CN100338223C - 一种单链dna快速制备技术及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单链DNA快速制备技术及试剂盒的制备方法。该技术快速、灵敏、纯度高，制备方法简便、成本低，适合各种规模不同核酸样品的DNA测序和探针制备。主要特征在于将一条引物通过固相合成或化学偶联等方法固定在固相基质微粒的表面获得固相引物，以靶核酸为模板在固相基质的表面进行固相PCR扩增，产物经加热变性，使DNA双链解链，而由固相引物延伸获得的DNA单链仍然保留在固相基质的表面；分离固/液相获得两条互补的DNA单链。运用本发明制备的单链DNA和RNA可用于核酸的测序，反义寡核苷酸药物的合成、单链探针的制备以及SELEX分子文库的构建等，可广泛地用于生物学、医药学、疾病预防、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

Description

一种单链DNA快速制备技术及试剂盒

本发明涉及一种单链DNA快速制备技术及试剂盒的制备方法。该技术快速、灵敏、纯度高，制备方法简便、成本低，适合不同核酸样品的DNA各种规模测序和探针制备，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

固相吸附、分离与合成技术在水质、水源、生物材料、生物体液(如血液、血清、血浆、脑脊液、尿液，泪液、汗液、消化液、精液、分泌液、组织液、渗出液、呕吐物、粪便)、组织/细胞和微生物裂解液、不同来源的蛋白、核酸等生物、化学分子以及药物等的分析检测、分离和纯化以及寡核苷酸、多肽、先导化合物和药物的合成等方面被广为应用。

生物固相化技术主要是利用不溶的固相基质材料，通过表面吸附或结合以捕获液相被分析物和被纯化物中的靶分子或固定新合成的靶分子，借助重力、压力、离心、过滤、磁力、流体等，经过一步或多步操作很方便的将未结合的分子(液相、游离相或流动相)与结合分子(固相)分离，以便获得纯的目的分子，或将靶分子从复杂的样品混合物或悬液中分离出来，用于进一步的分析研究。

在生物医药等的研究开发中，为合成反义寡核苷酸药物、探测基因表达的有无以及测定基因的碱基序列，了解遗传信息、判断基因有无突变等，经常需要快速制备一定数量的单链DNA和探针。通常的策略是：先将待测的靶基因序列插入重组扩增载体，如M13噬菌体等，然后转化宿主菌；通过培养细菌以扩增靶基因序列；单链DNA的分离提取与纯化。显然上述方法非常烦琐复杂，不仅周期长、费用高，而且效率低。采用不对称PCR技术，虽然可以获得较高比例的单链DNA，但反应中的寡核苷酸引物、dNTPs和DNA聚合酶以及扩增产生的双链DNA依然存在，还必须设法去除。为解决此问题，本发明把DNA固相扩增技术与固相分离技术相结合，用于DNA单链的快速扩增制备和测序，具有操作简便、快速高效、成本低等特点。

本发明的主要技术特征是，将PCR扩增的成对引物中的一条引物，通过固相合成或化学偶联等方法固定在固相基质微粒的表面获得固相引物，以靶核酸为模板在固相基质的表面进行固相PCR扩增，扩增的DNA产物经加热变性，使双链DNA中的一条因解链脱离固相基质，而另一条由固相引物延伸获得的DNA单链仍然保留在固相基质的表面；分离固/液相获得两条互补的DNA单链。运用本发明制备的单链DNA和RNA可广泛应用于核酸的测序，反义寡核苷酸药物、单链探针的制备以及SELEX分子文库的构建等技术领域。

本项发明同时还提供了基于本项技术发明制备试剂盒的方法，其主要技术特征在于：试剂盒由装有一定数量的、表面带有某种特定序列核酸或化学活性基团的生物微粒与各种配套试剂组成；利用试剂盒中所提供的生物微粒和试剂可方便、快速地进行DNA、RNA等单链核酸分子的制备、标记以及序列测定，使单链核酸的制备、标记与测序等操作步骤大大简化，缩短了操作时间，降低了工作强度，提高了工作效率；更提高了单链核酸制品的纯度、结果的重复性和准确性，使用更方便，操作更快捷；本发明可广泛地应用于环境监测、疾病诊断、新药开发与筛选、疫苗研究、生物分子的相互作用、基因组学、蛋白质组学和功能组学等技术、研究领域。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案其基本特征在于：单链DNA的快速制备技术和试剂盒，至少包括下述步骤：

①提供一种生物微粒，在模板的扩增反应中作为固相引物，其固相基质表面连接的寡核苷酸分子的序列与模板核酸分子互补；

②将生物微粒与模板核酸分子，非固相引物、dNTPs、DNA聚合酶，如耐热DNA聚合酶、测序酶、经基因重组或修饰的DNA聚合酶及其酶活性片段等混合，在生物微粒表面，通过固相聚合酶链反应(PCR)对模板核酸分子进行扩增；其中非固相引物或dNTPs中有一个可以是同位素、荧光素、生物素、半抗原、多肽、糖、寡糖或多糖等指示分子的标记物或被修饰的核苷酸；扩增反应至少完成一个循环，此循环包括a)加热变性，使模板DNA双链解链或消除单链核酸模板DNA形成的自身环化或发卡等二级结构；b)退火，使固/液相引物与模板的互补序列复性或杂交；c)在DNA聚合酶的作用下，使引物的寡核苷酸链序列延长，并固定在微粒表面；每经过一个反应循环，模板核酸靶序列的分子数量便增加1倍；

③离心漂洗数次以去除残留的模板核酸分子、非固相引物、dNTPs与DNA聚合酶等；

④加热变性，使扩增的双链DNA的正负链解链，获得互补的、分别位于固相和液相的单链DNA分子；

⑤用分离器将固/液相分离，分别获得两条不同的、序列互补的固相和液相单链DNA；

本发明的特征还在于：单链RNA的快速制备技术和试剂盒，至少包括下述步骤：

①提供一种生物微粒，其固相基质表面连接有双链DNA分子，在单链RNA的制备中作为固相DNA模板参与RNA的体外转录反应；双链分子可以是通过a.固相PCR扩增反应；b.基质微粒连接分子层的表面活性基团与核酸分子的连接反应；或c.抗原与抗体，配基配体等的特异性结合反应固定在基质微粒的表面；

②加入转录缓冲液、rNTPs、DNA依赖的RNA聚合酶等，在适当条件下反应：其中至少有一种rNTP为荧光素、生物素、半抗原、糖、多糖或寡糖、金属鳌合剂等指示分子的标记物；

③用固液相分离器将DNA固相模板与液相RNA等分离；

④收集液相去除酶、rNTPs、DTT、BSA和RNA酶抑制剂等残留物获得纯化单链RNA；

本发明的特征还在于：单链核酸的快速制备技术与试剂盒至少包括下述步骤：

①提供一种固/液相分离器和生物微粒，在生物微粒固相基质的表面连接有一种生物分子，如亲合素、链亲合素、抗体、凝集素、金属鳌合剂等或活性基团，如环氧乙基、环化亚胺碳酸盐基团以及氰酸酯、吖内酯等，可与各种核酸或寡核苷酸分子上的抗原或半抗原，糖、寡糖或多糖，生物素，金属或金属颗粒等指示分子结合或与5’末端的氨基等活性基团发生连接反应，使之固定或附着在固相基质的表面；生物微粒也可预装填在分离器内；

②经标记的单链DNA或RNA与生物微粒表面的生物分子结合或与基质微粒表面的活性基团发生连接反应，使之被固定在基质微粒的表面，分离固/液相，获得单链DNA或RNA；其中标记的单链DNA或RNA可以是下述任何一种形式或通过下述任何一种方式获得的单链核酸分子

a.模板核酸分子与引物、dNTP、DNA聚合酶等混合，通过液相聚合酶链反应(PCR)对模板核酸分子进行扩增；其中至少有一种dNTP成分或一条引物用生物素、半抗原、同位素、荧光素、糖、寡糖或多糖、金属或金属颗粒、凝集原等指示分子标记或5’末端被氨基化或为被修饰的核苷酸；扩增反应至少完成一个循环，此循环包括a)加热变性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延长；

b.以RNA或mRNA为模板，经反转录获得的被指示分子标记的cDNA；

c.用权利要求1和2所述方法获得的液相单链DNA和RNA；

d.通过任何方式获得或以任何形式存在的、经加热变性可获得的、被指示分子标记的单链核酸分子；

本发明的特征还在于：不同长度单链DNA的制备和试剂盒，可以用下述步骤和方法：

①提供一种生物微粒，其固相基质表面连接的单链核苷酸分子中有一段未知的碱基序列，在测序中作为扩增反应的靶核酸分子模板；单链核苷酸分子可以是通过a.固相PCR扩增反应；或b.基质微粒连接分子层的表面活性基团与核酸分子的连接反应，被固定在基质微粒的表面，经加热变性，分离去除液相部分获得；其未知序列的上下游序列中可带有克隆载体多位点接头；

②生物微粒与寡核苷酸引物、dNTPs、ddNTPs(或ddNTP)及DNA聚合酶等混合，在固相基质表面进行热循环测序反应；其中引物或dNTPs、ddNTPs中至少有一个是同位素、荧光素、生物素等的标记物；热循环测序反应包括a)加热变性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸；延伸的引物在ddNTP处终止，形成以固相单链DNA为模板，不同长度的引物延伸链；

③加热变性，使扩增的引物延伸链与固相模板解链；

④离心取液相进行凝胶电泳，检测DNA带形、分析并解读靶核酸序列。

本发明的特征还在于：生物微粒可以是下述任何一种形式：

①表面具有由不同活性基团，如环氧乙基、碘乙酰、酰肼基、环化亚胺碳酸盐基团以及氰酸酯、吖内酯等组成的连接分子层的基质微粒，借助活性基团可将核酸、寡核苷酸、抗体、亲合素或链亲合素、凝集素、金属鳌合剂等生物分子连接并固定在固相基质的表面；

②以基质微粒为固相载体，在其表面直接进行固相合成，获得与模板DNA片段的末端序列互补的寡核苷酸链，作为PCR反应的固相引物；

③基质微粒及其表面通过连接分子层的活性基团连接或固定的，与模板DNA或RNA片段的末端序列互补的，可作为各种固相PCR反应的固相引物的寡核苷酸链；

④固相基质微粒通过各种固相PCR扩增反应获得的，保留在其表面的双链DNA片段，在RNA的转录合成中作为转录模板；

⑤固相基质微粒及通过连接分子层的活性基团连接或固定在其表面的双链DNA片段，在RNA的转录合成中作为转录模板；

⑥固相基质微粒及其表面连接或固定的抗体、亲合素或链亲合素、凝集素、金属鳌合剂等活性分子；

⑦基质微粒以及通过其表面的抗体、亲合素或链亲合素、凝集素、金属鳌合剂等活性分子结合并固定在其表面的生物素、半抗原等指示分子标记的核酸分子；

本发明的特征还在于：基质微粒为任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，有荧光或无荧光的，硬质或软质，磁性或非磁性、有机或无机、单体或复合材料，经加工而成的、不同外观形状，大小均一的空心体、多孔或实心体的固相基质，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、琼脂糖、高分子合成材料、纤维素、乳胶、硅胶、层析基质、陶瓷、磁性或顺磁性材料、非金属或金属及其鳌合剂或复合材料；经处理可在其表面获得具有不同活性基团，如环氧乙基、碘乙酰、酰肼基、环化亚胺碳酸盐基团以及氰酸酯、吖内酯等组成的连接分子层，借助这些活性基团可进一步与不同长度和序列的核酸、寡核苷酸或抗体亲合素等生物分子连接，使之固定在微粒表面制成各种生物微粒。

本发明的特征还在于固相引物是指，与靶核酸链模板末端的碱基序列互补，通过下述方法之一固定在固相基质微粒表面的一段寡核苷酸链；

①通过DNA合成仅或其它固相合成技术，以基质微粒为固相直接合成，并保留在基质微粒表面的，具有游离的活性3’末端的寡核苷酸链；

②用任何方法合成的，借助5’端的末端修饰氨基等活性基团与固相微粒表面连接分子层的活性基团反应，被固定在固相微粒表面，保留游离的活性3’末端的寡核苷酸链；

本发明的特征还在于各种PCR扩增反应，可以是下述任何一种：

①以DNA片段为模板，通过聚合酶链反应(PCR)使引物的寡核苷酸链得以延伸，并使模板DNA片段得以扩增；PCR反应循环包括a)加热变性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸；每经过一个反应循环，模板核酸靶序列的分子数量便增加1倍；在模板核酸靶序列中可以含有限制性内切酶多酶位点人工接头或RNA聚合酶的启动子；如进行固相PCR反应，其中至少有一条寡核苷酸链应固定在固相微粒表面作为固相引物；

②以微粒表面的寡核苷酸分子为固相化铆接物，以已知序列的特异性核酸分子为模板，与游离的寡核苷酸分子配对引物，在微粒表面通过铆链聚合酶链反应(RCR)使寡核苷酸链延伸并进一步扩增；扩增产物通过固相化铆接物固定在基质微粒表面，RCR反应循环周期包括a)加热变性；b)退火；c)DNA聚合酶延伸靶核苷酸链序列；d)DNA连接酶连接；每经过一个反应循环，固着在基质微粒表面的模板核酸靶序列的分子数量便增加1倍；

③以mRNA为模板经反转录获得cDNA，再以cDNA为模板，以上下游两末端互补寡核苷酸分子为引物，进行聚合酶链反应，使模板mRNA得以扩增；如进行固相PCR扩增，其中至少应有一个寡核苷酸链被固定在固相微粒表面作为固相引物；

④不对称PCR反应，在此反应中，配对引物中有一条引物的数量或浓度明显高于另一条引物，经过几轮循环后，其中数量较少的引物被耗尽，而数量多的引物继续延伸、扩增，使扩增产物中的一条核酸单链的数量明显高于另一条互补核酸单链；如进行固相不对称PCR扩增，则其中至少应有一个寡核苷酸链被固定在固相微粒表面作为固相引物；

⑤连接酶链反应(LCR)，以寡核苷酸分子为固相引物，以已知序列的特定核酸分子为模板，通过LCR循环反应延长寡核苷酸链并进一步扩增，LCR反应循环周期包括a)加热变性；b)退火；c)DNA连接酶连接固相和液相引物，以使靶核苷酸链序列延长；如进行固相LCR扩增反应，则其中至少应有一个寡核苷酸链被固定在固相微粒表面作为固相引物；

本发明的特征还在于固液相分离及分离器，是指所用的下述任何一种固液相分离方式及其用品：

①一种双层微型离心管，由内层的固/液相分离管和外层的离心管组成，在分离管的下端是微孔膜或筛网样结构可允许液体通过，加入解链的单链DNA混合物离心，使固相基质微粒滞留在分离管内，通过的液体被收集在离心管中；

②一种微分离柱，由柱体、出液口和筛网样结构组成，筛网允许液体流过而将固相微粒滞留在柱体内，加入解链的单链DNA混合物，使液相与固相完全分离；

③一种微分离柱，由柱体和出液口组成；在一定强度的磁场中，磁性固相基质微粒附着在柱体的内表面而滞留在柱体内，使液相与固相完全分离；为增加固相微粒的回收率可以在柱体内增加高顺磁性填充物，以提高磁场的均一性并扩大固相微粒的附着表面；将分离柱脱离磁场，加压冲洗可收集固相微粒；

④一种微型过滤器，由滤器和微孔滤膜组成；解链的单链DNA混合物经过滤器过滤；液相DNA单链通过过滤器，收集于试管内，固相则滞留在过滤器内；

⑤一种微量离心管或PCR反应管，完成最后一轮PCR循环反应后，加热使DNA变性解链，离心使基质微粒沉淀，分别收集固相和液相部分。

⑥将生物微粒预装填入上述5种分离器中的任何一种分离装置内；解链的单链核酸分子借助指示分子标记物，与固相微粒表面的活性分子结合；分离固/液相获得纯化单链分子。

本发明的特征还在于：试剂盒至少装有一管生物微粒或固相基质，其固相基质表面具有化学活性基团或生物活性分子；并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒：

①至少有一管为测序酶，耐热或不耐热的DNA聚合酶或其酶活性的片段、基因重组产物或其酶修饰物等，用于PCR扩增反应或核酸的测序；

②至少有一管为反转录酶，用于cDNA的合成；

③至少有一管为核酸链接酶，用于DNA分子链的连接；

④至少有一管为dNTP或rNTP，其中至少有一种成分为指示分子的标记物或被修饰的核苷酸，在PCR扩增反应或转录合成中作为酶的底物；

⑤至少有一管为非固相寡核苷酸引物，其5’末端可被氨基化或用生物素、半抗原或荧光素等标记；

⑥至少有一种可用于固/液相分离的分离器；

⑦至少有一管为电泳样品缓冲液，用于核酸电泳样品的处理；

⑧至少有一管为ddNTPs，其中至少有一种成分为指示分子的标记物，用于链延伸-链终止等测序反应；

⑨至少有一管为RNA聚合酶，用于RNA的转录合成；

⑩至少有一管为缓冲液，用于PCR扩增、转录合成或实验中的各种漂洗等，如Tris-HCl缓冲液、TE，磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等。

本发明具有以下特点：1操作简便、效率高。靶核苷酸的扩增反应在固相微粒的表面进行，使扩增产物与酶及其底物等的分离以及两条互补单链的分离操作简便易行，省略了基因重组、克隆化、转化细菌以及后续的培养，靶核酸的分离纯化等操作步骤；2.易于制备、成本低。本发明所述的固相引物可通过固相合成直接获得，通过各种PCR反应可直接获得DNA和RNA单链核酸分子，并完成探针的标记；此外固相单链核酸分子作为模板可以多次重复使用，省略了模板、探针标记和制备中繁杂的分离纯化过程，大大简化了制备工艺；3.操作简便，节省样品与试剂。操作均可在微柱或微管等微型反应容器中进行，单链核酸分子的合成、标记以及结合、漂洗、分离与纯化等反应均在同一个容器中进行，解决了传统和现有单链核酸分子制备技术中操作步骤繁琐、试剂种类繁多、试剂用量大等问题；同时还解决了因样品不易获得和标记物价格昂贵等所带来的困扰；全部操作可在多孔微量PCR反应板中进行，易于实现大规模制备和全自动化操作；4.结果易于分析。由于固相微粒和液相单链核酸分子均可分别进行不同的标记，适当大小的固相微粒或含有荧光分子纳米微粒上的单链核酸分子可作为探针直接用于各种生物检测；因此，配合固/液相分离技术，使获得的固相和液相单链分子的分析鉴定极其简单易行，如通过对液相互补链的分析可以明确获得固相互补链的分子大小、碱基序列、纯度等，反之亦然；5.用途广泛。本发明不仅可用于新药的研究开发和基因组学、蛋白质组学、功能组学等现代生命科学的研究与开发；而且还可直接用于镶嵌式生物芯片生物微球和探针的制备、疾病的诊断，基因克隆、核苷酸序列分析，以及用于药物筛选、药物靶标分子或蛋白-核酸相互作用中单链核酸结合物的分子量、等电点、结构、功能、亲和力、组织/细胞及亚微或超微结构定位等进一步分析，甚至还可直接用于对结合物的不同解吸附条件与分离纯化等的分析研究。

下面结合附图作进一步的说明

图1.DNA单链和单链探针的制备流程与原理示意图

图中活性基团2在固相基质微粒1的表面形成连接分子层，将固相引物寡核苷酸3固定在微粒表面；与加热变性后的模板核酸分子6和液相引物4等共同退火，在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子链延伸，获得延长的引物单链核酸分子7和8；再变性退火，使单链核酸分子7和8与模板解链，并作为模板与引物分子复性；在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子链延伸，获得新的延长引物单链核酸分子7和8；每完成一次反应循环，单链分子7和8的数量(即靶核酸的数量)增加1倍；反应完成后，再加热变性，使单链核酸分子7和8解链，分离固液相，获得大量的固相单链DNA分子7和液相单链分子8；液相引物4末端用指示分子荧光素5标记可用作探针；用经过修饰的dNTP作为底物可以制备反义寡核苷酸药物；检测液相的荧光强度可进行定量分析；如液相引物4末端用指示分子生物素、半抗原等标记，则可进一步用链亲合素或抗体柱等分离纯化，获得新的固相单链分子。

图2.单链RNA的制备流程与原理示意图

图中，活性基团2在固相基质微粒1的表面形成连接分子层，通过固相PCR扩增反应或末端的活性氨基将双链DNA模板10固定在固相基质微粒1的表面；RNA聚合酶11识别DNA模板10中的启动子，催化以双链DNA分子10为模板的RNA单链12的合成，分离固液相，获得大量的指示性分子荧光素(或同位素)13等标记的液相单链RNA分子12作为生物探针；或用经过修饰的rNTP作为底物以制备反义RNA药物；或在rNTPs中加入适量的生物素或糖或寡糖等标记的rNTP，则可以用于RNA的分离纯化。分离的固相可以重新作为模板用于RNA单链12的合成。

图3.单链核酸和探针的固相分离和制备流程与原理示意图

图中寡核苷酸分子引物14和15与变性模板16共退火，其中引物15的末端带有指示性标记分子生物素18，在DNA聚合酶的作用下，引物14和15延伸，获得单链DNA分子19和20；再变性使单链核酸分子19和20与模板解链，并作为模板与引物分子退火复性；在DNA聚合酶的催化下，引物14和15的寡核苷酸分子链延长，获得新的延长引物单链核酸分子19和20；每完成一次反应循环，单链分子19和20的数量(即靶核酸的数量)增加1倍；反应完成后，加热变性，使单链核酸分子19和20解链，生物素分子18与固相基质微粒表面的亲合素21(也可以是链亲合素或抗生物素抗体)结合，使单链核酸分子20被吸附在基质微粒的表面，分离固液相分别获得单链分子19(液相)和单链分子20(固相)；为避免残留的标记引物15与合成的单链DNA分子20竞争结合固相微粒表面的亲合素或抗体等，实施中可采用不对称合成，使引物15的浓度低于引物14，在反应完成前引物15被耗尽，全部掺入单链DNA分子20中。

图4.几种常用固液相分离器的外观结构与工作原理示意图

图中4A.示一种微分离柱，由柱体23、出液口25和筛网样结构24组成，筛网24允许液体流过而将固相的生物微粒22滞留在柱体内，加入经解链处理的单链DNA混合物，使液相26与固相22完全分离，并液相26被收集在试管27中；

图中4B.一种双层微型离心管，由内层的固/液相分离管28和外层的离心管30组成，在分离管的下端是微孔膜或筛网样结构29可允许液体通过，加入解链处理的单链DNA混合物离心，使固相的生物微粒22滞留在分离管28内，通过的液体被收集在离心管30中；

图中4C.一种微分离柱，由柱体31和出液口25组成；在一定强度的磁场中，磁性固相基质微粒附着在柱体的内表面而滞留在柱体内，使液相与固相完全分离；为增加固相微粒的回收率可以在柱体内增加高顺磁性填充物32，以提高磁场的均一性并扩大固相微粒的附着表面；将分离柱脱离磁场，加压冲洗可回收固相微粒；

图中4D.一种微型过滤器，由微孔滤膜33、滤膜支板34和滤器35组成；解链的单链DNA混合物经过滤器过滤；液相DNA单链26通过过滤器，收集于试管27内，固相生物微粒22则滞留在过滤器内；打开滤器35冲洗滤膜可回收固相微粒22。微孔滤膜33可以有不同规格，以适应对固液相的分离和对不同分子量的生物大分子的分离。

图5.制备测序单链DNA的流程与原理示意图

图中固相基质微粒1表面的活性基团2，将固相引物寡核苷酸3固定在微粒表面；与变性的靶核酸分子模板6以及液相引物4等退火，在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子链延长，获得延长引物单链核酸分子7和8；再变性退火，使单链核酸分子7和8与模板解链，并作为模板与引物分子3和4复性；在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子链延长，获得新的延长引物单链核酸分子7和8；反应完成后，漂洗去除液相中的反应残留物；加热变性使单链核酸分子7和8解链，分离固液相，获得大量的固相单链DNA分子7和液相单链分子8；液相引物4末端用指示分子荧光素5标记，借此可监测分离效果和固相单链纯度，检测液相的荧光强度可以定量，将液相单链分子电泳可鉴定扩增靶核酸分子的纯度和分子量大小；以固相单链分子为模板，加入dNTPs和适量的ddNTP以及指示分子38标记的引物37，经多次退火、链延伸-链终止反应，获得大量不同长度的单链DNA分子39，分离液相并电泳，即可解读靶核酸分子的碱基序列。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

1.单链cDNA操针的制备

1)固相引物的制备：

在固相基质表面合成特定序列的寡核苷酸分子；为获得在PCR反应中可以利用的固相引物(PCR引物延伸方向为5’→3’，固相合成寡核苷酸延伸方向为3’→5’)，固相微粒表面的合成起始碱基通过核苷酸的侧链与基质表面连接分子层的活性基团连接，以保留3’端活性基团，用于PCR引物延伸反应。

2)固相PCR扩增：

将固相引物与模板核酸分子，非固相引物、dNTPs、适量Cy5-dCTP与耐热DNA聚合酶等混合，短暂离心后将反应管置PCR仪按下列程序，在固相基质表面通过固相聚合酶链反应(PCR)对模板核酸分子进行扩增：

反应	变性	退火	聚合延伸	反应周期
					1	94℃，5分钟	50-55℃，1分钟	72℃，1-5分钟	1
2	94℃，1分钟	50-55℃，1分钟	72℃，1-5分钟	10-80
					3	94℃，1分钟	50-55℃，1分钟	72℃，7-15分钟	1

3)固液相分离

反应完成后将反应混合液加热变性(97℃)，使DNA双链解链，移入双层离心管微分离器的分离管中，5000-10000rpm离心30-60秒，在分离管中加入50-300ul缓冲液，重复离心，分别收集固相(分离管)和液相(离心管)；

4)固相单链DNA的分离纯化

取出分离管置另一离心管中加入缓冲液离心漂洗，反复3-5次；收集固相微粒获得固相单链DNA，测定荧光强度计算固相单链DNA探针的合成量与重量或体积克分子比；用于镶嵌式生物芯片的制备；

5)液相单链DNA的分离纯化

将液相部分用酚-氯仿抽提以去除聚合酶等蛋白成分，水相部分乙醇沉淀，离心去除液体，将沉淀重溶于TE(pH7.6)，加入微型过滤器，滤器采用截留分子量大于30000的微孔滤膜，加压或离心过滤以除去液相引物和残留的dDNP及Cy5-dCTP等；打开滤器取下滤膜将截留物溶于缓冲液中；电泳测定DNA单链探针的分子量；测定荧光强度计算液相单链DNA探针的合成量，必要时乙醇沉淀，重溶于适量TE中，以调整液相探针的浓度。

2.单链RNA探针的制备

1)固相引物的制备：

在固相基质表面合成特定序列的寡核苷酸分子，作为固相引物用于PCR延伸反应。

2)固相PCR扩增：

以含有特定噬菌体启动子及其下游的外源靶序列为模板，将固相引物与非固相引物、dNTPs与耐热DNA聚合酶等混合，短暂离心后将反应管置PCR仪按预定程序，进行PCR反应扩增。

3)固/液相分离

反应完成后，混合液5000-10000rpm离心30-60秒，弃去上清液，加入缓冲液混匀，重复离心3-5次，保留固相获得固相长链线状双链DNA模板。

4)RNA的固相合成

将rNTPs，生物素标记的rGTP，BSA，亚精胺，RNA酶抑制剂和DNA依赖的RNA聚合酶等与固相DNA模板混合，37℃(T3和T7噬菌体RNA聚合酶)或40℃(SP6噬菌体RNA聚合酶)温育1-3小时。

5)单链RNA的分离与纯化

反应完成后，混合液离心，收集上清液用乙醇沉淀，离心去除液体以及残留的rNTPs和生物素标记的rGTP，将沉淀用乙醇漂洗后重溶于DEPC水或TE(pH7.6)缓冲液中；

离心管中的固相部分加入缓冲液混匀，重复离心3-5次，可用于RNA的再次合成。酚-氯仿抽提以去除聚合酶等蛋白成分，水相部分

上述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的适用范围与领域。实施例中未注明具体实验条件和实验方法及其组合形式的，可参照相关实验技术手册或文献资料，以及制造厂商所建议的条件实施或进行。本发明在此将《生物分子固定化技术及应用》(蒋中华等，1998年，化学出版社)，《核酸探针的合成、标记及应用》(Edge R.Wang，1998，科学出版社)，《最新分子生物学实验技术》(梁国栋，2001年，科学出版社)，《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克，1995，科学出版社)及中国专利申请号为02121325.9和02123775.1的专利引为主要参考文献。

本发明涉及一种单链DNA快速制备技术及试剂盒的制备方法。该技术快速、灵敏、纯度高，制备方法简便、成本低，适合不同核酸样品的DNA各种规模测序和探针制备，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

Claims (2)

1.一种用于核酸的测序、反义寡核苷酸药物的合成、单链探针的制备以及SELEX分子文库的构建的单链核酸快速制备试剂盒，其特征在于它至少包括一管生物微粒，所述生物微粒是表面具有由环氧乙基、碘乙基、酰肼基、环化亚胺碳酸盐、氰酸酯和吖内酯组成的连接分子层的固相基质微粒；一套用于固/液相分离的分离装置；并含有下述所有成分：

①至少有一管为DNA聚合酶或其酶活性的片段、基因重组产物或酶修饰物；

②至少有一管为反转录酶；

③至少有一管为核酸连接酶；

④至少有一管为dNTP或rNTP，其中至少有一种成分为指示分子的标记物；

⑤至少有一管为非固相寡核苷酸引物；

⑥至少有一管为电泳样品缓冲液；

⑦至少有一管为ddNTPs，其中有一种成分为指示分子的标记物；

⑧至少有一管为DNA依赖的RNA聚合酶；

⑨至少有一管为缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于固/液相分离装置是下述用品中的任意一种：

①双层微型离心管，由内层的固/液相分离管和外层的离心管组成，在分离管的下端是微孔膜或筛网样结构，使基质微粒滞留在分离管内，将流过的液体收集在离心管中；

②微分离柱，由柱体、出液口和筛网样结构组成，筛网允许液体流过而将固相微粒滞留在柱体内，使液相与固相分离；

③一种微分离柱，在柱体内添加高顺磁性填充物的微分离柱，由柱体和出液口组成，磁性固相基质微粒流经时，附着在柱体的内表面并滞留在柱体内，使液相与固相完全分离；

④一种微型过滤器，由滤器和不同孔径的微孔滤膜组成；

⑤一种微量离心管或PCR反应管。

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