CN112689681A - 用于检测和/或定量靶核苷酸序列的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测和/或定量样品中靶核苷酸序列(3)的方法，所述方法包括以下步骤：提供单链形式的靶核苷酸序列(3)；将所述靶核苷酸序列(3)与单链核酸的第一探针(1)和与单链核酸的第二探针(2)杂交，所述第一探针(1)的一端固定在固体载体(4)上，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第一部分(5)互补的序列，所述第二探针(2)的一端被标记，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第二部分(6)互补的序列，其中所述靶核苷酸序列的第一部分(5)和第二部分(6)共有2至10个核苷酸，从而形成第一探针‑靶核苷酸序列‑第二探针复合体；并检测该复合体。本发明还涉及用于所述方法中的试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2018年8月9日提交的意大利专利申请号102018000008017的优先权，其全部公开内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及基于具有两个核酸探针的系统用于检测和/或定量样品中靶核苷酸序列的方法和试剂盒。
背景技术
对不同生物样品(活检物(biospy)、血清、血浆、细胞培养物)中核酸的分析是许多疾病的研究和早期诊断(如阿尔茨海默氏病、癌症、骨关节炎、传染病)的基础，此外在兽医、农业和食品方面也有越来越多的应用。
分析的目的核酸为基因组DNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、不均一核RNA(hnRNA，前mRNA)和小序列RNA(小RNA)。将小RNA分裂为：微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)。
对于许多疾病的研究和早期诊断来说，微RNA是最令人关注的待分析的核酸。微RNA是具有18-24个核苷酸的短序列RNA(核糖核酸)，在转录和后转录水平上调节基因表达，通过抑制靶mRNA来与其结合。已经记载了不同物种(特别是哺乳动物)中的非常多的miRNA，通常序列的差异(因此效果的差异)是由于单个核苷酸的变化。它们的众多性和相似性需要开发能够在单个核苷酸水平上识别差异的高度特异性方法。微RNA有成为用于早期诊断许多疾病的新一代生物标记物的潜力。事实上，如今发现的许多新的生物标记物均为微RNA，它们参与调节许多生物系统和疾病，包括各种类型的癌症、神经退行性疾病和肌肉骨骼疾病(例如骨关节炎、阿尔茨海默氏病)。
迄今为止用于分析核酸的主要技术为PCR(聚合酶链反应)和直接测序。这些技术需要很长时间才能得到结果，需要高素质的人员来进行，而且非常昂贵。这些技术的另一个限制是它们容易被生物样品中存在的成分改变，例如Ca+、蛋白酶、核酸酶，和/或容易被用于收集和提取样品的缓冲液的质量和类型(例如EDTA、SDS的浓度)改变。因此，这些技术的另一个限制是在实际分析之前制备、提取和纯化样品，这容易延长时间和增加成本。具体而言，对于微RNA，如今使用的技术(PCR和测序)和正在销售的产品不令人满意，因为这些技术复杂，不易重复，不够特异性(没有针对短序列进行优化)，昂贵，需要较长时间和高素质的人员，并且与仪器和诊断-临床工作流程不兼容。
在EP2639312中已记载了一种避免使用PCR的方法。这种方法涉及使用具有DNA的寡核苷酸和能够识别DNA/RNA杂交体的抗体，但它仍然不允许以足够简单、可重复和灵敏的方式获得结果。
Hideyuki A.et al.,(2012),The Analyst,Vol.137,No.14,p.3234公开了一种用于检测miRNA的方法，所述方法包括与捕获探针和经标记的荧光探针的三明治杂交，其中两个探针完全相邻，以提供同轴堆叠效应。这种方法显示出有限的灵敏度。
因此，本发明的目的是提供用于检测和/或定量样品中的靶核苷酸序列的方法，所述方法以简单和有效的方式解决上述问题。具体而言，所述方法必须显示出高灵敏度、特异性、亲和力、稳定性、易于标准化、低成本和执行快速。
该目的是通过本发明实现的，因为该目的与权利要求1中限定的方法有关。
本发明的另一个目的是提供权利要求8中限定的试剂盒。
定义
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所涉及的本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在实践中或在本发明的评估中，可以使用许多与本文描述的那些相似或等同的材料和方法，但优选的材料和方法如下所述。除非另有说明，本文描述的用于本发明的技术为本领域普通技术人员公知的标准方法。
附图说明
图1示出了根据本发明的方法中使用的要素(element)的示意图。
具体实施方式
参考图1，用于检测和/或定量样品中靶核苷酸序列3的方法包括以下步骤。
在第一步中，提供单链的靶核苷酸序列3。
预先扩增靶核苷酸序列3不是必需的，但其必须以单链形式提供。
靶核苷酸序列可为基因组DNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、不均一核RNA(hnRNA，前mRNA)和小序列RNA(小RNA)：微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)。
优选地，靶核苷酸序列3为微RNA(miRNA)。
通常，靶核苷酸序列3的长度为10至50个核苷酸，优选18至30个核苷酸。
包含靶核苷酸序列3的样品可由生物液体(包括血液、血清、血浆、滑膜液、唾液，或在缓冲液中稀释的上述液体)以及细胞培养物、活检物、组织组成，它们需要单独一个均质化和裂解阶段而无需提取/纯化和扩增阶段。优选地，样品为活细胞。
在第二步中，将单链的靶核苷酸序列3与单链核酸的第一探针1和单链核酸的第二探针2杂交。
第一探针1的一端固定在固体载体4，并且另一端包含与靶核苷酸序列3的第一部分5互补的序列。
固体载体4选自纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙、陶瓷、玻璃、金属(如金和银、磁铁矿)和它们的组合。固体载体4还可由细胞、磷脂的脂质体和囊泡组成。优选地，固体载体4由具有48、96、384个孔的微孔板，磁珠，金珠或银珠，微粒，条带(strip)，色谱片、管、棒，过滤材料组成。
探针1可与经改造适于固相缀合的分子缀合，例如：赖氨酸、精氨酸、硫醇、半胱氨酸、谷胱甘肽。
第二探针2的一端被标记，并且另一端包含与靶核苷酸序列3的第二部分6互补的序列。
第二探针2可与一个或多个分子缀合，例如：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸。
优选地，第二探针2是用生物素、荧光分子(例如青色素、alexafluor)、荧光素标记的。
有利地，靶核苷酸序列的第一部分5和第二部分6共有2至10个核苷酸。
第二步的结果是形成了第一探针-靶核苷酸序列-第二探针复合体。
优选地，第一探针1和第二探针2由选自以下的核酸组成：PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、吗啉代(morpholino)、orn-PNA(具有鸟氨酸骨架的PNA)、aep-PNA(氨基乙基脯氨酰基-PNA)、aepone-PNA(氨基乙基吡咯烷酮-PNA)、GNA(乙二醇核酸)、HNA(己糖醇核酸)、TNA(苏糖核酸)、ENA(2’-O,4’-C-乙烯-桥接核酸)、ANA(阿拉伯核酸)、F-ANA(2’-F-阿拉伯核酸)。甚至更优选地，第一探针1和第二探针2由PNA(肽核酸)组成、甚至更优选地由具有修饰的骨架结构的PNA(其中α碳具有精氨酸或赖氨酸的侧链，作为取代基)组成。
使用由PNA组成的探针1、2允许提高方法的稳定性、特异性和灵敏度。使用其他人工寡核苷酸(例如LNA和吗啉代)也可以获得类似的特性。
由于没有静电斥力，PNA骨架的不荷电性质是一个重要的特性，这意味着PNA与DNA或RNA的两条链之间的亲和键比DNA或RNA的两条链之间的亲和键强得多。含有PNA的双链的更高稳定性转化为更高的熔化温度。与DNA或RNA的两条链形成的复合体相比，PNA与DNA或RNA的复合体对单个错配的存在更敏感。PNA具有高的生物稳定性；事实上，它们对人血清中和细胞或细胞提取物中的核酸酶和蛋白酶的攻击具有抗性，从而延长了它们在体外和体内的寿命。对酶降解的抗性伴随着高的化学稳定性。由于PNA的这些特性及如实施例3所示的生理pH(pH7.2)下操作的可能性，所述方法可用于活细胞。
所述方法还可在0mM至1000mM的盐水浓度下使用。
优选地，第一探针1和/或第二探针2由10至18个核苷酸组成。
优选地，当所述方法用于检测和/或定量miRNA时，探针2除N端区域之外还包含一个2-6个核苷酸的区域，以仅增加对不包括pre-miRNA的成熟miRNA的特异性，如在SEQ IDNO:13(PNA 2d)中，其中将4Timine(T)添加到N端区域(参见实施例)。
在第三步中，检测第一探针-靶核苷酸序列-第二探针复合体。
优选地，用选自与以下缀合的链霉亲和素/抗体的系统检测该复合体：过氧化物酶(单一HRP、HRP20、HRP40、HRP80)、PE(藻红蛋白)、荧光分子(例如青色素、alexafluor、荧光素)。
用于根据本发明的方法中的所述试剂盒包含：
-如上所述的第一探针1；
-如上所述的第二探针2；
-任选地至少一种选自以下的缓冲溶液：SSC5x、SSC05x、SSC5x Tween 0.05/0.01％、SSC 0.5x Tween 0.05/0.01％、SSC2.5x SDS 1/0.5％、SSC2.5x SDS 0.1/0.05％BSA 5/10％、SSC5x SDS 0.1/0.05％BSA 5/10％、PBS、PBS Tween 0.05/0.1％、pH 5.8至pH7.2的磷酸盐缓冲液、pH 5.8至pH 7.2的磷酸盐缓冲液SDS 0.1/0.05％。
实施例
实施例中使用的靶核苷酸序列3和探针1和2如下所述。
靶核苷酸序列。22个单链碱基的DNA和RNA，购自Sigma-Aldrich的合成产品。(错配点加下划线)
含有PNA的探针1和2，由Bioridis使用自动肽合成生产。
关键词：K：赖氨酸；G：甘氨酸；AEEA：氨基乙基乙醇胺；ac：乙酰化物；K Biot：含有缀合在侧链上的生物素的赖氨酸。
固相的制备。用不同的缀合体系对两种固相进行测试，以评估所述方法在不同固体载体上的能力：a)Nunc Immobilizer Amino(Thermo-Fischer)，96孔微滴板，表面具有稳定的亲电基团，以结合荷正电的基团；b)Nunc Maxisorp(Thermo-Fischer)，96孔微滴板，具有疏水/亲水表面，其被改造以适于结合许多类型的不同分子(荷电的或中性的)。将探针1按照供应商的方案与固相缀合。
缓冲液。SSC5x(750mM NaCl、75mM sc pH 7.0)；SSC5x T(750mM NaCl、75mM sc pH7.0、Tween 0.05)；SSC5x S(750mM NaCl、75mM sc EDTA 0.5mM；SDS 0.05％，pH 7.0)；SSC2.5x S(375mM NaCl、37.5mM sc EDTA 0.5mM；SDS 0.05％pH 7.0；)；SSC0.5x(75mMNaCl、7.5mM sc pH 7.0)；SSC0.5x T(75mM NaCl、7.5mM sc pH 7.0；Tween 0.05)；PBS(8.1mM Na2HPO4；KH2PO4 1.7mM；KCl 0.27mM；NaCl 137mM；pH 7.2)；PBST(8.1mM Na2HPO4；KH2PO4 1.7mM；KCl 0.27mM；NaCl 137mM；pH 7.2；Tween 0.05/0.1)；磷酸盐缓冲液、BF5.8(100mM NaP；100mM NaCl EDTA 0.5mM pH 5.8)BF5.8 S(100mM NaP；100mM NaCl EDTA0.5mM SDS 0.05％pH 5.8)；磷酸盐缓冲液、BF7.2(100mM NaP；100mM NaCl EDTA 0.5mM pH7.2)；磷酸盐缓冲液、BF7.2 S(100mM NaP；100mM NaCl EDTA 0.5mM SDS 0.05％pH 7.2)
检测系统。
在实施例中测试并在所述方法中使用的检测系统为：化学发光、比色和荧光，按照供应商的方案的指南使用。按照使用和设置指南用BIOTEK Synergy HT获取数据。对于化学发光系统和比色系统，测量用RLU(相对发光单位)表示(化学发光系统最大值4.5*106RLU；比色系统最大值4.500RLU)；对于荧光，测量用RFU(相对荧光单位，最大值99998RFU)表示(未显示后者实验结果)。
实施例1
方法。在SSC 0.5T0.1％中将RNA NA1稀释至浓度为150fmol/ml。将100μl先前制备的含有探针的溶液铺于孔中，并放置杂交3小时。然后去除RNA，并洗涤孔。将10nM的寡核苷酸加入含有SDS 0.1％的BF5.8中，过夜(o.n)杂交。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100ul浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
结果
该实施例示出了根据叠加区域中涉及的核苷酸，探针1和2与靶探针3之间杂交的优势。
实施例2(盐浓度影响)
方法。在SSC 0.5(NaCl 75mM)T0.1％和SSC 5x(NaCl 750nM)T0.1％中将RNA NA1分两部分稀释至浓度为150fmol/ml。将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交3小时。然后去除RNA，并洗涤孔。将10nM的探针2c加入含有SDS 0.1％的BF5.8中，过夜(o.n)杂交。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| 缓冲液 | δ(信号减去噪声) |
| SSC0.5 | 777.338 |
| SSC5 | 1.509.413 |
该实施例示出了所述方法在宽离子强度范围(750mM至75mM的NaCl浓度)内工作的能力。
实施例3(随pH变化的稳定性)
方法。在SSC 5x中将RNA NA1分两部分稀释至浓度为150fmol/ml的。将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交3小时。然后去除RNA，并洗涤孔。将10nM的探针2c加入含有SDS 0.05％的BF5.8或BF7.2中，过夜(o.n)杂交。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| 缓冲液 | δ(信号减去噪声) |
| BF5.8 | 802.804 |
| BF7.2 | 933.631 |
该实施例示出了所述方法在宽pH范围内，特别是在生理和细胞pH(pH7.2)下工作的能力。
实施例4(降低的杂交时间，无需过夜)
方法。在SSC 5x中将RNA NA1分两部分稀释至浓度为150fmol/ml、15fmol/ml、1.5fmol/ml。将100μl先前制备的含有用探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交90分钟。然后去除RNA，并洗涤孔。将10nM的探针2c加入含有SDS 0.05％的BF7.2中，杂交2小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| RNA浓度 | δ(信号减去噪声) |
| 150fmol/ml | 超刻度(off scale) |
| 15fmol/ml | 1.082.246 |
| 1.5fmol/ml | 66.998 |
该实施例示出了所述方法快速工作(5小时)而无需过夜阶段的能力。
实施例5(正电荷的影响)
方法。在SSC 5x中分两部分将RNA NA1稀释至浓度为15fmol/ml。将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交90分钟。然后去除RNA，并洗涤孔。将10nM的探针2c或2d或2e加入含有SDS 0.05％的BF7.2中，杂交2小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| 寡核苷酸探针1 | 寡核苷酸探针2 | 电荷 | δ(信号减去噪声) |
| 1c | 2d | 0 | 753855 |
| 1c | 2c | 1 | 725035 |
| 1c | 2e | 3 | 841788 |
该实施例示出了加入序列中的正电荷(用赖氨酸插入的)对杂交能力的影响。
实施例6(在血清和活细胞中使用而无需提取/纯化)
方法。用核糖核酸酶抑制剂(Thermo)处理血清和提取物，并用SSC5x SDS 0.1％EDTA 1mM以1:1稀释。将RNA NA1分部分稀释至浓度为15fmol/ml。将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交90分钟。然后去除RNA，并洗涤孔。将10nM的探针2c加入含有SDS 0.05％的BF7.2中，杂交2小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| 基质 | δ(信号减去噪声) |
| Ssc5x | 2038134 |
| 血清 | 2085434 |
| 细胞 | 1214368 |
该实施例示出了所述方法直接作用于生物样品：生物液体(例如血清)或活细胞，而无需提取和/或纯化阶段的能力。
实施例7(单一步骤)
方法。在SSC 5x中将RNA NA1分两部分稀释至浓度为15fmol/ml。对于一个系列，将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交90分钟。然后去除RNA，并洗涤孔。在一个系列中，将10nM的探针2c加入含有SDS 0.05％的BF7.2中用于进行杂交，并且在另一个系列中，将含有15fmol/ml RNA NA1和10nM 2c的溶液加入含有SDS0.05％的BF7.2中，并放置杂交2小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| 步骤数 | δ(信号减去噪声) |
| 2个步骤(5小时) | 1090550 |
| 1个步骤(3小时) | 1227210 |
该实施例示出了所述方法快速工作(3小时)并使用单一杂交步骤的能力。
实施例8(方法的特异性)
方法。在SSC2.5x S中将RNA NA1、NA2、NA3、NA4分部分稀释至浓度为150fmol/ml，加入20nM的探针2d。将100μl先前制备的含有探针1d的溶液铺于每个孔中，并放置杂交2小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| RNA | δ(信号减去噪声) |
| NA1 | 2070630 |
| NA2 | 0 |
| NA3 | 0 |
| NA4 | 0 |
该实施例示出了所述方法在单个错配水平上也是如何高度特异性的。
实施例9(RNA和DNA比较)
方法。在SSC2.5x S中将RNA NA1、DNA NA5分两部分稀释至浓度为150fmol/ml，加入20nM的探针2d。将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交4小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
| 核酸 | δ(信号减去噪声) |
| NA1(RNA) | 2300299 |
| NA5(DNA) | 904829 |
所述方法还可用于检测DNA。因为对DNA的较低亲和力确保了源自任何DNA片段的非特异性的风险较低，所以它可有利于的用于RNA。
实施例10(比色检测)
方法。在SSC2.5x S中将RNA NA1和NA2分两部分稀释至浓度为150fmol/ml和15fmol/ml(仅NA1)，加入20nM的探针2d。将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交4小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的比色底物(TMB高灵敏度底物,Biolegend)。10分钟后加入100μl终止液(Biolegend)阻断反应。按照方案在450nm处读取板。
| δ(信号减去噪声) | |
| NA1 150fmol/ml | 3.846 |
| NA1 15fmol/ml | 0.600 |
| NA2 150fmol/ml | 0.000 |
所述方法还可用于比色检测以及与先前实验使用的固体载体不同的固体载体上。
实施例11(灵敏度)
方法。在SSC2.5x S中将RNA NA1分两部分稀释至浓度为150fmol/ml、15fmol/ml、1.5fmol/ml、150amol/ml、15amol/ml、1.5amol/ml，加入10nM的探针2d。对于每个浓度，将100μl先前制备的含有探针1b的溶液铺于每个孔中，并放置杂交2小时。然后去除寡核苷酸，并洗涤孔。将100μl浓度为0.1μg/ml的SA-HRP40加入PBST中，持续60分钟。然后去除SA-HRP40，并洗涤孔。加入100μl的化学发光底物(Clarity,Biorad)。5分钟后进行采集。
计算为噪声+(3*标准偏差)的检出限(LOD)低于1.5amol/ml的浓度(实施例的最后一点)。
从实施例所示结果可以明显看出，根据本发明的方法具有高灵敏度、特异性、亲和力、执行简易和快速。
具体而言，使用三个寡核苷酸(两个探针和靶核酸)的部分叠加提供了先前从未获得过的优势。事实上，三重复合体(triplex complex)比双重复合体(duplex complex)具有更大的稳定性。
最后，显然可以对所描述和举例说明的方法和试剂盒进行修改和改变，而不偏离所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> Bioridis Srl
<120> 用于检测和/或定量靶核苷酸序列的方法和试剂盒
<130> 428-18
<160> 14
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA mir 146a 全匹配
<400> 1
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mir 146b 错配
<400> 2
ugagaacuga auuccauagg cu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1个错配
<400> 3
ugacaacuga auuccauggg uu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4个错配
<400> 4
ugagaacuga auuucacuug uu 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 全匹配
<400> 5
tgagaactga attccatggg tt 22
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 1A
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato"
<220>
<221> misc_structure
<222> 1..10
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 10
<223> /标准名称="AEEA-K-CONH2"
<400> 6
tcagttctca 10
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 1B
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..12
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 12
<223> /标准名称="AEEA-K-CONH2"
<400> 7
attcagttct ca 12
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 1C
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..16
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 16
<223> /标准名称="AEEA-AEEA-K-CONH2"
<400> 8
tggaattcag ttctca 16
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 1D
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="NH2-AEEA-AEEA-AEEA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..12
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 12
<223> /标准名称="G-CONH2"
<400> 9
actcttgact ta 12
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 2A
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato - 5(K(Biot)-AEEA)"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..16
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 16
<223> /标准名称="K-CONH2"
<400> 10
aacccatgga attcag 16
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 2B
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato - 5(K(Biot)-AEEA)"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..16
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 16
<223> /标准名称="K-CONH2"
<400> 11
catggaattc agttct 16
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 2C
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato - 5(K(Biot)-AEEA)"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..12
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 12
<223> /标准名称="K-CONH2"
<400> 12
aacccatgga at 12
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 2D
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato - 5(K(Biot)-AEEA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..16
<223> /标准名称="PNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 16
<223> /标准名称="G-CONH2"
<400> 13
ttttaaccca tggaat 16
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA 2E
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> /标准名称="N 端 acetilato - 5(K(Biot)-AEEA)"
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..12
<223> /标准名称="DNA"
<220>
<221> misc_feature
<222> 12
<223> /标准名称="KKK-CONH2"
<400> 14
aacccatgga at 12
Claims (9)
1.一种用于检测和/或定量样品中靶核苷酸序列(3)的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供单链形式的靶核苷酸序列(3)；
-将所述单链靶核苷酸序列(3)与单链核酸的第一探针(1)和与单链核酸的第二探针(2)杂交，
所述第一探针(1)的一端固定在固体载体(4)上，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第一部分(5)互补的序列，第二探针(2)的一端被标记，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第二部分(6)互补的序列，其中所述靶核苷酸序列的第一部分(5)和第二部分(6)共有2至10个核苷酸，从而形成第一探针-靶核苷酸序列-第二探针复合体；
-检测所述第一探针-靶核苷酸序列-第二探针复合体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一探针(1)和第二探针(2)是由选自以下的核酸形成：PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、吗啉代、orn-PNA(具有鸟氨酸骨架的PNA)、aep-PNA(氨基乙基脯氨酰基-PNA)、aepone-PNA(氨基乙基吡咯烷酮-PNA)、GNA(乙二醇核酸)、HNA(己糖醇核酸)、TNA(苏糖核酸)、ENA(2’-O,4’-C-乙烯-桥接核酸)、ANA(阿拉伯核酸)、F-ANA(2’-F-阿拉伯核酸)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一探针(1)和第二探针(2)是由PNA(肽核酸)形成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶核苷酸序列(3)为微RNA(miRNA)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一探针(1)和/或第二探针(2)由10至18个核苷酸形成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为活细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二探针(2)是用生物素、荧光分子或荧光素标记的。
8.一种用于根据前述权利要求中任一项所述的方法中的试剂盒，其包含：
-单链核酸的第一探针(1)，所述第一探针(1)的一端固定在固体载体(4)上，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第一部分(5)互补的序列，
-单链核酸的第二探针(2)，所述第二探针(2)的一端被标记，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第二部分(6)互补的序列，
其中所述靶核苷酸序列的第一部分(5)和第二部分(6)共有2至10个核苷酸。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，还包含至少一种选自以下的缓冲液：SSC5x、SSC05x、SSC5x Tween 0.05/0.01％、SSC 0.5x Tween 0.05/0.01％、SSC2.5x SDS 0.1/0.05％、SSC2.5x SDS 1/0.5％、SSC2.5x SDS 0.1/0.05％BSA 5/10％、SSC5x SDS 0.1/0.05％BSA5/10％、PBS、PBS Tween 0.05/0.1％、PH为5.8至7.2的磷酸盐缓冲液、pH为5.8至7.2的磷酸盐缓冲液SDS 0.1/0.05％。
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