CN107764804A - 一种自组装聚hrp探针、制备方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种自组装聚HRP探针、制备方法、试剂盒及其应用。本发明自组装聚HRP探针分子链中含有多个HRP，具有双重信号放大功能，设计能够与目标物和自组装聚HRP探针结合的辅助探针，采用化学发光的原理对多种物质进行检测，如蛋白质、DNA、RNA等。同时本发明将磁分离技术、自组装聚HRP探针的双重信号放大功能和化学发光检测技术相结合，建立了一种灵敏度高、特异性强、操作简便的方法并成功应用于血清中循环miR‑142‑3p的检测。对于血清中miR‑142‑3p检测结果表明T‑ALL患者(n＝7)与健康人(n＝7)之间响应信号的差别具有统计学意义(P<0.05)。

Description

一种自组装聚HRP探针、制备方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种自组装聚HRP探针、制备方法、试剂盒及其应用。

背景技术

目前对于蛋白质、DNA、RNA等的检测方式多种多样，基于化学发光检测的分析方法是其中一种，化学发光检测通常是通过催化发光底物发生反应产生检测信号，通过测定产生的化学发光信号大小确定待测物质的含量，其中辣根过氧化物酶(HRP)特有的催化性能，常被用作含有双氧水的发光底物的化学发光分析检测过程中，但是现有市售的HRP在用于含量较低的目标物的检测过程中会存在催化性能有限，不能高灵敏性的、高准确性的检测出目标物的缺陷，例如对于一些微小RNA的的检测。

微小RNA，又称microRNA、miRNA，是由19-25个核苷酸组成的非编码单链RNA，它具有高度保守性、发育时序性和器官组织特异性。成熟的miRNA可被装配整合到RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)中，进而引起靶mRNA降解或翻译抑制。通过上述转录后水平调控的方式，miRNA参与调控人体中超过1/3的基因，在细胞分裂、分化、凋亡、迁移和新陈代谢等多种生命活动中起到了重要的作用。越来越多的研究表明肿瘤患者体内的miRNA表达异常，且不同的肿瘤具有其特异性的miRNA表达谱。如68％慢性淋巴细胞白血病患者中miR-15a和miR-16-1有明显的表达下调或缺失。同时肿瘤来源的miRNA可被释放到循环系统进入血液中，形成循环miRNA，因对其检测具有取材方便、非侵入性的特点，循环miRNA迅速成为备受广泛关注的新型肿瘤标志物。另有研究表明，miRNA的表达水平改变与肿瘤的疾病状态、肿瘤患者预后和转归有关，如miR-142-3p表达水平较高的急性T淋巴细胞白血病患者较表达量低者更易发生复发，且生存时间更短。综上所述，miRNA的表达异常与肿瘤的发生、发展、预后及复发具有密切联系，miRNA的含量检测对肿瘤早期诊断、疗效监控、转移评估以及预后判断具有重要意义。

然而实际样品中miRNA具有含量低、同一家族中的miRNA序列差异小等特点，因此要求检测miRNA的方法要兼具高灵敏度和高特异性。目前miRNA的检测方法主要有NorthernBlot、RT-PCR、miRNA芯片检测法等。Northern Blot是经典的探针杂交检测法，被认为是检测miRNA的金标准，主要通过固定于固相载体上的寡核苷酸链与目标miRNA互补的方法将其捕获下来再进行后续检测，该方法存在反应时间长、灵敏度较低、样品用量大等不足。RT-PCR法是常用的高灵敏检测miRNA的方法，首先将目标miRNA逆转录为cDNA，然后进行PCR扩增，最后检测扩增后的cDNA含量从而实现对miRNA的检测，此方法常产生一些假阳性信号、且样品前处理复杂、耗时长、成本高，因此，限制了它的应用。miRNA芯片法是将多个与miRNA互补的核酸探针修饰于芯片上，通过杂交后产生的信号实现检测，该类方法适用于高通量、多组分miRNA的同时检测，但芯片制作和检测费用昂贵。因此，迫切需要建立一种灵敏度高，特异性强、操作简便、费用经济的方法以满足对实际样品中miRNA检测的需求。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一是提供一种自组装聚HRP探针，探针分子链中接入多个HRP，对化学发光检测产生信号放大作用，提高检测的灵敏度和准确性。

本发明的目的之二在于提供一种自组装聚HRP探针的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种试剂盒，该试剂盒使用本发明自组装聚HRP探针，采用化学发光的原理实现对目标物的检测，检测灵敏度和准确性高。

本发明的目的之四在于提供一种本发明试剂盒在检测DNA、RNA和蛋白质方面的应用，尤其是能够应用于检测miR-142-3p，利用本发明试剂盒检测miR-142-3p的灵敏度和准确性高。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种自组装聚HRP探针，由两种DNA探针杂交而成，其中一种为标记HRP的DNA探针，记为杂交探针1，其核苷酸序列为：

5'-HRP-AAAAAAAAAATACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；

另一种DNA探针记为杂交探针2，其核苷酸序列为：

5'-GCACCTGGGGGAGTAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。

上述自组装聚HRP探针的制备方法，包括取杂交探针1和杂交探针2，在室温环境下涡旋杂交，即完成。其中涡旋杂交的时间为1小时。

涡旋杂交反应过程中一个杂交探针1的部分序列与一个杂交探针2的部分序列结合，该杂交探针2未与上一个杂交探针1结合的部分序列再与下一个杂交探针1的部分序列结合，然后下一个杂交探针1未与该杂交探针2结合的部分序列再与下一个杂交探针2结合，如此往复循环杂交，使得杂交完成后的整个DNA探针链中结合入多个HRP，实现在使用该探针进行化学发光检测时对检测信号进行放大，提高检测的灵敏度。

一种试剂盒，包括用于捕获目标物的捕获探针、辅助探针和上述自组装聚HRP探针；其中辅助探针的核苷酸序列从5'端到3'端包括与目标物特异性结合的序列1、与自组装聚HRP探针互补结合的序列2。

可选的，上述试剂盒还包括目标物捕获载体、化学发光板、洗涤液、缓冲液、化学发光底液。

上述试剂盒应用于检测RNA、DNA和蛋白质，比如miRNA。

进一步的，上述试剂盒可以应用于检测miR-142-3p。

当上述试剂盒应用于检测miR-142-3p时，所述捕获探针的核苷酸序列为5'-AAAAAAAAAATCCATAAAGTAG-3'；辅助探针的核苷酸序列为5'-GAAACACTACAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。

为了更进一步的提升试剂盒的检测灵敏度，当上述试剂盒应用于检测miR-142-3p时，所述自组装聚HRP探针为浓度为20～500nmol/L的杂交探针1和浓度为20～500nmol/L杂交探针2杂交制成。

可选的，所述目标物捕获载体为链霉亲和素磁珠。在使用时通常将捕获探针首先负载在目标捕获载体上作为一个整体试剂使用，具体为将捕获探针负载在链霉亲和素上，记为C-DNA-MNPs，通过将链霉亲和素磁珠与捕获探针混合，在室温下涡旋反应制得，保存在免疫磁珠保存液中。

上述C-DNA-MNPs的具体制备方法为：

A：磁珠清洗：采用PBS缓冲液对链霉亲和素磁珠进行清洗；

B：链霉亲和素磁珠与捕获探针的结合：在清洗后的链霉亲和素磁珠中加入捕获探针，混合均匀，室温下涡旋反应后磁分离，获得磁珠，并采用PBS缓冲液清洗磁珠，即为C-DNA-MNPs；

C：保存磁珠：将步骤B制备的C-DNA-MNPs重悬于免疫磁珠保存液中，低温下储存备用。

为了更进一步提升试剂盒检测的灵敏度，当试剂盒应用于检测miR-142-3p时，上述C-DNA-MNPs制备过程中步骤B中加入500μl 100～800nmol/L的捕获探针。

上述试剂盒应用于检测miR-142-3p时，所述洗涤液为含10mmol/L Tris、50mmol/LNaCl、5mmol/L MgCl₂·6H₂O和0.05％Tween-20。

所述杂交缓冲液包括杂交缓冲液1和杂交缓冲液2；其中杂交缓冲液1为含20mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl和10mmol/L MgCl₂·6H₂O；杂交缓冲液2为含20mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、10mmol/L MgCl₂·6H₂O、1mmol/L DTT、1U/μL RNase inhibitor。

所述化学发光底物液包括化学发光底液A、化学发光底液B；其中化学发光底物液A为鲁米诺+增强剂(对羟基联苯，BIP)，化学发光底物液B为双氧水溶液。

上述试剂盒用于检测待检测样品中的miR-142-3P的具体检测方法，包括以下操作步骤：

(1)洗涤化学发光板：采用洗涤液清洗化学发光板；

(2)加C-DNA-MNPs：用杂交缓冲液1洗涤悬浮于免疫磁珠保存液的C-DNA-MNPs 3次，并重悬于相同体积杂交缓冲液1中，每孔1～90μL加入化学发光板中，用洗涤液洗板1次；

(3)加待检测样品：在步骤(2)处理后的化学发光板中加入一定体积的待检测样品，温育，磁分离，弃上清，用洗涤液洗板1次；

(4)在化学发光板每孔中加入辅助探针，温育，然后加入自组装聚HRP探针，温育，然后磁分离，弃上清，用洗涤液洗板3次；

(5)在化学发光板每孔中加入化学发光底液，用微孔板式发光检测仪检测RLU；

(6)按照上述步骤(1)至(5)同样的方法检测不同浓度的miR-142-3P标准品的RLU，绘制出RLU与miR-142-3P浓度之间关系的标准曲线图，得出RLU与miR-142-3P浓度之间的关系式，然后将步骤(5)中检测的待检测样品的RLU带入该关系式，即可计算出待检测样品中miR-142-3P的浓度。

为了更进一步提升试剂盒检测的灵敏度，检测miR-142-3p时，上述检测方法中C-DNA-MNPs的用量为1mg/ml的C-DNA-MNPs 10～90μl；辅助探针的浓度为10～100nmol/L；自组装聚HRP探针的浓度为20～500nmol/L。步骤(3)和步骤(4)中温育的条件为25℃下温育20min。

可选的，上述试剂盒用于检测血清样品中miR-142-3P；所述试剂盒还包括裂解液，所述裂解液中含有10～1000μg/ml蛋白酶K和质量体积百分含量为0.1～10％的SDS，pH＝7.4。

本发明有益效果：

1)本发明将两种DNA探针，其中一种标记有辣根过氧化物酶，进行杂交制得聚HRP探针，杂交过程中两种DNA探针的部分序列相互结合，实现循环杂交，由于其中一个DNA探针分子上标记有HRP，使得在杂交后的探针分子链中接入多个HRP。在化学发光分析法固有的灵敏度高的基础上，利用自组装方法制备含有多个辣根过氧化物酶催化中心的聚HRP(即辣根过氧化物酶聚合物)，该聚HRP探针在具备单个辣根过氧化物酶催化信号放大性能的同时，由自组装方法在同一条聚合物链上组装的多个辣根过氧化物酶催化中心亦可实现集成信号放大，从而有效地提高方法的检测灵敏度；

2)进一步地本发明的自组装聚HRP探针可以基于化学催化发光原理对DNA、RNA和蛋白质等多种物质进行检测，只需要设计合适的捕获探针，在辅助探针上设计能够与目标物和聚HRP结合的序列即可，而无需改变聚HRP探针设计，通用性强；

3)本发明采用链霉亲和素磁珠取代传统的化学发光板作为固相载体以增大固液接触面积、提高捕获效率，同时基于磁珠的磁分离性能可实现在后续实验中的检测体系置换，实现从复杂的血清体系向缓冲体系的转换，有效解决在血清中直接进行检测存在的背景干扰大，探针易降解等问题；

4)通过加入含SDS和蛋白酶K的裂解液，使血清中存在的miRNA有效地释放出来，有利于处理后血清样品中miR-142-3p的检测；裂解液中的SDS可以破坏外泌体和凋亡小体等囊泡结构，使miRNA释放出来；蛋白酶K可以破坏RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)，使蛋白质和miRNA分离；

5)本发明通过利用自组装聚HRP探针对信号进行放大，采用链霉亲和素磁珠作用载体提升对目标物的捕获效率，应用检测miR-142-3p的线性范围宽、检测限低、精密度和准确度高，实现对血清样品中循环miR-142-3p高灵敏度、高特异性和高准确度的检测。实际样品检测结果表明该方法可有效地用于血清中循环miR-142-3p检测。

附图说明

图1为H1 DNA(杂交探针1)、H2-1DNA(杂交探针2-1)、以及H1 DNA与H2-1DNA杂交后物质的琼脂凝胶电泳结果图；

图2为C-DNA-MNPs磁珠透射电子显微镜观察图片；

图3为利用本发明自组装聚HRP探针检测miR-142-3p的检测原理示意图；

图4为不同序列的DNA探针杂交后得到的自组装HRP探针的信号放大强弱的验证结果示意图；

图5为同等浓度与miR-142-3p相近的序列的检测结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

下述实施例中使用到的试剂和实验仪器介绍如下：

1、主要仪器

微孔板式发光检测仪(Berthold LB960)；纳米粒度及Zeta电位分析仪(ZetasizerNano-zs90，英国马尔文仪器有限公司)；透射电子显微镜(JEM-2100，日本)；酸度计(pH213，意大利HANNA公司)；78-1型电子磁力加热搅拌器(金坛市华峰仪器有限公司)；电热恒温培养箱(DHG-9146A，上海精宏实验设备有限公司)；XH-C型涡旋混匀仪(金坛市国旺实验仪器厂)；超微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)；精密电子天平(FA1204，青岛金科仪器仪表有限公司)；磁分离板(百运纳米科技有限公司)；可调系列微量加样器(Eppendorf，德国)，普通低温冰箱(青岛海尔集团有限公司)；数显电子恒温水浴锅(HH-2)。

2、主要试剂：

链霉亲和素磁珠(MNPs，百运纳米科技有限公司)；蛋白酶K(默克公司)；十二烷基硫酸钠(SDS)、对羟基联苯(BIP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)，上海晶纯生化科技股份有限公司；RNase inhibitor、RNase Free水、实验所用核酸序列，大连宝生物工程有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)、吐温-20(Tween 20)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，索莱宝科技有限公司；氯化镁(上海麦克林生化科技有限公司)；盐酸(洛阳昊华化学试剂有限公司)；氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(天津市科密欧化学试剂有限公司)；鲁米诺(Sigma)；氢氧化钠(洛阳市化学试剂厂)；30％双氧水(昊天试剂化学有限公司)；N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇(天津市博迪化工有限公司)；低吸附96孔化学发光板(深圳金灿华实业有限公司)；

3、配置溶液：

利用上述第2部分所述试剂配置所需要的溶液：

1)0.01mol/L PBS(pH＝7.4)；2)0.01mol/L PBST(pH＝7.4)；3)0.1mmol/L Tris-HCl(pH＝8.5)；

4)杂交缓冲液1(pH＝7.4)：20mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl和10mmol/L MgCl₂·6H₂O；

5)杂交缓冲液2(pH＝7.4)：20mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、10mmol/L MgCl₂·6H₂O、1mmol/L DTT、1U/μL RNase inhibitor；

6)洗涤液(pH＝7.4)：10mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、5mmol/L MgCl₂·6H₂O和0.05％Tween-20；

7)增强剂储存液：增强剂为BIP；

8)化学发光底液A：鲁米诺+增强剂；

9)化学发光底液B：双氧水溶液；

10)裂解液(pH＝7.4)：含10～1000μg/ml蛋白酶K和0.1～10％(w/v)SDS；

11)免疫磁珠保存液：购自百运纳米科技有限公司。

所用试剂均为分析纯，实验用水均为Milli-Q水(电阻率大于18.2MΩ·cm)

4、实验所用核酸序列

表1 实验所用核酸序列

序列名称	核酸序列(由5’到3’)
		捕获探针(C-DNA)	Biotin-AAAAAAAAAATCCATAAAGTAG
miR-142-3p	UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA
		DNA	TGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA
辅助探针(A DNA)	GAAACACTACAACTAAAAGGGTCTGAGGG
		杂交探针1(H1 DNA)	AAAAAAAAAATACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGT
杂交探针2-1(H2-1 DNA)	GCACCTGGGGGAGTAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG
		杂交探针2-2(H2-2 DNA)	GCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG
单碱基错配序列1(Mis 1-1)	UGUAGUGUUUCCUACUUUAUCGA
		单碱基错配序列2(Mis 1-2)	UGUAGUGUUUCCUACUUCAUGGA
单碱基错配序列3(Mis 1-3)	UGUAGUCUUUCCUACUUUAUGGA
		双碱基错配序列1(Mis 2-1)	UGUAGUGUUUCCUACCUUAUCGA
双碱基错配序列2(Mis 2-2)	UGUAGUCUUUCCUACUUCAUGGA
		随机序列(Ran)	AACGACACCGAUCAAGCGUAA AG

实施例1

本实施例制作自组装聚HRP探针，具体方法为：用杂交缓冲液1将杂交探针1(H1DNA)和杂交探针2(H2-1 DNA)稀释至所需的浓度，然后将稀释后的H1 DNA与H2-1 DNA加入涡旋混匀仪中，室温涡旋杂交1h，即得所述的自组装聚HRP探针。

杂交结果表征：分别将H1 DNA和H2-1 DNA稀释至浓度为1μmol/L、2μmol/L；然后取10μL 1μmol/LH1 DNA、10μL1μmol/LH2-1 DNA、10μL终浓度为1μmol/LH1 DNA和1μmol/LH2-1DNA杂交后的溶液、10μL终浓度为2μmol/LH1 DNA和2μmol/LH2-1 DNA杂交后的溶液，分别进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压100V，时间1h，最后进行凝胶成像，如图1所示，其中图1中泳道1：引物；泳道2：1μmol/L H1 DNA；泳道3：1μmol/L H2-1 DNA；泳道4：1μmol/L H1DNA+1μmol/L H2-1 DNA；泳道5：2μmol/L H1 DNA+2μmol/L H2-1 DNA。由图1可知当H1 DNA和H2-1 DNA单独存在时，H1 DNA存在两个条带，可能与其二级结构有关，H2-1 DNA存在一个条带。当H1 DNA和H2-1 DNA以摩尔比1:1混匀后，单独的H2-1 DNA条带不复存在，取而代之的是一系列长度不等(250bp至2000bp之间)的杂交带，表明H1 DNA和H2-1 DNA之间通过自组装形成了聚HRP探针。

实施例2

本实施例对固相载体进行改性，固相载体作为目标物捕获载体，本实施例选择链霉亲和素磁珠作为固相载体，采用C-DNA进行改性，具体方法为：

A：取300μL 2mg/mL的链霉亲和素磁珠于1.5mL低吸附离心管中，磁分离，弃上清。再加入300μL PBS缓冲溶液，充分混匀后磁分离，弃上清，共洗涤磁珠3次。

B：链霉亲和素磁珠与C-DNA的结合：向上述低吸附离心管中加入500μL 10～1000nmol/L的C-DNA，充分混匀，室温下涡旋反应30min后磁分离，用500μL PBS再清洗磁珠2次，即为修饰有C-DNA的链霉亲和素磁珠，记为C-DNA-MNPs；

C：保存：将步骤B中修饰有C-DNA的链霉亲和素磁珠C-DNA-MNPs重悬于600μL免疫磁珠保存液中，4℃下储存备用。

杂交改性结果表征：取本实施例制作的C-DNA-MNPs磁珠，采用透射电子显微镜进行观察拍照，结果如图2所示，链霉亲和素磁珠呈现近似球形，粒径在150nm～300nm之间，粒径大小较均一，放大边缘部分可见磁珠分为两层，中间黑色部分为磁核，边缘灰色部分与其表面修饰的链霉亲和素和C-DNA有关。同时粒度分析仪测得C-DNA-MNPs相比单独的MNPs而言，Zeta电位向负方向移动了22mV，表明C-DNA成功结合在链霉亲和素磁珠表面。

实施例3

一种试剂盒，包括低化学发光板、磁珠、辅助探针、自组装聚HRP探针、化学发光底液、裂解液、杂交缓冲液、洗涤液；其中化学发光底液包括A液和B液，其中A液为鲁米诺+增强剂，B液为双氧水溶液；杂交缓冲液包括杂交缓冲液1和杂交缓冲液2；磁珠为按照实施例2所述方法制备的C-DNA-MNPs磁珠；自组装聚HRP探针为按照实施例1所述方法制备的自组装聚HRP探针。

本实施例试剂盒用于检测miR-142-3p，该试剂盒中所用的核酸序列如表1所示，其中捕获探针能够特异性的与miR-142-3p结合，辅助探针部分序列与miR-142-3p中的部分序列互补配对，辅助探针另一部分与自组装聚HRP探针互补配对结合。

检测原理：

如图3所示，以链霉亲和素磁珠为固相载体，利用链霉亲和素/生物素间强的特异性相互作用，将生物素化的捕获探针固定到链霉亲和素磁珠表面，形成C-DNA-MNPs。当目标物miR-142-3p存在时，C-DNA特异性识别miR-142-3p的部分序列从而将其捕获下来；磁分离洗涤后，加入辅助探针，其部分序列与miR-142-3p的另外一部分序列互补配对形成“三明治结构”(C-DNA/miRNA/A DNA)；磁分离洗涤后，再加入提前制备好的自组装聚HRP探针(poly-HRP probe)，C-DNA/miRNA/A DNA中A DNA裸露的序列与自组装聚HRP探针互补结合，孵育后磁分离洗涤除去未结合探针；最后加入化学发光底液，用微孔板式发光检测仪检测化学发光的信号强度，利用信号强度与miR-142-3p浓度之间的相关关系实现对miR-142-3p检测。

具体检测方法：

1：绘制标准曲线：

(1)洗涤化学发光板：取低吸附96孔化学发光板，每孔加入300μL洗涤液洗涤一次，减少化学发光板对反应物的非特异性吸附。

(2)加C-DNA-MNPs：用杂交缓冲液1洗涤悬浮于免疫磁珠保存液的C-DNA-MNPs 3次，并重悬于相同体积杂交缓冲液1中，每孔1～90μL加入化学发光板中，用洗涤液洗板1次。

(3)加目标物(miR-142-3p或与其同序列的DNA)：用杂交缓冲液2将目标物稀释成不同浓度，每孔100μL加入化学发光板中，每个浓度做4个平行，25℃下温育20min，磁分离，弃上清，用洗涤液洗板1次。

(4)先后加入1～100nmol/L A DNA和自组装聚HRP探针，25℃下各温育20min后磁分离，弃上清，用洗涤液洗板3次。

(5)检测：每孔加入100μL化学发光底液A和100μL化学发光底液B，用微孔板式发光检测仪检测RLU，绘制不同浓度miR-142-3p与对应的RLU的标准曲线，得出浓度与RLU之间的对应关系式为Y＝26.50341X+13095.48246(r＝0.99837，X为C_miR-142-3p，Y为相对应的RLU-RLU0)。

2、血清样品检测：因为血清中的miRNA主要存在于外泌体和凋亡小体等囊泡结构中，要检测出血清中miR-142-3p含量，须破坏外泌体和凋亡小体等囊泡结构让miR-142-3p释放。因此在检测血清中miR-142-3p含量时，需要将血清样品与试剂盒中的裂解液等比例混合，在25～80℃下水浴处理，裂解液中的SDS可以破坏囊泡结构，使miRNA释放出来；蛋白酶K可以破坏RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)，使蛋白质和miRNA分离，处理后的血清溶液储存于-20℃备用。其检测方法与上述标准样品标准曲线绘制的检测方法基本相同，唯一不同的是，在步骤(3)加入备用的处理后血清溶液；然后按照步骤(4)和步骤(5)同样的方法检测血清样品的RLU，将检测得到的RLU带入标准曲线关系式中，计算出Y即为血清样品中miR-142-3p的含量。

实施例4

为了提高对miR-142-3p检测的准确性，对miR-142-3p检测过程中的各个条件进行了优化，具体优化过程为：

采用与miR-142-3p同序列的DNA为检测目标进行条件优化，所用浓度为1nmol/L，所用杂交缓冲液为杂交缓冲液1。

1、化学发光条件优化

采用单因素法优化化学发光条件，具体包括鲁米诺浓度、双氧水浓度和增强剂的浓度，首先向化学发光板中加入HRP，每孔10μL，浓度为4×10^-5mg/mL，再分别加入含有不同浓度鲁米诺、双氧水和增强剂的化学发光底液，在微孔板式发光检测仪上检测相对化学发光值。获得的优化结果为：鲁米诺的最优浓度为1mmol/L、双氧水的最优浓度为3mmol/L、增强剂的最优浓度为75μmol/L。

2、链霉亲和素磁珠上C-DNA修饰密度优化

链霉亲和素磁珠上C-DNA的修饰密度不同，会直接影响到C-DNA对目标物的捕获效率。因此对链霉亲和素磁珠上C-DNA的修饰密度进行优化显得尤为重要。具体方法为通过改变与链霉亲和素磁珠反应时C-DNA的浓度，使链霉亲和素磁珠上修饰不同密度的C-DNA，选择最优的C-DNA浓度。实验获得的修饰时采用的最优C-DNA浓度为100～800nmol/L。

3、反应物用量优化

反应物的用量多少，直接影响方法的灵敏度等关键指标。当反应物用量过少时，会使得检测信号值偏低；当反应物用量过多时，又会影响信号、浪费试剂等。因此分别对反应物C-DNA-MNPs用量、A DNA浓度和自组装聚HRP探针浓度进行了优化。实验获得的最优C-DNA-MNPs用量为10～90μL(浓度为1mg/mL)、最优A DNA的使用浓度为10～100nmol/L、最优自组装聚HRP探针的使用浓度为20～500nmol/L(以H1 DNA与H2-1 DNA自组装形成聚HRP探针时采用的H1 DNA浓度表示)。

4、温育时间优化

采用单因素法对C-DNA-MNPs捕获检测目标物的时间、加入A DNA后温育时间、加入自组装聚HRP探针后温育时间进行了优化。获得的优化结果为C-DNA-MNPs捕获检测目标物时间为20min，加入A DNA后温育时间为20min，加入自组装聚HRP探针后温育时间为20min。

5、杂交缓冲溶液中Mg²⁺浓度优化

Mg²⁺对维持双螺旋结构的稳定具有重要作用，但若其浓度过高，则不利于磁颗粒的分散，影响实验结果。因此，在不改变溶液pH的条件下对杂交缓冲液中的Mg²⁺浓度进行单因素优化。获得的优化结果为杂交缓冲溶液中Mg²⁺最优使用浓度为1～20mmol/L。

实施例5

具有不同DNA序列的H2-1 DNA和H2-2 DNA在杂交过程中会与H1 DNA产生不同的杂交行为，形成不同类型的聚HRP探针，产生的信号强度也不同，本发明中选择的H1 DNA/H2-1DNA杂交形成的聚HRP探针所获得的检测信号更强，能够更好的适应痕量物质的检测，比如血清中miR-142-3p的检测，为了验证自组装聚HRP探针的信号放大的强弱与选择的H2DNA(H2-1 DNA或H2-2 DNA)的序列相关，本实施例进行了如下实验：

分别采用表1中所示的杂交探针2-1(H2-1 DNA)和杂交探针2-2(H2-2 DNA)按照实施例1所示的方法与杂交探针1进行杂交，获得自组装聚HRP探针，然后采用获得的自组装聚HRP探针按照实施例3所示的检测方法与不同浓度的DNA(其序列与miR-142-3p相同，仅为用T碱基代替了U碱基)杂交，统计不同的自组装聚HRP检测到的RLU值，结果如下图4所示，由图4可知杂交探针2-1与杂交探针1制作的自组装聚HRP的信号强度要明显强于杂交探针2-2与杂交探针1制作的自组装聚HRP，表明本发明通过优化选择性制备的聚HRP探针具有更强的信号放大作用。

实施例6

评价实施例3所述检测方法：

1、检测限考察：配制4个浓度低于线性范围下限的miR-142-3p溶液(浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5pmol/L)，在实施例4优化后的条件下进行检测分析，每个浓度做4个平行，同时测定4个试样空白的相对化学发光值，求出对应的值(为溶剂空白相对化学发光值的均值，SD为其标准差)，miR-142-3p溶液的相对化学发光值均值大于所对应的miR-142-3p浓度为该方法的检测限，检测限为100fmol/L。

2、精密度考察：板内精密度：用杂交缓冲液2配制低、中、高(100、1000、7500pmol/L)三个浓度的miR-142-3p溶液，在同一块化学发光板中按优化后的条件进行检测，每个浓度做6个平行，记录对应的RLU，根据标准曲线计算得到相对应的浓度，求出板内精密度(RSD)。

板间精密度：用杂交缓冲液2配制低、中、高(100、1000、7500pmol/L)三个浓度的miR-142-3p溶液，在3块化学发光板中按优化后的条件分别进行检测，每个浓度做6个平行，记录对应的RLU，根据标准曲线计算得到相对应的浓度，求出板间RSD。

精密度考察结果如表2所示，对于高、中、低3个浓度的样品，板内精密度范围为3.00％～8.26％，板间精密度的范围是4.84％～9.27％。

表2 板内和板间精密度考察(n＝6)

3、加标回收率：

配制低、中、高(100、1000、7500pmol/L)三个浓度的miR-142-3p标准溶液，在一块化学发光板中用所建立的方法进行检测，每孔100μL，每个浓度做6个平行。将测得的RLU带入标曲计算得到对应的检测浓度，求出方法的加标回收率。

加标回收率的测定结果如表3所示，所建立的方法对高、中、低三个浓度标准溶液的加标回收率分别为107.14％、103.38％和113.40％。上述实验结果表明该方法在缓冲液中检测目标物具备高的准确度。

表3 缓冲液中加标回收率考察(n＝6)

4、特异性考察：

实际样品的成分复杂，要求检测方法具有较好的特异性，选择与miR-142-3p相差一个碱基的单碱基错配序列3条、相差两个碱基的双碱基错配序列2条以及1条随机序列作为检测目标，具体序列如表1所示。比较5nmol/LmiR-142-3p与同浓度的单碱基错配序列、双碱基错配序列、随机序列溶液的检测结果，评价方法特异性。

结果如下图5所示：组1：单碱基错配序列1；组2：单碱基错配序列2；组3：单碱基错配序列3；组4：双碱基错配序列1；组5：双碱基错配序列2；组6：随机序列；组7：miR-142-3p。当检测目标浓度相同时，单碱基错配序列的信号值约为miR-142-3p的1/3；双碱基错配序列和随机序列的信号值更低。上述实验结果表明该方法具备高的特异性。

实施例7实际样品中miR-142-3p的检测

1、血清样品中miR-142-3p的检测

按照实施例3所述的方法按照实施例4所示的优化条件对血清中miR-142-3p检测，结果表明T-ALL患者(n＝7)与健康人(n＝7)之间响应信号的差别具有统计学意义(P<0.05)，成功证明了该方法可有效地用于临床样品中白血病患者血清的循环miR-142-3p检测。

2、血清中加标回收率测定

将正常儿童血清按实施例3所述方法进行处理，然后向其中加入一定浓度的miR-142-3p标准品，配制浓度分别为100pmol/L、1000pmol/L和7500pmol/L的三个浓度样品，用所建立的方法进行实验，检测RLU，同时测定未加标血清的RLU，每个血清样品设计4个平行计算加标回收率。

由于正常儿童血清中miR-142-3p含量很低，所建立的方法无法检测出其具体含量，实际检测时发现其信号值与溶剂空白相差不大，因此在计算加标回收率时将正常儿童血清中miR-142-3p的本地含量记为零。加标回收率的计算结果如表4所示。对于高、中、低三个浓度的血清样品，回收率范围为97.46％～115.90％，对应的RSD范围为2.14％～13.6％。

表4 miR-142-3p在血清样品中的回收率(n＝4)

由上述实施例1～7的结果可知，本发明中自组装聚HRP探针具有信号放大功能，能够按照上述实施例中检测miR-142-3p，同样的原理，设计能够与目标物和自组装聚HRP探针结合的辅助探针，采用化学发光的原理可对多种物质进行检测，如蛋白质、DNA、RNA等。

同时本发明将磁分离技术、自组装聚HRP探针的双重信号放大功能和化学发光检测技术相结合，建立了一种灵敏度高、特异性强、操作简便的方法并成功应用于血清中循环miR-142-3p的检测。该方法的标准曲线为Y＝26.50341X+13095.48246(r＝0.99837，X为C_miR-142-3p，Y为相对应的RLU-RLU0)，线性范围为1pmol/L～10nmol/L，通过逐渐降低目标物浓度所获得的实测检测限为100fmol/L；板内精密度(RSD)范围为3.00％～8.26％，板间精密度(RSD)范围为4.84％～9.27％；血清样品中的加标回收率范围为97.46％～115.90％，对应的RSD范围为2.14％～13.6％。血清中miR-142-3p检测结果表明T-ALL患者(n＝7)与健康人(n＝7)之间响应信号的差别具有统计学意义(P<0.05)，成功证明了该方法可有效地用于血清中循环miR-142-3p检测。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 一种自组装聚HRP探针、制备方法、试剂盒及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaaaaaa tactccccca ggtgcccctc agaccctttt agt 43

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacctgggg gagtaaaaac taaaagggtc tgaggg 36

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacctgggg gagtaactaa aagggtctga ggg 33

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaaaaaaaa tccataaagt ag 22

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaacactac aactaaaagg gtctgaggg 29

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

uguaguguuu ccuacuuuau gga 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtagtgttt cctactttat gga 23

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

uguaguguuu ccuacuuuau cga 23

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uguaguguuu ccuacuucau gga 23

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

uguagucuuu ccuacuucau gga 23

<210> 11

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uguaguguuu ccuaccuuau cga 23

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

uguagucuuu ccuacuucau gga 23

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacgacaccg aucaagcgua aag 23

Claims (10)

1.一种自组装聚HRP探针，其特征在于，由两种DNA探针杂交而成，其中一种为标记辣根过氧化物酶的DNA探针，记为杂交探针1，其核苷酸序列为：

5'-HRP-AAAAAAAAAATACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；

另一种DNA探针记为杂交探针2，其核苷酸序列为：

5'-GCACCTGGGGGAGTAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。

2.一种如权利要求1所述的自组装聚HRP探针的制备方法，其特征在于，取杂交探针1和杂交探针2，在室温环境下涡旋杂交，即完成。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括用于捕获目标物的捕获探针、辅助探针和如权利要求1所述的自组装聚HRP探针；其中辅助探针的核苷酸序列从5'端到3'端包括与目标物特异性结合的序列1、与自组装聚HRP探针互补结合的序列2。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括目标物捕获载体、化学发光板、洗涤液、杂交缓冲液、化学发光底液。

5.一种如权利要求3或4所述的试剂盒的应用，其特征在于，应用于检测RNA、DNA和蛋白质。

6.如权利要求5所述的试剂盒的应用，其特征在于，应用于检测miR-142-3p。

7.如权利要求6所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述捕获探针的核苷酸序列为5'-AAAAAAAAAATCCATAAAGTAG-3'；辅助探针的核苷酸序列为5'-GAAACACTACAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。

8.如权利要求6或7所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述目标物捕获载体为链霉亲和素磁珠；所述捕获探针负载在链霉亲和素磁珠上，记为C-DNA-MNPs。

9.如权利要求6所述的试剂盒的应用，其特征在于，用于检测血清样品中miR-142-3P，所述试剂盒还包括裂解液，所述裂解液中含有10～1000μg/ml蛋白酶K和质量体积百分含量为0.1～10％的SDS，pH＝7.4。

10.如权利要求8所述的试剂盒的应用，其特征在于，其检测方法包括以下操作步骤：

(1)洗涤化学发光板：采用洗涤液清洗化学发光板；

(2)加C-DNA-MNPs：用杂交缓冲液洗涤悬浮于免疫磁珠保存液的C-DNA-MNPs 3次，并重悬于相同体积杂交缓冲液中，每孔1～90μL加入化学发光板中，用洗涤液洗板；

(3)加待检测样品：在步骤(2)处理后的化学发光板中加入一定体积的待检测样品，温育，磁分离，弃上清，用洗涤液洗板；

(4)在化学发光板每孔中加入辅助探针，25℃温度下温育20min，然后加入自组装聚HRP探针，温育，然后磁分离，弃上清，用洗涤液洗板3次；

(5)在化学发光板每孔中加入化学发光底液，用微孔板式发光检测仪检测RLU；

(6)按照上述步骤(1)至(5)同样的方法检测不同浓度的miR-142-3P标准品的RLU，绘制出RLU与miR-142-3P浓度之间关系的标准曲线图，得出RLU与miR-142-3P浓度之间的关系式，然后将步骤(5)中检测的待检测样品的RLU带入该关系式，即可计算出待检测样品中miR-142-3P的浓度。