CN104695027A - 测序文库及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种测序文库,所述测序文库中的插入片段是待测序列与标签序列同向交替串联体。本发明还提供该测序文库的制备方法。本发明还涉及一种测序方法。本发明提供的测序文库及测序方法,在任何测序深度下,都能有效去除DNA扩增错误和测序错误,从而超精确检测DNA分子上存在的突变。本发明提供的测序文库,适用于微量DNA短片段甚至单链DNA测序文库的构建。
Description
技术领域
本发明涉及一种测序文库及其制备和应用。
背景技术
第二代测序技术的发展,推动了生物学以及生物医学研究的革命性发展。但是由于高通量测序本身的特点,在测得的序列中存在约1%的碱基错误。虽然在一些应用中1%的错误率是可以忍受的,但是在很多情况下,这1%的错误却掩盖了很多真实的信息,而成为很多研究的障碍。比如:检测一个正常个体的某一组织或器官是否存在潜在的致癌突变位点、检测癌症细胞群体中DNA组成的异质性以及隐藏的小克隆群体、利用每个细胞中的DNA突变作为标记追溯该细胞的起源及分裂模式、准确获取一个高度杂合的癌症群体中的基因型、计算癌症细胞或体细胞分裂时突变产生的速率、寻找生物医学治疗中一些小群体(如癌症干细胞等)中存在的致病突变等。如何利用现有的二代测序技术准确的测定DNA的序列,就成了一个非常关键的问题。
截止目前,有一些方法尝试从生物、化学等方面对二代测序的错误进行改进,如无扩增的建库方法,有效的避免了文库准备过程中因聚合酶链式反应扩增产生的错误。通过对样品DNA和参考DNA分别加相应的标签,从而有效过滤链特异性的错误。有一些方法则从数据分析角度降低二代测序的错误率。另外,还有一些方法通过DNA随机打断时产生的断点信息或者在聚合酶链式反应扩增之前对DNA模板加入相应的标签来矫正由于聚合酶链式反应扩增产生的错误。通过加入标签,就可以确定哪些DNA分子来自于同一条分子,从而达到矫正的作用。
这些方法从一定程度上提高了二代测序的准确性,但是由于各自方法的缺陷性,比如在金迪及其同事的文章中,加入标签的方法是通过将标签加在特定引物的末端,通过聚合酶链式反应的方式将标签加入到DNA分子中,当加入标签时的聚合酶链式反应发生错误时,这种错误在后面的实验中就很难去除,从而限制了其对极低频位点的检测。对DNA进行外源加标签方法的一个非常大的局限是这种方法只能针对于小的基因组或者少数的目的基因,无法实现对整个基因组的全面检测。因为标签法需要测到相同和互补的标签才能起到DNA正负链相互校正的目的,这样就需要极高的测序深度,因此对于大的基因组是很难实现的。
同时,由于外周血具有易获取,获取过程不会对身体造成侵害性影响,且其含有的突变信息一定程度上反映了个体内真实的突变信息,因此,检测外周血中游离DNA所含有的突变信息,已被广泛应用于产前诊断和对癌症的监测中。但外周血中游离的DNA被降解为140-170碱基对,且在1毫升的血液中仅有几千个拷贝。如何利用如此少的DNA构建有效的DNA文库,如何利用有限的测序覆盖度检测到外周血游离DNA中存在的极低频率的突变,成为一个亟待解决的问题。
古化石DNA绝大多数被微生物所污染,DNA量少且降解严重,如何利用极少量的降解严重的古DNA有效的进行二代高通量测序文库的构建,并有效的富集古人类DNA也成为研究古人类DNA的一个难题。
综上所述,构建一种能够快速、有效、准确地构建DNA测序文库的方法是十分必要的。
发明内容
为了解决现有技术中,DNA测序准确率不能满足实际需求的问题,本发明实施例提供一种测序文库及其制备和应用。
本发明实施例提供一种测序文库,所述测序文库中的插入片段是待测序列与标签序列同向交替串联体。
所述待测序列与标签序列同向交替串联体的制备包括将所述待测序列连接所述标签序列,单链环化和滚环复制的步骤。所述待测序列与所述标签序列长度之和小于测序仪测序长度的一半。所述标签序列包括6-13个连续的确定碱基和1-13个连续的随机碱基。
本发明实施例还提供一种制备测序文库的方法,所述方法包括制备在待测序列与标签序列同向交替串联体的两端连接测序接头的核酸序列。所述待测序列与标签序列同向交替串联体的制备包括将所述待测序列连接标签序列,单链环化和滚环复制的步骤。所述待测序列与所述标签序列长度之和小于测序仪测序长度的一半。
本发明还涉及上述测序文库在目标片段捕获测序、单链DNA片段测序、化石DNA测序或外周血游离DNA测序中的应用。
本发明实施例提供一种测序方法,该方法所用测序文库的插入片段是待测序列与标签序列同向交替串联体。所述待测序列与标签序列同向交替串联体的制备包括将所述待测序列连接所述标签序列,单链环化和滚环复制的步骤。所述待测序列与所述标签序列长度之和小于测序仪测序长度的一半。
本发明提供的测序文库及其应用,至少实现了如下有益效果:
1、在任何测序深度下,都能有效去除DNA扩增错误和测序错误,从而超精确检测DNA分子上存在的突变。
通过连接标签序列到待测序的DNA小片段5’末端(总长度小于测序长度的一半),然后对这种嵌合体变性,得到单链的待测序列与标签序列连接片段DNA,再进行单链环化,而后对环化后的单链DNA进行滚环复制,构建待测序列与标签序列同向交替串联体序列。这些滚环复制所得到的重复单元之间,在扩增过程是相互独立的,因此,在各自单元上复制时所产生的错误也是独立的。以待测序列与标签序列同向交替串联体序列进行测序文库构建(文库插入片段大小为至少两个重复单元)。对该文库进行一次测序,则至少测了两次同向重复单元,将两次重复单元测得的序列进行相互确认,两次重复单元不一致的碱基,即是文库制备过程中或测序过程中产生的聚合酶链式反应错误或测序错误。一致的序列即是原始序列。由于测序的重复单元来自于环状DNA,需要利用标签序列来确定待测序列的起始。
一条单链DNA和它的互补链,经过扩增后就无法确定新复制的DNA来自于哪条链,这对识别碱基错误类型造成影响。例如,C突变为T和G突变为A,这两种类型的错误在双链DNA上是互补的,测序序列没有标记的话,就无法判断到底发生了C突变为T还是G突变为A。由于标签序列是非回文结构,并连接在单链DNA的5’端,经过复制扩增后,仍然可以根据标签序列的方向来确定出原始单链DNA,这样就可以识别出错误发生的类型,进而帮助识别低频突变。
由于DNA扩增的不平衡性,从少量DNA扩增到足够测序的DNA时会出现一部分DNA的拷贝数明显高于均值。在本发明中体现为:一个原始单链DNA滚环复制得到的多条测序序列共同反映同一条原始DNA的信息,存在测序冗余。但是在后续的数据处理中,由于没有任何信息来判断这些测序序列是否来自于同一个原始DNA单链环,这些测序序列可能被多次统计。由此会带来一种错误放大的效应:一个存在DNA损伤的单链滚环复制后,存在于多条测序序列中,被统计为可信的多次独立出现的DNA变异。识别出这种冗余将有助于排除上述错误。本发明的标签序列可包括两个部分:已知碱基组成的接头区和随机碱基的自由区。接头区为6至13个连续的碱基,自由区为1至13个连续的碱基。特别指出的是自由区的碱基组成是随机的,在核酸序列合成时涉及为相应长度的‘N’(随机碱基)。自由区的长度越长,区分的分辨率越高。如果自由区长度设计为零时,区分不同原始来源的测序序列仅依赖于1)从测序序列推断出的目标DNA片段的大小不同,2)推断出的目标DNA片段的序列组成不同。设计标签序列的总长为奇数,可有效避免形成回文结构。
以下使用测序错误率为1/100(二代测序的错误率是1/100至1/1000)来阐明本发明的原理。一条一致序列上两个重复单元的同一位点同时发生一种类型错误的概率是:1/3*(1/100)2,即3*10-5的错误率(更多的重复单元一致碱基的错误概率更低)。那么两条不同的一致序列出现同样错误的概率为:(1/3*(1/100)2)2即9*10-10,因此,该方法极其有效的去除了文库构建过程和测序过程中产生的错误,达到了精确测序的目的。
2、适用于微量DNA短片段甚至单链DNA测序文库的构建。
由于单链环化所需的DNA起始量小(纳克级别甚至更低),片段短(30-200碱基对),环化后扩增效率高。因此特别适用于外周血游离DNA和古化石等降解严重的DNA的测序文库构建。
3、能够兼容目标区域捕获(如:外显子捕获,目的基因捕获)等方法。
本发明提供的待测序列与标签序列同向交替串联体序列中,由原始DNA复制的不同拷贝是串联在一起的。在进行目标区域捕获时,探针捕获到的分子至少含有两个同向重复单元的核酸序列,能够精确的测定DNA序列。
4、该方法构建的待测序列与标签序列同向交替串联体序列可用于构建多种第二代短片段测序文库,使其适用于各种测序平台。
附图说明
图1:本发明实施例单链环化后的环大小及其分布图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
发明概述
本发明的创新点之一在于,通过对短片段DNA分子连接标签序列(两者的总长度小于测序仪测序长度的一半),单链环化,滚环复制,得到待测序列与标签序列同向交替串联体序列,构建测序文库并测序。具体来讲,可以采用如下两种方案来实现。
方案一:
首先将DNA随机打断成小于二代测序仪测序读长一半的片段(打断后的长度加上标签序列的长度应该小于读长一半),然后连接上标签序列,其中该标签序列第一条链(正链)的5’端经磷酸化修饰,而3’端突出一个T碱基,第二条链(负链)5’端未经磷酸化修饰,而3’端突出一个G碱基。经高温变性,去除切口处标签序列,这样就形成了含有单链标签序列的DNA序列,再经高温变性并立即冷却,将DNA变为单链。单链化后含标签序列的DNA,用单链环化酶进行环化。环化后的DNA,利用基于随机引物的滚环链置换扩增,大量扩增环化后的DNA分子。形成的扩增产物即是由目的DNA分子和标签序列组成的同向交替串联体。该同向同向交替串联核酸序列可用于构建标准的二代测序文库(文库构建过程中插入片段的大小应大于测序仪的测序长度)。
方案二:
首先将DNA随机打断成小于二代测序仪测序读长一半的片段(打断后的长度加上后续需要连接的标签序列的长度也应该小于读长的一半),然后连接上特定的标签序列(同方案一)。单链化后含标签序列的DNA,用单链环化酶进行环化。环化后的DNA通过具有链置换功能的DNA聚合酶(如Phi29 DNA 聚合酶)进行滚环扩增,引物则采用标签序列里面的第二条链(即负链)。扩增完成后,再用标签序列的第一条链(即正链)为引物,将滚环后的单链线性DNA合成双链。此时双链DNA是由标签序列和目的DNA组成的重复单元组成的。该双链DNA经纯化后,可用于构建标准的二代测序文库。文库构建过程中插入片段的大小应大于测序仪的测序长度,以保证得到的多个重复单元是相互独立的。
本发明所称测序仪的测序长度是指: 对双端测序而言, 测序仪的测序长度等于双端测序长度之和;对单端测序而言,测序仪的测序长度等于单端序列的长度。
本发明采用多重链置换扩增,是一种恒温的DNA扩增方法,利用phi29 DNA聚合酶的链置换活性,实现DNA的大量扩增。滚环扩增,是采用环状DNA为模板,利用特定的引物或者随机引物,在链置换酶的作用下,实现对环状DNA模板的大量扩增。当随机引物与单链环状DNA结合后,phi29 DNA聚合酶可以顺着环进行第二条链的合成,当合成到引物的起始位置时,phi29 DNA聚合酶通过其链置换活性将引物所在的链打开,新的合成继续进行下去。新合成的DNA单链又同时会与新的六随机引物结合,进行新一轮的合成。循环往复,从而实现了对环状DNA分子的有效扩增。
实施例1:
按照方案一构建待测序列与标签序列同向交替串联体文库(Illumina平台)
DNA
片段化
所用仪器和试剂:
超声打断仪:Covaris:S2 Focused-ultrasonicator
打断管:Covaris Microtube 6x16mm,
catalog #:520045
琼脂糖:Promega, Agarose, LE,
Analytical Grade, catalog #: V3121
电泳仪电源:北京市六一仪器厂,DYY-7C型
电泳槽:北京市六一仪器厂,DYCP-31DN型电泳槽
QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit
(250),Catalog #: 28606
Takara 20 bp DNA Ladder (Dye Plus),
Takara Code, 3420A
用超声打断仪(Covaris S2
Focused-ultrasonicator)将1ug 纯化好的基因组DNA打断为300bp(Intensity:4, Duty Cycle:10%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃, time:60s, number of
cycles:2)或者150-200bp(Intensity:5, Duty
Cycle:10%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃ , time:60s, number of cycles:5),打断体系为50ul。
4%琼脂糖凝胶电泳(80V,70min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit)80-130bp(或者60-90bp:根据测序仪的测序读长来决定回收片段的大小)片段(Takara 20 bp DNA Ladder),回收的简略步骤:6倍体积buffer QG溶胶,加入等体积异丙醇,混匀后过柱,buffer QG洗脱,buffer PE洗脱,晾干,56ul ddH2O洗脱。详见QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit说明书。
末端补平
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
片段化DNA:55.5ul
End Prep Enzyme Mix:3ul
End Repair Reaction Buffer (10X):6.5ul
共:65ul
20℃ 30min,65℃ 30min
末端加
A
并连接标签序列
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
已补平的DNA:65ul
Blunt/TA Ligase Master Mix:15ul
Ligation Enhancer:1ul
接头(标签序列)UO-A(50pmol):1ul
ddH2O:1.5ul
共:83.5ul
20℃ 30min, 65℃ 10min立即置于冰上3min。
产物用MinElute Reaction Cleanup Kit纯化,15ul 双蒸水洗脱。
标签序列:UO-A由100pmol的UO-adaptor1(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和100pmol的UO-adaptor2(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)等体积混合退火(94℃ 5min,以每秒0.1℃逐渐降温至25℃)而成。
UO-adaptor1:5'-pTATGGGCAGTCGT-3'
UO-adaptor2:5'-CGACTGCCCATAG-3'
注:标签序列包含但不局限于的实施例中UO-adaptor1和UO-adaptor2的序列形式。下同。
单链环化
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
New England Biolabs: Exonuclease I
(E. coli), Catalog #: M0293
New England Biolabs: Exonuclease III
(E. coli), Catalog #: M0206
Epicentre: CircLigase II ssDNA Ligase, Catalog
#: CL9025K
将片段化后的DNA 37℃蒸干至4.2ul。
95℃ 3min(注:需要用可以对100ul体系进行反应的PCR仪,否则95℃后,4.2ul容易被蒸干),立即置于冰上3min
完成后加入:
10Xcircligase buffer:0.5ul
10mmol Mncl2:0.25ul
Circligase(100u/ul): 0.25ul
65℃ 2h,80℃ 10min
环化完成后消化线性及二聚体DNA
Exonuclease I (E. coli): 0.25ul
Exonuclease III (E. coli): 0.25ul
37℃1h,80℃20min
多重链置换(
MDA
)反应
采用基于MDA原理的全基因组扩增(WGA)试剂盒,滚环扩增环化后的产物:
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
GE healthcare: illustra GenomiPhi HY
DNA Amplification Kits , Product code: 25-6600-20
Beckman Coulter, Inc :Agencourt AMPure XP
上述环化DNA:2.5ul
Sample buffer:22.5ul
95℃3min,立即置于冰上3min
完成后加入:
Reaction buffer:22.5ul
Enzyme mix:2.5ul
共20ul
30℃ 1h,65℃ 10min
产物采用Agencourt AMPure XP
(Beckman Coulter, Inc)磁珠纯化。概述如下:对扩增后产物加入1.8倍体积磁珠,室温放置5min,磁力架吸附5min,去上清,70%酒精洗两次,晾干后,50ul buffer AE(10 mM Tris-Cl, 0.5 mM EDTA; pH 9.0)洗脱。详见试剂盒说明书。
纯化后的产物即是待测序列与标签序列同向交替串联体。
对待测序列与标签序列同向交替串联体构建
Illumina
文库
可利用构建标准的Illumina文库的商业试剂盒,如:TruSeq DNA Sample
Preparation Kits, Nextera DNA Sample Preparation Kits等。
待测序列与标签序列同向交替串联体
DNA
片段化
所用仪器和试剂:
1) 超声打断仪:Covaris:S2 Focused-ultrasonicator
2) 打断管:Covaris Microtube 6x16mm, 货号:520045
3) 琼脂糖:Promega, Agarose, LE, Analytical Grade, catalog #: V3121
用超声打断仪(Covaris S2
Focused-ultrasonicator)将2ug纯化后的DNA片段同向重复串联体打断为500-700bp(Intensity:3, Duty Cycle:5%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃, time:15s, number of
cycles:5), 打断体系为85ul。
末端补平
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® End Repair Module, Catalog #:E6050
QIAGEN: MinElute Reaction Cleanup
Kit, Catalog #:28206
片段化DNA:85ul
NEBNext End Repair Reaction Buffer:10ul
NEBNext End Repair Enzyme Mix:5ul
共:100ul
20℃ 30min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,43ul ddH2O洗脱。
末端加
A
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® dA-Tailing Module, Catalog #:E6053
QIAGEN: MinElute Reaction Cleanup
Kit, Catalog #:28206
已补平的DNA:42ul
NEBNext dA-Tailing Reaction Buffer:5ul
Klenow Fragment (3´→ 5´ exo–):3ul
共:50ul
37℃ 30min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,35.5ul ddH2O洗脱。
标签序列连接
所用试剂:Invitrogen:T4 DNA Ligase, Catalog #:
15224-041
已末端加A的DNA:34.5ul
接头(标签序列)1(50pmol):3ul
5X DNA ligase buffer:10ul
T4 DNA Ligase: 2.5ul
共:50ul
16℃ 过夜(16h)
2%琼脂糖凝胶电泳(80V,80min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit)500~700bp片段,22ul ddH2O洗脱。
标签序列1:
Multiplexing Adapter 1.0:5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCT - 3’
Multiplexing Adapter 2.0:
5’-
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 3’
标签序列退火:取等体积100pmol的Multiplexing Adapter 1.0(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和Multiplexing Adapter 2.0(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl),94℃ 5min,接着以每秒0.1℃逐渐降温至25℃。退火完成后即形成了浓度为50pmol的标签序列。
PCR扩增
所用仪器试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
Thermo scientific: Phusion
High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer, Catalog #: F531L
上述回收的DNA(约30ng)+ddH2O:23ul
MP PCR primer 1.02(10pmol):1ul
MP index primer3(10pmol):1ul
2X Phusion High-Fidelity PCR Master
Mix: 25ul
共:50ul
PCR扩增循环条件:
98℃ 45s预变性,循环扩增(98℃ 15s,65℃ 30s,72℃ 60s)10次, 72℃ 5min,4℃ 冷却。
2%琼脂糖凝胶电泳(80V,80min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit)500-700bp片段,22ul ddH2O洗脱。
洗脱后的DNA即是构建好的文库,该文库即可用于二代测序平台测序。
引物序列如下:
MP PCR primer 1.0:
5’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA
CGCTCTTCCGATCT - 3’
MP index primer:
5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTT
CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT - 3’
其中:MP index primer 中的NNNNNN为索引碱基,如index1中的NNNNNN为:CGTGAT
按照方案一构建人外显子待测序列与标签序列同向交替串联体文库(
Illumina
测序平台)
DNA
片段化
所用仪器和试剂:
超声打断仪:Covaris:S2 Focused-ultrasonicator
打断管:Covaris Microtube 6x16mm,
catalog #:520045
琼脂糖:Promega, Agarose, LE,
Analytical Grade, catalog #: V3121
电泳仪电源:北京市六一仪器厂,DYY-7C型
电泳槽:北京市六一仪器厂,DYCP-31DN型电泳槽
QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit
(250),Catalog #: 28606
Takara 20 bp DNA Ladder (Dye Plus),
Takara Code, 3420A
用超声打断仪(Covaris S2
Focused-ultrasonicator)将1ug 纯化好的基因组DNA打断为300bp(Intensity:4, Duty Cycle:10%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃, time:60s, number of
cycles:2)或者150~200bp(Intensity:5, Duty
Cycle:10%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃ , time:60s, number of cycles:5),打断体系为50ul。
4%琼脂糖凝胶电泳(80V,70min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit)80~130bp(或者60~90bp:根据测序仪的测序读长来决定回收片段的大小)片段(Takara 20 bp DNA Ladder),回收的简略步骤:6倍体积buffer QG溶胶,加入等体积异丙醇,混匀后过柱,buffer QG洗脱,buffer PE洗脱,晾干,56ul ddH2O洗脱。详见QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit说明书。
末端补平
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
片段化DNA:55.5ul
End Prep Enzyme Mix:3ul
End Repair Reaction Buffer (10X):6.5ul
共:65ul
20℃ 30min,65℃ 30min
末端加
A
并连接标签序列
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
已补平的DNA:65ul
Blunt/TA Ligase Master Mix:15ul
Ligation Enhancer:1ul
接头(标签序列)UO-A(50pmol):1ul
ddH2O:1.5ul
共:83.5ul
20℃ 30min,65℃ 10min立即置于冰上3min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,15ul ddH2O洗脱。
标签序列:UO-A由100pmol的UO-adaptor1(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和100pmol的UO-adaptor2(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)等体积混合退火(94℃ 5min,以每秒0.1℃逐渐降温至25℃)而成。
UO-adaptor1:5' - pTATGGGCAGTCGT - 3'
UO-adaptor2:5' – CGACTGCCCATAG - 3'
DNA单链环化
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
New England Biolabs: Exonuclease I
(E. coli), Catalog #: M0293
New England Biolabs: Exonuclease III
(E. coli), Catalog #: M0206
Epicentre: CircLigase II ssDNA Ligase, Catalog
#: CL9025K
将片段化后的DNA 37℃蒸干至4.2ul。
95℃ 3min(注:需要用可以对100ul体系进行反应的PCR仪,否则95℃后,4.2ul容易被蒸干),立即置于冰上3min
完成后加入:
10Xcircligase buffer:0.5ul
10mmol Mncl2:0.25ul
Circligase(100u/ul): 0.25ul
65℃ 2h,80℃ 10min
环化完成后消化线性及二聚体DNA
Exonuclease I (E. coli): 0.25ul
Exonuclease III (E. coli): 0.25ul
37℃1h,80℃20min
多重链置换(MDA)反应
采用基于MDA原理的全基因组扩增(WGA)试剂盒,滚环扩增环化后的产物:
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
GE healthcare: illustra GenomiPhi HY
DNA Amplification Kits , Product code: 25-6600-20
Beckman Coulter, Inc :Agencourt AMPure XP,Item No. A63880
上述环化DNA:2.5ul
Sample buffer:22.5ul
95℃3min,立即置于冰上3min
完成后加入:
Reaction buffer:22.5ul
Enzyme mix:2.5ul
共20ul
30℃ 1h,65℃ 10min
产物采用Agencourt AMPure XP
(Beckman Coulter, Inc)磁珠纯化。概述如下:对扩增后产物加入1.8倍体积磁珠,室温放置5min,磁力架吸附5min,去上清,70%酒精洗两次,晾干后,50ul buffer AE(10 mM Tris-Cl, 0.5 mM EDTA; pH 9.0)洗脱。详见试剂盒说明书。
纯化后的产物即是待测序列与标签序列同向交替串联体。
对上述产生的待测序列与标签序列同向交替串联体构建外显子捕获文库(Illumina测序平台)
可利用构建外显子捕获文库的商业试剂盒,如:Agilent: SureSelect Human
All Exon Kits等。
待测序列与标签序列同向交替串联体DNA片段化
所用仪器和试剂:
1) 超声打断仪:Covaris:S2 Focused-ultrasonicator
2) 打断管:Covaris Microtube 6x16mm, 货号:520045
3) 琼脂糖:Promega, Agarose, LE, Analytical Grade, catalog #: V3121
用超声打断仪(Covaris S2
Focused-ultrasonicator)将2ug纯化后的待测序列与标签序列同向交替串联体打断为500 - 700bp(Intensity:3, Duty
Cycle:5%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃, time:15s, number of cycles:5), 打断体系为85ul。
末端补平
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® End Repair Module, Catalog #:E6050
QIAGEN: MinElute Reaction Cleanup
Kit, Catalog #:28206
片段化DNA:85ul
NEBNext End Repair Reaction Buffer:10ul
NEBNext End Repair Enzyme Mix:5ul
共:100ul
20℃ 30min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,43ul ddH2O洗脱。
末端加A
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® dA-Tailing Module, Catalog #:E6053
QIAGEN: MinElute Reaction Cleanup
Kit, Catalog #:28206
已补平的DNA:42ul
NEBNext dA-Tailing Reaction Buffer:5ul
Klenow Fragment (3´→ 5´ exo–):3ul
共:50ul
37℃ 30min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,35.5ul ddH2O洗脱。
标签序列连接
所用试剂:Invitrogen:T4 DNA Ligase, Catalog #:
15224-041
已末端加A的DNA:34.5ul
接头(标签序列)1(50pmol):3ul
5X DNA ligase buffer:10ul
T4 DNA Ligase: 2.5ul
共:50ul
16℃ 过夜(16h)
2%琼脂糖凝胶电泳(80V,80min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit)500 - 700bp片段,22ul ddH2O洗脱。
标签序列1:
Multiplexing Adapter 1.0:5’- pGATCGGAAGAGCACACGTCT -
3’
Multiplexing Adapter 2.0:
5’-
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 3’
标签序列退火:取等体积100pmol的Multiplexing Adapter 1.0(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和Multiplexing Adapter 2.0(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl),94℃ 5min,接着以每秒0.1℃逐渐降温至25℃。退火完成后即形成了浓度为50pmol的标签序列。
PCR扩增
所用仪器试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
Agilent: Herculase II Fusion DNA
Polymerases, Catalog #: 600677
QIAGEN: MinElute Reaction Cleanup
Kit, Catalog #:28206
4个反应并行进行,每个反应配方如下:
上述回收的DNA(约90ng)+ddH2O:36.5ul
MP PCR primer 1.02(10pmol):1ul
MP index primer3(10pmol):1ul
5× Herculase II Reaction Buffer: 10ul
dNTPs (100 mM; 25 mM each dNTP):
0.5ul
Herculase II Fusion DNA Polymerase:
1ul
共:50ul
PCR扩增循环条件:
98℃ 2min预变性,循环扩增(98℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 30s)8次, 72℃ 10min,4℃ 冷却。
PCR完成后浓缩4个反应管中的PCR产物(MinElute Reaction Cleanup Kit),46ul ddH2O洗脱。
2%琼脂糖凝胶电泳(80V,90min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit)500~700bp片段,26ul ddH2O洗脱。
引物序列如下:
MP PCR primer 1.0:
5’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA
CGCTCTTCCGATCT - 3’
MP index primer:
5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTT
CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT - 3’
其中:MP index primer 中的NNNNNN为索引碱基,如index1中的NNNNNN为:CGTGAT
外显子探针杂交
本实验采用Agilent: SureSelect Human
All Exon Kits对上述PCR反应产物进行外显子探针杂交。简述如下:
杂交缓冲液配制:
SureSelect Hyb #1 (orange cap, or
bottle): 25ul
SureSelect Hyb #2 (red cap): 1ul
SureSelect Hyb #3 (yellow cap):10ul
SureSelect Hyb #4 (black cap, or
bottle):13ul
共:49ul
65℃ 5 min
捕获文库混合物配制:
SureSelect Library:5ul
SureSelect RNase Block (purple cap):0.5ul
ddH2O: 1.5ul
共:7ul
65℃ 2min
样品混合物配制:
纯化好的DNA(约700ng):3.4ul
SureSelect Indexing Block #1 (green
cap):2.5ul
SureSelect Block #2 (blue cap):2.5ul
SureSelect Indexing Block #3 (brown
cap):0.6ul
共:9ul
95℃ 5min,65℃ hold
取13ul配制好的杂交缓冲液加入捕获文库混合物(7ul)中,再将样品混合物(9ul)加入,共29ul,65℃杂交24h。
磁珠(InvitrogenDynabeads® M-280 Streptavidin,Catalog #:11205D)抓取杂交好的片段(50ul磁珠,用200ul SureSelect Binding
Buffer洗涤三次, 200ul SureSelect Binding
Buffer重悬磁珠,加入杂交后产物,室温放置30min,磁珠吸附,SureSelect Wash 1洗一次,SureSelect Wash 2洗三次,36.5ul ddH2O重悬磁珠),详见Agilent: SureSelect Human
All Exon Kits操作手册。
探针杂交后PCR
所用仪器试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
Agilent: Herculase II Fusion DNA
Polymerases, Catalog #: 600677
Beckman Coulter, Inc :Agencourt AMPure XP,Item No. A63880
4个反应并行进行,每个反应配方如下:
外显子探针杂交中重悬的磁珠:36.5ul
MP PCR primer 1.0(10pmol):1ul
MP PCR primer 2.0(10pmol):1ul
5× Herculase II Reaction Buffer: 10ul
dNTPs (100 mM; 25 mM each dNTP):
0.5ul
Herculase II Fusion DNA Polymerase:
1ul
共:50ul
PCR扩增循环条件:
98℃ 2min预变性,循环扩增(98℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 30s)12次, 72℃ 10min,4℃ 冷却。
引物序列如下:
MP PCR primer 1.0:
5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA
CGCTCTTCCGATCT - 3’
MP PCR primer 2.0:
5’- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT - 3’
PCR完成后用Agencourt AMPure XP磁珠纯化,概述如下:对扩增后产物加入1.8倍体积磁珠,室温放置5min,磁力架吸附5min,去上清,70%酒精洗两次,晾干后,16ul ddH2O洗脱。详见试剂盒说明书。
洗脱后的DNA即是构建好的人外显子待测序列与标签序列同向交替串联体文库,该文库即可用于二代测序平台测序。
实施例
2
:
按照方案一构建外周血游离DNA待测序列与标签序列同向交替串联体文库(Illumina测序平台)
提取外周血游离DNA并检测其片段大小。
所用仪器和试剂:
QIAGEN:QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit,
catalog #: 55114
Agilent:2100 bioanalyzer
取2ml血浆,采用QIAGEN的QIAamp Circulating Nucleic
Acid Kit提取血浆中的DNA(cell-free circulating DNA),20ul ddH2O洗脱(提取方法见试剂盒说明书)。采用Agilent的2100 bioanalyzer检测提取的片段大小分布。从结果得出,正常人中游离的DNA片段大小集中在172bp附近,分布范围约是(130bp-230bp),浓度为0.354ng/ul。肝癌病人中游离的DNA片段大小集中在164bp附近,分布范围约是(110bp-210bp),浓度为4.78ng/ul。
末端补平
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
提取的外周血游离DNA+ddH2O:55.5ul
End Prep Enzyme Mix:3ul
End Repair Reaction Buffer (10X):6.5ul
共:65ul
20℃ 30min,65℃ 30min
末端加A并连接标签序列
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
已补平的DNA:65ul
Blunt/TA Ligase Master Mix:15ul
Ligation Enhancer:1ul
接头(标签序列)UO-A(50pmol):1ul
ddH2O:1.5ul
共:83.5ul
20℃ 30min, 65℃ 10min立即置于冰上3min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,15ul ddH2O洗脱。
标签序列:UO-A由100pmol的UO-adaptor1(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和100pmol的UO-adaptor2(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)等体积混合退火(94℃ 5min,以每秒0.1℃逐渐降温至25℃)而成。
UO-adaptor1:5'- pTATGGGCAGTCGT - 3'
UO-adaptor2:5'- CGACTGCCCATAG - 3'
DNA单链环化
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
New England Biolabs: Exonuclease I
(E. coli), Catalog #: M0293
New England Biolabs: Exonuclease III
(E. coli), Catalog #: M0206
Epicentre: CircLigase II ssDNA Ligase, Catalog
#: CL9025K
将提取的外周血游离的DNA 37℃蒸干至4.2ul。
95℃ 3min(注:需要用可以对100ul体系进行反应的PCR仪,否则95℃后,4.2ul容易被蒸干),立即置于冰上3min
完成后加入:
10Xcircligase buffer:0.5ul
10mmol Mncl2:0.25ul
Circligase(100u/ul): 0.25ul
65℃ 2h,80℃ 10min
环化完成后消化线性及二聚体DNA
Exonuclease I (E. coli): 0.25ul
Exonuclease III (E. coli): 0.25ul
37℃1h,80℃20min
多重链置换(MDA)反应
采用基于MDA原理的全基因组扩增(WGA)试剂盒,滚环扩增环化后的产物:
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
GE healthcare: illustra GenomiPhi HY
DNA Amplification Kits , Product code: 25-6600-20
Beckman Coulter, Inc :Agencourt AMPure XP
上述环化DNA:2.5ul
Sample buffer:22.5ul
95℃3min,立即置于冰上3min
完成后加入:
Reaction buffer:22.5ul
Enzyme mix:2.5ul
共20ul
30℃ 1h,65℃ 10min
产物采用Agencourt AMPure XP
(Beckman Coulter, Inc)磁珠纯化。概述如下:对扩增后产物加入1.8倍体积磁珠,室温放置5min,磁力架吸附5min,去上清,70%酒精洗两次,晾干后,50ul buffer AE(10 mM Tris-Cl, 0.5 mM EDTA; pH 9.0)洗脱。详见试剂盒说明书。
纯化后的产物即是待测序列与标签序列同向交替串联体。
对上述产生的待测序列与标签序列同向交替串联体构建illumina 测序文库
可利用构建标准的Illumina文库的商业试剂盒,如:TruSeq DNA Sample
Preparation Kits, Nextera DNA Sample Preparation Kits等。
同向重复串联体DNA片段化
所用仪器和试剂:
1) 超声打断仪:Covaris:S2 Focused-ultrasonicator
2) 打断管:Covaris Microtube 6x16mm, 货号:520045
3) 琼脂糖:Promega, Agarose, LE, Analytical Grade, catalog #: V3121
用超声打断仪(Covaris S2
Focused-ultrasonicator)将2ug纯化后的待测序列与标签序列同向交替串联体打断为500~700bp(Intensity:3, Duty
Cycle:5%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃, time:15s, number of cycles:5), 打断体系为85ul。
末端补平
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® End Repair Module, Catalog #:E6050
QIAGEN: MinElute Reaction Cleanup
Kit, Catalog #:28206
片段化DNA:85ul
NEBNext End Repair Reaction Buffer:10ul
NEBNext End Repair Enzyme Mix:5ul
共:100ul
20℃ 30min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,43ul ddH2O洗脱。
末端加
A
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® dA-Tailing Module, Catalog #:E6053
QIAGEN: MinElute Reaction Cleanup
Kit, Catalog #:28206
已补平的DNA:42ul
NEBNext dA-Tailing Reaction Buffer:5ul
Klenow Fragment (3´→ 5´ exo–):3ul
共:50ul
37℃ 30min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,35.5ul ddH2O洗脱。
标签序列连接
所用试剂:Invitrogen:T4 DNA Ligase, Catalog #:
15224-041
已末端加A的DNA:34.5ul
接头(标签序列)1(50pmol):3ul
5X DNA ligase buffer:10ul
T4 DNA Ligase: 2.5ul
共:50ul
16℃ 过夜(16h)
2%琼脂糖凝胶电泳(80V,80min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit)500~700bp片段,22ul ddH2O洗脱。
标签序列1:
Multiplexing Adapter 1.0:5’- pGATCGGAAGAGCACACGTCT -
3’
Multiplexing Adapter 2.0:
5’-
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 3’
标签序列退火:取等体积100pmol的Multiplexing Adapter 1.0(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和Multiplexing Adapter 2.0(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl),94℃ 5min,接着以每秒0.1℃逐渐降温至25℃。退火完成后即形成了浓度为50pmol的标签序列。
扩增
所用仪器试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
Thermo scientific: Phusion
High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer, Catalog #: F531L
上述回收的DNA(约30ng)+ddH2O:23ul
MP PCR primer 1.02(10pmol):1ul
MP index primer3(10pmol):1ul
2X Phusion High-Fidelity PCR Master
Mix: 25ul
共:50ul
PCR扩增循环条件:
98℃ 45s预变性,循环扩增(98℃ 15s,65℃ 30s,72℃ 60s)10次, 72℃ 5min,4℃ 冷却。
2%琼脂糖凝胶电泳(80V,80min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit)500 - 700bp片段,22ul ddH2O洗脱。
洗脱后的DNA即是构建好的文库,该文库即可用于二代测序平台测序。
引物序列如下:
MP PCR primer 1.0:
5’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA
CGCTCTTCCGATCT - 3’
MP index primer:
5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTT
CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT - 3’
其中:MP index primer 中的NNNNNN为索引碱基,如index1中的NNNNNN为:CGTGAT
实施实例
3
:
按照方案二构建待测序列与标签序列同向交替串联体文库(Illumina 测序平台)
步骤:
DNA片段化
所用仪器和试剂:
超声打断仪:Covaris:S2 Focused-ultrasonicator
打断管:Covaris Microtube 6x16mm,
catalog #:520045
琼脂糖:Promega, Agarose, LE,
Analytical Grade, catalog #: V3121
电泳仪电源:北京市六一仪器厂,DYY-7C型
电泳槽:北京市六一仪器厂,DYCP-31DN型电泳槽
QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit
(250),Catalog #: 28606
Takara 20 bp DNA Ladder (Dye Plus),
Takara Code, 3420A
用超声打断仪(Covaris S2
Focused-ultrasonicator)将1ug 纯化好的基因组DNA打断为300bp(Intensity:4, Duty Cycle:10%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃, time:60s, number of
cycles:2)或者150-200bp(Intensity:5, Duty
Cycle:10%, Cycles per Burst:200, Temperature:4℃ , time:60s, number of cycles:5),打断体系为50ul。
4%琼脂糖凝胶电泳(80V,70min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit)80-130bp(或者60-90bp:根据测序仪的测序读长来决定回收片段的大小)片段(Takara 20 bp DNA Ladder),回收的简略步骤:6倍体积buffer QG溶胶,加入等体积异丙醇,混匀后过柱,buffer QG洗脱,buffer PE洗脱,晾干,56ul ddH2O洗脱。详见QIAGEN MinElute Gel
Extraction Kit说明书。
末端补平
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
片段化DNA:55.5ul
End Prep Enzyme Mix:3ul
End Repair Reaction Buffer (10X):6.5ul
共:65ul
20℃ 30min,65℃ 30min
末端加A并连接标签序列
所用试剂:New England Biolabs :
NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for
Illumina®, Catalog #: E7370S
已补平的DNA:65ul
Blunt/TA Ligase Master Mix:15ul
Ligation Enhancer:1ul
接头(标签序列)UO-A(50pmol):1ul
ddH2O:1.5ul
共:83.5ul
20℃ 30min, 65℃ 10min立即置于冰上3min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,15ul ddH2O洗脱。
标签序列:UO-A由100pmol的UO-adaptor1(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和100pmol的UO-adaptor2(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)等体积混合退火(94℃ 5min,以每秒0.1℃逐渐降温至25℃)而成。
UO-adaptor1:5' – pTATGGGCAGTCGT - 3'
UO-adaptor2:5' - CGACTGCCCATAG - 3'
DNA单链环化
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
New England Biolabs: Exonuclease I
(E. coli), Catalog #: M0293
New England Biolabs: Exonuclease III
(E. coli), Catalog #: M0206
Epicentre: CircLigase II ssDNA Ligase, Catalog
#: CL9025K
将片段化后的DNA 37℃蒸干至4.2ul。
95℃ 3min(注:需要用可以对100ul体系进行反应的PCR仪,否则95℃后,4.2ul容易被蒸干),立即置于冰上3min
完成后加入:
10Xcircligase buffer:0.5ul
10mmol Mncl2:0.25ul
Circligase(100u/ul): 0.25ul
65℃ 2h,80℃ 10min
环化完成后消化线性及二聚体DNA
Exonuclease I (E. coli): 0.25ul
Exonuclease III (E. coli): 0.25ul
37℃1h,80℃20min
滚环扩增
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
New England Biolabs: phi29 DNA
Polymerase, Catalog #: M0269L
单链环化后的DNA:5.7ul
phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer:2ul
引物UO-a3(10pmol):1ul
ddH2O:8.9ul
共17.6ul,95℃ 3min,立即置于冰上3min。完成后加入:
10mM dNTP:1ul
100X BSA:0.4ul
phi29 DNA Polymerase(10U/ul):1ul
共:20ul
30℃ 8h,65℃ 10min。
引物序列:UO-a3: 5' - ACGACTGCCCATAT - 3'
线性
DNA
双链化
所用仪器和试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
New England Biolabs: phi29 DNA
Polymerase, Catalog #: M0269L
New England Biolabs: Exonuclease I
(E. coli), Catalog #: M0293
New England Biolabs: T4 DNA
polymerase , Catalog #: m0203
Epicentre: Ampligase® Enzyme and
Buffer , Catalog #:A3202K
Beckman Coulter, Inc :Agencourt AMPure XP,Item No. A63880
滚环后DNA:20ul
引物UO-a1(10p):1ul
Ampligase 10X Reaction Buffer:5ul
2.5mM dNTP:1ul
ddH2O: 22.5ul
95℃ 3min,立即置于冰上3min,完成后加入:
T4 DNA polymerase: 0.5ul
12℃ 2.5h,75℃ 20min。完成后加入:
Ampligase DNA Ligase:3ul
60℃ 1h。完成后加入:
Exonuclease I:1ul
37℃ 1h,80℃ 20min
产物用Agencourt AMPure XP磁珠纯化,概述如下:对扩增后产物加入1.8倍体积磁珠,室温放置5min,磁力架吸附5min,去上清,70%酒精洗两次,晾干后,20ul ddH2O洗脱。详见试剂盒说明书。
纯化后的产物即是DNA片段的同向重复串联体。
引物序列UO-a1:5'-pTATGGGCAGTCGT-3'
对上述产生的待测序列与标签序列同向交替串联体构建illumina 测序文库
滚环8h后得到的DNA的量为几十纳克到几百纳克不等,可以通过增加滚环的时间来增加滚环后的DNA产量。根据所得到的DNA的量,选择合适的商业试剂盒构建标准的Illumina文库:如果得到几十纳克的DNA可采用 Nextera DNA Sample
Preparation Kits或者其他基于少量DNA构建文库的试剂盒,如果得到的DNA的量为几百纳克,则可采用TruSeq DNA Sample Preparation Kits等可以针对多起始量DNA的试剂盒。
这里采用一种基于转座酶EZ-Tn5的文库构建方法:
转座子组装
Epi_MA1(10pmol): 1ul
Epi_MA2(10pmol): 1ul
甘油:0.5ul
1U/ul转座酶EZ-Tn5(epicentre):2.5ul
共:5ul
25℃ 20min
DNA片段化
上述转座子:5ul
5XLMW buffer:2ul
同向重复串联体DNA(约30ng)+ddH2O: 3ul
共:10ul
55℃ 10min
产物用MinElute Reaction Cleanup
Kit纯化,24ul ddH2O洗脱。
回收产物PCR扩增
所用仪器试剂:
PCR仪:Eppendorf: Mastecycler pro s
Thermo scientific: Phusion
High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer, Catalog #: F531L
上述回收的DNA(约30ng)+ddH2O:23ul
Epi_PCR primer 1.0(10pmol):1ul
Epi_index primer(10pmol):1ul
2X Phusion High-Fidelity PCR Master
Mix: 25ul
共:50ul
PCR扩增循环条件:
72℃ 3min(不可少),98℃ 30s,循环扩增(98℃ 10s,65℃ 30s,72℃ 3min)10次,4℃ 冷却。
2%琼脂糖凝胶电泳(80V,80min ;1XTAE),切胶回收(QIAGEN MinElute Gel Extraction
Kit)500~800bp片段,17ul ddH2O洗脱。
洗脱后的DNA即是构建好的文库,该文库即可用于二代测序平台测序。
上述各引物序列如下:
Epi_ME:
5’- CTGTCTCTTATACACATCT - 3’
Epi_Adaptor1:
5’-
CTACACGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGATGTGTATAAGAGAC
AG - 3’
Epi_Adaptor2:
5’- CGGTCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGATGTGTATAAGAGAC
AG - 3’
Epi_PCR primer 1.0:
5’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTCCCTCGCGCC
ATCAG - 3’
Epi_PCR index primer:
5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNCGGTCTGCCTTG
CCAGCCCGCTCAG - 3’
其中:Epi_PCR index primer 中的NNNNNN为索引碱基,如index1中的NNNNNN为:CGTGAT
Epi_MA1:
由等体积100pmol的Epi_ME(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和Epi_Adaptor1(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)退火而成。条件:94℃ 5min,接着以每秒0.1℃逐渐降温至25℃。
Epi_MA2:
由等体积100pmol的Epi_ME(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)和Epi_Adaptor2(退火缓冲液溶解:10mM Tris-HCl(pH 7.5),1 mM EDTA,0.1mM NaCl)退火而成。条件:94℃ 5min,接着以每秒0.1℃逐渐降温至25℃。
5XLMW buffer:50 mM Tris–OAc, pH 8.0, 25 mM Mg(OAc) 2
按实施实例
1
进行
Oseq
文库构建
对噬菌体Phix174实施本方法的实验测试以及数据分析,并评估该方法检测低频突变的能力。
对噬菌体1ug Phix174 DNA,超声打断成主带在300bp的DNA片段。回收60~80bp片段,连接标签序列,单链化,滚环扩增(详见实施实例1)。对滚环后的DNA进行了基于转座子EZ-Tn5的二代测序文库构建(详见实施实例3)。用hiseq 2000测得约10G的双向数据(读长为2×100=200bp)。对数据处理分析如下:
1、共测得:54391601条reads,其中能成环(能够检测到至少两个重复单元,下同)的reads数为:33987941条reads
2、成环率:OS2_in2:
(135951764/4)/(217566404/4)=62.49%
3、形成的环大小范围为:30 - 162bp,平均大小为:72.5333bp,标准差为:14.06478
中位数为:71bp。具体分布如图1所示。
4、对构建好的待测序列与标签序列同向交替串联体文库,进行双端的高通量测序(Pair-End sequencing)。由于环的大小小于测序仪的测序长度的一半,因此单端一次测序一定覆盖了至少一个单元的串联体,双端的一次测序一定测了至少两次串联体单元,将这两个串联体的序列相互比较,去除不一致的序列。利用该原理,来计算所测的数据中DNA的错误率。假设样品中不存在低频突变,该方法的错误率为1e-5。测序错误在不同碱基(参考基因组的碱基)上分布不同,其中C到T的突变频率较高,约为1e-4。这种突变的模式在其他测定低频突变的研究中也有发现,这两种突变很可能是由于胞嘧啶或者5甲基化胞嘧啶自发的脱氨基作用导致的。当发生脱氨基作用后,一根原始单链DNA上的碱基已经改变,对它的多次独立检测都只能观察到突变碱基。
从上述计算的结果可以看出,该方法的单碱基错误率(10-5)远远低于二代测序的错误率(1%),也远远低于现在已经存的一些改进方法,因此本方法较为彻底的消除了二代测序的错误率问题,借助于第二代测序技术平台实现了对DNA分子的超精确测序。该方法的另一个优点是测序精度与测序深度无关,解决了标签法必须在极高的测序覆盖乘数下才能较精确测定DNA序列的问题,从而也就可以实现对大基因组(如人类的基因组等)的精确测序。
该方法能够超精确测定细胞中的DNA分子组成,可以把一个正常或发生病变(如癌症组织等)细胞群体中的DNA组成较真实的呈现出来。在癌症的检测方面,可以用来检测一个正常个体的某一组织或器官是否已经发生了潜在的致癌突变,以达到提前发现癌症和预防癌症的目的。在癌症研究的方面,该方法可以检测癌症群体中DNA突变的分布情况;可以用于发现癌症组织中潜在的小克隆群体来真实的了解肿瘤的异质性结构;可以帮助阐释突变在癌症的发生发展所起的作用;可以用来寻找肿瘤干细胞等。对于癌症治疗方面,可以用于寻找肿瘤干细胞群体,然后针对肿瘤干细胞设计特定的药物靶标,以实现对癌症的有效治疗等。对正常个体而言,该方法可以用于检测个体中正常细胞内DNA发生的突变,从而追溯正常组织的生长模式;也可以测定不同年龄个体中,某一组织中DNA突变发生的个数,从而估算DNA突变的速率;可以用于检测一个正常个体中是否存在与各种疾病相关的突变,达到预防疾病的目的等。
同时该方法能对外周血中的游离DNA进行有效的文库构建,能够有效的检测外周血中存在的低频突变位点,这种通过非侵害性的检测手段就能够对癌症的发生及发展过程、产前诊断中胎儿体内的有害突变等进行有效的检测和评估。
在古人类DNA的序列测定是研究人类进化的主要手段,但测定古人类DNA有很多难题,其中最大的几个问题是提取的古人类DNA含量低,降解严重,微生物污染严重。该方法能够利用极少量的DNA(单双链均可)进行文库构建,构建的文库能够进行外显子捕获(去除微生物基因组污染),可有效针对古DNA文库构建过程中的这几个难题。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种测序文库,其特征在于,所述测序文库中的插入片段是待测序列与标签序列同向交替串联体。
2.权利要求1所述文库,其特征在于,所述待测序列与标签序列同向交替串联体的制备包括将所述待测序列连接所述标签序列,单链环化和滚环复制的步骤。
3.权利要求1所述文库,其特征在于,所述待测序列与所述标签序列长度之和小于测序仪测序长度的一半。
4.权利要求1所述文库,其特征在于,所述标签序列包括6-13个连续的确定碱基和0-13个连续的随机碱基。
5.一种制备测序文库的方法,其特征在于,所述方法包括制备在待测序列与标签序列同向交替串联体的两端连接测序接头的核酸序列。
6.权利要求5所述方法,其特征在于,所述待测序列与标签序列同向交替串联体的制备包括将所述待测序列连接标签序列,单链环化和滚环复制的步骤。
7.权利要求1-4任一项所述测序文库在目标片段捕获测序、单链DNA片段测序、化石DNA测序或外周血游离DNA测序中的应用。
8.一种测序方法,其特征在于,该方法所用测序文库的插入片段是待测序列与标签序列同向交替串联体。
9.权利要求8所述方法,其特征在于,所述待测序列与标签序列同向交替串联体的制备包括将所述待测序列连接所述标签序列,单链环化和滚环复制的步骤。
10.权利要求8所述方法,其特征在于,所述待测序列与所述标签序列长度之和小于测序仪测序长度的一半。
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