CN102212612A - 一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法 - Google Patents

一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，包括步骤：将DNA片段化；末端补平；与环化接头连接；将DNA片段环化；将DNA片段化为300-800bp的大小；在DNA片段的3’端加上腺嘌呤；连接特异Y型接头；PCR扩增DNA片段；筛选大小为400-700bp的片段，即得所需的双末端文库。本发明采用Y型接头代替原有的A、B接头，增加了DNA片段的利用率，使文库构建的效率提高了4倍。通过在Y型接头中引入区分多样品的标签序列，实现了多样品平行测序，有效的利用了测序板的空间，每次实验的成本节约了30％；减少了实验步骤，降低了样品和试剂的损耗，提高了文库构建的成功率；减少了数据的冗余率，提高了数据的利用率。

Description

一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法
技术领域
本发明属于基因文库的构建，更具体地，本发明涉及一种用于基于焦磷酸原理的高通量454测序的双末端文库的构建方法。
背景技术
如图1所示为目前的基于焦磷酸原理的高通量454测序的双末端文库的构建方法，其主要步骤为：通过HydroShear片段化仪将DNA片段化为3kb左右的大小；通过T4 DNA聚合酶将片段末端补平；将平端化的3kb片段与带有生物素的环化接头通过T4 DNA连接酶连接，去除接头自连的片段；填补缺口，通过重组酶将片段环化，将未环化的DNA片段通过外切酶切除；通过氮气雾化装置(雾化法)将DNA片段化300-800bp左右的大小；通过T4 DNA聚合酶将片段末端补平；通过Dynal M270(Invitrogen公司)抗生物素蛋白链霉素磁珠固定带有生物素的片段，连接454特有的A、B接头(A、B接头的序列如图2A、图2B所示)，并填补缺口；利用454特异A、B接头的引物进行PCR扩增，其中B引物带有生物素标记；筛选大小为400-700bp的片段；通过Dynal M270(Invitrogen公司)链霉素抗生物素蛋白磁珠固定带有生物素的片段，去除连接A、A和B、B的片段；通过氢氧化钠溶液解链，使带有A、B接头的片段分离出来，形成454测序所需要的单链文库。
现有基于焦磷酸原理的高通量454测序的双末端文库的构建方法步骤多，损耗大，需要进行15至20个循环的PCR扩增，增加了数据的冗余率，降低了数据的有效利用率；另外目前技术没有引入识别不同样品标签的接头，多样品的双末端测序只能通过物理分区来实现，浪费了测序板的空间，使单次实验的测序能力降低了30％。对于一些基因组过小或者过大的样本，使用物理分区，每个分区所得到的数据或者过多，或者过少，无法高效的利用测序板，造成了试剂的浪费。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种新的用在基于焦磷酸原理的高通量454测序的双末端文库的构建方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，包括以下步骤：
(1)将DNA片段化；
(2)将片段化后的DNA末端补平；
(3)将末端补平的DNA与带有生物素的环化接头连接，去除接头自连的小片段；所述环化接头序列为：
5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′
3′-TATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATA-5′
(4)填补缺口，将片段环化，切除未环化的DNA片段；
(5)将DNA片段化为300-800bp的大小；
(6)补平300-800bp的DNA片段末端，在DNA片段的3’端加上腺嘌呤；
(7)通过链霉素抗生物素蛋白磁珠固定带有生物素的片段，通过T4连接酶连接Y型接头；所述Y型接头为：
5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACGACT(N)nT-3′
3′-GGATAGGGGACACACGGAACAGATAGGGGACAACGCACAGGCTGCTGA(N)np-5′
其中，(N)n为标签序列，n为6-10的整数；
(8)利用Y型接头的引物，即5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3′，5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3′进行PCR扩增；
(9)筛选大小为400-700bp的片段；即得所需双末端文库。
优选地，所述步骤(1)中将DNA片段化为3kb大小。
优选地，所述步骤(4)中利用Cre重组酶将片段环化，利用核酸外切酶I切除未环化的DNA片段。
优选地，所述步骤(5)中通过雾化法将DNA片段化。
优选地，所述步骤(6)中通过taq酶在DNA片段的3’端加上腺嘌呤。
优选地，所述步骤(7)中通过T4连接酶连接Y型接头。
优选地，所述步骤(7)中Y型接头的标签序列为ACACGACGAC或ACACGTAGTA。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用Y型接头代替原有的A、B接头，增加了DNA片段的利用率，使文库构建的效率提高了4倍。通过在Y型接头中引入区分多样品的标签序列，实现了多样品平行测序，有效的利用了测序板的空间，每次实验的成本节约了30％。
(2)本发明减少了实验步骤，降低了样品和试剂的损耗，提高了文库构建的成功率；通过该方法，将PCR扩增降到10个循环，减少了数据的冗余率，提高了数据的利用率。
附图说明
图1为现有高通量454测序的双末端文库的构建流程图；
图2A为454测序的特异A接头；
图2B为454测序的特异B接头；
图3为本发明用于高通量454测序的双末端文库的构建流程图；
图4为本发明用于高通量454测序的双末端文库的构建方法中使用的Y型接头。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式来详细说明本发明。
在以下实施例中，如无特别说明，所有试剂均由Roche公司提供，Tris-HCl和Buffer EB是指10mM Tris-HCl(pH7.5-8.5)，室温是指22-25℃。
实施例1  一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法
请参阅图3和图4，本发明一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，包括以下步骤：
1、制备样品DNA
在离心管中加入5μg样品DNA，加入Tris-HCl至200μl体积，振荡。
2、DNA片段化(HydroShear DNA片段化仪)为3kb大小
按照使用说明，在HydroShear DNA片段化仪(Genomic Solutions)中片段化DNA。片段化前不要加热样品。取样品的一小部分跑胶并摸索最佳片段化条件。使用标准片段化装置，推荐使用已校准的速度为12，20个循环。
1.使用AMPure磁珠(Beckman Coulter)纯化片段化的DNA，步骤如下：
a.测量试管中DNA的总体积；
b.加入Tris-HCl使总体积达到200μl；
c.加入100μl已校准的AMPure磁珠，振荡；
d.让试管在室温中静置5分钟；
e.使用磁力架，让磁珠在管壁上聚集成团，整个清洗过程中，试管要放置在磁力架上；
f.移除上清液并用500μl 70％乙醇清洗磁珠2次；
g.移除所有上清液并让AMPure磁珠风干；
h.从磁力架上取下试管，加入52μl Tris-HCl并振荡至磁珠悬浮，这会将片段化的DNA从磁珠上洗脱下来；
i.在磁力架上，让磁珠在管壁上聚集成团后将含有DNA片段的上清液移至到新离心管中。
3、补平片段末端
在离心管中加入以下试剂：24.5μl分子生物级别水、10μl 10×PNK缓冲液(无沉淀，若有沉淀，将缓冲液加热至37℃并振荡)、0.5μl牛血清白蛋白(20mg/ml)、1μl ATP[pH7(100mM)]、4μl PCR核苷酸混合物(每种10mM)、50μl已片段化的DNA。振荡，将离心管放置冰上并加入以下酶：5μl T4 DNA聚合酶(1U/μl)、5μl多核苷酸激酶(PNK，10U/μl)，总共为100μl。
振荡并将在25℃室温中进行补平反应20分钟。之后马上将补平后的片段放入QIAquick柱子(Qiagen)里纯化。在室温中加35μl EB缓冲液洗脱。
4、环化接头连接
向含有补平纯化后DNA的试管中按顺序加入以下试剂：35μl片段化补平后的DNA(上述步骤3得到)、50μl快速连接酶缓冲液(2X Conc.)、10μl环化接头(20μM)，总共95μl。振荡，加入5μl快速T4 DNA连接酶，振荡并在25℃下连接反应15分钟。用QIAquick柱子纯化。在室温下用100μl EB缓冲液洗脱。
5、文库范围选择
向前述步骤所得的洗脱液中加入50μl AMPure磁珠。振荡并在室温中放置5分钟。使用磁力架，让磁珠在管壁上聚集成团，并移除上清液。将离心管放置在磁力架上，用500μl 70％乙醇清洗磁珠3次。丢弃全部上清液，风干磁珠。将离心管从磁力架上取下，加入42μl Tris-HCl，振荡使磁珠悬浮。在磁力架上，让磁珠在管壁上聚集成团。取40μl含有DNA的上清液移至一个新的离心管中。
6、填缺反应
在离心管中加入以下试剂：40μl环化接头DNA、5μl 10xThermoPol缓冲液(NEB)、2μl PCR核苷酸混合物(10mM each)、3μl Bst DNA聚合酶[Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌，长片段(8U/μl)](NEB)，共50μl。振荡并在50℃进行填缺反应15分钟。用QIAquick柱子纯化。在室温中加52μl EB缓冲液洗脱。用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Invitrogen)定量提取的DNA。需要至少100ngDNA来进行前期准备。如果超过了100ng，剩下的DNA可以用于后续环化并可在4℃保存。如果不足100ng，最好从头制备DNA。
7、DNA环化，去除未环化DNA
将1.54g 1，4-二硫苏糖醇(DTT，Sigma))溶于10ml水中，过滤，制备1M DTT储存液。取100ng已填缺DNA并加水至80ml。在0.2mlPCR管中，按顺序加入以下试剂：10μl 10x Cre缓冲液(NEB)、80μl已填缺DNA(100ng)、10μl Cre重组酶(1U/μl)(NEB)，总共100μl。振荡，在PCR仪上运行保温程序：37℃30分钟-70℃10分钟-4℃保存。
从1M DTT储存液中制备新鲜的100mM DTT稀释液。振荡并于冰上存放。18μl水、2μl DTT(1M)，共20μl。加1.1μl DTT(100mM)，振荡并快速离心，向样品中加入以下试剂：1.1μl ATP(100mM)、5μl Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase(10U/μl)(Epicentre)、3μl核酸外切酶I(20U/μl)(NEB)，振荡，37℃保温30分钟，加8μl Carrier DNA，振荡，用QIAquick柱子纯化环化DNA，室温下用100μl Tris-HCl洗脱。
8、环化DNA片段化(雾化法)为300-800bp的大小
将5.31ml甘油，0.37ml pH7.5的1M Tris-HCl，0.11ml 0.5M EDTA和4.21ml水混合，制备雾化缓冲液；加入500μl雾化缓冲液到雾化器(杯子)底部。将样品加入雾化器的雾化缓冲液中，混匀。
将有孔橡皮塞塞入雾化器头，将微孔过滤器塞入橡皮塞孔中；穿戴无菌手套，将雾化冷凝管插入吸气管中；为确保使用正常，将冷凝管插到底并且不要扭转吸气管；将杯子和雾化器拧紧，并将雾化器管(在雾化器上)一端与雾化器进气口相连；将雾化器移至外部通风橱中；将雾化器一端与氮气罐连接。
经雾化器，通入30psi(2.1bar)氮气2分钟，雾化DNA；雾化后，关闭氮气；拔下雾化器和氮气罐的管子；打开杯子并从杯子底部取出尽可能更多的样品；小心旋开雾化器头并测量雾化的样品体积，回收的样品应多于300μl；向雾化杯中加入2.4ml Qiagen PBI缓冲液，旋转收集样品液体并混匀；用一个QIAquick柱子纯化雾化后的DNA：a.过柱四次(每次750μl)，前三次每次离心15秒，最后一次离心1分钟；b.在室温下，用16μl Tris-HCl洗脱；将16μl样品转移至200l PCR管中。
9、片段末端补平，在3’端加上腺嘌呤A；
在1.7ml离心管中准备末端补平混合液：2.5μl 10xPNK缓冲液、2.5μl ATP、1μl dNTP、1μl T4聚合酶、1μl T4 PNK、1μl Taq聚合酶，共9μl体积。用移液枪上下混匀，并向DNA样品中加入9μl末端补平混合液；振荡5秒，在迷你离心机上离心2秒；按以下程序在PCR仪(ABI 9700)中进行末端补平：25℃ 20分钟；72℃ 20分钟；4℃保存。用QIAquick柱子纯化环化DNA；室温下用50μlTris-HCl洗脱。
10、文库固定
通过混匀5.9ml水，4.0ml的5M NaCl和0.1ml的100x TE，制备2x文库结合缓冲液。向全新的离心管中加入25μl Dynal M 270链霉素抗生物素蛋白磁珠；用磁力架使磁珠聚集并移除缓冲液；在磁力架上，分别用50μl 2x文库结合缓冲液清洗磁珠两次；加入50μl 2x文库结合缓冲液中使磁珠悬浮；加入50μl Dynal M270链霉素抗生物素蛋白磁珠和50μl片段化补平后的DNA；充分振荡并在室温下放置在试管旋转仪上15分钟；在磁力架上，用500μl TE缓冲液清洗固定文库3次，每次清洗前要充分振荡；除尽剩余的TE缓冲液，将管子从磁力架上取下。
11、连接带有标签序列的Y型接头
如图4所示，为带有标签序列的Y型接头序列，其中(N)n为标签序列，n为6-10的整数，在该实施例中，使用的标签序列为ACACGACGAC；标签序列为互补序列，p是磷酸基团。5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3′，5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3′为扩增引物。
在一个离心管中，按顺序加入一下试剂并振荡：15μl水、25μl快速连接酶缓冲液(2xConc.)、5μl带有标签序列的Y型接头(20μM)，共45μl连接混合液。在含有步骤11得到的固定文库的试管中加入45μl连接混合液。振荡使磁珠悬浮；加入5μl快速连接酶；振荡并在室温中放置与试管旋转仪上15分钟；在磁力架上，用500μl 1×TE缓冲液清洗磁珠3次；除尽剩余的TE缓冲液并将试管从磁力架上取下。
12、文库扩增
在200μl薄壁PCR管中，按顺序加入一下试剂：22.5μl水、5.0μl 5xGC-RICH反应缓冲液、6.0μl MgCl2(25mM)、2.0μl PCR核苷酸混合液(每种10mM)、10.0μl步骤12得到的双末端文库的磁珠悬浮液、2.5μl GC-RICH酶混合液(2U/μl)，总共50.0μl。振荡。
在PCR仪中进行以下步骤：热启动(1x)：94℃3分钟；扩增(10x)：94℃60秒、60℃60秒、72℃60秒；延伸(1x)：72℃60秒；保存：4℃。使用阴性扩增对照。
13、最终文库筛选
向50μl扩增反应物(步骤12得到的产物)中加入52μl Tris-HCl，最终总体积略高于100μl；振荡后将100μl扩增混合物移至一个新离心管中；根据已校准PEcutoff值的AMPure磁珠，向管中加入60μl AMPure磁珠；振荡；室温下保温静置5分钟；试管放置在磁力架上，使里面磁珠在管壁聚集；将上清液移入新的离心管中，确保上清液体积等于160μl，如需要，加Tris-HCl定容；向移入的上清液中加100μl Tris-HCl；在试管中加入80μl AMPure磁珠；振荡；室温下保温静置5分钟；试管放置在磁力架上，使里面磁珠在管壁聚集；清洗中将离心管放置在磁力架上；移去上清液并用500μl 70％乙醇清洗磁珠2次，每次静置30秒；移除上清液并将AMPure磁珠在37℃中风干2分钟；磁珠风干程度以磁珠堆出现可见缝隙为好，不要过度风干；将试管从磁力架上取下，加入50μlTris-HCl，振荡并使磁珠悬浮；这是将双末端文库从AMPure磁珠上洗脱出来；试管放置在磁力架上，使里面磁珠在管壁聚集；将上清液移至新试管中，得到双链的双末端文库，即可用于高通量454测序。

Claims (7)

1.一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将DNA片段化；
(2)将片段化后的DNA末端补平；
(3)将末端补平的DNA与带有生物素的环化接头连接，去除接头自连的片段；所述环化接头的序列为：
5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′
3′-TATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATA-5′
(4)填补缺口，将DNA片段环化，切除未环化的DNA片段；
(5)将DNA片段化为300-800bp的大小；
(6)补平300-800bp的DNA片段末端，在DNA片段的3’端加上腺嘌呤；
(7)通过链霉素抗生物素蛋白磁珠固定带有生物素的DNA片段，再连接Y型接头；所述Y型接头为：
5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACGACT(N)nT-3′
3′-GGATAGGGGACACACGGAACAGATAGGGGACAACGCACAGGCTGCTGA(N)np-5′
其中，(N))n为标签序列，n为6-10的整数；
(8)利用Y型接头的扩增引物，即5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3′，5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3′PCR扩增步骤(7)的DNA片段；
(9)筛选大小为400-700bp的片段；即得所需的双末端文库。
2.根据权利要求1所述的用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中将DNA片段化为3kb大小。
3.根据权利要求1所述的用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中利用Cre重组酶将片段环化，利用核酸外切酶I切除未环化的DNA片段。
4.根据权利要求1所述的用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中通过雾化法将DNA片段化。
5.根据权利要求1所述的用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中通过taq聚合酶在DNA片段的3’端加上腺嘌呤。
6.根据权利要求1所述的用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中通过T4连接酶连接Y型接头。
7.根据权利要求1所述的用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，所述标签序列(N)n为ACACGACGAC或ACACGTAGTA。
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