CN107058585B - 一种核酸杂交检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸检测方法，特别涉及一种核酸杂交检测方法，属于生物技术领域。本发明建立了一种新的核酸物质检测方法，通过该方法的建立扩大核酸检测产品在医疗、科研、食品安全等领域的使用范围。本发明方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现目标核酸的捕获和检测。相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，且具有稳定性好，成本低，检测速度快，对环境要求低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸检测方法，特别涉及一种核酸杂交检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
目前主流的核酸检测技术有基因测序、基因芯片、聚合酶链式反应等，以及基于非靶标物质扩增的技术，例如基于抗体捕获的第二代杂交捕获技术(德国凯杰公司的HC2)，基于RNA逆转录的核酸序列扩增技术(美国豪洛捷)，基于支链DNA信号放大的快速捕获杂交技术(科蒂亚生物)等。但目前的各种方法均存在各种不足，如基因测序成本居高不下，基因芯片操作复杂、检测灵敏度低，聚合酶链式反应对实验室要求高等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸杂交检测方法，该方法可以快速捕获杂交目标核酸。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种核酸杂交检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)根据目标核酸的序列设计捕获核酸序列、结合核酸序列、检测核酸序列和信号核酸序列，其中捕获核酸序列5’端进行氨基修饰，信号核酸序列5’标记信号基团；
(2)将捕获核酸序列固定到基质上；
(3)将结合核酸序列和检测核酸序列固定到微球上；
(4)通过核酸杂交反应，捕获核酸序列和待测目标核酸结合；
(5)通过核酸杂交反应，固定在微球上的结合核酸序列和待测目标核酸结合；
(6)通过核酸杂交反应，标记了信号基团的信号核酸序列和固定在微球上的检测核酸序列结合；
(7)通过检测信号基团是否存在来判断待测的样本中是否含有目标核酸。
本发明建立了一种新的核酸物质检测方法，通过该方法的建立扩大核酸检测产品在医疗、科研、食品安全等领域的使用范围。本发明方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现目标核酸的捕获和检测。
作为优选，所述的微球是聚苯乙烯(PS)、交联聚苯乙烯/聚二乙烯基苯(P[S/DVB])、二氧化硅或聚甲基丙烯酸酯(PMMA)微球，微球的直径为50-500nm。本发明采用的微球是表面聚合链霉亲和素的微球。
作为优选，所述捕获核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。
作为优选，所述信号核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。
作为优选，所述基质是微孔板、微球、玻片、硅片或微流体芯片。
作为优选，步骤(3)中，当基质是氨基修饰的微孔板则通过戊二醛固定，当基质是羧基修饰的微球时，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺固定；步骤(4)中，当基质是氨基修饰的微球时通过戊二醛固定，当基质是羧基修饰的微球时，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺固定。
作为优选，捕获核酸序列和信号核酸序列分别针对目标核酸的不同片段。
作为优选，所述信号基团选自胶体金、荧光素、化学发光酶、放射性元素或稀土元素。
本发明的有益效果是：本发明通过捕获核酸序列将目标核酸杂交捕获，再经过结合核酸序列、微球、检测核酸序列和信号核酸序列即可实现信号放大，从而检测到目标核酸的信号。相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，且具有稳定性好，成本低，检测速度快，对环境要求低等优点。
附图说明
图1是本发明方法的作用机理示意图；
图中：1基质，2捕获核酸序列，3目标核酸，41微球，42结合核酸序列，43检测核酸序列，51信号核酸序列，52信号基团。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
氨基修饰的聚苯乙烯微球，直径50-500nm，购自上海羧菲生物医药科技有限公司；
氨基修饰的微孔板，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
实施例1：
1.如图1所示的一种核酸杂交检测方法，该方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现待测目标核酸的捕获和检测。具体过程如下：
根据目标核酸3的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT(SEQ ID No.1)，设计捕获核酸序列2并修饰氨基：NH2-(CH2)6-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG(SEQ ID No.2)；
设计结合核酸序列42和检测核酸序列43，结合核酸序列42和检测核酸序列43的核苷酸序列相同，并修饰氨基：GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT-(CH2)6-NH2(SEQ ID No.3)。结合核酸序列用于与待测目标核酸结合，检测核酸序列用于与标记了信号基团的信号核酸序列结合。
设计信号核酸序列51并修饰FITC基团：AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC(SEQ IDNo.4)；
所述基质1具体为氨基化的微孔板；
所述微球41具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球(直径100nm)；
所述信号基团52为FITC。
2.在氨基化的微孔板的每个孔里加入5％戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；吸出液体，加入100μL 5nmol/L的捕获核酸序列(PBS缓冲液，0.01mol/L,pH 7.2)，37℃反应2h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；此时，捕获核酸序列固定到氨基化的微孔板上。
3.微孔板中每孔加入3％的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL。震荡反应1h，用磷酸缓冲液清洗；
所述预杂交液组成为：
0.5mL甲酰胺，
250μL 20×SSC(氯化钠-柠檬酸钠缓冲液)，
100μL 50×Denhards溶液(聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白5g，定容至500ml)
50μL小牛胸腺DNA，
50μL磷酸缓冲液(PBS，1mol/L,pH7.4)，
50μL乙二胺四乙酸(EDTA，100mmol/L)。
4.取氨基修饰的微球30μL(0.1％固含量)，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5％戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL5nmol/L的结合核酸序列和检测核酸序列(PBS缓冲液，0.01mol/L,pH 7.2)，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了结合核酸序列和检测核酸序列的标记微球。
5.将3％的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步所述的离心管。震荡反应1h，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到标记微球悬浮液。
6.在包被好的微孔板中每孔加入100μL杂交液，根据实验目的加入5μL待测目标核酸，40℃反应30min，弃上清；捕获核酸序列和待测目标核酸结合。
7.在微孔板上再加入100μL标记微球悬浮液，40℃反应30min，弃上清；固定在微球上的结合核酸序列和待测目标核酸结合。
8.在微孔板上加入100μL信号核酸序列(5nmol/L),40℃反应30min，弃上清；标记了信号基团的信号核酸序列和固定在微球上的检测核酸序列结合；
9.荧光分析仪上读取结果。计算检测孔和空白对照孔的比值，如果大于1.5，则表明检测样本中存在目标核酸，如果小于1.5则表面不含目标核酸或目标核酸含量低于检测限。在本实施例中，空白对照值为14345(光子数)，检测值为34925，比值为2.435，表明存在目标核酸，与预期结果一致，证明本方法可以用于实际样本的检测分析。
实施例2：
1.如图1所示的一种核酸杂交检测方法，该方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现待测目标核酸的捕获和检测。具体过程如下：
根据目标核酸3的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT(SEQ ID No.1)，设计捕获核酸序列2并修饰氨基：NH2-(CH2)6-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG(SEQ ID No.2)；
设计结合核酸序列42和检测核酸序列43，结合核酸序列42和检测核酸序列43的核苷酸序列相同，并修饰氨基：GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT-(CH2)6-NH2(SEQ ID No.3)。结合核酸序列用于与待测目标核酸结合，检测核酸序列用于与标记了信号基团的信号核酸序列结合。
设计信号核酸序列51并修饰FITC基团：AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC(SEQ IDNo.4)；
所述基质1具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球(直径100nm)；
所述微球41具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球(直径100nm)；
所述信号基团52为FITC。
2.取氨基修饰的微球30μL(0.1％固含量)，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5％戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL5nmol/L的捕获核酸序列(PBS缓冲液，0.01mol/L,pH 7.2)，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了捕获核酸序列的捕获微球。
3.将3％的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步的离心管。震荡反应1h，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到捕获微球悬浮液。
所述预杂交液组成为：
0.5mL甲酰胺，
250μL 20×SSC(氯化钠-柠檬酸钠缓冲液)，
100μL 50×Denhards溶液(聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白5g，定容至500ml)
50μL小牛胸腺DNA，
50μL磷酸缓冲液(PBS，1mol/L,pH7.4)，
50μL乙二胺四乙酸(EDTA，100mmol/L)。
4.取氨基修饰的微球30μL(0.1％固含量)，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5％戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL5nmol/L的结合核酸序列和检测核酸序列(PBS缓冲液，0.01mol/L,pH 7.2)，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了核酸序列和检测核酸序列的标记微球。
5.将3％的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步的离心管。震荡反应1h，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到标记微球悬浮液。
6.在微孔板中每孔加入100μL捕获微球悬浮液，根据实验目的加入5μL待测目标核酸，40℃反应30min，弃上清；捕获核酸序列和待测目标核酸结合。
7.在微孔板上再加入100μL标记微球悬浮液，40℃反应30min，弃上清；固定在微球上的结合核酸序列和待测目标核酸结合。
8.在微孔板上加入100μL信号核酸序列(5nmol/L),40℃反应30min，弃上清；标记了信号基团的信号核酸序列和固定在微球上的检测核酸序列结合；
9.荧光分析仪上读取结果。计算检测孔和空白对照孔的比值，如果大于1.5，则表明检测样本中存在目标核酸，如果小于1.5则表面不含目标核酸或目标核酸含量低于检测限。在本实施例中，空白对照值为13980(光子数)，检测值为49215，比值为3.52，表明存在目标核酸，与预期结果一致，证明本方法可以用于实际样本的检测分析。
结论：相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，大大降低了对环境的要求，可以使核酸检测广泛应用到各中小医院、社区诊所、临床科室、食品安全检测、疾控中心等。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江殷欣生物技术有限公司
<120> 一种核酸杂交检测方法
<130> ZJYX002
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 60
t 61
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accagaaagc cacggctaac tacg 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcggtaatac gtaggtggca agcgtt 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacgcttgcc acctacgtat taccgc 26
Claims (2)
1.一种核酸杂交检测方法，其特征在于该方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现待测目标核酸的捕获和检测：具体过程如下：
S1、根据目标核酸（3）的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT，序列如SEQ ID No.1所示，设计捕获核酸序列（2）并修饰氨基：NH2-(CH2)6-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG，序列如SEQ ID No.2所示；
设计结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43），结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43）的核苷酸序列相同，并修饰氨基：GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT-(CH2)6-NH2，序列如SEQ IDNo.3所示；结合核酸序列用于与待测目标核酸结合，检测核酸序列用于与标记了信号基团的信号核酸序列结合；.
设计信号核酸序列（51）并修饰FITC基团：AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC，序列如SEQID No.4所示；
所述基质（1）具体为氨基化的微孔板；
所述微球（41）具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球，直径100nm；
所述信号基团（52）为FITC；
S2、在氨基化的微孔板的每个孔里加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；吸出液体，加入100μL5nmol/L的捕获核酸序列，所述捕获核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；此时，捕获核酸序列固定到氨基化的微孔板上；
S3、微孔板中每孔加入3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；
所述预杂交液组成为：
0.5mL甲酰胺，
250μL20×SSC氯化钠-柠檬酸钠缓冲液，
100μL50×Denhards溶液，含有聚蔗糖5g、聚乙烯吡咯烷酮5g、牛血清白蛋白5g、定容至500ml，
50μL小牛胸腺DNA，
50μL PBS，lmol/L，pH7.4，
50μL乙二胺四乙酸EDTA，100mmol/L；
S4、取氨基修饰的微球30μL，0.1%固含量，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL5nmol/L的结合核酸序列和检测核酸序列，所述结合核酸序列和检测核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了结合核酸序列和检测核酸序列的标记微球；
S5、将3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步所述的离心管；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到标记微球悬浮液；
S6、在包被好的微孔板中每孔加入100μL杂交液，根据实验目的加入5μL待测目标核酸，40℃反应30min，弃上清；捕获核酸序列和待测目标核酸结合；
S7、在微孔板上再加入100μL标记微球悬浮液，40℃反应30min，弃上清；固定在微球上的结合核酸序列和待测目标核酸结合；
S8、在微孔板上加入100μL信号核酸序列5nmol/L，40℃反应30min，弃上清；标记了信号基团的信号核酸序列和固定在微球上的检测核酸序列结合；
S9、荧光分析仪上读取结果；计算检测孔和空白对照孔的比值，如果大于1.5，则表明检测样本中存在目标核酸，如果小于1.5则表面不含目标核酸或目标核酸含量低于检测限。
2.一种核酸杂交检测方法，其特征在于该方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现待测目标核酸的捕获和检测：具体过程如下：
S1、根据目标核酸（3）的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT(SEQ ID No.1)，设计捕获核酸序列（2）并修饰氨基：NH2-(CH2)6-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG，序列如SEQ ID No.2所示；
设计结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43），结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43）的核苷酸序列相同，并修饰氨基：GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT-(CH2)6-NH2，序列如SEQ IDNo.3所示；结合核酸序列用于与待测目标核酸结合，检测核酸序列用于与标记了信号基团的信号核酸序列结合；.
设计信号核酸序列（51）并修饰FITC基团：AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC，序列如SEQID No.4所示；
所述基质（1）具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球，直径100nm；
所述微球（41）具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球，直径100nm；
所述信号基团（52）为FITC；
S2、取氨基修饰的微球30μL，0.1%固含量，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL 5nmol/L的捕获核酸序列，所述捕获核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了捕获核酸序列的捕获微球；
S3、将3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步的离心管；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到捕获微球悬浮液；
所述预杂交液组成为：
0.5mL甲酰胺，
250μL20×SSC氯化钠-柠檬酸钠缓冲液，
100μL50×Denhards溶液，含有聚蔗糖5g、聚乙烯吡咯烷酮5g、牛血清白蛋白5g、定容至500ml，
50μL小牛胸腺DNA，
50μL PBS，lmol/L，pH7.4，
50μL乙二胺四乙酸EDTA，100mmol/L；
S4、取氨基修饰的微球30μL，0.1%固含量，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL5nmol/L的结合核酸序列和检测核酸序列，所述结合核酸序列和检测核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了结合核酸序列和检测核酸序列的标记微球；
S5、将3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步的离心管；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到标记微球悬浮液；
S6、在微孔板中每孔加入100μL捕获微球悬浮液，根据实验目的加入5μL待测目标核酸，40℃反应30min，弃上清；捕获核酸序列和待测目标核酸结合；
S7、在微孔板上再加入100μL标记微球悬浮液，40℃反应30min，弃上清；固定在微球上的结合核酸序列和待测目标核酸结合；
S8、在微孔板上加入100μL信号核酸序列5nmol/L，40℃反应30min，弃上清；标记了信号基团的信号核酸序列和固定在微球上的检测核酸序列结合；
S9、荧光分析仪上读取结果；计算检测孔和空白对照孔的比值，如果大于1.5，则表明检测样本中存在目标核酸，如果小于1.5则表面不含目标核酸或目标核酸含量低于检测限。
Priority Applications (1)
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| CN201710424228.7A CN107058585B (zh) | 2017-06-07 | 2017-06-07 | 一种核酸杂交检测方法 |
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