CN112710709A - 用于目标dna检测的硫化镉量子点玻碳电极及其制备方法、电化学发光传感器系统与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于目标DNA检测的硫化镉量子点玻碳电极及其制备方法,该硫化镉量子点玻碳电极包括表面覆盖有硫化镉量子点均匀膜的玻碳电极和吸附在硫化镉量子点均匀膜表面的金纳米颗粒,所述金纳米颗粒的表面键连有与待检测目标DNA碱基序列互补配对的Hairpin DNA。本发明同时提供了具有该硫化镉量子点玻碳电极的电化学发光传感器系统及其应用方法。本发明以硫化镉量子点为能量供体,金纳米颗粒为能量受体,构建成电化学发光共振能量体系,该电化学发光传感器系统具备优异的光电性能,结合不同Hairpin DNA探针,能够对多种不同类型的特定目标DNA进行超灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及特定目标DNA检测,特别是指一种用于目标DNA检测的硫化镉量子点玻碳电极及其制备方法、电化学发光传感器系统与应用。
背景技术
恶性肿瘤是引起全球死亡率上升的主要原因之一,已经严重威胁人类健康和社会发展,其中肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位。
研究人员一直在探索通过癌症的早期筛查、预后及治愈癌症的方法,此前,癌症的早期筛查主要依赖于影像学技术和对肿瘤标志物“癌胚抗原(CEA)”的监测,但是由于癌症起病隐匿并且相关症状并不明显,且癌胚抗原的敏感度和特异性较低,很容易造成误诊和漏诊。
现代生命科学研究表明,几乎所有的癌症都与基因突变密切相关,大量癌组织中存在特定的循环肿瘤DNA。循环肿瘤DNA,即ctDNA(circulating tumor DNA),是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统,是一种特征性的肿瘤生物标记。通过ctDNA的检测,能够检出血液中的肿瘤踪迹。ctDNA作为一种具备特征基因序列的DNA,与蛋白类标记物相比,ctDNA检测很少出现假阳性,因为ctDNA来自肿瘤细胞基因组突变。然而,通常与特定肿瘤相关的ctDNA在人体内浓度极低,采用常规基因测序方法进行检测难度较大,耗时长,费用高,难以满足癌症早期快速筛查的需要。因此,对于特定目标DNA的快速且灵敏检测对于癌症的早期筛查至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测试灵敏度高、耗时短的用于目标DNA检测的硫化镉量子点玻碳电极及其制备方法、电化学发光传感器系统与应用。
为实现上述目的,本发明首先提供了一种用于目标DNA检测的硫化镉量子点玻碳电极,包括表面覆盖有硫化镉量子点(CdS QDs)均匀膜的玻碳电极和吸附在硫化镉量子点均匀膜表面的金纳米颗粒(AuNPs),所述金纳米颗粒的表面键连有与特定目标DNA碱基序列互补配对的Hairpin DNA。
优选地,该玻碳电极以硫化镉量子点为能量供体,金纳米颗粒为能量受体,构建成电化学发光共振能量体系。
本发明其次提供了前述硫化镉量子点玻碳电极的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)制备硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极;
2)制备含有金纳米颗粒的分散液;
3)将与待检测目标DNA碱基序列互补配对的Hairpin DNA末端连接到步骤2)制备的金纳米颗粒上,制得AuNPs-Hairpin DNA;
4)将步骤3)制得的AuNPs-Hairpin DNA吸附到步骤1)制得的硫化镉量子点均匀膜上,制得CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极,即硫化镉量子点玻碳电极。
优选地,所述步骤1)中,硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极的制备方法如下:1.1)将玻碳电极抛光处理至光滑洁净的镜面,并用超纯水冲洗干净,然后将玻碳电极依次置于无水乙醇、浓硝酸、超纯水中分别超声处理10~30秒,用氮气吹干备用;1.2)称取54~81mg硝酸镉四水溶解于10~15mL甲醇中,搅拌均匀得到硝酸镉溶液(溶剂为甲醇),搅拌同时向硝酸镉溶液中加入10~20μL油酸;1.3)另取一容器,称取15~23mg Na2S溶解于10~15mL甲醇中,然后将得到的Na2S溶液转移至步骤1.2)制得的硝酸镉溶液中,并置于180~220℃环境中1~3小时,随后将得到的沉淀物用无水乙醇和超纯水依次离心洗涤去除杂质,得到硫化镉量子点,再将其超声分散于25~40mL超纯水中;1.4)取5~10μL硫化镉量子点与水的混合物滴加在步骤1.1)处理后的玻碳电极上,待其在室温自然干燥,制得硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极。
优选地,所述步骤2)中,金纳米颗粒的制备方法如下:取100~150mL摩尔浓度为1mmoL/L的四氯金酸溶液(溶剂为水)在烧瓶中加热至沸腾,再取20~30mL摩尔浓度为0.5moL/L的柠檬酸三钠溶液(溶剂为水)加入上述溶液中,搅拌均匀,待混合物颜色由无色变成酒红色,停止加热,即得含有金纳米颗粒的分散液。
优选地,所述步骤3)中,AuNPs-Hairpin DNA的制备方法如下:取一定量浓度为1~2μmoL/L的Hairpin DNA,加入步骤2)中制得的含有金纳米颗粒的分散液中,在室温下静置1~2小时,再加入10~20μL摩尔浓度为0.01moL/L的巯基乙酸溶液,在室温下静置0.5~1小时,制得AuNPs-Hairpin DNA。
优选地,所述步骤4)中,CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极的制备方法如下:取适量步骤3)制得的AuNPs-Hairpin DNA滴加在步骤1)制得的硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极上,并置于35~40℃环境中1~2小时,制得CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极。
本发明再次提供了一种用于目标DNA检测的电化学发光传感器系统,该系统具有如前所述的硫化镉量子点玻碳电极并以其作为工作电极。
优选地,该系统还具有作为参比电极的Ag/AgCl电极,作为对电极的铂电极,作为反应试剂的K2S2O8/PBS共反应剂,以及用于检测发光信号的超微弱发光探测仪。其他软硬件可采用现有电化学工作站的常规配置。
优选地,所述K2S2O8/PBS共反应剂是由13.51~27.03g K2S2O8溶解在1LpH为7.4~8.4的PBS缓冲溶液中制得。需要注意的是,这里的1L用于说明浓度,而非对体积的限定。
优选地,该系统作为检测血液样品中是否含有特定循环肿瘤DNA(ctDNA)的传感器系统。可通过检测血液样品中目标ctDNA浓度,为肿瘤的筛查提供中间信息。若检测的血液样品电化学发光信号明显偏高,可确定样品中含有目标ctDNA。可进一步结合相关影像学技术,如计算机断层扫描(CT)、X线检查等,进一步诊断其是否患有特定肿瘤。
本发明最后提供了上述电化学发光传感器系统在检测DNA样品是否具有特定目标DNA上的应用,其特征在于,包括如下步骤:将待检测DNA样品滴加到所述硫化镉量子点玻碳电极上,用PBS缓冲液冲洗后以其为工作电极在电化学发光传感器系统中构建三电极测试体系,使用循环伏安法进行扫描,检测其电化学发光强度(通常采用几个扫描周期的峰值),作为判断待检测DNA样品是否具有特定目标DNA。
优选地,该应用方法还包括建立标准曲线的步骤:配置一系列不同浓度的与Hairpin DNA碱基序列互补的T-DNA溶液,分别滴加到所述硫化镉量子点玻碳电极上,以其为工作电极在电化学发光传感器系统中构建三电极测试体系,使用循环伏安法进行扫描,检测其电化学发光强度,再根据滴加不同浓度T-DNA溶液后玻碳电极的电化学发光信号构建标准曲线,后续进行血液样品检测时将其电化学发光信号与标准曲线对照,确定与待检测DNA样品电化学发光强度相当的T-DNA浓度,作为样品中特定目标DNA的浓度。这里采用T-DNA而非目标DNA构建标准曲线的原因是,与目标DNA相比,人为设计的T-DNA通常仅包括特征碱基片段,容易根据需要的系列浓度定量配制。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:本发明以硫化镉量子点为能量供体,金纳米颗粒为能量受体,构建成电化学发光共振能量体系,能够对实际DNA样品中特定目标DNA(例如ctDNA)进行超灵敏检测,具备发光信号强、检出下限低、灵敏度高、方便快捷和成本低的优点,有很大的实际应用前景。
附图说明
图1为实施例2中电极体系(CdS QDs+K2S2O8/PBS)的电化学发光信号响应图。图中,纵轴为电化学发光强度(ECL intensity),横轴为扫描时间(Time)。
图2为实施例2中电极体系及对照组的电化学发光信号-电势图。图中,纵轴为电化学发光强度,横轴为扫描电势(Potential)。
图3为实施例2中电化学发光传感器系统检测10fM特定目标DNA样品、10fM随机序列Random1-DNA及10fM随机序列Random2-DNA的电化学发光强度对照图。
图4为实施例2构建的标准曲线图,图中针对0.01fM~1pM每一数量级浓度进行循环扫描三次得到对应强度下的ECL intensity。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例提供了一种硫化镉量子点玻碳电极及其制备方法。
该硫化镉量子点玻碳电极包括表面覆盖有硫化镉量子点均匀膜的玻碳电极和吸附在硫化镉量子点均匀膜表面的金纳米颗粒,所述金纳米颗粒的表面键连有与待检测目标DNA序列互补配对的Hairpin DNA。其制备方法主要包括以下步骤:
1)CdS QDs均匀膜覆盖的玻碳电极的制备:
1.1)首先将玻碳电极依次用平均粒径为0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉抛光处理至光滑洁净的镜面,并用超纯水冲洗干净,然后将玻碳电极置于无水乙醇、浓硝酸、超纯水各超声处理15秒,用氮气吹干备用;
1.2)称取54mg硝酸镉四水(Cd(NO3)2·4H2O)溶解于10mL甲醇中,搅拌均匀,搅拌同时向得到的Cd(NO3)2溶液中缓慢加入10μL油酸;
1.3)另取一玻璃容器,称取15mg硫化钠(Na2S)溶解于10mL甲醇中,然后将得到的Na2S溶液转移至Cd(NO3)2溶液中,并置于200℃环境中2小时,随后将得到的沉淀物用无水乙醇和超纯水依次离心洗涤去除杂质,得到CdS QDs,再将CdS QDs超声分散于25mL超纯水中;
1.4)取10μL CdS QDs分散液滴加在步骤1.1)处理后的玻碳电极上,待其在室温自然干燥,制得CdS QDs均匀膜覆盖的玻碳电极。
2)AuNPs的制备:取150mL摩尔浓度为1mmoL/L的四氯金酸(HAuCl4)溶液在烧瓶中加热至沸腾,再取30mL摩尔浓度为0.5moL/L的柠檬酸三钠(C6H5Na3O7)溶液加入上述溶液中,搅拌均匀,待混合物颜色由无色变成酒红色,停止加热,即得含有AuNPs的分散液,置于4℃冰箱备用。
3)AuNPs-Hairpin DNA的制备:取10μL 1μmoL/L与待检测目标DNA序列互补配对的Hairpin DNA,加入100μL步骤2)中制得的AuNPs分散液中,在室温静置1小时,再加入10μL摩尔浓度为0.01moL/L的巯基乙酸溶液,在室温下静置0.5小时,制得AuNPs-Hairpin DNA,置于4℃冰箱备用。
4)CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极的制备:取10μL步骤3)制得的AuNPs-Hairpin DNA滴加在步骤1)制得的CdS QDs均匀膜覆盖的玻碳电极上,并置于37℃环境中2小时,制得CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极,即制得该硫化镉量子点玻碳电极。
实施例2
本实施例进一步提供了一种电化学发光传感器系统,其在辰华CHI660E电化学工作站(包括软件系统)的基础上,采用实施例1制得的硫化镉量子点玻碳电极作为工作电极,采用Ag/AgCl电极作为参比电极,采用铂电极作为对电极,采用K2S2O8/PBS共反应剂作为反应试剂,采用超微弱发光探测仪检测发光信号。
以下以检测特定目标DNA为例,对该电化学发光传感器系统的检测过程进行具体说明:
1)将待检测DNA样品修饰到工作电极上:取10μL待检测DNA样品滴加到实施例1制得的CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极上,并置于37℃环境中2小时备用。
2)K2S2O8/PBS共反应剂的制备:取27.03g K2S2O8溶于1LPBS缓冲溶液(pH=7.4),缓慢搅拌均匀,置于室温中备用,制得K2S2O8/PBS共反应剂。
3)待检测DNA样品中特定目标DNA检测:以步骤1)所得玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂片电极为对电极,K2S2O8/PBS为共反应剂,构建三电极体系,将电化学工作站和超微弱发光探测仪连接在一起,使用循环伏安法(CV),扫描范围为-1.5~0V,扫描速率为0.1V/S,检测其电化学发光信号,多个循环周期的扫描结果见图1,取各循环周期电化学发光强度峰值的平均值作为待检测DNA样品的电化学发光强度值。
4)构建标准曲线:以0.01fM~1pM(fM=10-15mol/L,pM=10-12mol/L)每一数量级浓度配置一个已知浓度的特定目标DNA样品,为便于定量配制,这里的特定目标DNA采用与Hairpin DNA互补配对的T-DNA代替,样品溶剂为pH=7.4的PBS缓冲溶液;按步骤1)~3)中方法检测各样品的电化学发光信号,构建标准曲线(每个浓度取前三个峰),所得结果见图4。后续进行待检测DNA样品检测时将其电化学发光信号与标准曲线对照即可得到样品中特定目标DNA的浓度数量级。
该电化学发光传感器系统具有发光信号强、检出下限低、灵敏度高等优点,实测其检出下限(Detection limit)为1.2×10-17mol/L,线性范围(Linear range)为1.0×10-13~5.0×10-17mol/L,大大优于其他量子点材料玻碳电极。
为评估电极体系发光性能,采用不同电极和反应剂(不加AuNPs-Hairpin DNA和T-DNA),使用循环伏安法(CV),扫描范围为-1.5~0V,扫描速率为0.1V/S,检测其电化学发光信号,得到电化学发光信号-电势图,见图2。从图2中可以看出,采用GCE(玻碳电极)和PBS时,电化学发光强度趋近于零;采用GCE和K2S2O8/PBS时,电化学发光强度整体较弱;而采用本发明CdS QDs体系(CdS/GCE和K2S2O8/PBS)后,电化学发光信号响应大幅提高并且非常稳定,证明本发明所制备的硫化镉量子点具备优异的光电性能。
作为对比例,采用相同测试方法检测10fM特定目标DNA样品、10fM随机序列Random1-DNA、10fM随机序列Random2-DNA,所得结果见图3。从图3可以看出,含有特定目标DNA的电化学发光信号响应明显高于其它随机序列DNA,证明该电化学发光传感器系统特异性较强并且可用于特定目标DNA的超灵敏检测。
实施例2中所使用的Hairpin DNA、T-DNA、Random1-DNA及Random2-DNA碱基序列如下:
Hairpin DNA:5’-NH2-(CH2)6-GGA AGA CAT GAG CTG CAT GAT GAG TCT TCC-(CH2)6-SH-3’;
T-DNA:5’-CTCATC ATG CAG CTCATG-3’;
Random1-DNA:5’-TTT GGG CGG GCC AAACTG-3’;
Random2-DNA:5’-TTAGCG CTG GGCAAT CCG-3’。
附录:英文名词与缩略语:
CdS QDs:硫化镉量子点;
GCE:玻碳电极;
AuNPs:金纳米颗粒;
Hairpin DNA:Hairpin DNA是一种能形成茎-环相连“发卡状”构型的单链DNA,能与多种目标物高选择性结合并引发显著的结构翻转,通常用作DNA探针。
T-DNA:Target DNA的缩写,是指与Hairpin DNA的碱基序列互补配对的一段单链DNA,通常选取不同摩尔浓度的T-DNA用以构建标准曲线。
ctDNA:circulating tumor DNA的缩写,中文名循环肿瘤DNA,是指经脱落或者细胞凋亡后释放进入循环系统的肿瘤细胞体细胞DNA,是一种特征性的肿瘤生物标记。不同癌症肿瘤具有不同的ctDNA,需要对应设计与其碱基序列对应的Hairpin DNA和T-DNA。
Claims (10)
1.一种用于目标DNA检测的硫化镉量子点玻碳电极,其特征在于:包括表面覆盖有硫化镉量子点均匀膜的玻碳电极和吸附在硫化镉量子点均匀膜表面的金纳米颗粒,所述金纳米颗粒的表面键连有与待检测目标DNA碱基序列互补配对的Hairpin DNA。
2.一种如权利要求1所述的硫化镉量子点玻碳电极的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)制备硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极;
2)制备含有金纳米颗粒的分散液;
3)将与待检测目标DNA碱基序列互补配对的Hairpin DNA末端连接到步骤2)制备的金纳米颗粒上,制得AuNPs-Hairpin DNA;
4)将步骤3)制得的AuNPs-Hairpin DNA吸附到步骤1)制得的硫化镉量子点均匀膜上,制得CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极,即硫化镉量子点玻碳电极。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
所述步骤1)中,硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极的制备方法如下:1.1)将玻碳电极抛光处理至光滑洁净的镜面,并用超纯水冲洗干净,然后将玻碳电极依次置于无水乙醇、浓硝酸、超纯水中分别超声处理10~30秒,用氮气吹干备用;1.2)称取54~81mg硝酸镉四水溶解于10~15mL甲醇中,搅拌均匀得到硝酸镉溶液,搅拌同时向硝酸镉溶液中加入10~20μL油酸;1.3)另取一容器,称取15~23mg Na2S溶解于10~15mL甲醇中,然后将得到的Na2S溶液转移至步骤1.2)制得的硝酸镉溶液中,并置于180~220℃环境中1~3小时,随后将得到的沉淀物用无水乙醇和超纯水依次离心洗涤去除杂质,得到硫化镉量子点,再将其超声分散于25~40mL超纯水中;1.4)取5~10μL硫化镉量子点与水的混合物滴加在步骤1.1)处理后的玻碳电极上,待其在室温自然干燥,制得硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极;
和/或:
所述步骤2)中,金纳米颗粒的制备方法如下:取100~150mL摩尔浓度为1mmoL/L的四氯金酸溶液在烧瓶中加热至沸腾,再取20~30mL摩尔浓度为0.5moL/L的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液中,搅拌均匀,待混合物颜色由无色变成酒红色,停止加热,即得含有金纳米颗粒的分散液。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于:
所述步骤3)中,AuNPs-Hairpin DNA的制备方法如下:取一定量浓度为1~2μmoL/L的Hairpin DNA,加入步骤2)中制得的含有金纳米颗粒的分散液中,在室温下静置1~2小时,再加入10~20μL摩尔浓度为0.01moL/L的巯基乙酸溶液,在室温下静置0.5~1小时,制得AuNPs-Hairpin DNA;
和/或:
所述步骤4)中,CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极的制备方法如下:取适量步骤3)制得的AuNPs-Hairpin DNA滴加在步骤1)制得的硫化镉量子点均匀膜覆盖的玻碳电极上,并置于35~40℃环境中1~2小时,制得CdS QDs/AuNPs-Hairpin DNA修饰的玻碳电极。
5.一种用于目标DNA检测的电化学发光传感器系统,其特征在于:具有如权利要求1所述的硫化镉量子点玻碳电极并以其作为工作电极。
6.根据权利要求5所述的电化学发光传感器系统,其特征在于:还具有作为参比电极的Ag/AgCl电极,作为对电极的铂电极,作为反应试剂的K2S2O8/PBS共反应剂,以及用于检测发光信号的超微弱发光探测仪。
7.根据权利要求6所述的电化学发光传感器系统,其特征在于:所述K2S2O8/PBS共反应剂是由13.51~27.03g K2S2O8溶解在1L pH为7.4~8.4的PBS缓冲溶液中制得。
8.根据权利要求5~7中任一项所述的电化学发光传感器系统,其特征在于:该系统作为检测血液样品中是否含有特定循环肿瘤DNA的传感器系统。
9.一种如权利要求5~7中任一项所述电化学发光传感器系统的应用,其特征在于,包括如下步骤:将待检测DNA样品滴加到所述硫化镉量子点玻碳电极上,以其为工作电极在电化学发光传感器系统中构建三电极测试体系,使用循环伏安法进行扫描,检测其电化学发光强度,作为判断待检测DNA样品是否具有特定目标DNA。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:还包括建立标准曲线的步骤:配置一系列不同浓度的与Hairpin DNA碱基序列互补的T-DNA溶液,分别滴加到所述硫化镉量子点玻碳电极上,以其为工作电极在电化学发光传感器系统中构建三电极测试体系,使用循环伏安法进行扫描,检测其电化学发光强度,再根据滴加不同浓度T-DNA溶液后玻碳电极的电化学发光信号构建标准曲线,后续进行待检测DNA样品检测时将其电化学发光信号与标准曲线对照,确定与待检测DNA样品电化学发光强度相当的T-DNA浓度,作为样品中特定目标DNA的浓度。
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