CN101182579A - 一种无需扩增基因组dna的纳米探针芯片及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片及检测方法。其特征在于：未标记靶核酸的检测是通过两步连续的与等位特异地固定在芯片表面的捕捉探针以及标记纳米金颗粒的特异寡核苷酸探针的三明治杂交反应，经过银染增强的纳米金信号放大效应产生高灵敏的识别信号，然后直接用显微镜进行观察或者用普通光学扫描仪进行扫描直接得到相应的杂交结果，也可通过相关软件进行分析，得出检验报告。与传统的基于荧光信号检测的方法相比，本方法大大提高了检测的灵敏度和特异性，能够检测未扩增的基因组DNA样品中的靶基因及单碱基突变。

Description

一种无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片及检测方法

技术领域

本发明涉及一种无需扩增基因组DNA纳米探针芯片及检测方法及所述的纳米探针芯片检测方法，特别是一种直接检测基因组DNA中靶基因及基因突变的纳米探针芯片检测法。属于纳米探针芯片领域。

背景技术

基因突变的研究已经成为当今生命科学研究的热点之一。检测方法也随之迅速发展。对于基因突变的检测，20年前主要是利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。但该方法不能检测单核苷酸的多态性(SNP)的点突变，对于点突变主要是应用复杂的DNA测序分析方法。多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术是突变研究中的最重大进展，使得基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上。在等位特异的杂交方法中PCR的应用减少了复杂性并通过扩增提高了灵敏度。

近年来许多研究一直努力致力于开发新的标记和检测方法，使得更敏感和低成本检测核酸方法能够用于基因表达分析和单核苷酸多态性(SNP)的鉴定。

基因诊断芯片是上世纪90年代初由美国提出的技术，可看作PCR技术的进一步发展，实质是PCR、核酸杂交及芯片技术(核心为生物芯片的制备及反应信号的检测)的有机结合。所谓生物芯片是由固定于不同种类支持介质上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微数组组成，其中每个分子的位置及序列为已知，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄像机对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行量化分析。基因芯片技术在分子生物学研究领域、医学临床检验领域、生物制药领域和环境医学领域显示出强了大的生命力。首先，它为临床检验工作提供了一种全新的技术，使一些临床检验工作中难解决的问题成为可能。例如实验室诊断在单一因素疾病诊断中具有决定性的意义，但由于人体和疾病的复杂性，单一指标在临床工作的作用是有限的，这是往往需要多指标组合，而芯片技术正好提供了解决的思路。另外，有的实验室难题在高通量的检测中可以得以解决，如基因表达谱以及基因突变的检测等等。

然而目前的芯片尽管可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析，具有较好的灵敏性和特异度，但是仍然需要事先聚合酶链反应(PCR)扩增以增加特异的核苷酸浓度，而PCR扩增反应需要严格的实验室、昂贵的硬件设备和复杂的混合物和才能进行有效的酶反应，整个检测系统庞杂；并且操作烦琐、耗时，容易造成污染。

近年来，纳米颗粒应用于生物体系引起了普遍重视，纳米颗粒比表面积大、表面原子数比例高等特点也使得纳米颗粒显示出明显的表面效应，其表面具有很高的活性，颗粒官能团密度及选择性吸附能力变大，达到吸附平衡的时间大大缩短，粒子的稳定性大大提高。因此，与常规材料相比，纳米颗粒具有极高的偶联容量，可以在单位平面上连接更多的生物活性敏感分子，从而提高检测的敏感性。特别是纳米金，在分子生物学领域的研究和应用已成为目前科学家研究的热点。金纳米粒子在水中形成的分散系俗称胶体金，金颗粒可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，与巯基之间形成很强的Au-S共价键，这使得胶态金可与生物活性分子结合，形成的探针可用于生物体系的检测中。以胶体金为标记物的免疫金和免疫金银染色法，可以单标记或多重标记，并可以进行大分子的定性、定位以至定量研究，已被广泛应用于医学和生物学的众多领域。

而纳米技术和基因芯片技术的结合是基因检测中的一项重大进展，将纳米金标记的探针与互补的目的核酸共杂交锚定于固相载体上，可有效避免纳米金溶液体系中的一些非特异性吸附对观察终点的干扰。纳米金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的杂交位点处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而广泛应用于定性或半定量的快速检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为银染色。纳米金颗粒标记技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，且检测不依赖昂贵的激光检测仪器，只需普通光学仪器，甚至肉眼即可辨别。因此，生物传感器中利用纳米材料进行标记检测，对于构建快速、廉价、微型的生物传感器也具有非常重要的意义。比较传统的荧光检测技术，基于纳米技术的芯片检测方法由于微电子技术使带电荷的分子运动速度加快，分子杂交的时间大大缩短；并且银增强检测增加了检测的灵敏度和特异性，有望可以直接检测基因组DNA的突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片及检测方法。

本发明要解决的技术问题是针对目前PCR以及传统的芯片荧光检测方法存在的不足之处，提供一种无需基因扩增的纳米芯片及检测方法。

本发明的技术解决方案是纳米探针芯片采用了两个寡核苷酸探针，它们分别为等位特异的捕捉探针和共价结合纳米金颗粒的信号探针。其中，等位特异性的捕捉探针覆盖了单核苷酸多态性(SNP)位点，并且固定在玻片表面；而另一个共价结合纳米金颗粒的信号探针根据靶DNA序列的一个临近SNP位点的序列设计。所述的纳米芯片呈基于纳米金标记的三明治杂交。

所提供的纳米探针芯片的检测策略取于决高灵敏度的金纳米信号探针与靶DNA以及序列特异性的捕捉探针的识别突变位点的三明治等位特异性杂交方法，具体地说，一种无需扩增基因组DNA用于检测基因突变的纳米探针芯片的检测方法，其特点在于包括以下步骤：

1.待测样品的处理：通过如蛋白酶K消化法、快速高盐提取法、CTAB法、SDS裂解法等方法抽提基因组DNA，然后通过超声波降解或限制性内切酶切断DNA的方法，控制条件将基因组DNA降解成500-1000bp的片段。

2.根据待测的基因或SNP位点设计捕捉探针；根据临近捕捉探针的序列或SNP位点的靶DNA序列设计带有巯基的信号探针，

对于设计的捕捉探针的碱基数不超过25bp，巯基修饰的信号探针碱基数不超过40bp，TM值温度大致相等。

3.根据临近SNP位点的靶DNA序列设计带有巯基的信号探针，信号探针的碱基数不超过40bp，并且在探针的3’端加有三个CH2和一个SH巯基；

4.芯片的制作：将氨基修饰的捕捉探针通过芯片点样仪点在醛基修饰的玻片上，37℃度固定，制备SNP基因芯片。

5.用金纳米颗粒标记带有巯基修饰的信号探针。

6.纳米探针的芯片识别靶基因及SNP位点的杂交方法为标记了纳米金的探针与芯片上的捕捉探针以及靶DNA的两步连续的杂交。

7.其检测方法是通过银染显色的方法，利用银染试剂的氧化还原反应中形成的银颗粒聚集在纳米金上，而使杂交信号放大。

8.使用光学显微镜观察或者电荷藕合器件(CCD)照相采集以及普通光学扫描仪扫描记录芯片上的信息。

所述的样品处理过程是：血液或组织样品通过如蛋白酶K消化法、快速高盐提取法、CTAB法、SDS裂解法等方法抽提基因组DNA，然后通过超声波降解或限制性内切酶切断DNA的方法，控制条件将基因组DNA降解成500-1000bp的片段。

所述的纳米芯片探针设计原则为：根据待测的靶基因或SNP位点设计捕捉探针，原则是每个SNP位点尽量位于探针的中间，探针的长度尽量相同，为了更好地固定在醛基修饰的玻片上，捕捉探针的5’未端需加16个长度T的连接臂和氨基修饰。根据临近SNP位点的靶DNA序列设计带有巯基的信号探针，对于设计的所有SNP位点的捕捉探针碱基数为18-25bp，纳米金修饰的信号探针碱基数为30-40bp，TM值温度大致相等。探针的合成由大连宝生物有限公司(TAKARA公司)完成。

所述的基因芯片的制作：通过芯片点样仪将捕捉探针点在醛基修饰的玻片上，37℃度固定72小时，制备基因芯片。

所述的纳米探针的标记方法为：粒径为15nm-30nm的纳米金或15nm或30nm的纳米金(上海水源生物有限公司)200μl加巯基的寡核苷酸探针100umol/L，11μl，，室温下放置24小时，然后2M NaCl(以及1×PB)加入到该混合液中，使其浓度达到0.075M。2小时后继续加入NaCl，并调整NaCl浓度到0.1M。继续放置84小时后，纳米颗粒通过12000rpm离心进行分离(终浓度为吸收光谱520nm DNA)。

所述的纳米探针芯片的杂交方法为两步连续的杂交。第一步杂交：取降解成500-1000bp的基因组DNA(浓度100ng/μl)5μl加10μl杂交液混合，滴于芯片阵列处，盖上盖玻片，置于50℃杂交箱中半个小时，使DNA样品与芯片上的特异性捕捉探针结合。然后室温下取出芯片，在0.5M的NaNO₃中洗30秒。第二步杂交：将纳米金标记的探针2μl与10μl的杂交液混合后加在阵列处，50℃杂交箱中杂交20-30分钟，然后0.5M的NaNO₃中清洗3次(每次30秒)。

所述的银染显色方法是：在芯片阵列处加上新配制的银增强液，盖上盖玻片，37℃反应15分钟，结束后去掉盖片，超纯水洗一下，氮气吹干。

所述的纳米芯片检测方法：使用光学显微镜观察或者电荷耦合器件(CCD)照相采集以及普通光学扫描仪扫描记录芯片上的信息。该检测方法具有成本低、操作简单、重复性好等特点，不需要价格昂贵的检测仪器，易于在临床推广应用。

本发明优点及效果

(1)本发明的纳米探针检测方法可直接检测基因组DNA的突变，不需要特殊的仪器或PCR扩增；

(2)本发明的纳米芯片检测方法采用纳米探针的三明治杂交方法大大提高了杂交特异性和检测的灵敏度；

(3)本发明的纳米探针检测方法检测灵敏度超过了荧光检测法的灵敏度，并且重复性也较好；

(4)本发明纳米探针芯片检测方法采用纳米金标记，银染显色的方法检测杂交结果，背景低，稳定，快捷。杂交结果易于分析、保存。

(5)本发明的纳米探针芯片检测方法，只需普通的商用扫描仪或普通的CCD采集信号，不需要昂贵的荧光扫描仪，具有成本低、操作简单、重复性好等特点，更方便临床的推广使用。

附图说明

图1为基于纳米金标记的三明治杂交示意图。

图2为肺癌组织中P53基因检测的检测结果，其中，A为CCD照相结果，B为普通扫描仪扫描结果。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例及其附图对本发明作进一步说明。

实施例用于P53基因检测的纳米探针芯片

1.准备材料与试剂

(1)芯片：自制；

(2)EasyHtyb杂交液：购于Roche公司；

(3)所有探针合成在大连宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)

(4)15nm和30nm的纳米金购于上海水源生物科技有限公司

(5)NaNO₃洗液：1M   NaNO₃    300ml

              0.2M Na₂HPO₄  30.5ml

              0.2M NaH₂PO₄  9.5ml

              定容到1000ml

(6)PB溶液：0.3mol/L NaNO₃和10mmol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，PH7.0

(7)银染增强液：1％明胶                                 60μl

               2.55g柠檬酸/2.35g；柠檬酸三钠/10ml H₂0；10μl

               1.7g氢醌/30ml H₂O，                     30μl

               0.5g AgNO₃ 2ml H₂O；                    1.2μl

2.检测方式

(1)取病人血清或组织样品，按试剂盒提供的试剂及使用方法抽提基因组DNA，酶切或超声降解DNA片段，使DNA片段大致为500-1000bp的片段。

(2)探针设计及芯片制备

根据待测P53基因的248氨基酸位点设计捕捉探针

[NH2-poly(T)16-GCATGGGCTGCATGAACCG]根据临近捕捉探针位点的靶DNA序列设计带有巯基的信号探针

[TGGAAGACTCCAGGTCAGGAGCCAC-poly(A)10-(CH2)3-SH]。对于设计的捕捉探针碱基数不超过25bp，信号探针的碱基数不超过40bp，TM值温度大致相等。将捕捉探针通过芯片点样仪点在玻片上，37℃度固定72小时。

(3)纳米金探针的标记

a)15nm的胶体金溶液(上海水源生物有限公司)200μl加11μl巯基标记的包含P53基因248位点的探针(100μmol/L)，混匀，常温，避光24h；

b)分三次加1mol/L NaCl，PB溶液(100mmol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH7.0)，使其终浓度为0.1mol/L NaCl，10mmol/L PB，混匀，室温25℃，72h；

c)4℃，14000r/min离心1h，弃上清，重复3次，弃上清，以去除多余的未标记上的单链核酸；

d)加100μl 0.1mol/LNaCl，10mmol/L PB(pH7.0)混匀，置4℃储存备用

(4)纳米探针芯片的杂交

纳米探针芯片的杂交模式见图1，取打断的基因组DNA(浓度100ng/μl)5μl加10μl杂交液混合，滴于芯片阵列处，盖上盖玻片，置于50℃杂交箱中半个小时，使DNA样品与芯片上的特异性捕捉探针结合。然后室温下取出芯片，在0.5M的NaNO₃中洗30秒。将纳米金标记的探针2μl与10μl的杂交液混合后加在阵列处，50℃杂交箱中杂交20-30分钟，然后0.5M的NaNO₃中洗三次(每次30秒)。

(5)加银染增强液(新鲜配制)银染15分钟(37℃)，结束后去离子水清洗，氮气吹干。

(6)使用电荷藕合器件(CCD)照相采集信号或者用普通光学扫描仪扫描记录芯片上的信息。结果如图2所示。图2A是本发明的纳米芯片银染后，电荷藕合器件CCD拍照结果，图2B是普通扫描仪扫描后所得的结果。

Claims (8)

1.一种无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片，其特征在于所述的纳米探针芯片采用两个寡核苷酸探针，它们分别为等位特异的捕捉探针和共价结合纳米金颗粒的信号探针；其中，等位特异的捕捉探针覆盖了单核苷酸多态性位点，且固定在玻片表面，共价结合纳米金颗粒的信号探针按靶DNA序列的一个临近单核苷酸多态位点的序列设计。

2.按权利要求1所述的无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片，其特征在于所述的纳米芯片呈基于纳米金标记的三明治杂交。

3.使用如权利要求1或2所述的无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片的检测方法，其特征在于检测步骤为以下8步：

a)待测样品的处理

抽提基因DNA，并将基因组DNA降解成500-1000bp的片断；

b)根据待测基因或SNP位点设计捕捉探针

每个SNP位点位于探针的中间捕捉，探针的碱基数不超过25bp，固定在修饰好的玻片上，捕捉探针的5’未端需加16个长度T的连接臂和氨基修饰；

c)根据临近SNP位点的靶DNA序列设计带有巯基的信号探针

信号探针的碱基数不超过40bp，并且在探针的3’端加有三个CH2和一个SH巯基；

d)制作芯片

将捕捉探针通过芯片点样仪点在醛基修饰的玻片上，37℃度固定72小时，制备SNP基因芯片；

e)金纳米颗粒标记带有疏基的信号探针

15nm-30nm的纳米金200μl加巯基的寡核苷酸探针100umol/L，11μl，室温下放置24小时，然后将2M NaCl以及1×PB加入到该混合液中，使其浓度达到0.075M；2小时后继续加入NaCl，并调整NaCl浓度到0.1M；继续放置84小时后，纳米颗粒通过12000rpm离心进行分离；

f)纳米芯片与靶DNA的杂交

所述的杂交是由两次连续的杂交过程组成：

第一步杂交：取步骤a)降解的浓度为100ng/μl的基因组DNA 5μl加10μl杂交液混合，滴于芯片阵列处，盖上盖玻片，置于50℃杂交箱中孵育半个小时，使DNA样品与芯片上的特异性捕捉探针结合；然后室温下取出芯片，在0.5M的NaNO₃中洗30秒，氮气吹干；

第二步杂交：将步骤e)所述的纳米金标记的探针2μl与10μl的杂交液混合后加在阵列处，50℃杂交箱中杂交20-30分钟，然后0.5M的NaNO₃中清洗3次；

g)银染显色

在芯片阵列处加上配制的银增强液，盖上盖玻片，37℃反应15分钟，结束后去掉盖片，超纯水清洗后，氮气吹干；

h)检测

使用光学显微镜观察或者电荷耦合CCD器件照相采集以及普通光学扫描仪扫描记录芯片上的信息；

所述的杂交液购于Roche公司；

所述的SNP代表单核苷酸多态性；

所述的银增强液：1％明胶                                 60μl

                2.55g柠檬酸/2.35g；柠檬酸三钠/10ml H₂0；10μl

                1.7g氢醌/30ml H₂0，                     30μl

                0.5g AgNO₃ 2ml H₂0；                    1.2μl。

4.按权利要求3所述的无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片的检测方法，其特征在于步骤a)中待测样品是通过蛋白酶K消化法、快速高盐提取法、CTAB法或SDS裂解法方法抽提基因组DNA；然后通过超声波降解或限制性内切酶方法切断降解DNA的。

5.按权利要求3所述的无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片的检测方法，其特征在于步骤b)中所述的捕捉探针的碱基数为18-25bp。

6.按权利要求3所述的无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片的检测方法，其特征在于步骤c)中所述的信号探针的碱基数为30-40bp。

7.按权利要求3所述的无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片的检测方法，其特征在于步骤e)中所述的纳米金粒径为15nm或30nm。

8.按权利要求3所述的无需扩增基因组DNA的纳米探针芯片的检测方法，其特征在于步骤f)中所述的0.5M的NaNO₃清洗时，每次30秒。