CN111424069A - 适用于三代测序技术检测人长链非编码rna的样品处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，包括步骤：利用探针‑磁珠法去除人总RNA样品中的核糖体RNA，消除样品内大量核糖体RNA对长链非编码RNA的影响；之后进行RNA聚合酶和rATP条件下的加A反应，确保长链非编码RNA在三代测序中的识别，提高检出效率。同时提供一种检验样品处理是否成功的检测方法，将处理后的样品通过反转录PCR可以检测到未处理检测不到的非polyA尾巴的长链非编码基因hotair。本发明提供的方法能减少非必要的测序冗余，提高非编码RNA的检出率，通过加A反应，能在三代测序中一次性检测出polyA尾巴的和非polyA尾巴的长链非编码RNA，为构建完整的长链非编码RNA文库提供前期处理方法，为深入研究非编码RNA提供有效的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，可用于提高长链非编码RNA尤其是非polyA尾巴的长链非编码RNA的检出效率，以提高测序结果的有效性。
背景技术
非编码RNA(Non-coding RNA，ncRNA)是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，直接在RNA水平上行使各自的生物学功能。人类30多亿个碱基对的基因序列中2/3的序列被反转录，98％以上为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)通常指的是长度>200nt的ncRNA。大部分lncRNA同样由RNA聚合酶Ⅱ催化转录而来，但其序列保守性不高且表达丰度较低，在组织和细胞中表现出较强的特异性，并不一定都带polyA尾巴。近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。lncRNA的数量不仅在ncRNA中占绝对上风，而且还在多个层面上参与细胞分化和个体发育调控，并与疾病密切相关，近年来关于lncRNA的研究进展迅猛。其中，hotair基因(HOX tran antisense RNA)是多组织表达的一个lncRNA，参与基因表达调控，并在许多肿瘤中高表达，并且hotair是一个非polyA尾巴的lncRNA，在以oligo dT富集polyA+RNA方式的建库测序中无法被直接检测到。
第三代基因测序技术又被为“Single Molecule Real Time(SMRTTM)DNASequencing”(单分子实时DNA测序技术)，该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，因此第三代测序技术也叫从头测序技术。相比之前的测序技术，三代测序技术能够获得超长的读长(7,000-8,000bp甚至3,0000bp)，在准确度和敏感性上也远远抛开一代和二代。因此，三代测序技术一经出世，迅速被运用到分子生物学的各个领域。利用三代进行全长转录本测序也有着独特的优势。三代测序的的长读长可实现全长转录本测序，并使基因可变剪接形式的识别成为可能，因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究。同时，由于三代测序读长长，因此不再需要对RNA-Seq的reads进行组装，因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释，用以改进参考基因组中的基因注释信息。
此前，由于lncRNA丰度低，序列长度长，RNA-seq又大多采用打断加测序接头的方式，很难检测到充足且准确的lncRNA的生物信息数据。因此，高敏感度且长读长的三代基因测序技术非常适合检测lncRNA。同时，在RNA测序中，大量的rRNA(占总RNA含量的80～85％)会淹没丰度偏低的lncRNA，所以三代测序中利用oligo dT富集polyA+RNA的方法更适合于lncRNA的检测。但是，利用这种方式检测会丢失占lncRNA约40％的非polyA尾巴的lncRNA。
发明内容
本发明目的在于提供一种适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，该方法能去除核糖体RNA产生的干扰，提高lncRNA在样品中的丰度，并对样品RNA做3’端加A反应，使得原始样品中非polyA尾巴的长链非编码RNA能够被检出，最后对RNA进行反转录PCR进行样品处理是否成功的检测鉴定。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，包括对去除核糖体RNA后的样品RNA进行加A反应的步骤。
优选地，适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法中，加A反应采用的反应体系包括提取自大肠杆菌E.coli的RNA聚合酶(E-PAP)、酶反应缓冲液、底物rATP和去除核糖体RNA后的样品RNA。对样品RNA进行RNA聚合酶和rATP条件下的加A反应，对体系内所有RNA的3’端加上一定长度的腺嘌呤核糖核酸的尾巴，达到利用第三代测序技术的样品要求，确保长链非编码RNA在三代测序中的识别，提高检出效率。
优选地，适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法中，加A反应的体外反应温度为37℃，反应的时间为15分钟。
优选地，适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法中，去除核糖体RNA后的样品RNA是利用人总RNA样品采用探针-磁珠法去除核糖体RNA制备得到。
优选地，适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法中，利用人总RNA样品采用探针-磁珠法去除核糖体RNA是利用人核糖体RNA(rRNA)特异的生物素标记核酸(LNA)探针，通过加温、降温导致互补配对，对提取的人总RNA样品进行特异性识别和结合，再通过磁珠法将探针-rRNA结合物从体系中抽离出来，从而去除核糖体RNA。
第二方面，本发明还保护适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法在三代测序技术检测人长链非编码RNA中的应用。
第三方面，本发明提供了一种上述适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法是否成功的检测方法，该检测方法是通过反转录PCR进行。
优选地，检测方法具体包括步骤：将加A反应后的产物进行Oligo dT反转录，将获得的cDNA为模板进行PCR检测，在以引物β-actin-F、引物β-actin-R检测反转成功的基础上，以引物hotair-F、引物hotair-R检测加A是否成功。
优选地，引物β-actin-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，即5'-ctccatcctggcctcgctgt-3'；所述引物β-actin-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，即5'-gctgtcaccttcaccgttcc-3'；引物hotair-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，即5'-gcagtggaatggaacggatt-3'；引物hotair-R的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：4所示，即5'-cgtggcatttctggtcttgta-3'。本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：本发明提供的方法能去除核糖体RNA产生的干扰，提高lncRNA在样品中的丰度，并对样品RNA做3’端加A反应，使得原始样品中非polyA尾巴的长链非编码RNA能够被检出，从而一次性获得更加完整的lncRNA全长转录组，为构建完整的长链非编码RNA文库提供前期处理方法，为深入研究非编码RNA提供有效的技术手段。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明提供的适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法及样品处理是否成功检测方法流程示意图；
图2为本发明实施例中的PCR结果电泳图；
图3为本发明实施例中预测后的lncRNA的长度分布图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
如图1所示，本发明提供一种适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法及样品处理是否成功检测方法，步骤包括如下。
步骤一：Trizol法提取的人总RNA样品利用探针-磁珠法去除核糖体RNA，得到去除核糖体RNA后的样品RNA。
步骤一具体操作如下：
去除核糖体RNA的反应体系和实验步骤按照RiboMinusTMTranscriptomeIsolation Kit(Human/Mouse)试剂盒中的说明书进行：
328μL反应体系：20μL样品总RNA(2-10μg)，8μL100pmol/μL RiboMinusTMprobe以及300μL Hybridization Buffer(B5)；
反应步骤按照说明书进行：
328μL反应体系70℃解旋5min，缓慢降温至37℃并保持30min；
利用磁站对500μL磁珠进行两次500μL RNase free H2O洗涤，500μL B5Buffer重悬润洗，最后重悬于200μL B5 Buffer中，37℃至反应体系温浴结束，混合反应体系和磁珠置于37℃温育15min；
利用磁站吸附磁珠，转移～528μL上清溶液(含去除rRNA的RNA样品)，再加入50μLB5 Buffer洗涤，转移～50μL上清溶液，总共～575μL上清溶液加入500μL Binding Buffer(L3)和600μL 96-100％乙醇，按照RiboMinusTMConcentration Module说明书进行RNA过柱纯化；
利用56μL无RNA酶水洗脱去除核糖体RNA的RNA。
步骤二：对去除核糖体RNA后的样品RNA进行RNA聚合酶和rATP条件下的3’端加A反应。
步骤二具体操作如下：
反应体系按照Ploy(A)Tailing Kit试剂盒进行：
100μL反应体系：56μL去除核糖体RNA的RNA，20μL 5×E PAP Buffer，10μL 25mMMnCl2，10μL 10mM ATP，4μL E-PAP；
反应体系37℃孵育15min，获得100μL加A反应产物；
10μL加A反应产物留作反转录PCR检测，剩余90μL加A反应产物进行过柱纯化，按照说明书进行，以10μL无RNase去离子水洗脱2次。
步骤三：通过反转录PCR方法，来确定步骤一，步骤二操作是否成功。
步骤三中，反转录体系和操作步骤按照RevertAid RT Reverse TranscriptionKit试剂盒说明书进行：
10μL未纯化的加A反应产物，1μL50mM EDTA，65℃金属浴10min；
加入1μL Oligo(dT)Primer，65℃金属浴5min，冰上静置1min；
再加入4μL 5×Reaction Buffer，1μL20U/μL Ribolock RNase Inhibitor，2μL10mM dNTP mix，1μL RevertAid RT Transcriptase；
42℃孵育60min，70℃孵育5min。
反转录结束后，通过PCR的手段来检测步骤一步骤二是否成功，分别以β-actin-F(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，即5'-ctccatcctggcctcgctgt-3')和β-actin-R(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，即5'-gctgtcaccttcaccgttcc-3')，hotair-F(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，即5'-gcagtggaatggaacggatt-3')和hotair-R(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，即5'-cgtggcatttctggtcttgta-3')为引物，若步骤一，步骤二操作成功，则以hotair-F，hotair-R为引物所构建的PCR反应可反应成功。
PCR验证的反应体系按照2×Easy
PCR SuperMix试剂盒说明书进行：
30μLβ-actin反应体系：含有3μL反转录cDNA，15μL2×EasyTaq PCR SuperMix，2nmol/L β-actin-F，2nmol/Lβ-actin-R；
扩增程序采用：95℃预变性5min，然后95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸12s的程序进行45个循环。扩增产物大小249bp，表明cDNA反转成功。
50μL hotair反应体系：含有5μL反转录cDNA，25μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，2nmol/L hotair-F，2nmol/L hotair-R；
扩增程序采用：95℃预变性5min，然后95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸10s的程序进行50个循环。扩增产物大小156bp，表明适用于三代测序的lncRNA样品处理成功。处理成功的RNA样品可直接用于三代测序技术的建库和测序。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例
本实施例提供一种适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法及样品处理是否成功检测方法，步骤包括如下。
步骤一：取10μL浓度为1μg/uL Trizol法提取的人脑RNA标准品(人总RNA样品)，利用RiboMinusTMTranscriptome Isolation Kit(Human/Mouse)试剂盒进行核糖体RNA去除反应，具体操作按照说明书进行：10μL人脑总RNA(10μg)、10μL无RNase水、8μL100pmol/μLRiboMinusTMprobe以及300μL Hybridization Buffer(B5)组成328μL反应体系，进行70℃解旋5min，缓慢降温至37℃并保持30min；取500μL磁珠，进行两次500μL RNase free H2O洗涤，用500μL B5 Buffer重悬润洗，最后重悬于200μL B5 Buffer中，37℃至前述反应体系温浴结束，混合反应体系和磁珠置于37℃温育15min；吸附磁珠，转移含去除rRNA的RNA样品的上清溶液至1.5mL无RNase离心管中，再加入50μL B5 Buffer洗涤，转移上清溶液，总共～575μL上清溶液加入500μL Binding Buffer(L3)和600μL 96-100％乙醇，按照RiboMinusTMConcentration Module说明书进行RNA过柱纯化，利用56μL无RNase水洗脱去除核糖体RNA的RNA。
步骤二：用Ploy(A)Tailing Kit试剂盒对样品RNA进行RNA聚合酶和rATP条件下的加A反应，具体操作按照说明书进行：前述56μL去除核糖体RNA的RNA、20μL 5×E PAPBuffer、10μL 25mM MnCl2、10μL 10mM ATP、4μL E-PAP组成100μL反应体系，进行37℃孵育15min，预留10μL加A反应产物做后续反转录PCR检测，其余90μL加A反应产物进行过柱纯化，按照说明书进行，以10μL无RNase去离子水洗脱2次，获得10μL处理好的适用于三代测序的长链非编码RNA样品。
步骤三：对步骤二的产物进行利用试剂盒RevertAid RT Reverse TranscriptionKit试剂盒进行反转录，步骤按照利用说明书进行：10μL未纯化的加A反应产物、1μL 50mMEDTA，65℃金属浴10min，加入1μL Oligo(dT)Primer，65℃金属浴5min，冰上1min，再加入4μL 5×Reaction Buffer、1μL 20U/μL Ribolock RNase Inhibitor、2μL10mM dNTP mix、1μLRevertAid RT Transcriptase进行42℃孵育60min，70℃孵育5min。
反转录结束后，分别以β-actin-F，β-actin-R，hotair-F，hotair-R为引物进行PCR反应可反应，PCR验证的反应体系按照2×Easy
PCR SuperMix试剂盒说明书进行：30μLβ-actin反应体系含有3μL反转录cDNA、15μL2×EasyTaq PCR SuperMix、2nmol/L β-actin-F，2nmol/Lβ-actin-R，扩增程序采用95℃预变性5min，然后95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸12s的程序进行45个循环；50μL hotair反应体系含有5μL反转录cDNA、25μL 2×EasyTaq PCR SuperMix、2nmol/L hotair-F、2nmol/L hotair-R，扩增程序采用95℃预变性5min，然后95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸10s的程序进行45个循环。
结果：将步骤三得到的PCR结果取5μL hotair PCR产物和1μLβ-actin PCR产物，用2％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图如图2所示。
将10μL待测样品送样北京贝瑞和康生物技术有限公司利用PacBio Sequel II平台进行全长转录组测序(Iso-Seq)建库测序。样品经过NanoDrop 2000分光光度法和Agilent 2100系统检测后，进行Iso-seq建库流程，具体包括：利用Oligo(dT)富集polyA+mRNA，使用SMARTerTMPCR cDNASynthesis Kit进行RNA反转录，PCR扩增富集后BluePinin筛选全长cDNA片段，筛选的全长cDNA再次进行PCR富集、末端修复、链接SMRT哑铃接头等步骤，最终获得SMRT bell文库。文库利用Qubit 2.0和Agilent 2100进行定量和insert size检测，利用PacBio Calculator计算后进行上机测序，数据产出统计如下表1所示。
表1上机测序数据统计结果
下机数据进行序列质控，过滤接头、<300bp的片段以及准确度低于0.75的序列，获得每个测序小孔插入序列(Reads of Insert，ROI)，ROI长度、质量和测序深度统计，结果如下表2所示。
表2ROI长度、质量和测序深度统计结果
利用CPAT(Coding Potential Assessment Tool)软件对lncRNA进行预测，预测产生1317条lncRNA序列结果，以fasta文件格式保存，预测后的LncRNA的长度分布如图3所示。
本发明提供的方法在去除rRNA提高lncRNA丰度的基础上，对样品进行加A处理，使得样本中的非polyA尾巴的lncRNA在正常三代测序时也能够同时被捕获，从而一次性获得更加完整的lncRNA全长转录组。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院
<120> 适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法
<130> 2
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctccatcctg gcctcgctgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgtcacct tcaccgttcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcagtggaat ggaacggatt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtggcattt ctggtcttgt a 21
Claims (9)
1.一种适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，其特征在于：所述样品处理方法包括对去除核糖体RNA后的样品RNA进行加A反应的步骤。
2.根据权利要求1所述的适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，其特征在于：所述加A反应采用的反应体系包括提取自大肠杆菌E.coli的RNA聚合酶、酶反应缓冲液、底物rATP和去除核糖体RNA后的样品RNA。
3.根据权利要求1所述的适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，其特征在于：所述加A反应的温度为37℃，反应的时间为15分钟。
4.根据权利要求1所述的适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，其特征在于：所述去除核糖体RNA后的样品RNA是利用人总RNA样品采用探针-磁珠法去除核糖体RNA制备得到。
5.根据权利要求4所述的适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法，其特征在于：所述利用人总RNA样品采用探针-磁珠法去除核糖体RNA是利用人核糖体RNA特异的生物素标记核酸探针，通过加温、降温导致互补配对，对提取的人总RNA样品进行特异性识别和结合，再通过磁珠法将探针-rRNA结合物从体系中抽离出来，从而去除核糖体RNA。
6.权利要求1-5任一项所述的适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法在三代测序技术检测人长链非编码RNA中的应用。
7.一种权利要求1-5任一项所述的适用于三代测序技术检测人长链非编码RNA的样品处理方法是否成功的检测方法，其特征在于：所述检测方法是通过反转录PCR进行。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括步骤：将加A反应后的产物进行Oligo dT反转录，将获得的cDNA为模板进行PCR检测，在以引物β-actin-F、引物β-actin-R检测反转成功的基础上，以引物hotair-F、引物hotair-R检测加A是否成功。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述引物β-actin-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；所述引物β-actin-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述引物hotair-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；所述引物hotair-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
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|---|---|---|---|---|
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| CN109971843A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-05 | 复旦大学泰州健康科学研究院 | 一种单细胞转录组的测序方法 |
| CN110878298A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-03-13 | 深圳市易基因科技有限公司 | rRNA捕获探针及其应用 |
-
2020
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