CN108130366B - 一种构建人miRNA测序文库进行高通量测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建人miRNA测序文库进行高通量测序的方法,包括如下步骤:S1.提取人总RNA,反转成cDNA;S2.以cDNA为模板,用探针进行超高重PCR预扩增和超高重PCR扩增样品中的miRNA,同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头;S4.将mmPCR扩增产物连接标签序列;S5.将加上标签序列的样品进行凝胶电泳,回收纯化电泳产物,即构建好miRNA文库;S6.将得到的多个miRNA文库混合,利用二代测序技术进行高通量测序。本发明极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性,以及RNA靶向测序文库的均一性,缩短了构建文库和测序周期,降低了成本,具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地,涉及一种构建人miRNA测序文库进行高通量测序的方法。
背景技术
2006年以来,核酸测序技术取得了革命性的突破,第二代测序技术(NextGeneration Sequencing,NGS)能够快速测定数百万个序列,在技术上实现了对一个物种的转录组和基因组进行全貌分析。特别是高通量的转录组测序技术(RNA-seq)的产生。转录组测序(RNA-seq)是利用NGS技术进行测序,全面快速地获取某一物种或特定器官、组织在某一状态下的几乎所有转录本,分析个体、组织或细胞中的全转录组、小RNA含量或基因表达谱,是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。
将基于微流控技术的超高重PCR(mmPCR)与高通量测序技术相结合而产生超高重PCR测序(mmPCR-seq)是发明人于2014年在斯坦福大学发展的测序新技术,该技术能够同时扩增多达48个样本的960个位点,使这些位点的基因表达水平均一化,甚至对低含量的RNA样本都能准确定量其等位基因比例。mmPCR-seq填补了传统RNA-seq的靶向测序技术空白,该技术可用于研究转录组的等位基因变化、RNA修饰和RNA表观遗传组学研究,这一技术的发展通过降低成本而极大的扩展RNA-seq的应用领域。
但是目前的mmPCR-seq主要适用于有效构建mRNA文库测序,对于miRNA文库的构建效果不太好。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足,提供一种构建人miRNA测序文库进行高通量测序的方法。所述方法能够高效并完整地构建人pri-miRNA上的miRNA前体区域转录组文库,极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性,以及RNA靶向测序文库的均一性,缩短了构建文库和测序周期,降低了成本。
本发明的目的是提供一种构建人miRNA测序文库进行高通量测序的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种靶向扩增人miRNA前体区域的探针,所述探针共712对,其序列依次如SEQ IDNO:1~SEQ ID NO:1424所示。
本发明自主合成的特异性探针可对miRNA进行靶向扩增,扩增区域包括pri-miRNA上覆盖miRNA前体(pre-miRNA)的区域,是下一步结合mmPCR-seq技术发展新技术的前提
因此,上述探针在人miRNA测序中的应用亦在本发明保护范围内。
具体地,所述应用为上述探针在构建人miRNA高通量测序文库中的应用。
一种构建人miRNA测序文库进行高通量测序的方法,包括如下步骤:
S1.提取人总RNA,反转成cDNA;
S2.以步骤S1所述cDNA为模板,将上述712对探针混合在一起成为1个pool,进行超高重PCR预扩增;
S3.再以预扩增产物为模板,将上述712对探针随机分为48个pool,每个pool包含8~16对探针,进行超高重PCR扩增样品中的miRNA,同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头;
S4.将步骤S3的mmPCR产物连接标签序列;
S5.将加上标签序列的样品进行琼脂糖凝胶电泳,回收纯化电泳产物,即构建好miRNA文库;
S6.将得到的多个miRNA文库混合,利用二代测序技术进行高通量测序;
本发明以自主设计的特异性靶向人miRNA前体区域的探针为引物,先通过一轮超高重PCR预扩增,再以预扩增的产物为模板进行超高重PCR扩增,使RNA表达水平均一化,从而保证RNA靶向测序文库的均一性。极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性,缩短了构建文库和测序周期,降低了成本。
优选地,步骤S2所述超高重PCR预扩增的反应体系为KAPA 2G(2×)5μL,cDNA模板>100ng,50μM探针2.5~4μL,超纯水补充至10μL;反应程序为95℃变性10min,95℃15sec,65℃4min循环两次,95℃15sec,72℃4min循环13次。
优选地,步骤S3所述超高重PCR扩增反应体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL,20×Access Array Loading Reagent 0.25μL,预扩增产物100ng,超纯水补充至5μL;芯片的右侧三列中加同等数量孔,每个孔加4μL的primer solutions;反应程序分为7步:第1步,50℃2min,70℃20min,95℃10min;第2步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环15次;第3步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第4步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第5步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第6步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第7步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环5次。
优选地,步骤S2所述mmPCR预扩增与步骤S3所述mmPCR分别在特定区段富集捕获系统的两个不同部分中完成。
优选地,步骤S1所述RNA在提取过程中及逆转录之前,分别使用DNase I酶处理RNA样品。
优选地,步骤S1所述RNA样品于65℃变性,使用随机引物将RNA逆转录合成cDNA,并使用磁珠纯化cDNA。
优选地,步骤S2所述超高重PCR预扩增产物在进行下一轮超高重PCR之前进行纯化,优选为磁珠纯化。
优选地,步骤S5所述回收纯化为割胶回收纯化200bp~500bp的电泳产物。
优选地,步骤S6所述高通量测序包括但不限于IlluMina测序技术,优选为IlluMina NextSeq 500测序仪、IlluMina Miseq测序仪或IlluMina Hiseq 2500测序仪。
更优选地,所述测序仪为IlluMina NextSeq 500测序仪。
上述高通量测序获得的数据可基于标签序列区分不同的miRNA样品,通过生物信息学分析将单个样品测序获得的序列片段比对靶基因,得到miRNA的修饰和编辑信息,定位和定量RNA修饰信息。
因此,上述方法在定位和定量RNA修饰信息方面的应用亦在本发明保护范围内。
同时,本发明还提供一种用于构建人miRNA高通量测序文库的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求要求所述的712对探针,RNA抽提试剂,逆转录试剂,mmPCR所需试剂,AccessArray Loading Reagent,高保真聚合酶,磁珠纯化试剂盒以及凝胶回收试剂盒。
具体的,所述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
(1)人总RNA提取
提取人总RNA,RNA浓度和纯度用Nanodrop 2500光度计进行分析;在提取总RNA的过程中及下一步逆转录之前,分别使用DNase I酶处理RNA样品以消除残留的基因组DNA。
(2)RNA逆转录成cDNA
将步骤(1)的RNA样品于65℃变性,按照逆转录试剂盒说明书,使用随机引物,将总RNA逆转录成cDNA,按照磁珠纯化试剂盒说明书纯化cDNA。
(3)mmPCR预扩增
把人的712对特异性扩增探针混合在一起成为1个pool,对cDNA进行超高重PCR预扩增,预扩增反应体系为:2×KAPA 2G 5μL,cDNA模板>100ng,50μM探针2.5~4μL,超纯水补充至10μL;反应程序为:95℃变性10min,95℃15sec,65℃4min循环两次,95℃15sec,72℃4min共13个循环;磁珠纯化mmPCR预扩增产物。
(4)mmPCR
以预扩增产物为模板,将712对特异性扩增探针随机分为48个pool每个pool包含8~16对探针,使用所有探针pool对miRNA进行超高重PCR(mmPCR);芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL,20×Access Array LoadingReagent 0.25μL,预扩增产物100ng,超纯水补充至5μL;芯片的右侧三列中加同等数量孔,每个孔加4μL的primer solutions;反应程序分为7步:第1步,50℃2min,70℃20min,95℃10min;第2步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环15次;第3步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第4步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第5步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第6步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第7步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环5次;反应的同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头。
(5)Barcoding PCR
将超高重PCR产物稀释100倍,对mmPCR产物进行Barcoding PCR使每一个样品加上特有的标签序列(Barcode)。
(6)miRNA文库产物混合与纯化
将Barcoding PCR产物按比例混合进行2.5%琼脂糖凝胶电泳,割胶回收纯化200bp~500bp长度的产物,即构建好miRNA文库,测定miRNA文库浓度,琼脂糖凝胶电泳检测文库质量。
(7)IlluMina测序
将得到的多个miRNA文库混合,进行高通量测序。
在本发明采用了超高重PCR(mmPCR)扩增法结合IlluMina NextSeq 500高通量测序的建库测序方法,该方法以miRNA转录组为模板,使用自主合成的miRNA特异性探针pool,通过mmPCR原理对miRNA进行靶向扩增,扩增区域包括pri-miRNA上覆盖miRNA前体(pre-miRNA)的区域。扩增产物连接标签序列,进行IlluMina测序文库制备和测序。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明基于mmPCR扩增技术,利用人miRNA的序列信息特异性地设计出大量探针,能够特异性地靶向pri-miRNA上miRNA前体区域。
(2)本发明将自主设计的探针结合最新发展的mmPCR-seq高通量测序技术,发展出适用于构建miRNA文库的miR-mmRNA-seq高通量测序技术,能够高效并完整地构建人pri-miRNA上的miRNA前体区域的转录组文库,极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性,以及RNA靶向测序文库的均一性,缩短了构建文库和测序周期,降低了成本。
附图说明
图1为随机挑选的16对miRNA探针PCR测试结果电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为一系列片段大小为100bp~180bp的一条带,其中泳道M为分子量标记物,泳道1~16分别为16个miRNA探针的PCR产物电泳结果。电泳结果探针测试通过,可以用于mmPCR预扩增和mmPCR扩增。
图2为提取人总RNA后检测RNA质量的电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示6个样本来源的总RNA,分别为片段大小1500bp~4700bp的两条带,其中泳道M为分子量标记物,泳道1~6分别为提取自6个样本的总RNA电泳结果。RNA质量合格即可进行下一步逆转录及之后的mmPCR-seq文库构建。
图3为Agilent BioAnalyzer 2100分析mmPCR扩增产物的结果示意图,显示文库片段大小为200bp~3300bp。
图4为Barcoding PCR扩增产物电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为一系列片段大小300bp~400bp的单一条带,其中泳道M为分子量标记物,泳道1~16为16个随机挑选的mmPCR产物通过Barcoding PCR分别连接了特定barcode后的电泳结果。之后通过磁珠纯化即基本完成了mmPCR-seq测序文库制备。
图5为miRNA文库IlluMina NextSeq 500高通量测序结果示意图。Y轴为测序质量quality,测序质量高低以≥Q30的比例来衡量,越高质量越好。结果显示测序结果质量≥Q30的比例为100%。
图6为测序的覆盖深度和覆盖率示意图。X轴为测到的miRNA的数目,Y轴为每一个miRNA测到的read数。显示所有miRNA平均覆盖深度达到300×,所有miRNA覆盖率为90%。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1特定靶向人中microRNA(miRNA)的探针及使用此批探针构建miRNA测序文库进行高通量测序的方法
1、设计探针
设计特异性扩增miRNA的超高重PCR探针,所述探针特异性靶向扩增人pri-miRNA上覆盖的miRNA前体(pre-miRNA)的区域,所述探针共712对,其引物序列如表1所示,大部分探针扩增产物长度都在160~300bp。
表1靶向扩增人miRNA前体区域的探针序列表
2、总RNA提取
提取人总RNA,RNA浓度和纯度用Nanodrop 2500光度计进行分析;在提取总RNA的过程中及下一步逆转录之前,分别使用DNase I酶处理RNA样品以消除残留的基因组DNA,提取的总RNA作为miR-mmPCR-seq建库的起始模板。
3、RNA逆转录成cDNA
将RNA样品于65℃变性,按照Superscript III试剂盒说明书、使用随机引物,将总RNA逆转录成cDNA。逆转录反应在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)上完成。按照AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)试剂盒说明书使用磁珠纯化逆转录产物cDNA。
4、mmPCR预扩增
把所有的miRNA特异性扩增探针混合在一起成为1个pool,按照KAPA 2GPCR Kits及Access Array Loading Reagent(Fluidigm)试剂盒说明书,对cDNA进行超高重PCR预扩增,预扩增反应体系为2×KAPA 2G 5μL,cDNA模板>100ng,50μM Pre-Primer 2.5~4μL,超纯水补充至10μL;反应参数为95℃变性10min,95℃15sec,65℃4min循环两次,95℃15sec,72℃4min共13个循环;mmPCR扩增反应在Fludigm Access Array特定区段富集捕获系统(Fluidigm)上完成。按照AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)试剂盒说明书使用磁珠纯化mmPCR预扩增产物。
5、mmPCR
把人的特异性扩增探针随机分为48个pool每个pool包含8~16对探针,按照KAPA2G PCR Kits及Access Array Loading Reagent(Fluidigm)试剂盒说明书,使用所有探针pool对miRNA进行超高重PCR(mmPCR),反应的体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA2G 2.5μL,20×Access Array Loading Reagent 0.25μL,预扩增产物100ng,超纯水补充至5μL;芯片的右侧三列中加同等数量孔,每个孔加4μL的primer solutions;反应程序分为7步:第1步,50℃2min,70℃20min,95℃10min;第2步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环15次;第3步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第4步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第5步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第6步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第7步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环5次。mmPCR反应在Fludigm Access Array特定区段富集捕获系统(美国Fluidigm公司)上完成。反应的同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头。
7、Barcoding PCR
将超高重PCR产物稀释100倍,按照Phusion试剂盒说明书,对mmPCR产物进行Barcoding PCR使每一个样品加上特有的标签序列(Barcode),PCR反应在Veriti 96-wellThermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)上完成。
8、miRNA文库产物混合与纯化
将Barcoding PCR产物按比例混合进行2.5%琼脂糖凝胶电泳,按照ZymocleanGel DNA Recovery Kit(Zymo)试剂盒说明书割胶回收纯化200bp~500bp长度的产物,即构建好miRNA文库。使用Qubit 3.0测定miRNA文库浓度,琼脂糖凝胶电泳检测文库质量。
9、IlluMina测序
将得到的多个miRNA文库混合,使用IlluMina测序试剂盒,按照试剂盒说明书,进行高通量测序。测序反应在IlluMina NextSeq 500高通量测序仪(美国IlluMina公司)上完成,输出数据。
10、数据分析
采用IlluMina bcl2fastq软件进行测序原始数据提取。通过BWA软件将原始序列比对到基因组,通过samtools软件进行RNA编辑位点的提取。
结果如图6所示,显示5例样本测序的覆盖深度和覆盖率,显示所有miRNA平均覆盖深度达到300×,所有miRNA覆盖率为90%。表1显示每个样本能测到的miRNA种类达到80%。
通过本发明检测了5例人样本,发现和定量了多个编辑位点得到的编辑位点与Sanger测序的结果是一致的,说明本发明的方法可行。
Claims (10)
2.权利要求1所述引物在非疾病诊断目的的人miRNA测序中的应用。
3.一种构建人miRNA测序文库进行非疾病诊断目的高通量测序的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.提取人总RNA,反转成cDNA;
S2.以步骤S1所述cDNA为模板,将权利要求1所述引物混合在一起成为1个pool,进行microfluidics-based multiplex PCR预扩增;
S3.再以预扩增产物为模板,将权利要求1的引物随机分为48个pool,每个pool包含8~16对引物,进行microfluidics-based multiplex PCR扩增样品中的miRNA,同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头;
S4.将步骤S3的microfluidics-based multiplex PCR产物连接特有的标签序列;
S5.将加上标签序列的样品进行琼脂糖凝胶电泳,回收纯化电泳产物,即构建好miRNA文库;
S6.将得到的多个miRNA文库混合,利用二代测序技术进行高通量测序;
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S2所述microfluidics-basedmultiplex PCR预扩增的反应体系为2×KAPA 2GμL,cDNA模板>100ng,50μM引物2.5~4μL,超纯水补充至10μL;反应程序为95℃变性10min,95℃15sec,65℃4min循环两次,95℃15sec,72℃4min循环13次。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S3所述microfluidics-basedmultiplex PCR扩增反应体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL,20×Access Array Loading Reagent 0.25μL,预扩增产物100ng,超纯水补充至5μL;芯片的右侧三列中加同等数量孔,每个孔加4μL的primer solutions;反应程序分为7步:第1步,50℃2min,70℃20min,95℃10min;第2步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环15次;第3步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第4步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第5步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环2次;第6步,95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,循环8次;第7步,95℃15sec,80℃30sec,60℃30sec,72℃1min,循环5次。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S2所述microfluidics-basedmultiplex PCR预扩增与步骤S3所述microfluidics-based multiplex PCR分别在特定区段富集捕获系统的两个不同部分中完成。
7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S1所述RNA在提取过程中及逆转录之前,分别使用DNase I酶处理RNA样品。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S5所述回收纯化为割胶回收纯化200bp~500bp的电泳产物。
9.权利要求3~8任一所述方法在非疾病诊断目的的定位和定量RNA修饰信息方面的应用。
10.一种用于构建人miRNA高通量测序文库的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的712对引物,RNA抽提试剂,逆转录试剂,microfluidics-based multiplexPCR所需试剂,Access Array Loading Reagent,高保真聚合酶,磁珠纯化试剂盒以及凝胶回收试剂盒。
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