。
所述GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极的制备方法，包括如下步骤：
步骤Ⅰ：取一定量的GO分散在10～20mL二次水中，超声1～2h，再取一定量的CNTs，加入到溶解完全的GO悬浮液中，继续超声2～4h，取一定量的40～100nM的AuNPs加入到上述溶液中继续超声2～4h得到均匀悬浊液，将上述得到的悬浊液至于反应釜中150～300℃反应2～5h，得到GO/CNT/AuNPs；
步骤Ⅱ：取一定量步骤Ⅰ中制得的GO/CNT/AuNPs超声溶解于二次水中，将20～50μL制得的GO/CNT/AuNPs溶液滴涂在ITO电极表面，37℃下干燥2～4h；
步骤Ⅲ：滴涂10～50μL、10～50mg/mL的laccase溶液于步骤Ⅱ中得到的GO/CNT/AuNPs电极表面，37℃下干燥12～24h，二次水冲洗后，置于4℃下备用。
一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1M PB缓冲体系。
所述AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极的制备方法，包括如下步骤：
将20～50μL发卡DNA滴涂到修饰有AuNPs-g-C3N4的ITO电极表面4～8℃孵育8～12h，二次水冲洗电极表面；向修饰有发卡DNA的电极表面滴加20～50μL含有20～40mM EDC及10～20mM NHS的CdS-COOH QDs溶液，室温下反应1～2h后，二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加20～50μL、1～3mM的MCH溶液，室温孵育1～3h，进行封板，二次水冲洗电极表面，得到AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极。
一种如上述所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器的应用，将其用于检测miRNA。
所述检测方法包括如下步骤：
步骤(1)：将AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极、GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极、含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1M PB缓冲体系组装为电池，测量电池的EOCV，记为E0 OCV；
步骤(2)：向AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极电极表面滴涂miRNA，孵育，二次水冲洗电极表面，得到AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS/MiRNA光阳极；
步骤(3)：将AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS/MiRNA光阳极、GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极、含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1M PB缓冲体系组装为电池，测量电池的EOCV，记为En OCV。
基于PEFC的自供能miRNA生物传感器超灵敏检测miRNA的原理如图1和图2所示：
当无目标miRNA时，CdS QDS靠近电极表面，对g-C3N4起到敏化作用，光阳极光电流较大，流向生物阴极的电子较多，此时，PEFC的开路电压较大；当引入目标miRNA时，目标miRNA与发卡DNA由于配对作用形成的刚性双螺旋结构，使得CdS QDS远离g-C3N4电极表面，使得CdS QDS对g-C3N4的敏化作用减弱，随着引入miRNA浓度的增加，远离g-C3N4表面发卡DNA的量增加，CdS QDS远离g-C3N4电极表面的量增加，光电流减弱，流向阴极的电子减少，从而导致PEFC的开路电压减小，通过开路电压减小值与目标miRNA对应关系得出miRNA含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，实现miRNA简单、方便、快速、灵敏、高效检测，相对现有的miRNA检测方法，具有以下特点：
(1)本发明所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，检测过程中无需外加电源，仅需两根电极即光引发生物燃料电池的阴阳两极和适宜的光源，整个检测设备简单，便于实现现场实时监测；
(2)本发明所述的CdS QDs对g-C3N4的敏化作用，敏化效果良好，稳定性高，重复性好；
(3)本发明所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器采用DNA杂交配对进行分子识别，不仅具有极高选择性，还具有成本低、操作简单等优点；
(4)本发明所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器中，具有优异光电活性的g-C3N4在PEFC阳极提供电子，同时生物阴极GO/CNTs/AuNPs/laccase对氧气具有良好的电催化活性，实现对目标物miRNA的超灵敏检测，大大提高了检测灵敏度；
(5)通过构建无额外供电设备的自供能生物传感器，不需要昂贵的仪器设备，可实现miRNA检测的微型化、便携化和集成化。
附图说明
图1为基于PEFC的自供能miRNA生物传感器超灵敏检测miRNA的原理图之一；
图2为基于PEFC的自供能miRNA生物传感器超灵敏检测miRNA的原理图之二；
图3为基于PEFC的自供能miRNA生物传感器装置示意图；
图4(A)为修饰有不同浓度miRNA的AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极和GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极联合的EOCV值；
图4(B)为将miRNA的不同浓度作为横坐标、miRNA的不同浓度下测得的En OCV值作为纵坐标的对数线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面通过实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
基于PEFC的自供能miRNA生物传感器用于miRNA-141的检测
(1)C3N4的制备：
将三聚氰胺与尿素按质量比1:1混合，置于管式炉中，以3℃/min升温至550℃后维持2h，获得的黄色块状固体即为C3N4，研磨至粉末备用；
(2)g-C3N4的制备：
取1g的步骤(1)中制得的C3N4，加入到100mL、5M的HNO3中110℃回流8h，将回流得到的白色产物9000rpm多次离心洗涤至中性，将得到的洗涤液在3000rpm下离心15min，取上清液得到白色泛蓝胶体，即为剥离好的g-C3N4纳米片；
(3)AuNPs-g-C3N4的制备：
取2mL步骤(2)中制得的剥离好的g-C3N4纳米片溶解在4mL二次水中并超声0.5h，将20μL的HAuCl4在搅拌条件下加入到上述溶液中，超声10min，在室温下搅拌0.5h，重复加入三次HAuCl4，将126μL、0.04M新配制的NaBH4快速加入到上述溶液中，持续搅拌20min，将200μL、0.01M的柠檬酸钠逐滴加入到上述溶液中，持续搅拌30min，之后将上述溶液5000rpm离心10min，二次水清洗一次，得到的沉淀分散于4mL二次水中，得到AuNPs-g-C3N4混合物；
(4)AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极的制备：
将20μL步骤(3)中制得的AuNPs-g-C3N4滴涂在ITO电极表面，将发卡DNA用PB缓冲溶液稀释，用移液枪移取20μL发卡DNA滴涂到修饰有AuNPs-g-C3N4光电活性材料的ITO电极表面，将滴涂好的ITO电极4℃孵育12h，用二次水多次冲洗；用PB缓冲溶液配制20mM EDC和10mM NHS的混合溶液，使用EDC和NHS的混合溶液将CdS-COOH QDs溶液稀释至200nM，室温下避光放置，用移液枪移取20μL含有20mM EDC及10mM NHS的CdS-COOH QDs溶液滴涂到修饰有发卡DNA的电极表面，室温下反应1h，二次水冲洗电极表面，滴加20μL 1mM的MCH室温孵育1h，封板，二次水冲洗电极表面，置于4℃备用。
(5)GO/CNT/AuNPs的制备：
取0.08g的GO分散在10mL二次水中，超声1h，再取0.04的CNTs，加入到溶解完全的GO悬浮液中，继续超声2h，取4mL的60nM的AuNPs加入到上述溶液中继续超声2h得到均匀悬浊液，将上述得到的悬浊液至于反应釜中180℃反应3h，得到GO/CNT/AuNPs。
(6)GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极的制备：
取一定量步骤(5)中制得的GO/CNT/AuNPs超声溶解于二次水中，将20μL制得的GO/CNT/AuNPs溶液滴涂在ITO电极表面，37℃下干燥2h，滴涂10μL、30mg/mL的laccase溶液于修饰有GO/CNT/AuNPs电极表面，37℃下干燥12h，二次水冲洗后，置于4℃备用。
(7)基于PEFC的自供能miRNA生物传感器的搭建和测量：
如图3所示，将修饰有GO/CNT/AuNPs/laccase的ITO电极作为生物阴极，修饰有AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS的ITO电极作为光阳极，转移到盛有含0.1M葡萄糖的0.1M PB缓冲溶液(pH＝7.4)的小池子中，利用两电极体系，工作电极夹生物阴极，参比电极和对电极接在一起夹光阳极，进行信号测试，测量PEFC的EOCV，记为E0 OCV；
向AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极电极表面滴涂20μL目标miRNA，37℃孵育2h，得到AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS/MicroRNA光阳极，将该光阳极和GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极组装成电池，测量PEFC的EOCV，记为En OCV；
更换目标miRNA的浓度，得到一系列En OCV值，将miRNA的不同浓度设为横坐标，将一系列miRNA的不同浓度下测得的En OCV值设为纵坐标，得到miRNA浓度与En OCV之间的线性关系，以便于通过测定的En OCV值，根据线性关系得知具体的miRNA浓度，达到检测miRNA的目的。
本实施例中，miRNA-141的DNA序列为：5′-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3′；发卡DNA的序列为5′-H2N-(CH2)6-CCA TCT TTA CCA GAC AGT GTT ACA AGA TGG TTT-(CH2)6-SH-3′。
图4(A)为修饰有不同浓度miRNA的AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极和GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极联合的EOCV值，a-j分别为50.0aM、100.0aM、500.0aM、1.0fM、5.0fM、10.0fM、50.0fM、100.0fM、500.0fM和1.0pM；图4(B)为将miRNA的不同浓度作为横坐标，miRNA的不同浓度下测得的En OCV值作为纵坐标，得到的对数线性关系图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的专利涵盖范围内。

Claims (10)

1.一种基于PEFC的自供能生物传感器，其特征在于，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1M PB缓冲体系。
2.一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极，
所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1MPB缓冲体系。
3.根据权利要求2所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极的制备方法包括如下步骤：
将发卡DNA滴涂到修饰有AuNPs-g-C3N4的ITO电极表面，一次孵育，二次水冲洗电极表面；向修饰有发卡DNA的电极表面滴加含有EDC及NHS的CdS-COOH QDs溶液，反应，二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加MCH溶液，二次孵育，二次水冲洗电极表面，得到AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极。
4.根据权利要求3所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述发卡DNA的滴涂量为20～50μL。
5.根据权利要求3所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述CdS-COOH QDs溶液为20～50μL含有20～40mM EDC及10～20mM NHS的CdS-COOH QDs溶液。
6.根据权利要求3所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，MCH溶液为20～50μL、1～3mM的MCH溶液。
7.根据权利要求3所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述一次孵育的条件为4～8℃孵育8～12h。
8.根据权利要求3所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述二次孵育的条件为室温孵育1～3h。
9.一种如权利要求2-8任意一项所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器的应用，其特征在于，将其用于检测miRNA。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
步骤(1)：将AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极、GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极、含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1M PB缓冲体系组装为电池，测量电池的EOCV，记为E0 OCV；
步骤(2)：向AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极电极表面滴涂miRNA，孵育，二次水冲洗电极表面，得到AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS/MiRNA光阳极；
步骤(3)：将AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS/MiRNA光阳极、GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极、含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1M PB缓冲体系组装为电池，测量电池的EOCV，记为En OCV。
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