CN108251503A - 一种快速构建链特异性rna高通量测序文库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法。本发明中RNA建库完成仅需四步，即片段化，RT、PCR富集和文库纯化。与传统RNA文库构建方法相比，简化了操作流程，时间短，效率高，并且只需2种酶即可产生高质量的链特异性RNA‑seq文库。

Description

一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法。
技术背景
近年来，随着Illumina、Roche 454、SOLiD等二代高通量测序仪的相继推出，测序费用大幅度下降，越来越多的研究者借助二代测序平台得到的大数据，进行更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质组之间的交互作用。RNA测序(RNA-seq)已成为生物学和医学不可或缺的工具，RNA序列信息作为机体基因在转录水平的表征，为疾病诊断分析和基因治疗等方法应用提供了重要支持。
目前进行RNA测序需构建文库。以去完rRNA的RNA样品为例，传统的RNA文库构建流程如说明书附图图1所示，包括片段化、纯化、随机引物杂交，cDNA合成、第二条链合成、末端修复、纯化、磷酸化、加A、加接头、纯化、PCR富集和纯化，整个流程操作繁琐，所需试剂种类多，耗时长，致使物料和人力成本偏高，且需多次纯化，每步都有损耗，多步积累致使得率较低。且传统建库方法获得的测序文库无法区分正义链和反义链。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，目的是解决RNA测序建库过程中操作繁琐、物料和人力成本偏高的问题，同时解决RNA方向性问题，具有成本低，时间短，效率高且具有链特异性的优势。
实现本发明目的快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，按照以下步骤进行：
(1)采用片段化试剂对RNA样本片段化；
(2)在步骤(1)后直接加入逆转录引物、模板跳转引物以及逆转录试剂，实现由RNA逆转录成DNA并加上测序接头；
(3)在步骤(2)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；
(4)在步骤(3)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
所述的片段化试剂是RT-Buffer，包括：5～500mM Tris-HCl pH7.0～9.0，5～500mM NaCl，1～100mM DTT，0.1～50mM MgCl2。
所述的RNA样本来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织FFPE、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液，其它动物物种、植物、细菌以及病毒。
所述的RNA包括Total RNA、lncRNA、mRNA、circRNA等。
所述的RNA片段化温度为80℃-95℃。
所述的RNA片段化时间为1分钟-60分钟。
所述的逆转录引物5’端为测序引物序列，3’端为序列特异性引物序列，所述的特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物和多聚物寡核酸，其中基因特异性引物长度为15-60bp，随机引物长度为3-20bp，如：NNNNNN，N＝A或C或G或T，多聚物寡核酸长度为10-60bp，如：oligo dT。
所述的模板跳转引物5’端为测序引物序列，3’端为跳转序列，其中跳转序列为DNA或RNA或DNA/RNA混合链，长度为2-10bp，跳转序列的碱基需修饰，所述的修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰。
所述的逆转录试剂包括：5～500mM Tris-HCl(pH7.0～9.0)、5～500mM NaCl、1～100mM DTT、0.1～50mM MgCl2、0.1～50mM dNTP。
所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因多家高通量测序平台。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明是一种通过巧妙设计接头和试剂来产生链特异性RNA-seq文库的新方法，本发明中RNA建库完成仅需四步，即片段化，RT、PCR富集和文库纯化。与传统RNA文库构建方法相比，简化了操作流程，时间短，效率高，并且只需2种酶产生高质量的链特异性RNA-seq文库。
附图说明
图1是现有技术中RNA文库构建原理图；
图2是本发明RNA文库构建原理图；
图3是本发明RNA文库构建流程图；
图4是本发明实施例1中得到的RNA文库电泳图；
图5是本发明实施例2中得到的RNA文库与传统方法构建文库的对比图；
其中：1：链特异性RNA文库快速构建方法；2：传统RNA文库构建方法。
具体实施方式
下面以Illumina平台为例，结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
参照图2-3，本实施例快速构建外泌体RNA文库的方法，按照以下步骤进行：
(1)采用片段化试剂对RNA样本片段化；
取4ml血浆按照exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit(77064，QIAGEN)说明书进行外泌体的分离以及RNA的提取；
在PCR管中配制表1反应体系，热循环仪85℃处理6min，立即置冰上；
表1片段化反应体系
组分 体积(μL)
RNA 13
RT-Buffer 4
1uM RT-HEX 1
总体积 18
RT-HEX核酸序列为：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN；
(2)在步骤(1)后直接加入逆转录引物、模板跳转引物以及逆转录试剂，实现由RNA逆转录成DNA并加上测序接头；
配制表2反应体系，混匀，室温放置10min，热循环仪中42℃反应90min；
表2逆转录反应体系
组分 体积(μL)
步骤(1)产物 18
RT-Buffer 1
20mM DTT 2
TS-3G 1
10mM dNTP 3.5
RNase Inhibitor 0.5
Reverse Transcriptase 1
总体积 27
TS-3G核酸序列：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGG；
(3)在步骤(2)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；
按表3配制反应体系，按下面程序进行文库扩增。扩增完成后，取5μL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，140V，25min。
表3 PCR进行文库放大反应体系
组分 体积(μL)
上一步产物 23
Mix 25
TS-Index 1
TS-Primer1 1
总体积 50
文库扩增程序：
98℃45S；
98℃15S，60℃30S，28个循环；
72℃30S；
72℃1min；
4℃forever；
TS-Index核酸序列：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGCCAGGTGACTGGAGTTC；
TS-Primer1核酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA；
(4)步骤(3)反应结束后，用无核酶水将RT产物补足至50μL，加入40μL AMPure XPbeads，混匀并室温静置5min，反应管置于磁力架上，静置3-5min，弃上清；加200μL80％乙醇进行洗脱，重复2～3次，用20μL 10mM Tris-HCl进行洗脱，得到纯化后的产物即为上机文库。
文库检测：
1.电泳分析
取2μL纯化后的产物按照Life说明书进行Qubit定量，取5μL进行2％琼脂糖凝胶，140V，25min；得到的电泳分析结果如图4所示，文库主带清楚且主要分布在400bp左右，条带亮度明亮，与预期结果一致。
2.qPCR定量检测
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作，使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测，参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量，结果如表4所示。
表4 qPCR检测结果
样品 RNA文库
qPCR浓度(nM) 75
从表4可以看出建库文库达到上机要求浓度，可用于上机测试。
3.上机质控数据
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序，结果如表5所示。
表5测序数据质控
从表5可以看出文库比对到基因组序列比例为98％，符合上机文库质量要求。
实施例2
本实施例是对快速链特异性RNA文库构建方法与传统RNA文库构建方法进行对比，具体步骤是：
1.快速链特异性RNA文库构建方法
去除rRNA样本按照实施例1中方法进行链特异性RNA文库快速构建。
2.传统RNA文库构建方法
取相同去除rRNA样本按照VAHTS Total RNA-seq(H/M/R)Library Prep Kit forIllumina(NR603，南京诺唯赞)说明书进行文库构建，包括以下步骤：
2.1通过温控和金属离子对RNA进行片段化，纯化；
2.2第一链cDNA合成；
2.3第二链cDNA合成；
2.4采用VAHTS DNA Clean Beads对步骤2.2.3产物进行纯化；
2.5末端修复，纯化；
2.6加dA-Tailing；
2.7接头连接；
2.8磁珠分选纯化；
2.9 PCR富集，纯化。
3.qPCR质检及上机测序
按照实施例1中方法对流程2.1和2.2的文库进行qPCR质控和上机测序。
4.实验结果
4.1文库电泳检测分析结果
从琼脂糖凝胶分析结果(图5)可知，本发明的链特异性RNA文库快速构建方法与传统RNA建库方法所获得的文库主带分布差别不大，条带亮度无明显差别。
4.2 qPCR文库定量分析结果
表6 qPCR检测结果
样品 快速建库法 传统建库法
qPCR浓度(nM) 83 81
由表6可知，链特异性RNA文库快速构建方法和传统RNA文库构建方法构建的文库均符合上机测序要求，链特异性快速建库法略好于传统方法。
4.3上机质控数据
表7测序数据质控
从表7对比结果看，在相当数据产出量情况下，快速建库法要略好于传统建库法。
4.4链特异性快速建库法与传统建库法对比
表8测序数据质控
建库方法 传统建库法 链特异性建库法
开盖次数 11 6
转管次数 7 4
实验步骤 14 5
实验用时(h) 6.5 4
实验成本 高 低
从表8对比结果可知，链特异性RNA文库快速构建法既简化了实验操作流程和步骤，又缩短了时间，节省了人力成本，同时也可避免样本间污染和样本混样，降低因建库流程复杂引发错误操作风险，提高实验结果的可重复性和准确性。

Claims (10)

1.一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)采用片段化试剂对RNA样本片段化；
(2)在步骤(1)后直接加入逆转录引物、模板跳转引物以及逆转录试剂，实现由RNA逆转录成DNA并加上测序接头；
(3)在步骤(2)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；
(4)在步骤(3)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
2.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的片段化试剂是RT-Buffer，包括：5～500mM Tris-HCl pH7.0～9.0，5～500mMNaCl，1～100mM DTT，0.1～50mM MgCl2。
3.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA样本来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织FFPE、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液，其它动物物种、植物、细菌以及病毒。
4.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA包括Total RNA、lncRNA、mRNA、circRNA等。
5.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA片段化温度为80℃-95℃。
6.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA片段化时间为1分钟-60分钟。
7.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的逆转录引物5’端为测序引物序列，3’端为序列特异性引物序列，所述的特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物和多聚物寡核酸，其中基因特异性引物长度为15-60bp，随机引物长度为3-20bp，如：NNNNNN，N＝A或C或G或T，多聚物寡核酸长度为10-60bp，如：oligo dT。
8.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的模板跳转引物5’端为测序引物序列，3’端为跳转序列，其中跳转序列为DNA或RNA或DNA/RNA混合链，长度为2-10bp，跳转序列的碱基需修饰，所述的修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰。
9.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的逆转录试剂包括：5～500mM Tris-HCl(pH7.0～9.0)、5～500mM NaCl、1～100mMDTT、0.1～50mM MgCl2、0.1～50mM dNTP。
10.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因多家高通量测序平台。
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