CN101033484B - 基于纳米微珠在单管内完成核酸提取、扩增和检测的方法 - Google Patents

Abstract

基于纳米微珠在单管内完成核酸提取、扩增和检测的方法本发明涉及核酸检测领域。发明公开了一种以纳米微珠为平台、可在单个反应管中完成核酸提取、扩增和检测的方法，其目的是将核酸提取、扩增和检测整合为一个连续的过程，从而实现所提取的核酸无损失地参与扩增和检测，并且便于进行高通量的核酸检测实验。技术方案包括：将待测样品中的核酸释放并与纳米微珠混合；如果样品中存在核酸，则核酸与纳米微珠形成核酸-纳米微珠复合物；将核酸-纳米微珠复合物与其他成分分离；所述被分离的核酸-纳米微珠复合物全部直接用于核酸的实时扩增检测系统进行靶核酸检测，以明确样品中是否存在特定的核酸序列并可确定其浓度。本方法可用于临床医学、法医学、考古学等涉及生物诊断的领域以及生命科学的基础研究。

Description

基于纳米微珠在单管内完成核酸提取、扩增和检测的方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地说，涉及一种通过分离纯化样品中的核酸成分，然后对其进行体外特异性扩增和实时检测，以明确样品中是否存在靶核酸并可确定其浓度的方法。 

背景技术

在医学和生物学领域中经常遇到的一个问题是要确认在某个样品(例如献血者的血液或取自患者的血液或体液样品)中是否存在与某种疾病病原体相应的靶核酸并测定该靶核酸的浓度。但是样品中的靶核酸常常是微量、并且与多种其它核酸序列同时存在于待测样品中，使得无法直接检测样品中的靶核酸。目前解决这类问题的一个常用方法是通过核酸体外特异性扩增增加靶核酸序列的拷贝数，然后检测扩增产物及浓度，以间接判定样品中该靶核酸是否存在及其原始浓度。进行特异性扩增的序列可以是靶核酸的全长，也可以是靶核酸的部分片段。在对样品中的核酸进行特异性扩增之前，另一个必须面对的问题是，待测样品几乎是无一例外地还包含有除核酸以外的其它物质(例如蛋白质、脂类物质等)，这些物质的存在将严重影响到核酸体外扩增的效率甚至导致扩增失败，所以必须将样品中的核酸与其它物质分离才能对其进行特异性扩增。因此，通过核酸特异性扩增来测定样品中是否存在靶核酸序列并确定其浓度的检测实验实际上包括了三个主要步骤：核酸的提取——即核酸的分离纯化、靶核酸的体外特异性扩增、以及扩增产物的检测。作为重要的分子生物学方法，由核酸的提取、靶核酸的体外特异性扩增、及扩增产物的检测所组成的核酸扩增检测技术是临床诊断(如传染病、遗传病和各种类型的癌症)的重要手段，也常常应用于其他领域，例如法医学、考古学、以及生命科学的基础研究等。 

实际上，核酸的扩增检测在传统上也正是按照上述三个步骤(即核酸提取、靶核酸体外特异性扩增、以及扩增产物的检测)依次、分开进行的，如此存在着一些显著的缺点：①开放操作多、易污染，包括外源核酸污染、样品交叉污染、以及核酸酶污染等；②易引起核酸损失导致检测的敏感性降低：包括核酸分离和纯化操作所引起的核酸的损失、以及分离纯化所回收的核酸不能完全用于后续的扩增检测；③“终点”测量直接影响了定量的准确性；④实验周期长，手工操作多，从而不能有效降低检测成本；⑤因为影响因素多而导致实验的重复性差。这些缺点直接影响到结果的可靠性和准确性，同时也造成在临床上难以进行高通量的检测。 

近年来，核酸提取、体外特异性扩增、以及核酸的检测在各自领域陆续出现了许多新技术和新方法，尤其是将核酸的体外特异性扩增与实时检测扩增产物相结合的核酸实时扩增检测技术发展迅速，例如实时荧光定量PCR已经在基础研究和临床诊断中得到了广泛的应用。 

核酸实时扩增检测技术实现了将核酸的体外特异性扩增和扩增产物的检测整合为一个反应体系，使特异性扩增和扩增产物的检测得以在单个反应管中完成，减少了开放操作步骤和实验周期，很大程度上降低了污染的几率，检测结果的特异性也因为受特异性扩增和扩增产物检测的双重控制而显著提高，并且定量原理更为精确。但是目前的核酸提取技术还未能与核酸的特异性扩增、扩增产物的检测相整合，随着核酸实时扩增检测技术的迅速发展，核酸提取与核酸实时扩增检测的脱节已逐渐成为制约实验灵敏度、准确性、以及高通量测试的瓶颈。 

核酸提取即核酸的分离纯化过程，其目的是指将核酸与其它物质如蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开。核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，可用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法将核酸分离、纯化。经典的核酸提取方法是酚/氯仿提取法，适用于大多数生物样本，目前在基础科研中仍在被广泛使用，但是该法实验操作时间长，易污染，核酸提取的效率和质量差异较大，因此在样本数量较多或者样本所含核酸量较少时此法并不适用。近年来另一类被广泛使用的方法是亲和层析法，亲和层析法利用了核酸与其它生物大分子对分离载体的亲和力的差异来提取核酸。例如玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂，在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到玻璃或硅土、硅胶表面而与其它生物分子分离，结合至固相载体的核酸然后用低盐缓冲液或水洗脱；一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体，磁珠可通过磁场分离而无需离心；另外，还有一些方法是以磁性玻璃微珠为载体，即以磁性材料为核心、以硅材料为包被表面的微珠，载体的表面无须修饰即可与核酸直接结合，同时也能够通过磁场分离载体，如在美国专利6027945、5945525中所公开的方法。目前已有较多的基于上述方法的临床或科研用商品试剂盒，如Promega公司的MagneSil Paramagnetic Particles产品，生物梅里埃(Biomerieux)公司的NucliSens miniMAG产品以及QIAGEN公司的MagAttract系列试剂盒。这些方法具有分离和纯化同步进行，核酸提取效率高，操作相对简单的优点，但是最终都需要一个洗脱的步骤将核酸与固相载体分离，然后转移至扩增和检测系统，洗脱和转移是导致核酸提取与核酸实时扩增检测相脱节——即不能在单管中连续地完成核酸的提取、靶核酸的体外 特异性扩增、以及扩增产物检测的原因，其主要的不利影响有： 

i.利用固相载体通过亲和层析法提取待测样本中的核酸，在分离和纯化过程中引 起的核酸损失较小，核酸提取效率高，但是洗脱不彻底和转移操作将无可避免 地造成核酸的损失，导致分离纯化后的核酸并不能完全回收用于后续的扩增检 测，造成整个实验的检测灵敏度降低、以及不同样本间或相同样本重复实验时 因洗脱效率的误差而导致检测误差。例如在美国专利6027945中所公开的方法， 详细阐述了洗脱效率为“至少60％”，即检测效率因为洗脱不彻底可降低至 60％。 

ii.为了提高洗脱效率，需要用较大体积的低盐缓冲液或水洗脱，与后续的扩增检 测实验对待测核酸溶液的体积要求不能很好地衔接，因此常常是取洗脱液的部 分而不是全部进行扩增检测。例如常用的标准方案是用50μl洗脱缓冲液洗脱， 而仅取其中的5μl进行扩增检测。如此可同样导致分离纯化后的核酸并没有完 全用于扩增检测。 

iii.洗脱和转移步骤不利于进一步缩短实验周期和进行多样本的并行检测；同时开 放式操作成为整个实验过程中最容易受到污染的环节。 

分离纯化后的核酸不能完全用于扩增检测而引起的待测核酸的损失，其影响对于靶核酸仅微量存在的样本尤为突出，例如临床上检测病原体的早期感染；而洗脱和转移这一较为费时的开放式操作也是制约实验能够高通量进行的限速环节。因此，如何快速简便地从待测样品中提取核酸，将其与核酸实时扩增检测技术整合为一个连续的过程，实现在单个反应管中完成核酸的分离纯化、并且分离纯化后的核酸无损失地参与靶核酸的特异性扩增和检测，是目前核酸扩增检测领域一个亟待解决的问题。 

发明内容

本发明的目的在于，提供一种可在单个反应管中完成核酸提取、扩增和检测的方法；同时在所述的单个反应管中，所提取的核酸无损失地参与扩增和检测。 

为了此目的，本发明提供一种以纳米微珠为平台的核酸分离、扩增和检测方法，该方法包括：①将含有或可能含有核酸的样品经化学或物理等方法处理后，使核酸释放并与纳米微珠混合；②如果所述样品中存在核酸，则核酸与纳米微珠形成核酸-纳米微珠复合物；③通过离心、或磁力、或抽滤将核酸-纳米微珠复合物与其他成分分离；④将所述被分离的核酸-纳米微珠复合物不经洗脱、全部直接用于核酸实时扩增检测系统进行靶核酸的特异性扩增和扩增产物的实时检测，以明确所测样品中是否存在特定的核酸序列并可确定其浓度。 

纳米粒子具有小尺寸效应、量子尺寸效应、界面与表面效应、以及宏观量子隧道效应等特性，因此粒子的光、磁、电、热、力以及化学活性等性质与本体物质有显著差异，表现出许多优异的性能和全新的功能。纳米粒子由于粒径很小，具有大量的自由表面，使得纳米粒子具有较高的胶体稳定性和优异的吸附性能，并能较快地达到吸附平衡，因此纳米聚合物粒子可以直接用于生物物质的吸附分离。近年来，纳米微珠也开始被用于核酸提取，并通过使用不同的材料、结构设计、表面修饰等方法发展出一些各具特色的以纳米微珠为吸附载体的核酸提取技术，例如在CN02139817.8、CN02114158.4、WO2003/089906等专利中均有详细的描述。 

值得注意的是，陆续有研究报道蛋白质吸附于纳米粒子时并不会象吸附在本体块上那样发生变性，相反地酶活性能够得到很好的保存(J Am ChemSoc.1996；118(5)：1154-1157.Biotechnol Bioeng.1992；40：483-490.)；而将酶固化在纳米玻璃微珠上可使酶活性和稳定性显著增加(Chem Commun(Camb).2004；(13)：1528-9.Analyst.2001；126(8)：1274-8.)。本发明采用了纳米微珠作为分离核酸的吸附载体，被吸附的核酸不需洗脱即作为扩增和实时检测的模板，如此可实现在单个反应管中完成核酸提取、扩增和检测，同时实现了在所述的单个反应管中，所提取的核酸被无损失地用于扩增和检测；作为吸附载体，纳米微珠不但不影响靶核酸的特异性扩增和实时检测，还能够促进实时扩增和检测的效率。 

所述简单而且快速的方法可以在诊断分析和科学研究中使用，与传统的方法相比具有下述主要优点： 

1)可在单个反应管中完成核酸提取、扩增和检测，简化了操作步骤，缩短了实 验周期，也便于实现多个样品的并行检测； 

2)无需将核酸从核酸-纳米微珠复合物上洗脱，可避免传统方法因洗脱和转移所 引起的核酸不能完全回收、以及所回收的核酸不能完全用于扩增检测的缺点， 使分离纯化后的核酸能够全部参与扩增和检测，因此提高了检测的敏感性； 

3)无需将核酸从核酸-纳米微珠复合物上洗脱，可避免样本间因洗脱、转移效率 的误差所引起的检测误差，使检测结果具有更好的可比性和重复性； 

4)无需将核酸从核酸-纳米微珠复合物上洗脱，可显著降低转移核酸这一开放操 作引起样品污染的可能性——包括外源核酸污染、样品交叉污染、以及核酸 酶的污染； 

5)以纳米微珠作为核酸的吸附载体具有巨大的比表面积，核酸提取的效率高； 

6)在核酸的扩增和实时检测过程中，纳米微珠的存在能够提高扩增检测的效率； 

7)将核酸的分离、扩增和实时检测整合为一个连续的系统，如果采用磁性分离 或抽滤来替代核酸提取过程中的离心分离操作，可实现整个分析过程的自动 化，配合多个样品的并行检测，能够进行高通量检测实验。 

具体实施方式

除非另外说明，此处所使用的科学和技术术语与本发明所属领域中任何普通技术人员的一般理解相同。 

I.基于纳米微珠在单管内完成核酸提取、扩增和检测的方法 

本发明提供一种以纳米微珠为平台的、可在单个反应管中完成核酸提取、扩增和检测的方法，同时实现了在所述的单个反应管中，所提取的核酸被无损失地用于扩增和检测。该方法包括： 

1)将含有或可能含有核酸的样品经化学或物理等方法处理后使核酸释放并与纳 米微珠混合； 

2)如果所述样品中存在核酸，则核酸与纳米微珠形成核酸-纳米微珠复合物； 

3)通过离心、或磁力、或抽滤将核酸-纳米微珠复合物与其他成分分离； 

4)将所述被分离的核酸-纳米微珠复合物不经洗脱、全部直接用于核酸实时扩增 检测系统进行靶核酸的特异性扩增和扩增产物的实时检测，以明确所测样品 中是否存在特定的核酸序列并可确定其浓度。 

本方法可以被用来从任何合适的样品中检测靶核酸。代表性样品包括但不局限于临床样品(如血清、血浆、全血、唾液、尿液、组织和细胞培养物等)、动物细胞、植物细胞、病毒、细菌、真菌等。靶核酸包括DNA及其衍生物、RNA及其衍生物、或者DNA及其衍生物与RNA及其衍生物的混合物。 

可以用任何合适的物理或化学方法使核酸释放，代表性的物理方法包括但不局限于超声裂解、低渗裂解、冻融裂解等通过机械力使细胞破碎的方法，代表性的化学方法包括但不局限于在一定的pH环境下加入表面活性剂(SDS、Triton X-100、Tween 20等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍等)。 

可以用任何合适的方法来制备纳米微珠，或者是能够直接获得的商品。所述纳米微珠的直径在1nm～10000nm之间，优选直径在10nm～1000nm之间。在形成核酸-纳米微珠复合物后，可以对所述的核酸-纳米微珠复合物进行必要的洗涤以去处残留的不合要求的成分。 

本方法可以选用磁性纳米微珠，也可以选用非磁性纳米微珠。磁性纳米微珠是指能够在外加磁场的作用下产生磁性，可通过磁力作用与反应体系的其他组分分离的纳 米微珠。 

本方法所选用的磁性纳米微珠和非磁性纳米微珠，其表面均是由任何能够与核酸非特异或者特异结合的材料制成，代表性的材料包括但不局限于氧化硅及其衍生物。磁性纳米微珠为核壳式结构的纳米微珠：由能够直接或间接与核酸结合的材料组成微珠的壳层，由磁性材料组成微珠的核层。代表性的磁性材料包括但不局限于顺磁物质、铁磁物质和亚铁磁物质。 

本方法可根据具体的实施条件选择人工操作或者是自动化进行实验。如果具备相关的设备，采用磁性纳米微珠或者将纳米微珠固化或吸附在反应管内的滤膜或隔膜上，相应地，可通过磁性分离或者抽滤代替离心进行有关的分离操作，使整个实验过程的任何步骤都可以程序化自动进行，例如此方法结合生物芯片设备可建立自动化核酸芯片检测系统。在不具备相关设备的情况下，本方法也可通过人工操作完成。此外，磁性分离替代离心操作实也可通过人工操作完成。自动化分析和手工操作这两种模式的检测效率的在敏感性和准确性方面是一致的，自动化操作更有利于进行高通量检测。 

本方法能够在单个反应管中完成核酸提取、扩增和检测整个实验过程，所述的单个反应管是指对应于一个待测样品进行一次检测所需要的独立实验单元，可以是一个独立的反应管如一个PCR薄壁管，也可以是多孔板如96孔板中的一个孔。在单个反应管中完成整个实验过程便于实现多个样品的并行检测，配合自动化操作可进行高通量的检测实验。 

可以用任何合适的方法扩增和实时检测所述的核酸-纳米微珠复合物中是否存在靶核酸。核酸特异性扩增的方法包括但不局限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)等。核酸的特异性扩增与实时检测相结合的代表性方法包括但不局限于荧光实时定量PCR、实时NASBA(基于核酸序列的扩增(NASBA)与分子信标(Molecular Beacon)相结合的核酸实时等温扩增检测技术)等。 

本方法要求的温度主要取决于形成核酸-纳米微珠复合物之后所采用的核酸扩增和实时检测的方法。例如用荧光实时定量PCR进行扩增和检测，扩增和检测过程需要温度循环；如果用实时NASBA进行扩增和检测，则扩增和检测过程需要控制在41℃±1℃进行。从样本提取核酸并形成核酸-纳米微珠复合物的过程可以在室温下进行。 

本方法可以用任何合适的样品体积进行。 

II.代表性实施方案 

通过裂解待测样品中的细胞(如病毒、细菌、哺乳动物细胞等)，释放出核酸被纳米微珠吸附形成核酸-纳米微珠复合物，离心或通过磁力或抽滤将核酸-纳米微珠复合物与其它成分分离，通过进一步的洗涤去处残余的不必要的组分后，将所获得的核酸-纳米微珠复合物直接与靶核酸的扩增和实时检测反应体系混合，进行靶核酸的特异性扩增和扩增产物的实时检测。 

实施方案的一个重要方面是采用纳米微珠作为分离核酸的载体，在形成核酸-纳米微珠复合物后直接将复合物用于扩增和检测，而无须如传统方法那样要先通过洗脱步骤使核酸从核酸-纳米复合物中释放出来、再对核酸进行扩增检测，如此就实现了在一个反应管中完成核酸的提取、扩增和检测，并且反应体系中的纳米微珠能够促进核酸的特异性扩增和检测的效率。 

操作程序如下： 

1)纳米微珠，保存于无核酸酶的超纯水中； 

2)将少量纳米微珠与待测样品、提取核酸所用的裂解缓冲液混合，用振荡器充 分振荡、混匀，使核酸释放并与纳米微珠结合，形成核酸-纳米微珠复合物； 

3)离心或利用磁场、或抽滤分离核酸-纳米微珠复合物，弃去上清液，冲洗核酸 -纳米微珠复合物； 

4)冲洗后的核酸-纳米微珠复合物经风干后加入核酸扩增和检测体系的反应组 分进行扩增和实时检测。 

实施例一：利用纳米玻璃微珠在单管内扩增检测人血清HIV-1 RNA 

反应在200μl PCR薄壁管(RNase Free)中进行，采用多孔纳米玻璃微珠作为核酸分离纯化载体，酶标仪中进行靶核酸的特异性扩增和扩增产物的实时检测，核酸的实时扩增检测方法参照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)：2150-2155.)。 

样本为血清学检测已确认的HIV-1感染者的血清以及无HIV-1感染的正常人血清。每个待测样本取100μl血清，在PCR薄壁管中与裂解液(5M异硫氰酸胍，0.1MTris·HCl(pH6.4)，1％Triton X-100)60μl充分混匀，然后加入纳米玻璃微珠(400mg/mlH2O)2.5μl，充分震荡混匀，室温静置10min后离心(12000rpm，1min)，弃上清。洗涤缓冲液I(5M异硫氰酸胍，0.1M Tris·HCl(pH6.4))和洗涤缓冲液II(75％乙醇)依次冲洗微珠各2次。冲洗结束弃上清后，加入超纯水(RNase Free)5μl，与预先准 备好的实时扩增检测的反应体系(10μl)混合。65℃孵育5 min后再于41℃孵育5 min，加入5μl酶混合液后置于酶标仪进行恒温(41℃)扩增检测，仪器设定每分钟检测1次荧光信号的变化，反应持续90分钟。 

反应体系的组成参照(NucleicAcids Res.1998；26(9)：2150-2155.)，各组分及终浓度如下：Tris-HCl(40mM，pH 8.5)，MgCl₂(12mM)，KCl(70mM)，DTT(0.5 mM)，dNTP(各1mM)，ATP/UTP/CTP(各2mM)，GTP(1.5 mM以及ITP(0.5mM)，引物1和引物2各1μM，探针50nM。引物和设计参照(J Clin Microbiol.2001；39(4)：1378-1384.)，序列如下：引物1(5′-aattctaatacgactcactatagggagagGGGCGCCACTGCTAGAGA)，  引物  2(5′-CTCAATAAAGCTTGCCTTGA)，探针(5′-FAM-cgtacgagtagtgtgtgcccgtctgtcgtacg-DABCYL)。 

酶混合液的组成亦参照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)：2150-2155.)，成份如下：山梨醇(375 mM)，BSA(2.1μg)，RNase H(0.08 U)，T7 RNA聚合米(32U)以及AMV反转录酶(6.4U)。 

实施例二：利用磁性纳米玻璃微珠在单管内扩增检测人血清HIV-1 RNA 

反应在可进行荧光检测的96孔酶标板中进行，采用磁性纳米玻璃微珠作为核酸分离纯化载体，酶标仪中进行靶核酸的特异性扩增和扩增产物的实时检测，核酸的实时扩增检测方法参照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)：2150-2155.)。 

样本为血清学检测已确认的HIV-1感染者的血清以及无HIV-1感染的正常人血清。每个待测样本取100μl血清，在酶标板的反应孔中与裂解液(5M异硫氰酸胍，0.1M Tris·HCl(pH6.4)，1％Triton X-100)60μl充分混匀，然后加入磁性纳米玻璃微珠(400mg/ml H₂O)2.5μl，轻柔振摇10min后，磁性分离器上固定微珠，弃上清。洗涤缓冲液I(5M异硫氰酸胍，0.1MTris·HCl(pH6.4))和洗涤缓冲液II(75％乙醇)依次冲洗微珠各2次。冲洗结束弃上清后，加入超纯水(RNase Free)5μl，与预先准备好的实时扩增检测的反应体系(10μl)混合。65℃孵育5 min后再于41℃孵育5 min，加入5μl酶混合液后置于酶标仪进行恒温(41℃)扩增检测，仪器设定每分钟检测1次荧光信号的变化，反应持续90分钟。 

反应体系的组成参照(NucleicAcids Res.1998；26(9)：2150-2155.)，各组分及终浓度如下：Tris-HCl(40mM，pH 8.5)，MgCl₂(12mM)，KCl(70mM)，DTT(0.5 mM)，dNTP(各1mM)，ATP/UTP/CTP(各2mM)，GTP(1.5 mM以及ITP(0.5mM)，引 物1和引物2各1μM，探针50nM。引物和设计参照(J Clin Microbiol.2001；39(4)：1378-1384.)，序列如下：引物1(5′-aattctaatacgactcactatagggagagGGGCGCCACTGCTAGAGA)，引物2(5′-CTCAATAAAGCTTGCCTTGA)，探针(5′-FAM-cgtacgagtagtgtgtgcccgtctgtcgtacg-DABCYL)。 

酶混合液的组成亦参照(NucleicAcids Res.1998；26(9)：2150-2155.)，成份如下：山梨醇(375 mM)，BSA(2.1μg)，RNase H(0.08 U)，T7 RNA聚合米(32 U)以及AMV反转录酶(6.4U)。 

Claims (36)

1.一种基于纳米微珠、能够在单个反应管内完成核酸提取、扩增和检测全部过程的方法；同时在所述的单个反应管中，所提取的核酸无损失地参与扩增和检测，该方法包括：将含有或可能含有核酸的样品经化学或物理方法处理后，使核酸释放并与纳米微珠混合；如果所述样品中存在核酸，则核酸与纳米微珠形成核酸-纳米微珠复合物；通过离心、或磁力、或抽滤将核酸-纳米微珠复合物与其他成分分离；所述被分离的核酸-纳米微珠复合物不经洗脱、全部直接用于核酸实时扩增检测系统进行靶核酸的特异性扩增和扩增产物的实时检测，以明确所测样品中是否存在特定的核酸序列并可确定其浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法能够在单个反应管中完成核酸的提取、靶核酸的特异性扩增、以及扩增产物检测的全部过程。

3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的单个反应管是指对应于一个样品进行一次检测所需要的独立实验单元，是一个独立的反应管或多孔板中的一个孔。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，能够在单个反应管中完成核酸的提取、靶核酸的特异性扩增、以及扩增产物检测的全部过程，当利用多个所述单反应管时就便于实现多样本的并行检测。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法在核酸与纳米微珠形成核酸-纳米微珠复合物后，无须将核酸从核酸-纳米微珠复合物上洗脱、转移或分离，核酸及其纳米微珠载体以复合物的形式全部直接进入核酸的特异性扩增和实时检测。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述核酸-纳米微珠复合物全部直接用于核酸实时扩增检测系统时，核酸在扩增和实时检测过程中的存在形式是仍旧吸附在纳米微珠上，或者是与纳米微珠分离而游离于反应体系中。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的整个实验过程在自动化设备上完成，或者通过手工操作完成。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是指任何可能含有可用本方法分离、扩增和检测的靶核酸的物质。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述靶核酸是DNA或RNA，或者DNA与RNA的混合物。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠其表面由任何能够与核酸非特异或者特异结合的材料制成。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠是磁性纳米微珠或者非磁性纳米微珠。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述磁性纳米微珠是指能够在外加磁场的作用下产生磁性，可通过磁力作用与反应体系其他组分分离的纳米微珠。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述磁性纳米微珠为核壳式结构的纳米微珠：由磁性材料组成微珠的核层，由能够直接或间接与核酸结合的材料组成微珠的壳层。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，如果采用磁性纳米微珠，以磁性分离代替离心便于使整个实验过程自动化进行。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠的直径在1nm～10000nm之间。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠的的几何形状是规则的或是不规则的。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠的表面是光滑的，或者是具有许多微孔的。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述表面具有微孔的纳米微珠，其微孔贯穿纳米微珠而形成孔道，或者是不贯穿微珠的微孔。

19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述组成磁性纳米微珠核层的磁性材料为可磁化物质。

20. 如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述可磁化物质由纳米级的金属组合物组成。

21. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠其表面能够根据具体需要进行必要的修饰或标记。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠是悬浮在反应管中的。

23. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠是固化在反应管内壁的，反应管内壁是规则光滑的，或是不规则不光滑的。

24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠是固化或吸附在反应管内的滤膜或隔膜上的。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，如果采用滤膜或隔膜固化或吸附纳米微珠，用抽滤分离代替离心或磁力进行分离操作，便于使整个实验过程自动化进行。

26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠是使用任何合适的方法自行制备而成的，或者是能够直接获得的商品。

27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的确定样品中靶核酸浓度的方法取决于核酸实时扩增检测系统所采用的定量检测方法。

28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸实时扩增检测系统是任何一种核酸特异性扩增和实时检测方法。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的核酸特异性扩增是需要温度循环的核酸扩增方法，或者是核酸的等温扩增方法。

30.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述独立的反应管为PCR 薄壁管，所述多孔板为96孔板。

31.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述纳米微珠的直径在10nm～1000nm之间。

32.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述可磁化物质为顺磁物质、铁磁物质或亚铁磁物质。

33.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述可磁化物质为铁的氧化物、钴的氧化物或镍的氧化物。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述可磁化物质由纳米级的金属组合物组成。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述可磁化物质为铁的氧化物、钴的氧化物或镍的氧化物。 

36.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述的核酸特异性扩增为聚合酶链式反应（PCR）、连接酶链式反应（LCR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、转录介导的扩增（TMA）、环介导的等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）或链置换扩增（SDA）。