CN117165657A - 一种rna文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种RNA文库的构建方法，包括在反转录阶段引入样本标签序列(barcode)，实现多样本混合建库(multiplexing)，从而显著提高实验的效率，并降低样本的投入量，并采用CRISPR‑Cas9的方法，去除文库中高比例的核糖体和线粒体RNA序列，显著提高测序数据的信噪比。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体液中片段化RNA文库的构建方法。
背景技术
RNA是一种高度动态和多样化的生物分子，在多种生物过程中扮演了重要的作用。RNA标志物检测有望为多种疾病的诊断、预后和药物反应预测等提供有价值的信息。RNA标志物与现有的DNA和蛋白标志物相比，具有更好的敏感性、组织特异性和多样性，给更好的临床检验带来了新的期望。
然而，临床上易获得并广泛使用的样本类型，如FFPE(福尔马林固定石蜡包埋样本)和体液样本(如血液、尿液、唾液等)，其RNA的检测均存在很大程度的困难。对于FFPE样本来说，福尔马林固定和高温石蜡的渗入均会一定程度上导致RNA的降解，保存环境和时间也对RNA的含量与完整性有很大影响。因此FFPE样本往往存在RNA含量低、降解严重等问题。而对于体液样本来说，除了与蛋白结合、形成二级结构或被包裹在囊泡结构中的RNA之外，高水平RNA酶的存在会导致体液中的RNA被不同程度的降解，因此体液RNA也存在RNA含量低、片段化等问题。此外，RNA样本往往被高比例的核糖体RNA和线粒体RNA等类型所主导，限制了我们对其他更有信息价值的RNA类型(如mRNA和lncRNA等)的检测，而特异性去除碎片化的非目标RNA也存在一定的技术难度，这些都为高通量地鉴定和检测疾病RNA标志物带来了巨大的挑战。
由于小RNA丰度高且不易受到降解问题的干扰，现有的方法大多都是针对样本中的miRNA进行检测。如被广泛应用的适配子连接法，就是通过在miRNA两端加接头的方式构建高通量测序文库。但是，miRNA基因总共约有两千条，其蕴含的信息量比较有限，而mRNA、lncRNA等长RNA类型的数量则远超miRNA(约有10万条)，同时存在多种转录后修饰(如可变剪接、可变多聚腺苷酸化和RNA编辑等)，因而长RNA包含了更多的信息量。
为了检测临床样本中微量、片段化的长RNA，有研究者开发了Phospho-seq，通过加入T4 PNK的修复步骤来优化适配子连接法使其可以用于长RNA碎片的检测。但是这种方法没有考虑到核糖体RNA和线粒体RNA占比过高的问题，因此大量的数据被信息量较少的rRNA和mtRNA占据，测序数据信噪比很低，没有对文库进行早期标记，从而无法实现对多个样本进行混样建库，效率低，成本高至￥1000元以上，而且有误差。除此之外，也有研究者采用SMARTer-seq进行临床样本长RNA碎片的检测。该方法采用随机引物和模板转换的方法来捕获RNA，相较于基于适配子连接法的Phospho-seq来说，效率有了很大程度的提高，同时也避免了适配子序列连接RNA所存在的偏好性。但是，一方面该方法无法进行混样建库，导致其成本昂贵；另一方面，该方法虽然去除了核糖体RNA，但是却没有考虑到高比例的线粒体RNA的影响，也在一定程度上降低了测序数据的信噪比。以上问题都限制了临床样本中微量、片段化的RNA用作疾病标志物的研究进展和在临床上的应用。
发明内容
本发明针对临床样本RNA微量、片段化和被核糖体及线粒体RNA主导等问题，通过应用模板转换、早期标记、分子标签和CRISPR-Cas9等技术，很好地解决了上述瓶颈问题，同时极大地降低了构建高通量测序文库的经济成本并提高了测序数据的信噪比。本发明的技术可广泛应用于微量、片段化的RNA的检测中，包括但不限于临床FFPE和体液样本等，有望促进RNA用于疾病诊断、预后和药物反应预测等科学研究和临床应用。
本发明的第一方面，提供了一种RNA文库的构建方法。
优选的，所述的构建方法包含使用sgRNA和Cas9去除核糖体RNA和线粒体RNA序列。进一步优选的，包含加入Cas9核酸酶、核糖体RNA的sgRNA、线粒体RNA的sgRNA以及缓冲液，然后室温孵育后，进行Cas9体外切割反应，优选的，所述的Cas9体外切割反应程序为30-40℃孵育50-70分钟，60-70℃孵育3-10分钟。
优选的，所述的构建方法还包括反转录的步骤，进一步优选为将N6-barcode引物与RNA混合进行反转录的步骤。
优选的，所述的构建方法还包括将反转录模板转换为寡聚核苷酸(优选TSO-UMIoligo)。
优选的，所述的构建方法还包括预扩增的步骤，进一步优选为采用包含index序列和/或接头序列的引物进行预扩增。
优选的，所述的构建方法还包括文库扩增的步骤，进一步优选的，包括采用包含接头的引物进行文库扩增。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将获取的RNA进行反转录，然后将反转录模板转换为寡聚核苷酸，然后进行预扩增，加入sgRNA和Cas9去除核糖体RNA和线粒体RNA序列，之后文库扩增。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包含：
1)获取RNA；
2)将步骤1)获得的RNA反转录为cDNA；
3)将反转录模板转换至寡聚核苷酸；
4)预扩增，优选还包含纯化和/或选择目标大小的片段；
5)加入sgRNA和Cas9去除核糖体RNA和线粒体RNA序列，优选还包含纯化的步骤；
6)文库扩增。
优选的，所述的步骤1)中获取RNA包含提取、纯化RNA，优选提取、纯化来源于体液中的RNA。所述的体液包括细胞内液和细胞外液，优选的，所述的细胞内液选自细胞质基质、核液或细胞器的基质的细胞液；所述的细胞外液选自组织液、唾液、尿液、血浆、淋巴或脑脊液。
进一步优选获取RNA包含提取核酸、消化DNA以及纯化和浓缩。
优选的，所述的提取核酸包括离心去除细胞碎片、加入裂解液、加入氯仿，然后离心。
进一步优选的，所述的提取核酸包括将血浆样本离心去除细胞碎片；加入裂解液，裂解脂肪、细胞外囊泡(例如外泌体)以及RNP，孵育；加入氯仿，静置后离心取上清；加入乙醇后采用离心柱提取。
优选的，所述的裂解液优选为QIAzol Lysis Reagent。
优选的，所述的离心包括使用离心柱，所述的离心柱优选为Zymo-SpinTMICColumn。
所述的消化DNA包括加入DNA酶及缓冲液后进行37℃金属浴中孵育20-30分钟。还包括使DNA酶失活的步骤。
所述使DNA酶失活的步骤包括将上述孵育20-30分钟后的混合物置于80℃金属浴中孵育1-5分钟(优选孵育2分钟)。
所述的纯化和浓缩包括加入乙醇后通过离心柱的步骤。
优选的，所述的离心柱为Zymo-SpinTMIC Column。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的步骤1)获取RNA包含：
A)将血浆样本离心去除细胞碎片后加入QIAzol Lysis Reagent进行裂解，孵育；
B)加入氯仿，静置后离心取上清；
C)加入乙醇后加入至Zymo-SpinTMIC Column离心柱中离心；
D)洗脱RNA，所得流穿液即为血浆cfRNA溶液；
E)DNA酶及缓冲液后进行37℃金属浴中孵育20-30分钟，消化DNA；
F)加入RNA Binding Buffer到E)中消化完成的样品中；
G)重复上述C)-D)步骤进行纯化和浓缩。
优选的，所述步骤2)包含将N6-barcode引物与RNA混合进行反转录。
优选的，所述的反转录程序包括70-75℃孵育3-5分钟后立即置于4℃冰盒中孵育1-5分钟。
优选的，所述的N6-barcode引物包含SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：13所示核苷酸序列中的至少一种。
优选的，所述的N6-barcode引物包含5’端和/或3’端的修饰。
进一步优选的，所述的修饰包括硫代修饰(优选为硫代磷酸酯修饰)、磷酸化修饰、内部氨基修饰、5’氨基修饰、3’氨基修饰、疏基修饰、生物素Biotin修饰、地高辛修饰和/或间隔修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的N6-barcode引物包含5’端修饰，所述的5’端修饰为生物素Biotin修饰，
在本发明的一个具体实施方式中，所述的N6-barcode引物从5’端到3’端依次包含5’端修饰(优选为生物素Biotin修饰)、SEQ ID NO：2-13中的至少一种。
优选的，所述步骤3)中寡聚核苷酸为TSO-UMI oligo。
优选的，所述的步骤3)中还包含常规使用的模板转换所需试剂。
优选的，所述的步骤3)的反应程序包括40-45℃孵育80-100分钟，65-75℃孵育5-15分钟。
优选的，所述的TSO-UMI oligo包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。
优选的，所述的TSO-UMI oligo包含5’端和/或3’端的修饰。
进一步优选的，所述的修饰包括硫代修饰(优选为硫代磷酸酯修饰)、磷酸化修饰、内部氨基修饰、5’氨基修饰、3’氨基修饰、疏基修饰、生物素Biotin修饰、地高辛修饰和/或间隔修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的TSO-UMI oligo包含5’端修饰，所述的5’端修饰为生物素Biotin修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的TSO-UMI oligo从5’端到3’端依次包含5’端修饰(优选为生物素Biotin修饰)、SEQ ID NO：1。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的TSO-UMI oligo序列为：
Biotin-GTGTGCTCTTCCGATCTCGNNNNNNNNrGrGrG。
优选的，所述步骤4)中预扩增的引物包含index序列，优选还包含接头序列。
优选的，所述的预扩增的程序包括变性、退火、延伸及终延伸的步骤。
优选的，所述预扩增的引物包含SEQ ID NO：14-29中的至少一种。
优选的，所述的引物包含5’端和/或3’端的修饰。
进一步优选的，所述的修饰包括硫代修饰(优选为硫代磷酸酯修饰)、磷酸化修饰、内部氨基修饰、5’氨基修饰、3’氨基修饰、疏基修饰、生物素Biotin修饰、地高辛修饰和/或间隔修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’端修饰为生物素Biotin修饰，所述的3’端修饰为硫代磷酸酯修饰，优选对3’端第2-5(例如2、3、4、5)个碱基进行硫代磷酸酯修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的预扩增的引物从5’端到3’端包含5’端修饰(优选为生物素Biotin修饰)、SEQ ID NO：14-29中的至少一种、3’端修饰(优选为硫代磷酸酯修饰)。
优选的，所述的步骤5)去除核糖体RNA和线粒体RNA序列包括：加入Cas9核酸酶、核糖体RNA的sgRNA、线粒体RNA的sgRNA以及缓冲液，然后室温孵育后，进行Cas9体外切割反应，优选的，所述的Cas9体外切割反应程序为30-40℃孵育50-70分钟，60-70℃孵育3-10分钟。
优选的，所述的步骤6)为使用带有接头的引物进行文库扩增。
优选的，所述的文库扩增的程序包括变性、退火、延伸及终延伸的步骤。
优选的，所述的文库扩增的引物包含SEQ ID NO：30和/或31。
优选的，所述的文库扩增的引物包含5’端和/或3’端的修饰。
进一步优选的，所述的修饰包括硫代修饰(优选为硫代磷酸酯修饰)、磷酸化修饰、内部氨基修饰、5’氨基修饰、3’氨基修饰、疏基修饰、生物素Biotin修饰、地高辛修饰和/或间隔修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的文库扩增的引物包含3’端修饰，所述的3’端修饰为硫代磷酸酯修饰，优选对3’端第2-5(例如2、3、4、5)个碱基进行硫代磷酸酯修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的文库扩增的引物从5’端到3’端依次包含SEQ ID NO：30和/或31、3’端修饰(优选为硫代磷酸酯修饰)。
优选的，所述的构建方法还包含文库质量控制，进一步优选的，所述的文库质量控制包含RNA定量，以进行后续混样。
优选的，所述的RNA来源于体液，所述的体液包括细胞内液和细胞外液，优选的，所述的细胞内液选自细胞质基质、核液或细胞器的基质的细胞液；所述的细胞外液选自组织液、唾液、尿液、血浆、淋巴或脑脊液。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括：
1)提取血浆中的核酸，消化DNA，然后纯化和浓缩获得RNA；
2)将N6-barcode引物与步骤1)中获得的RNA混合进行反转录；
3)将反转录模板转换至TSO-UMI oligo；
4)用包含index序列和接头的引物进行预扩增，然后进行纯化和/或选择目标大小的片段；
5)加入Cas9核酸酶、核糖体RNA的sgRNA、线粒体RNA的sgRNA以及缓冲液，然后室温孵育后，进行Cas9体外切割反应，然后进行纯化，优选的，所述的Cas9体外切割反应程序为30-40℃孵育50-70分钟，60-70℃孵育3-10分钟；
6)使用带有接头的引物进行文库扩增。
本发明的第二方面，提供了一种获取RNA的方法。
优选的，所述的方法包含提取、纯化RNA，优选提取、纯化来源于体液中的RNA。所述的体液包括细胞内液和细胞外液，优选的，所述的细胞内液选自细胞质基质、核液或细胞器的基质的细胞液；所述的细胞外液选自组织液、唾液、尿液、血浆、淋巴或脑脊液。
进一步优选获取RNA包含提取核酸、消化DNA以及纯化和浓缩。
优选的，所述的提取核酸包括离心去除细胞碎片、加入裂解液、加入氯仿，然后离心。
进一步优选的，所述的提取核酸包括将血浆样本离心去除细胞碎片；加入裂解液，裂解脂肪、细胞外囊泡(例如外泌体)以及RNP，孵育；加入氯仿，静置后离心取上清；加入乙醇后采用离心柱提取。
优选的，所述的裂解液优选为QIAzol Lysis Reagent。
优选的，所述的离心包括使用离心柱，所述的离心柱优选为Zymo-SpinTMICColumn。
所述的消化DNA包括加入DNA酶及缓冲液后进行37℃金属浴中孵育20-30分钟。还包括使DNA酶失活的步骤。
所述使DNA酶失活的步骤包括将上述孵育20-30分钟后的混合物置于80℃金属浴中孵育1-5分钟(优选孵育2分钟)。
所述的纯化和浓缩包括加入乙醇后通过离心柱的步骤。
优选的，所述的离心柱为Zymo-SpinTMIC Column。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的获取RNA的方法包含：
A)将血浆样本离心去除细胞碎片后加入QIAzol Lysis Reagent进行裂解，孵育；
B)加入氯仿，静置后离心取上清；
C)加入乙醇后加入至Zymo-SpinTMIC Column离心柱中离心；
D)洗脱RNA，所得流穿液即为血浆cfRNA溶液；
E)DNA酶及缓冲液后进行37℃金属浴中孵育20-30分钟，消化DNA；
F)加入RNA Binding Buffer到E)中消化完成的样品中；
G)重复上述C)-D)步骤进行纯化和浓缩。
优选的，所述的G中重复次数为2-10(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10)次。
本发明的第三方面，提供了一种上述构建方法或其构建的文库在测序、诊断疾病中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种测序方法。
优选的，所述的测序方法包括使用上述的构建方法获得的文库，上机测序。
本发明的第五方面，提供了一种疾病的诊断方法，所述的诊断方法包括检测RNA标志物。优选的，所述的检测RNA标志物包括获取RNA，并采用上述RNA文库的构建方法获得RNA文库，并进行测序，以检测RNA标志物。
优选的，所述的检测RNA标志物包括检测RNA标志物的有无或含量(例如表达量)高低。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本申请中简写与全称对照：
cfRNA：细胞外RNA，指由细胞产生和分泌至体液(如血浆等)中的RNA。cfRNA已被提出在多种生物学过程中发挥作用，其中包括在细胞间具有潜在的通讯与调控作用。
模板转换：即在反转录产物延伸至RNA 5'末端时，反转录模板转换到TSO(模板转换寡聚核苷酸)上的现象。
Barcode：样本标签序列；
Multiplexing：将多个样本混合在一起进行建库或测序的操作。
UMI：unique molecular identify，分子标签序列。
sgRNA：single guide RNA，即单链向导RNA，可以引导Cas9蛋白在基因编辑位点进行定向切割。
PAM：protospacer adjacent motif，间隔序列前体临近基序，在靶DNA序列附近可以被Cas9蛋白靶向的2-6个碱基序列。
rRNA：ribosomal RNA，核糖体RNA。
mtRNA：mitochondrial RNA，线粒体RNA。
cDNA：complementary DNA，互补脱氧核糖核酸。
Library：高通量测序文库。
PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应。
FFPE：Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded，福尔马林固定石蜡包埋样本。
T4 PNK：T4 Polynucleotide Kinase，T4多聚核苷酸激酶。
SMARTer-seq：SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3-Pico InputMammalian。
tucpRNA：transcripts of uncertain coding potential。
RNP：核糖核酸蛋白复合物。
本发明的有益效果：
1)本发明采用早期标记策略，在反转录阶段引入样本标签序列(barcode)，实现多样本混合建库(multiplexing)，从而显著提高实验的效率，并降低样本的投入量；
2)本发明创新性地采用基于CRISPR-Cas9的方法，去除微量、片段化RNA文库中高比例的核糖体和线粒体RNA序列(以及任意其他想要去除的序列)，从而显著提高测序数据的信噪比，另外，本申请去除核糖体和线粒体RNA序列为预扩增后进行去除，避免了反转录之前的RNA阶段去除导致获取的cfRNA量低难以建库等问题；
3)本发明显著降低了建库成本，单样本建库测序成本不超过￥500元；
4)本发明采用分子标签序列(UMI)准确定量RNA，避免PCR扩增产生的重复序列对定量造成的偏差；
5)本发明采用随机引物结合与模板转换法捕获微量的片段化RNA，从而实现比适配子序列(adaptor)连接法更高效率的高通量测序文库构建。
附图说明
图1：sgRNA设计流程图；
图2：sgRNA模板DNA合成图；
图3：文库构建流程示意图；
图4：文库的核酸片段分布检测结果；
图5：最终文库结构示意图；
图6：典型基因(ACTB、FTH1、B2M)的读段分布图；
图7：不同血浆起始量下检测到的基因数目。
图8：核糖体和线粒体RNA序列去除效果图，其中，Untreated表示未处理组；Depleted表示去除rRNA和mtRNA序列组，genome表示读段比对到基因组中的比例、chrMandrRNA表示读段比对到rRNA和mtRNA的比例；
图9：不同建库方法读段比对到人类基因组(genome)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA(chrM)、spikeIn、微生物核酸序列(microbiome)以及无法比对读段(unmapped)的比例；
图10：不同建库方法读段比对到外显子、内含子和基因间区域上的比例；
图11：不同建库方法读段比对到信使RNA(mRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)、假基因(pseudogene)、misc、短链非编码RNA(sncRNA)、tucpRNA和外显子(exon)上的比例。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案、优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
本申请实施例中获得的文库进行测序使用的测序平台为Illumina HiSeq XTMTen测序平台。
实施例中使用的试剂来源及价格(表1)：
表1
实施例1：文库构建
一、cfRNA的提取
1.取1mL血浆样本，在4℃下16,000xg离心10分钟去除细胞碎片；
2.加入5mL QIAzol Lysis Reagent，混匀后室温孵育5分钟；
3.加入1mL氯仿，上下颠倒15秒，彻底混匀后室温静置2-3分钟；
4.对上述混合物在4℃下12,000xg离心15分钟；
5.将上清水相转移至新的无RNA酶的离心管中；
6.加入与上清水相等体积的无水乙醇并彻底混匀；
7.加入800μL上述混合物至配有收集管的离心柱(Zymo-SpinTMIC Column)中，16,000xg离心30秒，弃流穿液；
8.重复上述步骤7，直至所有混合物均已通过离心柱；
9.加入400μL RNA Prep Buffer，16,000xg离心30秒，弃流穿液；
10.加入700μL RNA Wash Buffer，16,000xg离心30秒，弃流穿液；
11.加入400μL RNA Wash Buffer，16,000xg离心2分钟，弃收集管，将过滤柱转移至新的无RNA酶的离心管中；
12.加入22μL无RNA酶的超纯水至过滤柱基质中，室温孵育1分钟，16,000xg离心30秒洗脱RNA；
13.将流穿液加至过滤柱基质中，重复上述步骤12的洗脱步骤1次，所得流穿液即为血浆cfRNA溶液。
二、残留DNA的消化
1.将提取得到的22μLcfRNA与表2中的试剂混合；
表2
2.将上述混合液置于37℃金属浴中孵育20-30分钟。
3.将上述混合液置于80℃金属浴中孵育2分钟以使DNase I失活。
三、RNA的纯化和浓缩
1.加入100μL RNA Binding Buffer至50μL上述DNase I消化完成的样品中。
2.加入150μL无水乙醇并彻底混匀；
3.将上述混合物转移至配有收集管的离心柱(Zymo-SpinTMIC Column)中，16,000xg离心30秒，弃流穿液；
4.重复上述步骤3，直至所有混合物均已通过离心柱；
5.加入400μL RNA Prep Buffer，16,000xg离心30秒，弃流穿液；
6.加入700μL RNA Wash Buffer，16,000xg离心30秒，弃流穿液；
7.加入400μL RNA Wash Buffer，16,000xg离心2分钟，弃收集管，将过滤柱转移至新的无RNA酶的离心管中；
8.加入7μL无RNA酶的超纯水至过滤柱基质中，室温孵育1min，16,000xg离心30秒洗脱RNA；
9.将流穿液加至过滤柱基质中，重复上述步骤8的洗脱步骤1次；
10.将6μL cfRNA溶液转移至200μL无核酸酶的八联排管中。
四、靶向人线粒体RNA和核糖体RNA的sgRNA的设计与制备
1.sgRNA设计流程图如图1所示。具体步骤如下：
1.1使用DASHit软件中的cprisr_site命令扫描核糖体RNA和线粒体RNA上的PAM位点。
1.2去除脱靶到人类转录组(除了rRNA和mtRNA之外)上的sgRNA序列。
1.3去除可能形成二级结构的sgRNA序列。
1.4使用Benchling评估sgRNA的on-target score(灵敏度分数)和off-targetscore(特异性分数)，去除off-target score低于40的sgRNA。
1.5去除覆盖同一位点的冗余sgRNA。
1.6手动为未被覆盖的区域添加sgRNA。
2.sgRNA模板DNA的制备
2.1根据上述sgRNA设计，合成sgRNA的模板DNA(图2)。
2.2按表3准备一步法制备sgRNA模板DNA的PCR反应体系。
表3
2.3将上述体系放入PCR仪器中，进行表4中的热循环步骤。
表4
2.4对PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下电泳40分钟。
2.5对130bp的条带切胶，使用TIANgel purification kit进行凝胶回收和DNA纯化，并使用100μL无核酸酶的水洗脱DNA。
2.6使用dsDNA HS Assay Kit测定DNA浓度。
3.sgRNA的体外转录
体外转录采用HiScribeTMT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit，具体如下：
3.1按表5准备sgRNA体外转录(In vitro transcription，IVT)反应体系。
表5
3.2混匀后将反应体系置于PCR仪中，37℃孵育4～16小时，最终置于4℃保存。
3.3按表6准备sgRNA模板DNA消化反应体系。
表6
3.4混匀后将反应体系置于PCR仪中，37℃孵育15分钟，80℃孵育2分钟以使DNaseI失活，最终置于4℃保存。
3.5使用RNA Clean&ConcentratorTM-5试剂盒纯化体外转录所得到的sgRNA(按照上述步骤三的RNA的纯化和浓缩进行纯化)。
3.6将纯化后的sgRNA置于PCR仪中，72℃孵育2分钟，然后冷却至4℃保持至少2分钟以使sgRNA折叠形成二级结构。
3.7将rRNA和mtRNA的sgRNA分别稀释至300ng/μL和38ng/μL，置于-80℃保存待用。sgRNA应避免反复冻融，冻融次数不应超过3次。
五、样本标签序列的设计与合成
1.样本标签序列的设计
1.1在RStudio中导入R包“DNABarcodes”。
1.2设置样本标签序列长度为4，海明距离为3，生成标签序列。
1.3过滤三联体、自身互补序列和GC含量不平衡的序列。
2.带有样本标签序列的随机六聚体引物的合成，
引物序列如表7所示。
表7
其中，rG：RNA-G，*：硫代磷酸酯(phosphorothioate)
六.文库构建的流程示意图如图3所示。
1、反转录
1.1将第三步的RNA的纯化和浓缩步骤中纯化得到的6μL cfRNA与1μL N6-barcode(X)引物混合；
1.2将反应体系置于PCR仪中，72℃孵育3分钟后立即置于4℃冰盒中孵育2分钟；
1.3向体系中加入表8中的成分：
表8
1.4混匀后将反应体系置于PCR仪中，42℃孵育90分钟，70℃孵育10分钟，最终得到20ulcDNA溶液置于4℃保存。
2.样本质量控制
2.1按表9准备实时荧光定量PCR反应体系；
表9
2.2在冰上或4℃下将18.5μL上述反应体系分别加入96孔板的10个孔中；
2.3在冰上或4℃下加入1.5μL的4μM预混引物。共有2对预混引物(表10)，每对引物有两个重复实验孔；
表10
| 序列编号 | 引物名称 | 序列(5'→3') |
| SEQ ID NO：32 | AC-ee-F | CTGAACCCCAAGGCCAACC |
| SEQ ID NO：33 | AC-ee-R | GAGGCGTACAGGGATAGCAC |
| SEQ ID NO：34 | TM-ee-F | GAAGACAGAGACGCAAGAGA |
| SEQ ID NO：35 | TM-ee-R | GTACAGTGCATATTGGCGGC |
2.4贴好96孔板的封膜以防交叉污染；
2.5将上述体系置于实时荧光定量PCR仪上进行下表11中的热循环步骤；
表11
2.6对实时荧光定量PCR检测的结果进行整理和分析。
3.Multiplexing预扩增
3.1将5个RNA含量相近，且带有不同样本标签的cDNA样本混合在一起(multiplexing)，每个样本17.5μL；
3.2按照表12中的成分依次添加，并彻底混匀；
表12
其中，PCR1引物见表7。
3.3将上述体系放入PCR仪器中，进行表13中的热循环步骤；
表13
4.文库纯化和片段大小选择
4.1将160μL磁珠加入至200μL的预扩增产物中，彻底混匀后室温孵育8分钟；
4.2将上述混合物样本管置于磁力架上6分钟直到溶液彻底澄清；
4.3在磁力架上将上述溶液的上清吸出并丢弃；
4.4加入400μL新鲜配制的80％乙醇溶液洗涤磁珠，等待30秒后吸出上清并丢弃；
4.5重复1次上述洗涤步骤4.4；
4.6将所有残留乙醇吸干并丢弃，打开管盖并晾干磁珠；
4.7加入52μL无核酸酶的水，彻底重悬磁珠；
4.8在磁力架外室温孵育5分钟，将DNA从磁珠上彻底洗脱下来；
4.9将样本管重新置于磁力架1分钟直到溶液彻底澄清；
4.10每个样本分别吸出50μL上清，加入到一个新的八联排管中；
4.11将40μL磁珠加入至50μL的样本中，彻底混匀后室温孵育8分钟。
5.高丰度核糖体RNA与线粒体RNA的去除
5.1按表14准备CRISPR-Cas9反应体系并彻底混匀；
表14
5.2将上述反应体系置于25℃金属浴孵育10分钟；
5.3当步骤4.11的8分钟孵育完成后，将样本管置于磁力架上6分钟直到溶液彻底澄清；
5.4在磁力架上将上述溶液的上清吸出并丢弃；
5.5加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液洗涤磁珠，等待30秒后吸出上清并丢弃；
5.6重复1次上述洗涤步骤5.5；
5.7将所有残留乙醇吸干并丢弃，打开管盖并晾干磁珠；
5.8加入21.5μL的CRISPR-Cas9反应体系，彻底重悬磁珠；
5.9在磁力架外室温孵育5分钟，将DNA从磁珠上彻底洗脱下来；
5.10将样本管重新置于磁力架1分钟直到溶液彻底澄清；
5.11每个样本分别吸出20μL上清，加入到一个新的八联排管中；
5.12将反应体系置于PCR仪中，37℃孵育60分钟，65℃孵育5分钟，最终置于4℃保存。
6.文库扩增
6.1按表15准备文库扩增反应体系并彻底混匀；
表15
其中，PCR2引物见表7。
6.2将上述文库扩增体系放入PCR仪器中，进行表16中的热循环步骤；
表16
7.文库纯化
7.1将100μL磁珠加入至100μL的文库样本中，彻底混匀后室温孵育8分钟；
7.2将上述混合物样本管置于磁力架上6分钟直到溶液彻底澄清；
7.3在磁力架上将上述溶液的上清吸出并丢弃；
7.4加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液洗涤磁珠，等待30秒后吸出上清并丢弃；
7.5重复1次上述洗涤步骤7.4；
7.6将所有残留乙醇吸干并丢弃，打开管盖并晾干磁珠；
7.7加入52μL无核酸酶的水，彻底重悬磁珠；
7.8在磁力架外室温孵育5分钟，将DNA从磁珠上彻底洗脱下来；
7.9将样本管重新置于磁力架1分钟直到溶液彻底澄清；
7.10每个样本分别吸出50μL上清，加入到一个新的八联排管中；
7.11再次重复磁珠纯化步骤7.1到7.10，使用1×磁珠，并最终将文库重悬于17.5μL无核酸酶的水中，每个样本分别吸出16μL上清溶液即为最终文库(见图5)。
实施例2：文库的质量控制
1使用dsDNA HS Assay Kit测定文库浓度，文库浓度需大于1ng/μL；
2使用安捷伦4200生物分析仪对文库的核酸片段分布进行质量控制(图4)。
实施例3：测序
1.血浆样本来源
本实施例的待测血浆样本来源于北京大学第一医院的健康人(1人)血浆样本(1mL)。
2.文库构建及质控
采用本申请实施例1的建库方法构建血浆RNA文库，并通过本申请实施例2的文库质量控制方法进行质控，获得测序文库。
3.测序
利用上述获得的测序文库对典型基因ACTB、FTH1和B2M进行测序，得到的基因读段分布图如图6所示。
结果表示：本申请实施例1所述的方法构建的RNA文库，可以进行测序。
实施例4：不同血浆起始量下的测序效果
1.血浆样本来源
本实施例的待测血浆样本来源于北京大学第一医院的健康人(3人)血浆样本(3mL/人)。
2.文库构建及质控
采用本申请实施例1的建库方法进行不同起始量(包括200μL、400μL、600μL、800μL和1000μL)的血浆RNA文库构建，并通过本申请实施例2的文库质量控制方法进行质控，获得测序文库。
3.测序
利用上述获得的测序文库进行测序，不同血浆起始量下检测到的基因数目如图7所示。
结果显示：检测到的基因数目随着血浆起始量的增加而增加，当血浆起始量增加到800至1000μL时，检测到的基因数目逐渐到达平台期。通常，1mL血浆中RNA的含量为皮克至纳克级。
实施例5：建库过程中去除rRNA和mtRNA干扰对测序的影响
1.血浆样本来源
本实施例的待测血浆样本来源于北京大学第一医院的健康人(3人)血浆样本(2mL/人)。
2.文库构建及质控
文库分为对照组及实验组，实验组按照本申请实施例1的建库方法构建血浆RNA文库，对照组按照，不去除rRNA和mtRNA的干扰(去除实施例1中第5.高丰度核糖体RNA与线粒体RNA的去除)，其他步骤与本申请实施例1的建库方法相同的方法构建血浆RNA文库，两种文库均使用1mL血浆样本作为起始材料，并通过本申请实施例2的文库质量控制方法进行质控，获得测序文库。
3.测序
利用上述获得的测序文库进行测序，两种文库读段比对到人类基因组上的比例及比对到rRNA和mtRNA序列上的比例见图8。
结果显示：实验组读段比对到人类基因组上的比例明显提高，读段比对到rRNA和mtRNA序列上的比例则明显下降。
实施例6：不同建库方法的效果对比
一、数据来源
为了比较不同建库方法的效果，在GEO数据库中下载了Phospho-seq(GSE126049，GSE126050)，SILVER-seq(GSE131512)和SMARTer-seq(GSE142987)的cfRNA测序数据；
其中，SMARTer-seq方法包含以下步骤；
第一步：通过使用QIAzol等试剂结合异丙醇沉淀对样品中的总RNA进行抽提；
第二步：使用随机引物和模板转换技术对总RNA进行捕获；
第三步：通过PCR进行预扩增并形成完整文库结构；
第四步：使用磁珠进行预扩增产物的筛选和纯化；
第五步：使用ZapR&R probe对来源于核糖体RNA的序列进行去除；
第六步：通过PCR对文库进行扩增；
第七步：使用磁珠进行目标文库的筛选和纯化；
第八步：文库质量控制；
第九步：高通量测序；
Phospho-seq方法包含以下步骤：
第一步：通过使用QIAzol等试剂结合吸附柱对样品中的总RNA进行抽提；
第二步：使用T4 PNK修复RNA末端；
第三步：使用适配子序列(adaptor)连接法进行3'端RNA捕获；
第四步：使用适配子序列连接法进行5'端RNA捕获；
第五步：反转录进行第一链cDNA合成；
第六步：通过PCR对文库进行扩增；
第七步：目标文库筛选和纯化；
第八步：文库质量控制；
第九步：高通量测序；
SILVER-seq方法参见：Zhou Z,Wu Q,Yan Z,Zheng H,Chen CJ,Liu Y,Qi Z,Calandrelli R,Chen Z,Chien S,Su HI,Zhong S.Extracellular RNA in a singledroplet of human serum reflects physiologic and disease states.Proc Natl AcadSci U S A.2019Sep 17；116(38):19200-19208.doi:10.1073/pnas.1908252116.Epub2019 Sep 3.PMID:31481608；PMCID:PMC6754586.
利用本申请实施例1的建库方法，采用来源于北京大学第一医院的健康人(5人)的血浆样本构建RNA文库进行测序，获得cfRNA测序数据。
将不同方法获得的测序进行统一处理。
二、对比结果
四种建库方法获得的文库测序所得的读段比对到人类基因组、核糖体RNA、线粒体RNA、spikeIn(ERCC RNA Spike-In Mix，购自Ambion货号4456740)、微生物核酸序列以及无法比对读段的比例对比结果如图9所示。结果表示：对本申请实施例1的建库方法获得的文库进行测序，所得的数据相比Phospho-seq和SMARTer-seq方法，有较高的人类基因组比对率。虽然SILVER-seq的人类基因组比对率更高，但是其数据可能存在较大的DNA污染(见图10)。图10也表明，本申请实施例1的建库方法获得的文库进行测序，所得的数据相比Phospho-seq和SILVER-seq方法，有较高的外显子比对率。其中，SILVER-seq的外显子比对率最低，表明该数据可能存在较大的DNA污染。
四种建库方法获得的文库测序所得的读段比对到不同RNA类型的比例：
四种建库方法获得的文库测序所得的读段比对到不同RNA类型的比例对比如图11所示。结果表示：本申请实施例1的建库方法获得的文库测序所得读段大部分都比对到mRNA上，其次是比对到一些非编码RNA类型上。
最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已对本发明进行了描述，但本领域普通技术人员应当理解，可以在实行上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附说明书所限定的本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 一种RNA文库的构建方法
<130> P0102022050430
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
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<210> 2
<211> 30
<212> DNA
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<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
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<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
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acgacgctct tccgatctat gaacnnnnnn 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
acgacgctct tccgatctat tgagnnnnnn 30
<210> 14
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tc 62
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<400> 15
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a 61
<210> 16
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agaagacggc atacgagatt ctccggagtg actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc 60
tc 62
<210> 17
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<400> 17
cgaccaccga gatctacaca tagaggcaca ctctttccct acacgacgct cttccgatct 60
a 61
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<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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tc 62
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<211> 61
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<400> 19
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a 61
<210> 20
<211> 62
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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tc 62
<210> 21
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tc 62
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a 61
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a 61
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a 61
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtacagtgca tattggcggc 20
Claims (10)
1.一种RNA文库的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包含使用sgRNA和Cas9去除核糖体RNA和线粒体RNA序列。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包含：
1)获取RNA；
2)将步骤1)获得的RNA反转录为cDNA；
3)将反转录模板转换至寡聚核苷酸；
4)预扩增，优选还包含纯化和/或选择目标大小的片段；
5)加入sgRNA和Cas9去除核糖体RNA和线粒体RNA序列，优选还包含纯化的步骤；
6)文库扩增。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)包含提取核酸、消化DNA以及纯化和浓缩；
优选的，所述的提取核酸包括离心去除细胞碎片、加入裂解液、加入氯仿，然后离心；所述的纯化和浓缩包括离心；
进一步优选的，所述的裂解液优选为QIAzol Lysis Reagent，所述的离心包括使用离心柱，所述的离心柱优选为Zymo-SpinTMIC Column。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)包含将N6-barcode引物与RNA混合进行反转录；
优选的，所述的N6-barcode引物包含SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：13所示核苷酸序列中的至少一种。
5.根据权利要求2-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中寡聚核苷酸为TSO-UMI oligo；
优选的，所述的TSO-UMI oligo包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。
6.根据权利要求2-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中预扩增的引物包含index序列，优选还包含接头序列；
优选的，所述预扩增的引物包含SEQ ID NO：14-29中的至少一种；
优选的，所述的预扩增的引物包含5’端和/或3’端的修饰，所述的修饰包括硫代修饰、磷酸化修饰、内部氨基修饰、5’氨基修饰、3’氨基修饰、疏基修饰、生物素Biotin修饰、地高辛修饰和/或间隔修饰。
7.根据权利要求2-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤5)去除核糖体RNA和线粒体RNA序列包括：加入Cas9核酸酶、核糖体RNA的sgRNA、线粒体RNA的sgRNA以及缓冲液，然后室温孵育后，进行Cas9体外切割反应，优选的，所述的Cas9体外切割反应程序为30-40℃孵育50-70分钟，60-70℃孵育3-10分钟。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的RNA来源于体液，所述的体液包括细胞内液和细胞外液，优选的，所述的细胞内液选自细胞质基质、核液或细胞器的基质的细胞液；所述的细胞外液选自组织液、唾液、尿液、血浆、淋巴或脑脊液。
9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：
1)提取血浆中的核酸，消化DNA，然后纯化和浓缩获得RNA；
2)将N6-barcode引物与步骤1)中获得的RNA混合进行反转录；
3)将反转录模板转换至TSO-UMI oligo；
4)用包含index序列和接头的引物进行预扩增，然后进行纯化和/或选择目标大小的片段；
5)加入Cas9核酸酶、核糖体RNA的sgRNA、线粒体RNA的sgRNA以及缓冲液，然后室温孵育后，进行Cas9体外切割反应，然后进行纯化，优选的，所述的Cas9体外切割反应程序为30-40℃孵育50-70分钟，60-70℃孵育3-10分钟；
6)使用带有接头的引物进行文库扩增；
优选的，所述的文库扩增的引物包含SEQ ID NO：30和/或31。
10.一种测序方法，其特征在于，所述的测序方法包括使用权利要求1-9任一所述的构建方法获得的文库，上机测序。
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