CN104865383A - 联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片及制备方法，其属于液相蛋白芯片的技术领域。该液相蛋白芯片包括经过羧基功能化或者生物素华的聚苯乙烯微球，在微球上包被纳米金颗粒层以及在纳米金颗粒层嵌设量子点，其中选择五种标记了不同发射波长的量子点的微球分别偶联M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K的单克隆抗体。通过该技术，能够同时检测结直肠癌的M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K标记物，可用于检测结直肠癌的早期事件，灵敏度高，特意性强，检测方法可靠。

Description

联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片及制备方法
技术领域
本发明涉及液相蛋白芯片的技术领域，尤其是涉及能够同时检测五个结直肠癌的特异性标记物的液相蛋白芯片。
本发明涉及的另外一个方面就是液相蛋白芯片的制备方法。
背景技术
结直肠癌是世界上常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率排第三位，近年来，随着人们生活水平的提高以及饮食结构的改变，其发病率呈明显上升趋势。但是，目前国内外对结直肠癌的早期诊断仍处于较低水平，约半数的患者明确诊断时已进入中期和晚期结直肠癌。因此，提高结直肠癌的早期诊断是目前国内外迫切需要解决的关键问题。
目前早期诊断结直肠癌有以下几种的常用技术：
(1)大便隐血试验是结肠癌常用的筛查方法，操作简便、无创，主要缺点是灵敏度低、特异性差。
(2)电子结肠镜(简称内镜)是发现及诊断结直肠癌最有效的手段，也是目前早期诊断结直肠癌的主要方法，尤其是在高危人群的检查具有重要的临床价值。因其为创伤性检查伴有出血、肠穿孔等危险的副作用、且需要一定的设备和仪器，对操作人员的专业水平要求较高，故在大范围人群的检查存在着很大的局限性。
(3)电化学发光技术检测常用肿瘤标记物：如CEA、CA199、CA242、CA50，因其阳性率低，缺乏特异性(66.7％)，不合适用于结直肠癌的早期诊断。
(4)采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DNA和检测微小RNA的浓度对结直肠癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但它们在应用于结直肠癌的早期诊断方面还有待于进一步研究。
近年来，国内外学者开始致力于寻找敏感、特异、可靠、有效的结直肠癌新生物标记物以及建立无创伤性检查和发明方法来提高早期诊断结直肠癌的诊断率。
有研究显示，M2型丙酮酸激酶(M2-PK)在胃肠肿瘤的发生、发展和代谢中发挥重要的作用。与正常组织相比，胃癌组织中M2-PK表达升高，与患者低生存率相关。国外学者认为肿瘤M2-PK在血浆、粪便检测其灵敏度(90.7％)和特异性(96.3％)较高，且与疾病分期和淋巴结转移相关，有望成为结直肠癌新型肿瘤标记物，尤其是在粪便的检测其临床价值更大。M2-PK主要以两种形式存在，即高活性的四聚体形式和低活性的二聚体形式。前者主要存在于分化的组织和正常增殖的细胞中，而后者常存在于肿瘤细胞中，与底物亲和力低，促使肿瘤细胞内糖代谢中间体如磷酸烯醇类物质等积累，对肿瘤细胞的增殖具有重要作用。结直肠癌是一种多基因性疾病，在发生发展过程中涉及到相关基因的改变如：K-ras、APC等基因突变。国外学者报道K-ras基因突变与结直肠癌密切相关，是结直肠癌的早期分子事件。APC基因突变与早期结直肠癌和腺瘤的诊断有较大的临床价值，尤其是在高危人群早期诊断具有重要意义。近年来我国学者提出富含亮氨酸重复测序G蛋白耦联受体5(LGR5)，是一种干细胞分子标记物，也是Wnt信号通路的靶基因之一，其表达量的增加能够促进胃肠黏膜的自我更新，LGR5在结直肠癌组织中呈高水平的表达。
目前有研究提出AKT和PI3K基因突变可作为肿瘤的早期诊断、确定肿瘤的浸润范围以及判断预后的重要指标。近年来，有研究表明MXRAS有可能成为对大肠癌前病变早期诊断的有实用价值的肿瘤标记物。由于结直肠癌在遗传学上是多步骤、多阶段、多基因改变的过程，多基因联合检测对提高检出率及检测敏感性更有重要意义，故本项目根据病人的需要可单指标或多指标联合检测，在结直肠癌早期诊断和筛查中发挥重要作用。本项目研发的试剂成本较低以及病人支出的费用也得到降低，符合我国新医改医疗计划中对加强基层医院和社区医疗服务中心的要求。
另外，随着量子技术的发展，越来越适应生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学以及蛋白质组学等研究。特别的，量子点纳米标记荧光不仅能特异性靶向肿瘤部位，还能通过荧光强弱反映出其活跃程度，可应用于肿瘤的早期诊断和监测疗效。
现有的技术中，关于结直肠癌的检测基本都是基于单个标记物指标进行检测或者只是针对量子编码微球、或者针对结直肠癌的后期检测诊断，难以满足社会发展的需要。
例如中国专利公告号为中国专利申请号CN100342034C披露了-种大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备的方法，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的大肠癌蛋白。提出生物芯片技术可以实现把多个结直肠癌的蛋白表达进行一次检测。不足之处是：该申请号专利只对大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备的方法进行描述，没有研究成熟的早期诊断结直肠癌的特异性标记物，缺乏专一性。
中国公告号为CN 1164238A披露了一种对人结肠癌相关蛋白抗原的单克隆抗体，是特异性对人类具有免疫原性的结肠癌相关抗原的糖蛋白抗原的鼠/人嵌合抗体可用于人结肠癌、乳癌和卵巢癌的免疫诊断。该专利没有成熟的早期诊断结直肠癌标记物，缺乏专一性。
中国专利公告号为CN 101003835B披露了一种用于大肠癌检查的基因组合的检测方法，该方法通过在基因群中的至少2种以上的基因或者基因产物的表达量，筛选检测样品中的大肠癌细胞。该专利同样存在不足：(1)通过销售商业的基因芯片，价格昂贵，不适合临床的广泛应用。(2)使用多种技术：基因芯片、多重RT-PCR技术等，需要设计特异性探针和引物，操作繁琐、费时费力，也不合适应用于临床。(3)同样存在没有成熟的早期诊断结直肠癌标记物，缺乏专一性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的一个方面是提出一种联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其目的解决现有的结直肠癌的检测只能针对癌症后期检测，且针对性不强，检测速度慢、检测数据不准确等的问题。
为了解决上述的技术问题，本发明提出的基本技术方案为：包括直径和材料相同的随机排列在微通道内的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球；
所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球均包被有纳米金颗粒层并且该纳米金颗粒层嵌设有量子点，其中每种微球的纳米金颗粒层中嵌设的量子点的发射波长互不相同；
所述第一微球通过共价方式偶联M2-PK单克隆抗体形成M2-PK量子点荧光探针，所述第二微球通过共价方式偶联K-ras单克隆抗体形成K-ras量子点荧光探针，所述第三微球通过共价方式偶联APC单克隆抗体形成APC量子点荧光探针，所述第四微球通过共价方式偶联AKT单克隆抗体形成AKT量子点荧光探针，所述第五微球通过共价方式偶联PI3K单克隆抗体形成PI3K量子点荧光探针。
本发明的另外一个方面即提供一种用于制备上述的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片的方法。
具体的，其制备方法的步骤为：
A：活化处理，各取400μl第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球进行活化处理；
B：纳米金包被，各取0.25g经过活化处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分别加入胶体金中，离心处理使得第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的外表面包被纳米金颗粒层；
C：量子点标记，将经过步骤B处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分别加入2mL量子点中振荡15分钟，得到量子点标记的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球，其中每种微球所使用的量子点的发射波长互不相同；
D：探针偶联，各取经过步骤C处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球0.01g分别加入到含有M2-PK单克隆抗体、APC单克隆抗体、AKT单克隆抗体、PI3K单克隆抗体和K-ras单克隆抗体的浓度为30μg/mL的磷酸缓冲液中进行偶联，偶联后用PBS缓冲液洗涤得到液相蛋白芯片。
本发明的有益效果是：
本发明所提出的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片针对结直肠癌的M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K标记物，能够用于检测结直肠癌的早期事件，灵敏度高，特异性强，检测结果稳定，检测方法可靠。另外，由于本发明的技术方案能够同时检测五个结直肠癌的标记物，节约检测时间、检测样本、试剂、耗材和劳动，并降低成本。
附图说明
图1为本发明所述的液相蛋白芯片的制备方法的原理框图；
图2为所述的经过纳米金颗粒包被和量子点标记的微球的结构示意图；
图3为所述微球在微通道内的排列示意图。
具体实施方式
以下将结合附图1至附图3对本发明做进一步的说明，但不应以此来限制本发明的保护范围。
为了便于说明兵避免累赘，以下的说明均举一个标记物进行说明，而不对全部标注物做具体说明，因为其基本的制备方法是一样的；或者只说明所用的标记物的相关制备方法，而不列举具体的标记物；但是，这样的做法不应成为公开不充分或者描述不清楚的理由，因为本领域内的普通技术人员根据以下说明是可以清楚的知道具体的制备是如何处理的。例如，以下的具体操作中使用微球这一名词，其可代表第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球。而不用每次重复第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球。
本发明的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，包括直径和材料相同的随机排列在微通道11内的第一微球10、第二微球20、第三微球30、第四微球40和第五微球50；为了更好的显示第一微球10、第二微球20、第三微球30、第四微球40和第五微球50在微通道11内的位置可参照图3，其中第一微球10、第二微球20、第三微球30、第四微球40和第五微球50的直径均小于微通道11的内径。
所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球均包被有纳米金颗粒层并且该纳米金颗粒层嵌设有量子点，其中每种微球的纳米金颗粒层中嵌设的量子点的发射波长互不相同；
所述第一微球通过共价方式偶联M2-PK单克隆抗体形成M2-PK量子点荧光探针，所述第二微球通过共价方式偶联K-ras单克隆抗体形成K-ras量子点荧光探针，所述第三微球通过共价方式偶联APC单克隆抗体形成APC量子点荧光探针，所述第四微球通过共价方式偶联AKT单克隆抗体形成AKT量子点荧光探针，所述第五微球通过共价方式偶联PI3K单克隆抗体形成PI3K量子点荧光探针。
具体的，该液相蛋白芯片是通过以下方式来实现的。
具体实施例一
M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K的单克隆抗体的制备。
1、免疫抗原的制备
通过携带M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K蛋白基因的一种大肠杆菌的工程菌株制备基因重组M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K蛋白；将制得的基因重组M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K蛋白分别注射到不同的多个个小鼠体内进行免疫。
2、杂交瘤细胞的制备和筛选
选择血清抗体效价达到1×106的小鼠，分别于融合前3天腹腔注射M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K抗原100μg。通过无菌的方式取得小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，并加入45％的聚乙二醇(PEG)以促进融合。具体的，聚乙二醇(PEG)按下述步骤加入。在37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1.0ml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟内加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清；用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中。次日于每孔加入100μl含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基，以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K的杂交瘤细胞形成。
3、抗M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K蛋白单克隆抗体腹水的制备和抗体纯化
在经过2步骤处理后的小鼠内注射0.5ml Sigma公司生产的弗氏不完全佐剂，使M2-PK杂交瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约1～2周后，将2×106个杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中，注入小鼠腹腔。注射杂交瘤细胞大约1～2周后，用9号针头将腹水抽出，可反复收集数次；腹水经离心澄清后4℃存放备用。注意，此处仅以M2-PK杂交瘤细胞的腹水制备为例进行说明，而其他的K-ras、APC、AKT和PI3K杂交瘤细胞的腹水制备与M2-PK杂交瘤细胞的腹水制备完全一样，此处不进行赘述。
经过上述方法取得的M2-PK杂交瘤细胞、K-ras杂交瘤细胞、APC杂交瘤细胞、AKT杂交瘤细胞和PI3K杂交瘤细胞的腹水会产生各自的抗体，此时均使用采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化得到抗体。此处仅以M2-PK单克隆抗体为例进行说明，其他的单克隆抗体与M2-PK单克隆抗体一样，不做赘述。
M2-PK杂交瘤细胞的腹水用60mM、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，用0.1N盐酸将醋酸缓冲液的pH值调至4.8，该醋酸款冲液的液体由清亮变混浊，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入33μl辛酸，出现大量沉淀后，在4℃下静置2小时，在转速为5000～10000r/min温度为4℃进行离心处理30分钟，取液体的上清液；在上清液加入1/10体积比的pH为7.4的100mM磷酸盐缓冲液，并用0.1N氢氧化钠将调pH值至7.4，在冰浴搅拌下缓慢加入硫酸铵，具体加入量为每毫升上清液加入0.277硫酸铵即为45％饱和度，在4℃静置过夜，在转速为5000～10000r/min温度为4℃进行离心处理30分钟，不要上清液，将沉淀溶于适量浓度为10毫摩尔每升的磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)对经过上述处理的液体进行定量，分别从杂交瘤获得M2-PK单克隆抗体、K-ras单克隆抗体、APC单克隆抗体、AKT单克隆抗体和PI3K单克隆抗体，测定浓度后的抗体加入浓度50％的甘油中于-80℃下保存。以上获得的单克隆抗体效价1∶512000～1∶1024000；抗体蛋白含量为18.459mg/mL～40.014mg/mL。
具体实施例二
纳米金包被量子编码微球的制备以及M2-PK单克隆抗体、K-ras单克隆抗体、APC单克隆抗体、AKT单克隆抗体和PI3K单克隆抗体的偶联。
1、纳米金颗粒的制备
本发明中的玻璃容器经酸洗并用蒸馏水冲净，然后经硅化处理。硅化处理的方法是用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。纳米金颗粒的制备操作方法及过程如下：将HAuC14先配制成0.01％的水溶液，取100mL加热至沸；搅动下准确加入10mL的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，继续加热煮沸15min，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程约2～3min；将该水溶液冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。用此法可制备20nm左右粒径的胶体金，其中金的浓度约为0.1mg/mL。
2、纳米金颗粒包被微球的制备
纳米金包被微球是通过纳米金颗粒在电性微球表面的沉积来制备的。在10mL离心管中加入0.025g微球和一定量的胶体金，振荡一定时间，离心处理，得到的微球用蒸馏水和乙醇洗涤数次，室温干燥，备用。
3、量子点的编码
将经过包被纳米金颗粒的微球直接加入到2mL量子点的氯仿溶液中，室温下振荡15分钟，此时溶液中几乎没有游离的量子点，然后将经过量子点标记的微球分别用乙醇洗涤几次，干燥后备用。注意，此处标记不同的微球时所使用的量子点的发射波长互不相同。
需要说明一下的是，本发明中的微球使用聚苯乙烯材料制成，微球通过接枝处理带上于纳米金颗粒电性相反的电荷，通过静电作用使得纳米金颗粒沉积在微球的表面；在量子点编码过程中，量子点是通过渗透和扩散等方式嵌入到纳米金颗粒层中并被吸附固定。
经过纳米金颗粒包被以及量子点标记的微球，其结构如图2所示，包括微球01、纳米级颗粒层02和量子点03。
具体实施例三
经过纳米金颗粒包被和量子点标记的微球与M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K的单克隆抗体偶联。
此处以M2-PK单克隆抗体为例进行说明，而其他的单克隆抗体的偶联与M2-PK单克隆抗体的偶联一样，此处不进行赘述。
把试管中含M2-PK单克隆抗体的浓度为50nmol/L，pH＝6.0的磷酸缓冲液在电磁搅拌下稀释到30μg/mL，加入吐温-80到1％(V/V)，然后把0.01g量子点编码纳米金颗粒层包被的微球加入其中，继续搅拌10分钟，然后把5％的BSA溶液(1％)加入试管中以封闭没有反应完的位点，封闭完成后，对微球进行离心分离，再用PBS缓冲液洗涤，重复洗涤3次。经过计算，探针的密度大约为0.01μg/g微球。
另外，以下将说明一下以本发明所制得的液相蛋白芯片的检测方法：
a试剂盒置室温平衡30min，加样前充分混匀各试剂。
b在反应板上依次加入反应缓冲液、血清样本(或标准品)20μl/孔，微球悬液20μl/孔，充分混匀。
c 37℃孵箱避光反应45min。
d取出反应板加PE标记二抗溶液充分混匀，37℃孵箱避光反应30min后，每孔加终止液80μl后充分混匀。
e置Luminex 200多功能流式分析仪上读数，用配套软件拟合剂量一反应曲线，计算被检血清样本中各项检测指标的浓度。
再者，本发明所述的液相蛋白芯片可以得到以下的应用：
(1)液相蛋白芯片技术将液相蛋白芯片与流式细胞术充分结合，以荧光微球为反应载体，反应体系为液体，可同时检测100个以上的指标。
(2)本发明可以同时检测M2-PK、APC、K-ras、AKT和PI3K等多个结直肠癌的标记物，且可以检测血样本、粪便、尿液、唾液等分泌物。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其特征在于：包括直径和材料相同的随机排列在微通道内的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球；
所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球均包被有纳米金颗粒层并且该纳米金颗粒层嵌设有量子点，其中每种微球的纳米金颗粒层中嵌设的量子点的发射波长互不相同；
所述第一微球通过共价方式偶联M2-PK单克隆抗体形成M2-PK量子点荧光探针，所述第二微球通过共价方式偶联K-ras单克隆抗体形成K-ras量子点荧光探针，所述第三微球通过共价方式偶联APC单克隆抗体形成APC量子点荧光探针，所述第四微球通过共价方式偶联AKT单克隆抗体形成AKT量子点荧光探针，所述第五微球通过共价方式偶联PI3K单克隆抗体形成PI3K量子点荧光探针。
2.如权利要求1所述的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其特征在于：所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球为带电性的微球，并且纳米金颗粒层是通过第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的电性吸引沉积在各自的表面上。
3.如权利要求1所述的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其特征在于：所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的球面经过羧基处理或者生物素化处理以方便形成量子点荧光探针。
4.如权利要求1所述的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其特征在于：所述M2-PK单克隆抗体、APC单克隆抗体、AKT单克隆抗体、PI3K单克隆抗体和K-ras单克隆抗体分别通过M2-PK杂交瘤细胞、APC杂交瘤细胞、AKT杂交瘤细胞、PI3K杂交瘤细胞以及K-ras杂交瘤细胞注射在不同的小鼠体内形成的腹水制备而得。
5.如权利要求5所述的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其特征在于：所述金胶体的粒径为18-22nm，其中金的浓度为0.1mg/ml。
6.如权利要求1所述的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其特征在于：所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球表面接枝有羧基，并通过该羧基与所述量子点固定连接。
7.一种制备方法，用于制备权利要求1至权利要求7之一所述的液相蛋白质芯片，其特征在于，包括步骤：
A：活化处理，各取400μl第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球进行活化处理；
B：纳米金包被，各取0.25g经过活化处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分别加入胶体金中，离心处理使得第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的外表面包被纳米金颗粒层；
C：量子点标记，将经过步骤B处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分别加入2mL量子点中振荡15分钟，得到量子点标记的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球，其中每种微球所使用的量子点的发射波长互不相同；
D：探针偶联，各取经过步骤C处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球0.01g分别加入到含有M2-PK单克隆抗体、APC单克隆抗体、AKT单克隆抗体、PI3K单克隆抗体和K-ras单克隆抗体的浓度为30μg/mL的磷酸缓冲液中进行偶联，偶联后用PBS缓冲液洗涤得到液相蛋白芯片。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：B的具体步骤为，在五个10mL离心管中加入分别加入0.025g第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球，以及各加入0.2～0.4mg的金胶体，振荡2h后，离心处理，得到具有纳米金颗粒层的微球，并用蒸馏水和乙醇分别洗涤3次，在室温干燥后备用。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：C的具体步骤为，各取0.25g的微球各自加入到含有体积比为5％的丁醇和体积比为95％的氯仿的混合溶液中，然后加入2mL含有不同比例量子点的溶液，室温下搅拌2h，过滤分离出微球并用乙醇洗涤数次，干燥。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：D步骤具体为，向试管中加入含M2-PK单克隆抗体的磷酸缓冲液，并在电磁搅拌下将其稀释到30μg/mL，加入吐温T-80到1％(V/V)，然后把0.01g经过步骤C处理的第一微球加入其中，继续搅拌10分钟，然后把5％的BSA溶液加入试管中以封闭没有反应完的位点；待封闭完成后，对微球进行离心分离，再用PBS缓冲液洗涤，重复洗涤3次；APC单克隆抗体、AKT单克隆抗体、PI3K单克隆抗体和K-ras单克隆抗体的偶联依照上述的方法处理。
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