CN110205365B

CN110205365B - 一种高效研究rna相互作用组的高通量测序方法及其应用

Info

Publication number: CN110205365B
Application number: CN201910589430.4A
Authority: CN
Inventors: 尹东; 李耀庭; 廖建友
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN110205365A

Abstract

本发明公开了一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法及其应用。该方法包括如下步骤：(1)根据待测RNA的长度，每隔100bp设置一条DNA探针；(2)将细胞用1～3％(v/v)的甲醛溶液交联固定细胞后进行超声破碎，得到核酸的长度范围为100～500nt细胞裂解液；(3)加入DNA探针进行杂交，再对目标RNA进行富集，洗涤，纯化，得到RNA碎片；(4)将RNA碎片的3’末端和RNA接头连接，然后将产物逆转录成cDNA，再将cDNA的3’末端与DNA接头连接，得到目标RNA与其相互作用RNA的文库；(5)对文库进行扩增，再进行检测分析。该方法能够用于对低含量的相互作用RNA进行文库构建。

Description

一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法及其应用

技术领域

本发明涉及RNA相互作用组学领域，特别涉及一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法及其应用。

背景技术

RNA-RNA相互作用是基因表达过程的基础。它们在基因转录，翻译，转录后和翻译后修饰行使重要的功能。RNA-RNA相互作用包括：small nuclear(sn)RNA–snRNA和snRNA–precursor messenger(pre-m)RNA的相互作用，它们参与了剪接体的组装、催化反应和去组装的，而剪接体是行使将pre-mRNA剪接内含子而加工成为成熟mRNA的功能，从而为后面mRNA进行功能性翻译奠定基础。另外，氨基酰化trandfer RNAs(tRNA)和mRNAs的相互作用参与蛋白翻译时的肽链产生过程。small nucleolar(sno)RNAs与目标RNA的相互作用能对其RNA进行修饰。Micro(mi)RNAs和mRNAs相互作用而影响目标mRNA的表达。CircRNAs和miRNAs相互作用调控miRNA的功能发挥。Long non-coding(lnc)RNAs和mRNAs的相互作用从而控制转录和翻译过程开合。近年来，随着高通量测序和质谱技术的日渐成熟，有关相互作用组学的研究成为当前的研究热点。

目前，对于RNA-RNA相互作用的研究方法主流是基于邻位连接手段(RNAproximity ligation,RPL)，将相邻的相互作用的RNA连接成RNA双倍体，而检测双倍体方法。基于邻位连接的策略代表性方法主要是：Ligation of interacting RNA followedhigh-throughput sequencing(LIGR-seq，连接相互作用RNA结合高通量测序技术)，psoralen analysis of RNA interactions and structures(PARIS，以补骨脂素交联并分析RNA的相互作用和二级结构)和sequencing of psoralen-crosslinked,ligated andselected hybirds(SPLASH，测序鉴定以补骨脂素交联，连接和筛选的RNA嵌合体)。虽然三种测序方法的名字和细节不同，但它们都基于相同的设计原理。RNA邻位连接是将相邻的RNA-RNA相互作用通过连接酶形成嵌合体，然后通过高通量测序和生物信息学分析，得出相互作用的RNA。首先RNA被补骨脂素或其衍生物(psoralen derivatives)直接固定，然后通过365nm的紫外光交联，中间处理后被254nm的紫外光解交联，最后对得到的不同来源链RNA进行测序。虽然，基于RNA邻位交联技术能直接反映体内RNA-RNA相互作用和RNA的二级结构，但也存在一些缺点。第一是补骨脂素交联时，对于碱基选择具有偏向性，偏向于固定邻近相对的嘧啶碱基，尤其是尿嘧啶，可能会使到结果中G-C富集的区域被低估。第二是通过连接酶得到的RNA嵌合体比例较少，连接酶的反应效率仍需提高。在测到Reads数据中，RNA分子内部的结构占有大部分，而分子间的RNA-RNA嵌合体reads数量偏低。因此，对低丰度的RNA相互作用难以进行检测。第三是邻位连接不仅连接邻近RNA相互作用链，还会把其他随机的单链RNA或RNA自身连接，并会混入后面测序中，可能导致假阳性的产生。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法。

本发明的另一目的在于提供所述高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，包括如下步骤：

(1)设计DNA探针：根据待测RNA的长度，每隔100bp设置一条DNA探针；其中，DNA探针为3’末端带有生物素修饰的DNA探针，DNA探针中GC％的含量为45％，其长度为20个核苷酸；

(2)超声破碎：将细胞用1～3％(v/v)的甲醛溶液交联固定细胞后，加入裂解缓冲液进行超声破碎，得到细胞裂解液；其中，细胞裂解液中核酸的长度范围为100～500nt；

(3)探针和RNA杂交：将步骤(1)设计的DNA探针加入到步骤(2)中得到的细胞裂解液中，并加入两倍细胞裂解液体积的杂交缓冲液进行杂交，待杂交结束后加入磁珠对目标RNA进行富集，洗涤，解交联，并使用DNA酶和碱性磷酸酶去除DNA与磷酸基团，得到纯化后的RNA碎片；

(4)两步接头连接及构建文库：将步骤(3)中得到的纯化后的RNA碎片的3’末端和RNA接头进行连接反应，得到RNA偶联接头产物；然后将RNA偶联接头产物逆转录成cDNA，再将cDNA的3’末端与DNA接头进行连接反应，得到目标RNA与其相互作用RNA的文库；

(5)对步骤(4)中得到的目标RNA与其相互作用RNA文库进行扩增，再进行检测和分析。

步骤(1)中所述的待测RNA优选为U6 snRNA序列。

步骤(1)中所述的生物素修饰优选为Biotin TEG修饰。

步骤(1)中所述的每隔100bp设置一条DNA探针即当待测RNA的长度小于或等于100bp，设置一条DNA探针；当待测RNA的长度大于100bp而小于或等于200bp，设置两条DNA探针，以此类推；如有两个以上探针，每个探针相隔60～80bp；注意不要使用重复或广泛同源的区段，且一个样品管中不要使用超过50种探针，即探针的条数不超过50条。

步骤(1)中所述的DNA探针的浓度优选为100μM。

步骤(2)中所述的细胞为正常细胞或癌细胞；优选为HepG2细胞。

步骤(2)中所述的甲醛溶液通过如下方法配置得到：将甲醛加入到37℃、pH7.4的PBS缓冲液中，优选为配置1～3％(v/v)的甲醛溶液。

步骤(2)中所述的甲醛溶液优选为2％(v/v)的甲醛溶液。

步骤(2)中所述的甲醛溶液的用量为按每1×10⁷个细胞配比2.5～10mL甲醛溶液计算；优选为按每1×10⁷个细胞配比10mL甲醛溶液计算。

步骤(2)中所述的细胞的浓度为2×10⁷个细胞/500μL(Lysis buffer)。

步骤(2)中所述的超声破碎为采用plus超声破碎仪进行超声破碎，超声破碎的设置为高能量模式，超声破碎的时间为20min～4h(可根据细胞种类、数量而定)。

步骤(2)中所述的裂解缓冲液为Lysis buffer，其配方如下：50mM Tris-HClpH7.0(三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液)，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，1％SDS(w/v)(十二烷基硫酸钠)。

所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，还包括对步骤(2)中得到细胞裂解液进行验证的步骤；具体为：将细胞裂解液进行琼脂糖胶电泳，若细胞裂解液中核酸的长度为100～500nt，则说明超声完成，反之，继续进行超声破碎，直至细胞裂解液中核酸的长度为100～500nt为止。

步骤(3)中所述的细胞裂解液为每500μL含2×10⁷个细胞裂解后得到的细胞裂解液。

步骤(3)中所述的DNA探针的总浓度为100μM(即探针池的总浓度为100μM，单个探针的浓度为总浓度除以探针数，当DNA探针为两条或以上时，将每条DNA探针按照100μM的初始浓度等体积混合为探针组，然后加入到样品中，即体系中各探针的浓度均相同)。

步骤(3)中所述的DNA探针与细胞裂解液的体积比为1:500。

步骤(3)中所述的杂交缓冲液为Hybridization buffer，其配方如下：750mM NaCl(氯化钠)，1％(w/v)SDS，50mM Tris-HCl pH7.0，1mM EDTA pH8.0，15％(v/v)Formamide(甲酰胺)。

步骤(3)中所述的磁珠为Streptavidin C1磁珠；优选为Thermo FisherScientific公司的Streptavidin C1磁珠。

步骤(3)中所述的磁珠的用量为按每2×10⁷所述细胞配比100μL磁珠计算。

步骤(3)中所述的洗涤为采用Wash buffer进行洗涤；优选为用Wash buffer洗涤5次，每100μL磁珠使用1mL的Wash buffer。

所述的Wash buffer的配方如下：2x SSC(柠檬酸钠)缓冲液和0.5％(w/v)SDS。

步骤(3)中所述的解交联为用Proteinase K buffer进行解交联；其中，Proteinase K buffer的配方如下：100mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.0)，1mM EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。

步骤(3)中所述的DNA酶优选为TURBO DNase。

步骤(3)中所述的碱性磷酸酶优选为FastAP Thermosensitive AlkalinePhosphatase。

步骤(4)中所述的RNA接头为用染料标记后的RNA接头。

所述的染料优选为IRdye-800CW-DBCO。

步骤(4)中所述的RNA接头的核苷酸序列优选为：

5’-Phos/AUAUAGGNNNNNAGAUCGGAAGAGCGUCGUGUAG-3’AzideN/；其中，“Phos”表示磷酸基团；“AzideN”表示叠氮修饰。

步骤(4)中所述的DNA接头的核苷酸序列优选为：

5’-Phos/NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3’SpC3/；其中，“Phos”表示磷酸基团；“spc3”为间臂(spacer；阻止接头自连)。

步骤(4)中所述的构建文库为采用磁珠对体系中的核酸进行回收；所述的磁珠为SILANE磁珠；优选Thermo Fisher Scientific公司的SILANE磁珠。

步骤(4)中所述的连接所用的T4 RNA连接酶为T4 RNA Ligase 1。

所述的T4 RNA Ligase 1的浓度为30U/μL。

步骤(4)中所述的检测为文库检测；优选为采用Bioanalyzer High sensitiveDNA assay(Agilent，cat.no.5067-4626)进行文库检测。

步骤(4)中所述的分析为对RNA与其相互作用RNA文库进行分析，其采用生物信息学分析流程进行分析，具体过程如下：

(a)使用FASTX tool kit对下机数据进行处理，生成FASTQ格式文件；

(b)使用Cutadapt剪掉5’-接头序列和3’-接头序列；

(c)使用BBMap suite中bash script clumpify.sh包去除PCR重复；Cutadapt去掉随机碱基和barcodes；

(d)使用STAR将序列比对hg19和rRNA参考基因；

(e)使用MACS 1.4将reads统计成peak；

(f)使用HOMER中annotatePeaks.pl标注peak信息，并提取peak结果；

(g)将标注的peak结果使用Reactome数据库在线分析。

步骤(b)所述的5’-接头序列优选为：CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。

步骤(b)所述的3’-接头序列优选为：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。

所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法在研究或鉴定RNA-RNA相互作用，研究细胞中编码RNA或非编码RNA在生理/病理状态中的相互作用调控生物过程中的应用；所述应用的环境为体外环境，如对细胞进行研究。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明提供一种高效率的RNA-RNA相互作用在全基因组水平上的鉴定技术，对于目标RNA与其相互作用的RNA，按照CIRDES原则设计目标RNA的反向互补探针，将细胞内的相互作用的状态进行固定，匀质化，杂交和富集纯化得到RNA片段。接着进行建库实验。建库步骤包括：首先，对经纯化后的RNA片段的3’末端和RNA接头(RNA adapter)进行连接反应，连接后凝胶电泳纯化，去除过量接头。随后，连有接头的RNA被逆转录成cDNA。接着，cDNA与单链DNA接头进行连接反应。最后进行文库扩增。在RNA和DNA接头的设计上，本发明引入了随机核苷酸序列，其目的在于判断测序的得到的两个相同序列是来源于两个相同的RNA的片段还是来自PCR的重复，通过校正降低测序的偏向性和提高定量的准确性。同时，在进行连接反应时，使用了高浓度的T4 RNA连接酶，相比于普通浓度，其连接效率更高。本发明采用Thermo Fisher Scientific公司的SILANE磁珠对体系中的核酸进行回收。使用磁珠回收法，相比于柱回收法和乙醇沉淀法，有更高的回收效率和缩短建库时间。在RNA逆转录成cDNA后，取1μL的文库进行定量PCR(quantitative Polymerase ChainReaction,q-PCR)的检测，以确定每个样品的扩增循环数。接着，文库使用/>Ultra^TMII/>Master Mix酶体系进行扩增。该反应酶具有高保真性，适合于二代测序文库扩增。最后，使用AMPure XP磁珠，对文库进行核酸纯化，使用Bioanalyzer高灵敏度DNA实验进行文库的含量和大小分布的检测。高通量测序后，产生的原始数据，有对应的生物信息学分析流程对数据进行解读(该流程简洁，可操作性强，易于掌握)。

2、本发明针对待研究RNA的序列，根据碱基互补配对的原则，设计长度为20个核苷酸(nucleotide,nt)的带有3’末端生物素修饰的DNA探针。目标序列每隔100bp的区域，设置一条探针，覆盖整个RNA的序列。我们将对目标RNA设计的所有探针，以相同浓度混合在一起形成一个探针库。这样目的是：保证了加入探针后能结合任意断裂的RNA碎片，有利于增加富集度。相比传统的体外诱饵策略，即利用体外合成的RNA加入到细胞裂解液中以捕获相互作用的复合物。该方法能捕获到生理状态下的相互作用并且有效的减少假阳性的结果。

3、本发明选用甲醛为交联剂固定细胞，并对甲醛交联的浓度和比例的条件进行优化(2％的甲醛溶液，每10mL交联1×10⁷个细胞)，使到样品与无交联组相比，具有很高的富集效率；随后，通过超声匀质的方法将细胞裂解液中RNA随机打断成100到500nt的长度；接着在杂交反应中，目标RNA会被多条探针配对结合并被加入的链霉亲和素磁珠捕获，使目标RNA与其相互作用的生物大分子从细胞裂解液中被富集出来，经过洗脱步骤后，被纯化的RNA可以被后续的高通量检测而鉴定。

4、本发明建立一种高效率的建库策略，同时该策略中引入可视化的红外光激发接头，可以方便的评估建库时RNA的含量。

5、本发明提供的RNA相互作用检测技术在实际应用中能够鉴定编码RNA或非编码RNA在细胞内全基因组水平上的相互作用，经优化的高通量测序的建库策略，能够用于对低含量的相互作用RNA进行文库构建。该技术有助于研究RNA或非编码RNA在生理/病理状态中的相互作用调控生物过程的机制，为临床上疾病治疗提供新的研究思路。还可以应用于的新的或功能性的RNA-RNA相互作用的鉴定，为解释RNA在生命活动承担的作用提供理论机制基础。

6、本发明提供的体内RNA相互作用组学的测序技术有助于研究目标RNA与其他RNA在细胞内相互作用的调控网络，探讨其相互作用在参与生物过程中所发挥的作用。实际应用中研究U6 snRNA在体内的相互作用，通过检测与U4 snRNA相互作用，验证本发明的稳健性。同时也展示U6新的相互作用mRNA及其参与生物通路。本发明亦可用于对未知的非编码RNA-非编码RNA的相互作用的发现，非编码RNA-编码RNA相互作用的机制研究。

附图说明

图1是CIRDES(Capture interacting RNA and Deep sequencing)技术流程图。

图2是使用CIRDES技术，在样品中对U6 snRNA的特异性富集的柱状图。

图3是使用CIRDES技术中设计的RNA接头偶联红外激发染料，使到RNA和接头的连接过程可视化，并评估不同样品中建库初始RNA的含量图；其中，图A为U6 RNA、阳性对照和阴性对照的样品并偶联接头的电泳图；图B为不同样品RNA回收后，用于评估相对含量的点杂交图；图C为LI-COR系统计算不同样品的红外光信号值的柱状图(SR：25ng的200nt的small RNA，阳性对照；U6：捕获U6 snRNA的样品；NC：靶向细菌RNA的样品，阴性对照)。

图4是显示U6snRNA与U4snRNA存在相互作用的测序峰图。

图5是CIRDES鉴定U6snRNA与其相互作用mRNA相互作用网络图(并标注主要参与生物学通路)。

图6是对不同交联条件下，qRT-PCR检测样品中U4RNA的丰度图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

本发明建立了针对目标RNA全基因组上捕获相互作用RNA的技术，即一种高效和特异的全基因组上检测细胞内RNA-RNA相互作用技术，并命名为CIRDES(Captureinteracting RNA and Deep sequencing)。本发明实施例提供的使用CIRDES技术，针对U6snRNA在细胞内全基因组水平的RNA相互作用鉴定(图1)，总体上包括以下步骤：

步骤一：首先通过NCBI数据库查询人类的U6 snRNA序列，根据CIRDES探针设置规则，设计与目标RNA的反向互补探针。

步骤二：在15cm皿中培养HepG2细胞(购于中国科学院细胞库)，使用20mL含10％血清的DMEM进行培养，待细胞汇合度达到90％可进行交联实验。预热37℃PBS(pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，下同)配2％(v/v)甲醛溶液，对细胞进行交联。用终浓度500mM的甘氨酸溶液终止反应后，预冷PBS进行洗涤，细胞刮下来转移到离心管，细胞计数，按照2×10⁷个细胞定为一份样品。去除上清后，用液氮将细胞团冻住，然后放-80℃保存。

步骤三：在室温中融化交联后的细胞。轻弹离心管底部使细胞团松散并混匀细胞。4℃、2000g离心3min。移液器吸去所有残留的PBS。加入500μL的Lysis Buffer(已加抑制剂)/2×10⁷个细胞，重悬细胞，然后超声匀质。将能量设到高档(high mode)，在4℃水浴中，以30s ON，45s OFF条件进行超声匀质。每次将细胞裂解液按照4×10⁷个细胞分到15mL离心管，每次超声两个15mL离心管，超声约80个循环。

步骤四：将超声后样品在离心机以4℃、16100g离心10min，取上清并且合并。取每份细胞裂解液(即2×10⁷细胞的裂解液)体积的1/100做RNA Input。取磁珠(按10μL磁珠/2×10⁷个细胞裂解液配置)，用10倍磁珠体积(100μL)的Lysis Buffer洗三次。按每毫升(mL)细胞裂解液以2mL的量配置Hybridization Buffer(已加抑制剂)，涡旋混匀。将裂解液转移到15mL管中，加入Hybridization Buffer。加入上述Lysis Buffer洗过的磁珠，在分子杂交炉中37℃预杂交30min。随后置于磁力架上1min，分离并丢弃磁珠。室温解冻U6 snRNA的探针(probe)。每2×10⁷个细胞加入1μL 100μM探针，混匀。在杂交炉中37℃孵育过夜。在杂交结束前20min，按每100μL磁珠/1μL探针准备磁珠，用10倍体积的Lysis Buffer洗三次。用裂解细胞相同体积的Lysis Buffer(添加抑制剂)来将磁珠悬浮。在杂交结束后，将磁珠悬浮液加到每个管中，混匀，在杂交炉中37℃旋转混匀30min。准备Wash Buffer(按每100μL磁珠5mL，每个样品管最少加250μL)，预热至37℃，使用前加入100×PMSF。将杂交后的样品放置磁力架上，回收磁珠，保留上清备用。使用1mL Wash Buffer洗磁珠，悬浮磁珠后在杂交炉中37℃洗5min，然后用微型离心机简单离心1min。放置磁力架上去除buffer，从磁力架取出，再加入新的Wash buffer，重复上述操作5次。第一次洗的时候在15mL管里面洗，后面可以转到1.5mL管中洗。每次洗之前要用枪吸干净上次洗涤后残留的液体。在最后一次洗的时候，先加入磁珠等体积的Wash Buffer，重悬所有磁珠，磁力架去除buffer后，用10μL的移液吸头把剩余的buffer吸走。将样品管从磁力架移走，磁珠用于提取RNA。

步骤五：在5μL的RNA Input中加入90μL PK Buffer，5μL蛋白酶K。样品(步骤四中移走buffer后的磁珠)中加入90μL的PK Buffer，10μL蛋白酶K(Proteinease K)，在涡旋仪中50℃孵育1小时。经短暂离心后，95℃煮10min，然后放冰上2min。加入100μL的DEPC水，加入200μL酚-氯仿(苯酚：氯仿＝1:1；v/v)，剧烈涡旋5min，静置5min，以15000rpm、4℃离心20min。取上清转移到新管并加入等体积氯仿，剧烈涡旋30s。再在15000rpm、4℃离心15min。取上清，加入1/10体积3M NaAc(醋酸钠)，0.5μL蓝色糖元，3倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜。第二天，样品以15000rpm，4℃离心1h。用移液吸头缓慢吸取上清并丢弃(注意RNA沉淀因为少，非常容易漂起来，动作要缓慢并不要扰动液体)。真空抽干后用11μL DEPC水回溶。取1μL样品做10μL体系的逆转录，q-PCR检测目标U6 snRNA和GAPDH的丰度。

步骤六：订制(Integrated DNA Technologies公司)RNA接头，加入DEPC水，溶解稀释成1nM/μL。在IRdye-800CW-DBCO中加入37.7μL DEPC水溶成10mM工作液。取1μL接头，加入8μL的1×PBS，加入1μL 10mM的Rdye-800CW-DBCO(共10μL)。37℃孵育2h。将反应液转入1.5mL低吸附管，按照QIAquick nucleotide removal Kit(QIAGEN)纯化接头。将接头溶液分装后放-80℃保存。

步骤七：RNA片段与RNA接头的连接，按照T4 RNA连接酶体系进行反应。在eppendorf恒温混匀仪上25℃连接1.5h(混匀条件为1200rpm，30s涡旋，15min中断)。使用SILANE磁珠(Thermo Fisher Scientific公司，Dynabeads^TMMyOne^TM,40mg/mL，cat.no.37002D)进行RNA纯化，DEPC水回溶。配制10％尿素-PAGE胶。将偶联染料接头的RNA和2×stop solution混合、变性、冰上放置2min，上样。电泳后(深蓝色跑到4/5胶处)，奥德赛机器显影，拍照(宽8.5、高7.6cm)打印。按照打印的图片进行胶切割，割出的胶条切成碎粒，用针刺穿0.5mL管子后，将胶条放到0.5mL管，0.5mL管套到2mL管，12000rpm转2min，收集2mL管内的碎胶。加入700μL的0.3M NaCl(氯化钠)，并加3μL RNA inhibitor，旋转过夜。次日，将上清取出，点1μL到尼龙膜上，待液滴稍干，放在奥德赛检测机器，观察信号强度。将上清转移到spin-X柱(康宁，cat.no.8162)，8000rpm离心2min；收集滤液后加入1μL糖元，700μL的异丙醇，-20℃沉淀过夜；第二天13000rpm离心20min，75％乙醇洗一次，DEPC水回收RNA。

步骤八：将RNA与引物先混合，加入到SuperScript III逆转录酶体系，再进行逆转录反应。反应结束后，往体系中加入3μL的ExoSAP-IT，混合，37℃孵育12min。随后加入2.55μL 1M NaOH，70℃孵育10min。变性后，加入2.55μL 1M醋酸。使用SILANE磁珠进行cDNA纯化。用5.5μL灭菌3dH2O悬浮磁珠，静置5min。在带磁珠样品中加入0.5μL的单链DNA接头，并转到PCR管中。将样品75℃变性2min，冰上2min，按每样品配置14.1μL的T4 RNALigation MasterMix，加入样品管混匀。在恒温混匀仪上25℃连接过夜。(混匀条件为1700rpm，30s涡旋，30min中断)。使用SILANE磁珠对产物进行纯化。加入25μL H₂O，室温静置5min，70℃变性5min，置磁力架上1min，取上清并转移到新管。

步骤九：先取1μL的cDNA样品稀释到10μL，进行q-PCR检测判断扩增循环数。剩余的样品进行PCR的建库扩增。反应结束后，使用Ampure XP磁珠回收文库和Bioanalyzer Highsensitive DNA assay检测文库片段的大小。

CIRDES技术具体包括如下步骤：

1、CIRDES探针设置

1.1设计规则：

(1)探针数量＝100bp/目标RNA的长度；

(2)探针的GC％＝45％；

(3)探针的寡核苷酸的数量(长度)＝20；

(4)每个探针相隔＝60～80bp；

(5)不要使用那些重复或者广泛同源的区段。

1.2在上海生工订购3’末端Biotin TEG修饰的反向互补(目标RNA和对照组)探针(probe)；

1.3将所有探针用DEPC水都稀释成浓度为100μM，然后将每个探针等体积混合到一个离心管中；其中探针池(probe pool)的总浓度为100μM，体系中单个探针的浓度为总浓度除以探针数。注意：一个样品管中不要使用超过50种探针。

2、试剂配制

(1)Lysis buffer：含有终浓度为50mM Tris-HCl pH7.0，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)和1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)。

(2)Hybridization Buffer：含有终浓度为750mM NaCl，1％(w/v)SDS，50mM Tris-HCl pH7.0，1mM EDTA pH8.0和15％(v/v)甲酰胺(Formamide)。

(3)Wash buffer：含有终浓度为2x SSC缓冲液(pH值是7.4)和0.5％(w/v)SDS。

(4)Proteinase K Buffer：含有终浓度为100mM NaCl,10mM Tris-HCl pH7.0,1mMEDTA pH8.0和0.5％(w/v)SDS。

3、贴壁细胞交联处理

(1)将HepG2细胞培养在15cm板，在37℃、5％CO₂的培养环境；

(2)37℃预热一管50mL PBS，4℃预冷一到两管50mL PBS；

(3)培养板从培养箱拿到超净工作台，用真空泵吸去培养基，用10mL常温PBS洗一次细胞；

(4)用37℃PBS配2％(v/v)甲醛溶液，注意2％(v/v)甲醛溶液在每次实验前配置；

(5)去除PBS后，加入2％(v/v)的甲醛溶液；

(6)培养箱培养10min，每隔3min取出来，用手环形混匀(使甲醛充分接触细胞)；

(7)加入终浓度为500mM的甘氨酸溶液终止反应，室温摇动孵育5min；终止结束后，去除上清，用4℃预冷的PBS洗3次；

(8)加入2mL的4℃预冷PBS，将培养皿放到冰上，用细胞刮将其刮下来，用移液枪转移到离心管内；

(9)4℃，2000g离心5min(注意要用进口离心机)，彻底去除上清；

(10)用4℃预冷的PBS重悬；

(11)细胞计数；

(12)按每2×10⁷个细胞配比1mL PBS的量，加入4℃预冷的PBS，悬浮细胞(按每份2×10⁷个细胞计算)；

(13)将细胞分装到1.5mL离心管中，每个1.5mL管1mL细胞悬浮液(注意：每管中细胞量要尽量分的一样，否则会影响超声效果)；

(14)4℃，2000离心3min，彻底去除上清；

(15)用液氮将细胞团冻住，然后放-80℃保存。

4、超声匀质前细胞准备

(1)提前一个小时打开Bioruptor超声破碎仪，预冷(4℃)水浴，并预冷(4℃)离心机；

(2)在室温中融化交联后的细胞(步骤3制备)，然后轻弹离心管底部使细胞团松散并混匀细胞，在4℃、2000g离心3min，再用真空泵吸去所有残留的PBS；

(3)按照每2×10⁷个细胞配制500μL的Lysis Buffer(步骤2配置的LysisBuffer)，在Lysis Buffer中加入5μL蛋白酶抑制剂(100×，Selleck)、5μL PMSF(苯甲基磺酰氟100×，上海生工)和2.5μL RNasin(200×，Promega)(按照500μL的Lysis buffer配比)，混匀；

(5)将配制后的Lysis Buffer加入到含细胞团块的1.5mL离心管中，重悬细胞；转移到15mL离心管，准备超声匀质。

5、超声打断DNA和RNA

(1)在15mL离心管中含有1mL的细胞裂解液(4×10⁷个细胞)，每次超声使用两个离心管。

(2)将Bioruptor超声破碎仪的能量设到高档(high mode)，在4℃水浴中，以30sON，45s OFF条件超声；每30min检查一下超声效果，如果不浑浊的话就停止超声，否则就继续；超声时间约为20min～4h(超声样品种类，数量，样品体积，水浴温度等都会影响超声时间)；同一个样品分成多个管的话，每30min混合一次，然后再分开超声，这样可以保证一致性；

(3)待细胞裂解液变澄清后，吸5μL裂解液到一个1.5mL管中，加入90μLProteinase K(PK)Buffer和5μL Proteinase K(蛋白酶K；20mg/mL,Thermo FisherScientific,cat.no.AM2546)，涡旋混匀，简单离心，50℃孵育1h；

(4)使用柱纯化试剂盒纯化(Thermo Fisher Scientific，cat.no.K0701)，用30μLElution Buffer回溶核酸，全部用于跑1％琼脂糖胶；如果核酸大小在100～500bp，说明超声完成，如果不是，则按上述方法继续超声(超声约80个循环)。超声后的样品保存于-80℃冰箱。

6、探针和RNA杂交

(1)打开分子杂交炉预热到37℃，并预冷4℃离心机。从4℃冰箱中取出Hybridization Buffer，检查Hybridization Buffer是否有析出沉淀。若有析出沉淀，将装有buffer的离心管，在37℃水浴加热(所有1.5mL管都用DNA Lobind tubes，cat.no.0030108051)；

(2)将超声后样品从-80℃冰箱中拿出放室温中溶解；

(3)将样品在4℃、16100g离心10min，取上清并合并；

(4)取每份细胞裂解液(2×10⁷细胞的裂解液)体积的1/100(5μL)做RNA Input；

(5)取磁珠(Thermo Fisher Scientific Dynabeads^TMMyOne^TMStreptavidin C1,10mg/mL)(按10μL磁珠/2×10⁷细胞裂解液计算)，用10倍磁珠体积的Lysis Buffer洗三次，该磁珠用于去除能和磁珠非特异结合的蛋白(pre-clear步骤)；

(6)按每毫升(mL)细胞裂解液配比2mL Hybridization Buffer，并在Hybridization Buffer加入抑制剂((5μL蛋白酶抑制剂(100×，Selleck)，5μL的PMSF(100×，上海生工)和2.5μL的RNasin(200×，Promega))，(按照500μL的Hybridization Buffer配比)涡旋混匀；

(7)将细胞裂解液转移到15mL管中，按照2mL Hybridization Buffer比1mL细胞裂解液加入Hybridization Buffer；

(8)加入步骤(5)中Lysis Buffer洗过的磁珠，在分子杂交炉中37℃洗30min，然后将样品管置于磁力架上1min，丢弃磁珠，保留上清；

(9)室温解冻探针(即上述步骤1.2上海生工合成的探针；按每2×10⁷个细胞加入1μL 100μM探针组)，混匀；然后在分子杂交炉中37℃孵育过夜(可以前一天晚上离开实验室时做上，第二天早晨来收；也可以孵育4h，一般不超过16h)；注意：杂交用的小管要用封口膜密封起来；如果探针长时间没用，需要测一下浓度，100μM的单链探针一般浓度为500～600ng/μL；

(10)在杂交结束前20min，按每100μL磁珠/100pmol探针准备磁珠(Thermo FisherScientific Dynabeads^TMMyOne^TMStreptavidin C1,10mg/mL)，即1μL探针加入100μL磁珠；磁珠先用10倍体积的Lysis Buffer(不添加抑制剂)洗三次；

(11)准备裂解细胞相同体积的Lysis Buffer并添加抑制剂，5μL蛋白酶抑制剂(100×，Selleck)、5μL PMSF(苯甲基磺酰氟100×，上海生工)和2.5μL RNasin(200×，Promega)(按照500μL的Lysis buffer配比))，混匀；用Lysis buffer将磁珠悬浮。在杂交结束后，将磁珠悬浮液加到每个管中，混匀，在杂交炉中37℃旋转混匀30min；杂交后取样，并保留上清；

(12)准备Wash Buffer(每100μL磁珠准备5mL Wash Buffer，每个管最少加250μL)；预热至37℃，使用前加入PMSF；

(13)将杂交后的样品放置磁力架上，回收磁珠，保留上清。使用1mL Wash Buffer洗磁珠，悬浮磁珠后在杂交炉中37℃洗5min，然后用微型离心机简单离心1min。放置磁力架上去除buffer，从磁力架取出，再加入新的Wash buffer，重复上述操作5次。(第一次洗的时候在15mL管里面洗，后面可以转到1.5mL管中洗。每次洗之前要用移液枪吸干净残留的液体)；

(14)在最后一次洗的时候，先加入磁珠等体积的Wash Buffer，重悬所有磁珠，磁力架去除buffer后，用10μL的移液吸头把剩余的buffer吸走。将样品管从磁力架移走，磁珠用于提取RNA。

7、检测目标RNA是否被探针捕获

(1)预冷4℃离心机；

(2)在5μL RNA Input(上述步骤6(4)获得)中加入90μL的PK Buffer(步骤3获得的Proteinase K Buffer)，5μL的蛋白酶K(Proteinase K，20mg/mL,Thermo FisherScientific,cat.no.AM2546)在样品管中磁珠的加入90μL的PK Buffer，再加入10μL蛋白酶K，在涡旋仪中50℃孵育1h；

(3)短暂离心后，95℃煮10min(用板子压住)，然后放冰上；

(4)加入100μL的DEPC水，加入200μL酚氯仿(苯酚：氯仿＝1:1；v/v)，剧烈涡旋5min，静置5min；

(5)15000rpm，4℃离心20min；

(6)取上清转移到新管并加入等体积氯仿，剧烈涡旋30s；

(7)15000rpm，4℃离心15min；

(8)取上清，加入1/10体积3M NaAc(醋酸钠)，0.5μL蓝色糖元(Glycogen Blue)和3倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜；

(9)第二天，样品以15000rpm，4℃离心1h；

(10)用移液枪缓慢吸走上清，并丢弃(注意：RNA沉淀因为少，非常容易漂起来)；

(11)真空抽干后用11μL DEPC水回溶；

(12)取1μL的样品做10μL体系逆转录(Takara逆转录试剂盒)；

(13)q-PCR检测目标RNA和GAPDH的丰度(RocheSYBR Green Ⅰ Mastermix，cat.no.04707516001)。

注意：上述全程用低吸附管(DNA Lobind tubes)。

8、DNA与磷酸基团的去除

(1)将上述q-PCR检测后剩余的RNA溶解到30μL的DEPC水中；

(2)加入20μL预混体系：

(3)混合好后37℃孵育30min；

(4)取15μL SILANE磁珠(Thermo Fisher Scientific公司的SILANE磁珠)，在磁力架上静置1min，弃上清；

(5)用500μL的RLT buffer(Qiagen，cat.no.79216)洗涤一次磁珠；

(6)加入150μL RLT Buffer，混匀磁珠，并转移到样品中；

(7)加入300μL无水乙醇，混匀，静置15min，磁力架上静置1min，弃上清；80％(w/w)EtOH(乙醇)洗两次；

(8)晾干后，加入10μL DEPC水，回溶，70℃变性5min，放置磁力架上1min，分离磁珠，上清转移新管。

9、RNA接头染料标记

(1)RNA接头(5’-Phos/AUAUAGGNNNNNAGAUCGGAAGAGCGUCGUGUAG-3’，AzideN；其中，“Phos”表示磷酸基团；“AzideN”表示叠氮修饰；由Integrated DNA Technologies公司合成)总量为54.9nmol，加入54.9μL DEPC水，溶成1nM/μL(晶体溶解之前用小枪头戳了一下)；

(2)在IRdye-800CW-DBCO(LICOR，cat.no.929-50000)中加入37.7μL DEPC水溶成10mM的工作液(注意溶解后的染料在-20℃冰箱中只能保证2个星期的稳定性)；

(3)取1μL的1nM/μL RNA接头，加入8μL的1×PBS，加入1μL的10mM的IRdye-800CW-DBCO(共10μL)；

(4)37℃孵育2h；

(5)将(4)步孵育后的反应体系转入1.5mL低吸附管中，加入100μL PNI Buffer(QIAquick nucleotide removal Kit，QIAGEN)，混匀，加入到QIAquick离心柱(QIAquicknucleotide removal columns)中；

(6)室温6000rpm离心30s；

(7)用750μL PE Buffer(QIAquick nucleotide removal Kit，QIAGEN)洗一遍柱子；

(8)13000rpm离心2min，去除残余乙醇；

(9)将柱子转移到新的1.5mL管中；

(10)每个柱子加入30μL的DEPC水，室温静置2min；

(11)13000rpm离心1min；

(12)将洗脱液合并(洗脱液为淡蓝色)，计算标记接头浓度(染料分子量1326.3，标记后的接头的分子量：12382.3g/mol)；NanoDrop测得浓度为426.2ng/μL，计算原液浓度为：34.4μM/L；

(13)将接头溶液分装后放-80℃保存；

10、RNA接头的连接(第一步连接)

(1)按如下体系做RNA接头连接：

注意：接头不要反复冻融，注意分装；

70℃变性2min，冰上2min；

(2)立即加入T4 RNA ligase 1体系(New England Biolabs，cat.no.M0437M)：

并用枪吹打混匀；

(3)在Eppendorf恒温混匀仪上25℃连接1.5h(混匀条件为1200rpm，30s涡旋，15min中断)；

(4)取15μL SILANE磁珠，在磁力架上静置1min，弃上清；

(5)用500μL的RLT buffer洗涤一次磁珠；

(6)加入61μL RLT Buffer，混匀磁珠，并转移到样品中；

(7)加入65μL无水乙醇，混匀，静置15min，磁力架上静置1min，弃上清；

(8)用1mL 75％(w/w)乙醇(-30℃冰箱中保存)悬浮后置磁力架上弃上清，重复一遍(即共洗2遍)；

(9)第二遍洗完之后在桌面微型离心机上简单离心，用枪吸掉残余液体；

(10)室温干燥10min；

(11)加入14.3μL水，回溶，70℃变性5min，放置磁力架上1min，分离磁珠，上清转移新管。

11、Urea-PAGE电泳纯化

(1)先配10％RNA尿素-PAGE胶(200mL：19g丙烯酰胺、1g甲叉双丙烯酰胺、96g尿素、40mL 5×TBE、60mL 3ddH₂O)；

(2)将已连接接头的RNA(步骤10制备)和2x stop solution(95％(v/v)Formamide(甲酰胺)，20mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.05％(v/v)溴酚蓝，0.05％(v/v)二甲苯菁)混合，70℃变性2min，冰上2min，上样时加1μL RNasin(注意上样前把尿素吹散)；

(3)跑胶后(深蓝色跑到4/5胶处)，奥德赛机器显影，拍照(宽8.5、高7.6cm)打印；

(4)按照打印的图片进行胶切割，割出的胶条切成碎粒；

(5)用针刺穿0.5mL管子后，将胶放到0.5mL管，然后放到2mL管，12000rpm转2min，收集2mL管内的碎胶；

(6)加入700μL的0.3M NaCl转洗过夜，加3μL RNasin(200×)；

(7)次日，将上清取出，点1μL观察荧光强度，取胶粒同时检测下荧光强度；

(8)将含有胶粒的洗脱液加入到spin-X柱，8000rpm转2min；

(9)收集滤液，加入1μL糖元，700μL的异丙醇，-20℃沉淀过夜；

(10)次日，13000rpm转20min，75％(w/w)乙醇洗一次，DEPC水回收RNA。

12、逆转录和5’DNA接头连接(第二步连接)

(1)将样品转移到一个PCR管中，加入10(0.5μL of 20μM stock)pmol的AR17引物；其中，AR17引物：5’-ACACGACGCTCTTCCGA-3’。

按如下体系配置反应液：

(3)65℃加热5min，冰上2min；再加入SuperScript^TMIII逆转录反应体系(ThermoFisher Scientific cat.no.18080085)：

/>

按如下程序做反转录(RT)：

(3)立刻将样品从PCR仪上取下，并将样品转到1.5mL低吸附管中；

(4)加入3μL的ExoSAP-IT(用于消化RT引物，Affymetrix，cat.no.78201)，混合，37℃孵育12min；

(5)加入2.55μL 1M NaOH(终浓度为100mM，母液现配现用)；

(6)70℃孵育10分钟(用于去除RNA用)；

(7)加入2.55μL 1M醋酸(母液现配现用)；

(8)取12μL SILANE磁珠，在磁力架上静置1min，弃上清；

(9)用500μL RLT buffer洗涤一次磁珠；

(10)加入75μL RLT Buffer和65μL无水乙醇(-30℃冰箱中保存，注意尽量不要暴露在空气中)，混匀样品，静置15min，磁力架上静置1min，弃上清；

(11)用1mL 80％(w/w)乙醇重悬后，转移到新管；

(12)置磁力架上弃上清，重复一遍(共洗2遍)；

(13)第二遍洗完之后在桌面微型离心机上简单离心，用枪吸掉残余液体；

(14)用5.5μL灭菌3dH₂O悬浮磁珠，静置5min；注意不要丢弃磁珠；

(15)在带磁珠样品中加入0.5μL的80μM(40pmol)DNA接头(IntegratedDNATechnologies公司合成)，并转到PCR管中；

(16)将样品75℃变性2min，冰上2min(注意：样品变性完之后加入master mix)；

(17)配置14.1μL/样品的T4 RNA Ligation Master Mix：

(18)样品中加入14.1μL Ligation Master Mix，用枪吹打混匀；

(19)在恒温混匀仪上25℃连接过夜(混匀条件为1700rpm，30s涡旋，30min中断)；

(20)取5μL SILANE磁珠，在磁力架上静置1min，弃上清；

(21)用500μL的RLT buffer洗涤一次磁珠；

(22)加入61μL RLT Buffer和55μL无水乙醇(乙醇保存在-30℃冰箱中，注意尽量不要暴露在空气中)，混匀样品，静置15min，期间吹打混匀两次；磁力架上静置1min，弃上清；

(23)加入1mL 75％(w/w)乙醇，混匀后转移到新管中；

(24)置磁力架上弃上清，重复一遍(共洗2遍)；

(25)第二遍洗完之后在桌面微型离心机上简单离心，用枪吸掉残余液体；室温晾干5-10min；

(26)加入25μL H₂O，回溶，室温静置5min，70℃变性5min，放置磁力架上1min，分离磁珠，上清转移新管。

13、qRT-PCR评估文库相对含量

(1)配置PCR Mater Mix：

PCR_F_D501(上游引物，PAGE纯化，储存浓度100μM，工作浓度20μM)：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；

PCR_R_D701(下游引物，PAGE纯化；字体加粗部分为barcode，下同)：

PCR_R_D702(下游引物，PAGE纯化)：

PCR_R_D703(下游引物，PAGE纯化)：

PCR_R_D704(下游引物，PAGE纯化)：

PCR_R_D705(下游引物，PAGE纯化)：

PCR_R_D706(下游引物，PAGE纯化)：

/>

2、按如下程序进行q-PCR：

14、建库PCR

(1)配置PCR Mater Mix：不同样品混不同的barcode(不同的PCR下游引物)，以不加模板的样品作为空白对照。

(2)加入20μL cDNA，用枪吹打混匀，按如下程序跑PCR：

15、文库的质量检测

(1)按照AMPure XP磁珠说明书(BECKMAN COULTER，cat.no.A63882)，对建库PCR反应后的文库进行纯化，用30μL的H₂O回溶磁珠，放置磁力架，回收溶解产物并转移到新管；

(2)芯片的准备：按照Bioanalyzer High sensitive DNA试剂盒(Agilent，cat.no.5067-4626)所提供的说明书进行；

(3)凝胶-染料混合物的准备：将400μl凝胶基质与20μl染料(Bioanalyzer Highsensitive DNA kit)混合后，用离心过滤器过滤。将凝胶-染料混合物取9μL注入芯片中，将5μl marker(Bioanalyzer High sensitive DNA kit)加入各个样品孔中；

(4)取上述步骤15(1)磁珠回收的文库产物(经稀释到500ng/μL)各1μl分别加入12个样品孔中，将1μl ladder(Bioanalyzer High sensitive DNA kit)加入指定的ladder孔中，最后将芯片涡旋混匀后放入Agilent 2100Bioanalyzer中进行自动检测分析。

实施例1

1、针对U6 snRNA以CIRDES设计规则，设计反向互补探针

首先通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)查询人类的U6snRNA序列(>NC_000015.10:c67840045-67839940，Homo sapiens chromosome 15,GRCh38.p12 Primary Assembly)，结果见表1；然后根据上述CIRDES探针设计原则进行设计，由于RNA的片段长度少于200nt，则设计两条探针，结果见表1。

表1：U6snRNA序列和CIRDES技术设计的U6探针序列

2、CIRDES技术富集U6 snRNA与其相互作用RNA

按上述方法在15cm皿培养HepG2细胞，然后使用2％(v/v)的甲醛溶液，按照1×10⁷细胞：10mL甲醛溶液交联固定，随后经过80个循环的超声匀质，将细胞裂解液中核酸断裂为100～500nt的长度。加入U6 snRNA的探针(即CIRDES U6探针1和CIRDES U6探针2；浓度比为1:1；)到裂解液中，进行杂交过夜。杂交结束后，加入Streptavidin C1磁珠(Dynabeads^TMMyOne^TMStreptavidin C1,10mg/mL，cat.no.65001)对目标RNA进行富集，经过洗涤步骤后，去除非特异的组分。使用提取试剂提取磁珠上富集的RNA，乙醇沉淀回收，得到CIRDES技术富集的U6 snRNA与其相互作用RNA。结果见图2，图2是在样品中对U6 snRNA的特异性富集度图(NC探针是根据细菌RNA-lacZ设计，理论上不能靶向到人类基因组某个RNA，作为阴性对照)。

3、CIRDES技术对相互作用RNA的文库构建

将上述获得的U6 snRNA与其相互作用RNA使用两步接头连接策略进行文库构建。首先对RNA 3’末端连接偶联染料的RNA接头(5’-Phos/AUAUAGGNNNNNAGAUCGGAAGAGCGUCGUGUAG-3’AzideN)，得到RNA-接头产物。接着进行凝胶电泳，因为接头上带有染料，在红外光的激发下，能被显示系统可视化。随后，RNA进行逆转录成cDNA并连上DNA接头(5’-Phos/NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3’SpC3；其中，“Phos”表示磷酸基团；“spc3”是间臂(阻止接头自连)；由Integrated DNA Technologies公司合成)。cDNA经PCR文库扩增后，对其文库质量进行检测。

结果如图3所示，图3是使用CIRDES技术中设计的偶联染料的RNA接头使到连接过程可视化，并评估不同样品中建库初始RNA的含量图；其中，图A为U6 RNA、阳性对照和阴性对照的样品并偶联接头的电泳图；图B为不同样品间RNA回收后，用于评估相对含量的点杂交图；图C为LI-COR系统计算不同样品的红外光信号值的柱状图(SR：25ng的200nt的smallRNA，阳性对照；U6：捕获U6 snRNA的样品；NC：靶向细菌RNA的样品，阴性对照；其中，SR样品是使用Thermo Fisher Scientific公司的miRNA iolation kit试剂盒从提取的total RNA分离长度为200nt及以下的RNA和RNA片段；NC是针对lac-Z基因设计的探针，用作阴性对照(见表1)。

4、CIRDES配套的生物信息学分析流程分析相互作用RNA的数据

(1)使用FASTX tool kit对下机数据进行处理，生成FASTQ格式文件；

(2)使用Cutadapt剪掉5’接头序列：CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；剪掉3’接头序列：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；

(3)参数设置：--match-read-wildcards-e 0.1--quality-cutoff 6-m 18；BBMapsuite。

(4)使用bash script clumpify.sh包去除PCR重复；Cutadapt去掉随机碱基和barcodes；

(5)使用STAR将序列比对hg19和rRNA参考基因，参数--runThreadN 10,--outReadsUnmapped Fastx,–outFilterType BySJout,and–outFilterScoreMin 10；

(6)SAM tools将SAM文件转BAM文件；

(7)MACS 1.4将reads统计成Peak；

(8)使用annotatePeaks.pl标注peak信息，并提取peak结果；

(9)Enrichment Pathway使用Reactome数据库在线分析；

(10)相互作用调控网络使用Cytoscape绘制；

(11)IGV软件对相互作用的peak进行可视化解读。

图4是显示U6 snRNA与U4 snRNA存在结合的峰图。

图5是CIRDES鉴定U6 snRNA与其相互作用mRNA相互作用网络分析图，并标出其主要参与剪接体剪切，miRNA生成，mRNA降解等RNA的代谢过程。

实施例2

参考实施例1的实验步骤，区别在于交联剂甲醛的浓度和用量不同，分为以下五组实验：

(1)不使用交联剂甲醛(命名为：-Formaldehyde)；

(2)使用1％(v/v)的甲醛溶液，按照1×10⁷个细胞：2.5mL甲醛溶液交联固定(命名为：1％-Formaldehyde-2.5mL)；

(3)使用2％(v/v)的甲醛溶液，按照1×10⁷个细胞：2.5mL甲醛溶液交联固定(命名为：2％-Formaldehyde-2.5mL)；

(4)使用2％(v/v)的甲醛溶液，按照1×10⁷个细胞：10mL甲醛溶液交联固定(命名为：2％-Formaldehyde-10mL)；

(5)使用3％(v/v)的甲醛溶液，按照1×10⁷个细胞：2.5mL甲醛溶液交联固定(命名为：3％-Formaldehyde-2.5mL)。

然后用qRT-PCR检测样品中U4RNA的丰度。结果如图6所示，从图中可以看出，使用2％(v/v)的甲醛溶液进行交联固定，其富集效率高；当1×10⁷个细胞中加入10mL 2％(v/v)甲醛溶液进行交联固定时，其富集程度最好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RNA接头

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

auauaggnnn nnagaucgga agagcgucgu guag 34

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AR17引物

<400> 2

acacgacgct cttccga 17

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR_F_D501

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atagcctaca ctctttccct acacgacgct 60

cttccgatct 70

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR_R_D701

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatcgagta atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatc 65

<210> 5

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR_R_D702

<400> 5

caagcagaag acggcatacg agattctccg gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatc 65

<210> 6

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR_R_D703

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agataatgag cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatc 65

<210> 7

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR_R_D704

<400> 7

caagcagaag acggcatacg agatggaatc tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatc 65

<210> 8

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR_R_D705

<400> 8

caagcagaag acggcatacg agatttctga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatc 65

<210> 9

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR_R_D706

<400> 9

caagcagaag acggcatacg agatacgaat tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatc 65

<210> 10

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Human U6 snRNA (Hg37)

<400> 10

gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60

ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tatttt 106

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CIRDES U6 探针1

<400> 11

atatgtgctg ccgaagcgag 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CIRDES U6 探针2

<400> 12

cacgaatttg cgtgtcatcc tt 22

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNA接头

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 13

nnnnnnnnnn agatcggaag agcacacgtc tg 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’接头序列

<400> 14

cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ct 32

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3’接头序列

<400> 15

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NC探针

<400> 16

ccagtgaatc cgtaatcatg 20

Claims

1.一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）设计DNA探针：根据待测RNA的长度，每隔100 bp设置一条DNA探针；其中， DNA探针为3’末端带有生物素修饰的DNA探针，DNA探针中GC%的含量为45%，其长度为20个核苷酸；

（2）超声破碎：将细胞用体积百分比2～3%的甲醛溶液交联固定细胞后，加入裂解缓冲液进行超声破碎，得到细胞裂解液；其中，细胞裂解液中核酸的长度为100～500 nt；

（3）探针和RNA杂交：将步骤（1）设计的DNA探针加入到步骤（2）中得到的细胞裂解液中，并加入两倍细胞裂解液体积的杂交缓冲液进行杂交，待杂交结束后加入磁珠对目标RNA进行富集，洗涤，解交联，并使用DNA酶和碱性磷酸酶去除DNA与磷酸基团，得到纯化后的RNA碎片；

（4）两步接头连接及构建文库：将步骤（3）中得到的纯化后的RNA碎片的3’ 末端和RNA接头进行连接反应，得到RNA偶联接头产物；然后将RNA偶联接头产物逆转录成cDNA，再将cDNA的3’ 末端与DNA接头进行连接反应，得到目标RNA与其相互作用RNA的文库；

（5）对步骤（4）中得到的目标RNA与其相互作用RNA文库进行扩增，再进行检测和分析；

步骤（2）中所述的甲醛溶液的用量为按每1×10⁷个细胞配比2.5～10 mL甲醛溶液计算；

步骤（4）中所述的连接所用的T4 RNA连接酶为T4 RNA Ligase 1；所述的T4 RNALigase 1的浓度为30 U/μL；

步骤（4）中所述的RNA接头的核苷酸序列为：

5’-Phos/AUAUAGGNNNNNAGAUCGGAAGAGCGUCGUGUAG-3’AzideN/；其中，Phos表示磷酸基团；AzideN表示叠氮修饰；

步骤（4）中所述的DNA接头的核苷酸序列为：

5’-Phos/NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3’SpC3/；其中，Phos表示磷酸基团；spc3为间臂。

2.根据权利要求1所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的甲醛溶液通过如下方法配置得到：将甲醛加入到37℃、pH7.4的PBS缓冲液中，配置体积百分比2～3%的甲醛溶液；

步骤（2）中所述的甲醛溶液的用量为按每1×10⁷个细胞配比2.5～10 mL甲醛溶液计算。

3.根据权利要求1所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的甲醛溶液为体积百分比2%的甲醛溶液。

4.根据权利要求1所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的DNA探针的总浓度为100 μM；

步骤（3）中所述的DNA探针与细胞裂解液的体积比为1:500。

5.根据权利要求1所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于：还包括对步骤（2）中得到细胞裂解液进行验证的步骤；具体为：将细胞裂解液进行琼脂糖胶电泳，若细胞裂解液中核酸的长度为100～500 nt，则说明超声完成，反之，继续进行超声破碎。

6.根据权利要求1所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的待测RNA为U6 snRNA序列；

步骤（1）中所述的生物素修饰为Biotin TEG修饰；

步骤（1）中所述的探针的条数不超过50条；

步骤（1）中所述的DNA探针的浓度为100 μM；

步骤（2）中所述的细胞为正常细胞或癌细胞；

步骤（2）中所述的超声破碎的时间为20 min～4 h；

步骤（3）中所述的磁珠为Streptavidin C1磁珠；

步骤（4）中所述的构建文库为采用磁珠对体系中的核酸进行回收；所述的磁珠为SILANE磁珠。

7.根据权利要求1所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的裂解缓冲液为Lysis buffer，其配方如下：50 mM pH7.0的Tris-HCl，10 mM EDTA，w/v 为1% 的SDS；

步骤（3）中所述的杂交缓冲液为Hybridization buffer，其配方如下：750 mM NaCl，w/v 为1%的SDS，50 mM pH7.0的Tris-HCl，1 mM pH8.0的EDTA，v/v 为15%的甲酰胺；

步骤（3）中所述的解交联为用Proteinase K buffer进行解交联；其中，Proteinase Kbuffer的配方如下：100 mM NaCl，10 mM pH7.0的Tris-HCl，1 mM pH8.0的EDTA，w/v 为0.5% 的SDS。

8.根据权利要求1所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的分析为对RNA与其相互作用RNA文库进行分析，具体过程如下：

（a）使用FASTX tool kit对下机数据进行处理，生成FASTQ格式文件；

（b）使用Cutadapt剪掉5’-接头序列和3’-接头序列；

（c）使用BBMap suite中bash script clumpify.sh包去除PCR重复；Cutadapt去掉随机碱基和barcodes；

（d）使用STAR将序列比对hg19和rRNA参考基因；

（e）使用MACS 1.4将reads统计成peak；

（f）使用HOMER中annotatePeaks.pl标注peak信息，并提取peak结果；

（g）将标注的peak结果使用Reactome数据库在线分析。

9.权利要求1～8任一项所述的高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法在研究或鉴定RNA-RNA相互作用、研究细胞中编码RNA或非编码RNA在生理/病理状态中的相互作用调控生物过程中的应用，其特征在于：所述应用的环境为体外环境。