CN108103173B - 一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法，包括如下步骤：S1.提取小鼠总RNA，反转成cDNA；S2.以cDNA为模板，用探针进行超高重PCR预扩增和超高重PCR扩增样品中的miRNA，同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头；S4.将mmPCR扩增产物连接标签序列；S5.将加上标签序列的样品进行凝胶电泳，回收纯化电泳产物，即构建好miRNA文库；S6.将得到的多个miRNA文库混合，利用二代测序技术进行高通量测序。本发明极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，以及RNA靶向测序文库的均一性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本，具有较大的应用前景。

Description

一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法。
背景技术
2006年以来，核酸测序技术取得了革命性的突破，第二代测序技术(NextGeneration Sequencing，NGS)能够快速测定数百万个序列，在技术上实现了对一个物种的转录组和基因组进行全貌分析。特别是高通量的转录组测序技术(RNA-seq)的产生。转录组测序(RNA-seq)是利用NGS技术进行测序，全面快速地获取某一物种或特定器官、组织在某一状态下的几乎所有转录本，分析个体、组织或细胞中的全转录组、小RNA含量或基因表达谱，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。
将基于微流控技术的超高重PCR(mmPCR)与高通量测序技术相结合而产生超高重PCR测序(mmPCR-seq)是发明人于2014年在斯坦福大学发展的测序新技术，该技术能够同时扩增多达48个样本的960个位点，使这些位点的基因表达水平均一化，甚至对低含量的RNA样本都能准确定量其等位基因比例。mmPCR-seq填补了传统RNA-seq的靶向测序技术空白，该技术可用于研究转录组的等位基因变化、RNA修饰和RNA表观遗传组学研究，这一技术的发展通过降低成本而极大的扩展RNA-seq的应用领域。
但是目前的mmPCR-seq主要适用于有效构建mRNA文库测序，对于miRNA文库的构建效果不太好。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法。所述方法能够高效并完整地构建小鼠pri-miRNA上的miRNA前体区域转录组文库，极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，以及RNA靶向测序文库的均一性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本。
本发明的目的是提供一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种靶向扩增小鼠miRNA前体区域的引物，其特征在于，所述引物共563对，其序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:1126所示。
本发明自主合成的特异性引物可对miRNA进行靶向扩增，扩增区域包括pri-miRNA上覆盖miRNA前体(pre-miRNA)的区域，是下一步结合mmPCR-seq技术发展新技术的前提
因此，上述引物在小鼠miRNA测序中的应用亦在本发明保护范围内。
具体地，所述应用为上述引物在构建小鼠miRNA高通量测序文库中的应用。
一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法，包括如下步骤：
S1.提取小鼠总RNA，反转成cDNA；
S2.以步骤S1所述cDNA为模板，将上述563对引物混合在一起成为1个pool，进行超高重PCR预扩增；
S3.再以预扩增产物为模板，将上述563对引物随机分为48个pool，每个pool包含8～12对引物，进行超高重PCR扩增样品中的miRNA，同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头；
S4.将步骤S3的mmPCR产物连接标签序列；
S5.将加上标签序列的样品进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化电泳产物，即构建好miRNA文库；
S6.将得到的多个miRNA文库混合，利用二代测序技术进行高通量测序；
本发明以自主设计的特异性靶向小鼠miRNA前体区域的引物为引物，先通过一轮超高重PCR预扩增，再以预扩增的产物为模板进行超高重PCR扩增，使RNA表达水平均一化，从而保证RNA靶向测序文库的均一性。极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本。
优选地，步骤S2所述超高重PCR预扩增的反应体系为KAPA 2G(2×)5μL，cDNA模板>100ng，50uM引物2.5～4μL，超纯水补充至10μL；反应程序为95℃变性10min，95℃15sec，65℃4min循环两次，95℃15sec，72℃4min循环13次。
优选地，步骤S3所述超高重PCR扩增反应体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array Loading Reagent 0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃2min，70℃20min，95℃10min；第2步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环15次；第3步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第4步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第5步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第6步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第7步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环5次。
优选地，步骤S2所述mmPCR预扩增与步骤S3所述mmPCR分别在特定区段富集捕获系统的两个不同部分中完成。
优选地，步骤S1所述RNA在提取过程中及逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品。
优选地，步骤S1所述RNA样品于65℃变性，使用随机引物将RNA逆转录合成cDNA，并使用磁珠纯化cDNA。
优选地，步骤S2所述超高重PCR预扩增产物在进行下一轮超高重PCR之前进行纯化，优选为磁珠纯化。
优选地，步骤S5所述回收纯化为割胶回收纯化200bp～500bp的电泳产物。
优选地，步骤S6所述高通量测序包括但不限于Illumina测序技术，优选为Illumina NextSeq 500测序仪、Illumina Miseq测序仪或Illumina Hiseq 2500测序仪。
更优选地，所述测序仪为Illumina NextSeq 500测序仪。
上述高通量测序获得的数据可基于标签序列区分不同的miRNA样品，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的序列片段比对靶基因，得到miRNA的修饰和编辑信息，定位和定量RNA修饰信息。
因此，上述方法在定位和定量RNA修饰信息方面的应用亦在本发明保护范围内。
同时，本发明还提供一种用于构建小鼠miRNA高通量测序文库的试剂盒，，所述试剂盒包括权利要求要求所述的563对引物，RNA抽提试剂，逆转录试剂，mmPCR所需试剂，Access Array Loading Reagent，高保真聚合酶，磁珠纯化试剂盒以及凝胶回收试剂盒。
具体的，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)小鼠总RNA提取
提取小鼠总RNA，RNA浓度和纯度用Nanodrop 2500光度计进行分析；在提取总RNA的过程中及下一步逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品以消除残留的基因组DNA。
(2)RNA逆转录成cDNA
将步骤(1)的RNA样品于65℃变性，按照逆转录试剂盒说明书，使用随机引物，将总RNA逆转录成cDNA，按照磁珠纯化试剂盒说明书纯化cDNA。
(3)mmPCR预扩增
把小鼠的563对特异性扩增引物混合在一起成为1个pool，对cDNA进行超高重PCR预扩增，预扩增反应体系为：2×KAPA 2G 5μL，cDNA模板>100ng，50uM引物2.5～4μL，超纯水补充至10μL；反应程序为：95℃变性10min，95℃15sec，65℃4min循环两次，95℃15sec，72℃4min共13个循环；磁珠纯化mmPCR预扩增产物。
(4)mmPCR
以预扩增产物为模板，将563对特异性扩增引物分为48个pool，每个pool包含8～12对引物，使用所有引物pool对miRNA进行超高重PCR(mmPCR)；芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array Loading Reagent 0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃2min，70℃20min，95℃10min；第2步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环15次；第3步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第4步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第5步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第6步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第7步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环5次；反应的同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头。
(5)Barcoding PCR
将超高重PCR产物稀释100倍，对mmPCR产物进行Barcoding PCR使每一个样品加上特有的标签序列(Barcode)。
(6)miRNA文库产物混合与纯化
将Barcoding PCR产物按比例混合进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收纯化200bp～500bp长度的产物，即构建好miRNA文库，测定miRNA文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测文库质量。
(7)Illumina测序
将得到的多个miRNA文库混合，进行高通量测序。
在本发明采用了超高重PCR(mmPCR)扩增法结合Illumina NextSeq 500高通量测序的建库测序方法，该方法以miRNA转录组为模板，使用自主合成的miRNA特异性引物pool，通过mmPCR原理对miRNA进行靶向扩增，扩增区域包括pri-miRNA上覆盖miRNA前体(pre-miRNA)的区域。扩增产物连接标签序列，进行Illumina测序文库制备和测序。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明基于mmPCR扩增技术，利用小鼠miRNA的序列信息特异性地设计出大量引物，能够特异性地靶向pri-miRNA上miRNA前体区域。
(2)本发明将自主设计的引物结合最新发展的mmPCR-seq高通量测序技术，发展出适用于构建miRNA文库的miR-mmRNA-seq高通量测序技术，能够高效并完整地构建小鼠pri-miRNA上的miRNA前体区域的转录组文库，极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，以及RNA靶向测序文库的均一性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本。
附图说明
图1为随机挑选的16对miRNA引物PCR测试结果电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为一系列片段大小为100bp～180bp的一条带，其中泳道M为分子量标记物，泳道1～16分别为16个miRNA引物的PCR产物电泳结果。电泳结果引物测试通过，可以用于mmPCR预扩增和mmPCR扩增。
图2为提取小鼠总RNA后检测RNA质量的电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示6个样本来源的总RNA，分别为片段大小1500bp～4700bp的两条带，其中泳道M为分子量标记物，泳道1～6分别为提取自6个样本的总RNA电泳结果。RNA质量合格即可进行下一步逆转录及之后的mmPCR-seq文库构建。
图3为Agilent BioAnalyzer 2100分析mmPCR扩增产物的结果示意图，显示文库片段大小为200bp～350bp。
图4为Barcoding PCR扩增产物电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为一系列片段大小300bp～400bp的单一条带，其中泳道M为分子量标记物，泳道1～16为16个随机挑选的mmPCR产物通过Barcoding PCR分别连接了特定barcode后的电泳结果。之后通过磁珠纯化即基本完成了mmPCR-seq测序文库制备。
图5为miRNA文库Illumina NextSeq 500高通量测序结果示意图。Y轴为测序质量quality，测序质量高低以≥Q30的比例来衡量，越高质量越好。结果显示测序结果质量≥Q30的比例为100％。
图6为测序的覆盖深度和覆盖率示意图。X轴为测到的miRNA的数目，Y轴为每一个miRNA测到的read数。显示所有miRNA平均覆盖深度达到300×，所有miRNA覆盖率为90％。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1特定靶向小鼠中microRNA(miRNA)的引物及使用此批引物构建miRNA测序文库进行高通量测序的方法
1、设计引物
设计特异性扩增miRNA的超高重PCR引物，所述引物特异性靶向扩增小鼠pri-miRNA上覆盖的miRNA前体(pre-miRNA)的区域，所述引物共563对，其引物序列如表1所示，大部分引物扩增产物长度都在160～300bp。
表1靶向扩增小鼠miRNA前体区域的引物序列表
Figure GDA0002817982100000061
Figure GDA0002817982100000071
Figure GDA0002817982100000081
Figure GDA0002817982100000091
Figure GDA0002817982100000101
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Figure GDA0002817982100000211
Figure GDA0002817982100000221
Figure GDA0002817982100000231
Figure GDA0002817982100000241
Figure GDA0002817982100000251
Figure GDA0002817982100000261
Figure GDA0002817982100000271
Figure GDA0002817982100000281
Figure GDA0002817982100000291
Figure GDA0002817982100000301
Figure GDA0002817982100000311
Figure GDA0002817982100000321
Figure GDA0002817982100000331
Figure GDA0002817982100000341
Figure GDA0002817982100000351
2、总RNA提取
提取小鼠总RNA，RNA浓度和纯度用Nanodrop 2500光度计进行分析；在提取总RNA的过程中及下一步逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品以消除残留的基因组DNA，提取的总RNA作为miR-mmPCR-seq建库的起始模板。
3、RNA逆转录成cDNA
将RNA样品于65℃变性，按照Superscript III试剂盒说明书、使用随机引物，将总RNA逆转录成cDNA。逆转录反应在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)上完成。按照AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)试剂盒说明书使用磁珠纯化逆转录产物cDNA。
4、mmPCR预扩增
把所有的miRNA特异性扩增引物混合在一起成为1个pool，按照KAPA 2G PCR Kits及Access Array Loading Reagent(Fluidigm)试剂盒说明书，对cDNA进行超高重PCR预扩增，预扩增反应体系为2×KAPA 2G 5μL，cDNA模板>100ng，50uM Pre-Primer 2.5～4μL，超纯水补充至10μL；反应参数为95℃变性10min，95℃15sec，65℃4min循环两次，95℃15sec，72℃4min共13个循环；mmPCR扩增反应在Fludigm Access Array特定区段富集捕获系统(Fluidigm)上完成。按照AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)试剂盒说明书使用磁珠纯化mmPCR预扩增产物。
5、mmPCR
把小鼠的特异性扩增引物随机分为48个pool，每个pool包含8～12对引物，按照KAPA 2G PCR Kits及Access Array Loading Reagent(Fluidigm)试剂盒说明书，使用所有引物pool对miRNA进行超高重PCR(mmPCR)，反应的体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array Loading Reagent 0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃2min，70℃20min，95℃10min；第2步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环15次；第3步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第4步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第5步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第6步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第7步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环5次。mmPCR反应在Fludigm Access Array特定区段富集捕获系统(美国Fluidigm公司)上完成。反应的同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头。
7、Barcoding PCR
将超高重PCR产物稀释100倍，按照Phusion试剂盒说明书，对mmPCR产物进行Barcoding PCR使每一个样品加上特有的标签序列(Barcode)，PCR反应在Veriti 96-wellThermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)上完成。
8、miRNA文库产物混合与纯化
将Barcoding PCR产物按比例混合进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，按照ZymocleanGel DNA Recovery Kit(Zymo)试剂盒说明书割胶回收纯化200bp～500bp长度的产物，即构建好miRNA文库。使用Qubit 3.0测定miRNA文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测文库质量。
9、Illumina测序
将得到的多个miRNA文库混合，使用Illumina测序试剂盒，按照试剂盒说明书，进行高通量测序。测序反应在Illumina NextSeq 500高通量测序仪(美国Illumina公司)上完成，输出数据。
10、数据分析
采用Illumina bcl2fastq软件进行测序原始数据提取。通过BWA软件将原始序列比对到基因组，通过samtools软件进行RNA编辑位点的提取。
结果如图6所示，显示5例样本测序的覆盖深度和覆盖率，显示所有miRNA平均覆盖深度达到300×，所有miRNA覆盖率为90％。表1显示每个样本能测到的miRNA种类达到80％。
通过本发明检测了5例小鼠样本，发现和定量了多个编辑位点得到的编辑位点与Sanger测序的结果是一致的，说明本发明的方法可行。

Claims (10)

1.一种扩增小鼠miRNA前体区域的引物，其特征在于，所述引物共563对，其序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:1126所示：
Figure FDA0002946867570000011
Figure FDA0002946867570000021
Figure FDA0002946867570000031
Figure FDA0002946867570000041
Figure FDA0002946867570000051
Figure FDA0002946867570000061
Figure FDA0002946867570000071
Figure FDA0002946867570000081
Figure FDA0002946867570000091
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2.权利要求1所述引物在非疾病诊断目的的小鼠miRNA测序中的应用。
3.一种构建小鼠miRNA测序文库进行非疾病诊断目的的高通量测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取小鼠总RNA，反转成cDNA；
S2.以步骤S1所述cDNA为模板，将权利要求1所述引物混合在一起成为1个pool，进行microfluidics-based multiplex PCR预扩增；
S3.再以预扩增产物为模板，将权利要求1的引物随机分为48个pool，每个pool包含8～12对引物，进行microfluidics-based multiplex PCR扩增样品中的miRNA，同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头；
S4.将步骤S3的microfluidics-based multiplex PCR产物连接标签序列；
S5.将步骤S4加上标签序列的产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化电泳产物，即构建好miRNA文库；
S6.将得到的多个miRNA文库混合，利用二代测序技术进行高通量测序。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述microfluidics-basedmultiplex PCR预扩增的反应体系为2×KAPA 2G 5μL，cDNA模板>100ng，50uM引物2.5～4μL，超纯水补充至10μL；反应程序为95℃变性10min，95℃ 15sec，65℃ 4min循环两次，95℃15sec，72℃ 4min循环13次。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3所述microfluidics-basedmultiplex PCR扩增反应体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array Loading Reagent 0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃2min，70℃ 20min，95℃ 10min；第2步，95℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环15次；第3步，95℃ 15sec，80℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环2次；第4步，95℃ 15sec，60℃30sec，72℃ 1min，循环8次；第5步，95℃ 15sec，80℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环2次；第6步，95℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环8次；第7步，95℃ 15sec，80℃30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环5次。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述microfluidics-basedmultiplex PCR预扩增与步骤S3所述microfluidics-based multiplex PCR分别在特定区段富集捕获系统的两个不同部分中完成。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述RNA在提取过程中及逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S5所述回收纯化为割胶回收纯化200bp～500bp的电泳产物。
9.权利要求3～8任一所述方法在非疾病诊断目的的定位和定量RNA修饰信息方面的应用。
10.一种用于构建小鼠miRNA高通量测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的563对引物，RNA抽提试剂，逆转录试剂，microfluidics-based multiplexPCR所需试剂，Access Array Loading Reagent，高保真聚合酶，磁珠纯化试剂盒以及凝胶回收试剂盒。
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