CN102321622B - 一种引物-固相载体复合物及其制备和用于测序的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种引物-固相载体复合物及其制备方法和应用。一种引物-固相载体复合物，包括引物和固相载体，该固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，该第一固相载体与至少一个第二固相载体结合，该第二固相载体与至少一个引物结合。本发明的引物-固相载体复合物具有高引物结合密度的特性，能大大提高固相表面的PCR扩增效率，降低在后续的扩增反应中对操作人员的操作要求。

Description

一种引物-固相载体复合物及其制备和用于测序的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种引物-固相载体复合物及其制备和用于测序的方法。

背景技术

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。目前高通量测序平台对样品处理的方式主要有两种，分别是通过玻片桥式PCR进行样品处理和通过乳液PCR进行样品处理。

其中玻片桥式PCR进行样品处理的原理如下：芯片表面上随机分布有分别与非对称接头互补的引物，单链DNA两端加上非对称的接头，并利用两端的接头与相应的引物互补，从而将片段固定在芯片表面形成寡核苷酸桥。经过多个PCR热循环，成千上万的复制产物制备出来，每一簇都分别固定在芯片表面一个单一的物理位置上。但是，芯片表面为一平面，能够用于与非对称接头互补的引物结合的位点有限，且各引物与单链DNA的结合均在同一水平面上，相互之间存在一定的空间位阻，不利于后续的PCR扩增反应。

乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。但是，“注水到油”这个技术需要专业人员进行操作，且对操作人员的技术要求很高，极容易失败，同时整个乳液PCR流程中需要用到多种专用仪器(如乳浊液震荡仪、PCR仪、乳浊液破碎仪等)，另外乳液PCR对磁珠的利用效率较低，扩增完成后还需专门的步骤富集带有扩增产物的磁珠，然后才能进行后续的测序反应。

因此，需要一种新的引物-固相载体复合物，该引物-固相载体复合物具有高引物结合密度特性，能大大提高固相表面的PCR扩增效率，降低在后续的扩增反应中对操作人员的操作要求。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种引物-固相载体复合物，旨在解决引物-固相载体的引物结合密度偏低，固相表面的PCR扩增效率偏低，在后续的扩增反应中对操作人员的高操作要求。同时，本发明还提供了这种引物-固相载体复合物的制备方法，此外，本发明还提供了利用这种引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法，以及这种引物-固相载体复合物在核酸测序过程中的应用。

本发明是这样实现的，一种引物-固相载体复合物，包括引物和固相载体，该固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，该第一固相载体与至少一个第二固相载体结合，该第二固相载体与至少一个引物结合。

优选地，该引物与第二固相载体之间的结合方式包括：

通过引物与第二固相载体携带的基团相互配对，实现直接结合；

或者通过中间子携带的基团与引物、第二固相载体携带的基团分别配对，实现间接结合。

该中间子用于结合引物和第二固相载体。

优选地，该第一固相载体与第二固相载体之间的结合方式包括：

通过第一固相载体与第二固相载体携带的基团相互配对，实现直接结合；

或者通过连接子携带的基团与第一固相载体、第二固相载体携带的基团分别配对，实现间接结合。

该连接子用于结合第一固相载体和第二固相载体。

更优选地，上述基团的配对可采用各种形式，包括但不限于生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰(iodacetyl)-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

上述任一方案中，第一固相载体的表面可为各种表面类型，包括但不限于平面、弧面、波浪形表面、不规则表面或这些表面类型的结合。

上述任一方案中，第二固相载体可为各种形状，包括但不限于球状固相载体、半球状固相载体、椭球状固相载体、柱状固相载体或不规则形状的固相载体。

上述任一方案中，第一固相载体的表面为适于固定生物基团或化学基团的材料，所述固定包括共价键连接。

本发明还提供了一种上述的引物-固相载体复合物的制备方法，该方法包括：

A.第二固相载体与至少一个引物结合；

B.第一固相载体与至少一个第二固相载体结合；

该步骤A、B无先后顺序。

优选地，该步骤A中的第二固相载体与引物之间的结合为直接结合或通过中间子间接结合。

该中间子用于结合引物和第二固相载体。

更优选地，该步骤A中的第二固相载体与引物之间的结合为通过中间子间接结合，所述步骤A包括以下步骤：

A1.第二固相载体与至少一个中间子结合；

A2.中间子与至少一个引物结合；

所述步骤A1、A2无先后顺序。优选地，该步骤B中的第一固相载体与第二固相载体之间的结合为直接结合或通过连接子间接结合。

该连接子用于结合第一固相载体和第二固相载体。

更优选地，该步骤B中的第一固相载体与第二固相载体之间的结合为通过连接子间接结合，该步骤B包括以下步骤：

B1.第一固相载体与至少一个连接子结合；

B2.连接子与至少一个第二固相载体结合；

所述步骤B1、B2无先后顺序。

更优选地，该步骤A、B2无先后顺序，形成引物-第二固相载体-连接子复合物；然后再进行步骤B1，形成引物-固相载体复合物。

更优选地，该步骤B1包括：

B11.将引物-第二固相载体-连接子复合物溶于碱性溶液中，混匀，然后点样至第一固相载体上，该第一固相载体为表面带有异硫氰基末端的第一固相载体；

B12.将点样后的第一固相载体于25至42℃固定0.5至3h，得到引物-固相载体复合物。

该碱性溶液为pH值在8.5至9.5之间的溶液，如碳酸氢钠溶液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris盐酸缓冲液等。

本发明的引物-固相载体复合物有多种用途，包括但不限于：利用所述引物-固相载体复合物作为引物进行PCR扩增；或利用所述引物-固相载体复合物上固定的引物作为探针，进行杂交检测或核酸片段的捕获。

本发明还提供了一种基于上述任一种引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法，包括以下步骤：

A.将核酸分子结合到引物-固相载体复合物上；

B.在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的核酸分子为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物。

优选地，在步骤A之前包括步骤A’：制备上述的任一种引物-固相载体复合物。

该步骤A’具体可采用上述任一种引物-固相载体复合物的制备方法。

优选地，步骤B所述PCR扩增反应为等温PCR扩增反应或热循环PCR扩增反应。等温扩增反应，即在PCR反应过程中，变性、退火和延伸的温度保持一致的PCR扩增反应。热循环PCR扩增反应，即在PCR反应过程中，变性温度和退火温度、延伸温度不同，需循环进行加热、降温的PCR扩增反应。

优选地，步骤B所述PCR扩增反应为桥式PCR反应或非桥式PCR反应。桥式PCR反应，即在PCR反应中用于扩增的上下游引物均被固定，这样扩增产物或用于扩增的模板链可分别通过与上下游引物的结合而成桥。

更优选地，步骤B所述PCR扩增反应为桥式PCR等温扩增反应，该桥式PCR等温扩增反应，指其既是等温扩增反应，又是桥式PCR反应。

本发明还提供了一种利用上述任一种引物-固相载体复合物进行核酸测序的方法，该方法包括以下步骤：

A.将核酸分子结合到引物-固相载体复合物上；

B.在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的核酸分子为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；

C.对扩增产物进行核酸测序。

优选地，该步骤C包括以下步骤：

C1.变性扩增产物，使其形成单链，得到固定在引物-固相载体复合物上的单链扩增产物；

C2.利用碱基互补原则，对固定在引物-固相载体复合物上的扩增产物进行核酸测序反应。

更优选地，该步骤C2中的进行核酸测序反应的方法采用Sanger测序法、焦磷酸测序法或循环可切除测序法。循环可切除测序法，即在测序过程中，依次逐个添加带有荧光标记的核苷酸或寡核苷酸序列，继而检测荧光信号，切除荧光信号，如此往复最终获得扩增产物的碱基序列。

与现有技术相比，本发明通过与第一固相载体结合的第二固相载体连接引物，本发明的第二固相载体的立体表面相当于是对第一固相载体表面的放大，从而提高了第一固相载体的引物结合密度，进而提高了固相表面的PCR扩增效率，同时本发明的引物-固相载体复合物保留了玻片桥式PCR中的引物-固相载体复合物的优点，即在后续扩增反应中对操作人员的操作要求较低。此外，本发明提供的引物-固相载体复合物的制备方法步骤简单；上述引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法对操作人员的操作要求降低，非专业人员也能进行操作，且PCR扩增效率高，扩增后只需简单的处理即可用与后续的测序反应；上述引物-固相载体复合物进行核酸测序的方法，对系统光源的要求较低，简化了核酸测序的操作步骤和流程，提高了高通量核酸测序的效率。

附图说明

图1是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图2是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图3是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图4是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图5是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图6是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图7是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图8是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图9是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图10是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图11是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图12是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图13是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图14是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图15是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图16是本发明的引物-固相载体复合物的一个实施例的结构示意图；

图17是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图18是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图19是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图20是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图21是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图22是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图23是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图24是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图25是本发明的制备引物-固相载体复合物的一个实施例的方法流程图；

图26是本发明的利用引物-固相载体复合物进行PCR扩增的一个实施例的方法流程图；

图27是本发明的利用引物-固相载体复合物进行PCR扩增的一个实施例的方法流程图；

图28是本发明的利用引物-固相载体复合物进行核酸测序的一个实施例的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

图1示出了本发明中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物，包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

现有的进行桥式PCR扩增的玻片是通过其玻片表面的修饰基团直接与引物连接，而本方案则是通过与第一固相载体相结合的第二固相载体连接引物，相对于现有技术的玻片表面来说，本发明的第二固相载体的立体表面相当于是对第一固相载体表面的放大，从而提高了第一固相载体的引物结合密度，进而提高了固相表面的PCR扩增效率，同时本发明的引物-固相载体复合物保留了玻片桥式PCR中的引物-固相载体复合物的优点，即在后续扩增反应中对操作人员的操作要求较低，非专业人员也能够进行操作。

需要说明的是：

所述第一固相载体2的表面为适于固定生物基团或化学基团的材料，所述固定包括共价键连接。该材料包括但不限于：玻片、硅片、陶瓷、金属、金属氧化物、塑料、橡胶、尼龙，该共价键连接可以是直接连接也可以是间接连接(如先对第一固相载体进行修饰，然后通过修饰物进行共价键连接)。

所述第二固相载体3可采用各种材质，包括但不限于：玻片、硅片、陶瓷、金属、金属氧化物、塑料、橡胶、尼龙。

第一固相载体2的表面可为各种表面，包括但不限于：平面、弧面、波浪形表面、不规则表面或这些表面类型的结合。

第二固相载体3可为各种形状，包括但不限于：球状固相载体、半球状固相载体、椭球状固相载体、柱状固相载体或不规则形状的固相载体。

引物1与第二固相载体3之间的结合方式为通过引物1与第二固相载体3携带的基团相互配对，实现直接结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

第一固相载体2与第二固相载体3之间的结合方式为第一固相载体1与第二固相载体3携带的基团相互配对，实现直接结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

对于图1所示的引物-固相载体复合物的结构，其包含的各种技术方案将在下述的多个实施例中进行详细阐释。

在本发明的一个典型实施例中，第一固相载体2材质为玻片，其表面为平面，玻片表面有多个修饰基团，修饰基团为醛基；第二固相载体3为无荧光背景的球状磁珠，磁珠表面有多个功能基团，功能基团为氨基；引物3的5’端带有标记基团，标记基团为羧基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为醛基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-羧基。

该典型实施例由于采用了无荧光背景的球状磁珠，通过磁珠表面的多个氨基分别与引物5’端的羧基、玻片表面的醛基结合，因此本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，上述典型实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图2示出了本发明的一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为硅片，其表面为弧面，硅片表面有多个修饰基团，修饰基团为异硫氰基；第二固相载体3为无荧光背景的球状磁珠，磁珠表面有多个功能基团，功能基团为醛基；引物1带有标记基团，标记基团为醛基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为异硫氰基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-醛基。

图3示出了本发明的另一个实施例中的引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为陶瓷，其表面为波浪形表面，陶瓷表面上有多个修饰基团，修饰基团为生物素；第二固相载体3为球状磁珠，磁珠表面有多个功能基团，功能基团为链霉亲和素；引物1带有标记基团，标记基团为生物素。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为生物素-链霉亲和素，第二固相载体3与引物1的结合方式为链霉亲和素-生物素。

图4示出了本发明的另一个实施例中的引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相体载2材质为塑料，其表面为波浪形表面和平面的结合，塑料表面上有多个修饰基团，修饰基团为异硫氰基；第二固相载体3为无荧光背景的球状磁珠，磁珠表面有多个功能基团，功能基团为氨基；引物1的5’端带有标记基团，标记基团为异硫氰基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为异硫氰基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-异硫氰基。

图5示出了本发明另一个实施例中的引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为玻片，其表面为弧面和平面的结合，玻片上有多个修饰基团，修饰基团为异硫氰基；第二固相载体3为无荧光背景的球状磁珠，磁珠表面有多个功能基团，功能基团为氨基；引物1的5’端带有标记基团，标记基团为异硫氰基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为异硫氰基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-异硫氰基。

图6示出了本发明的另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为金属，其表面为弧面和波浪形表面的结合，金属表面有多个修饰基团，修饰基团为纳米金；第二固相载体3为无荧光背景的球状磁珠，磁珠表面有多个功能基团，功能基团为氨基和巯基；引物1的5’端带有标记基团，标记基团为异硫氰基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为纳米金-巯基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-异硫氰基。

图7示出了本发明的另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为玻片和硅片，其表面为平面、波浪形表面、弧面和不规则表面的结合，其表面有多个修饰基团，修饰基团既有醛基，又有羧基；第二固相载体3为无荧光背景的球状磁珠，磁珠表面有多个功能基团，功能基团为氨基；引物1的5’端带有标记基团，该标记基团为异硫氰基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为醛基-氨基、羧基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-异硫氰基。

图8示出了本发明的另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为玻片，其表面为平面，玻片表面有多个修饰基团，修饰基团为异硫氰基；第二固相载体3为椭球状，材质为塑料，其表面有多个功能基团，功能基团为氨基；引物1的5’端带有标记基团，该标记基团为醛基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为异硫氰基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-醛基。

本实施例由于采用了椭球状的塑料，并通过椭球状塑料表面的多个氨基分别与引物5’端的醛基、玻片表面的异硫氰基结合，因此本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，本实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图9示出了本发明的另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为塑料(聚苯乙烯)，其表面为平面，塑料表面有多个修饰基团，修饰基团为异硫氰基；第二固相载体3为正方体，材质为玻璃，玻璃表面有多个功能基团，功能基团为氨基；引物1的5’端带有标记基团，标记基团为羧基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为异硫氰基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-羧基。

本实施例由于采用了正方体玻璃，并通过正方体玻璃表面的多个氨基分别与引物5’端的羧基、塑料表面的异硫氰基结合，因此本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，本实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图10示出了本发明的另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物，包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为玻片，其表面为平面，玻片表面有多个修饰基团，修饰基团为巯基；第二固相载体3为不规则形状的金属，金属表面有多个功能基团，功能基团为纳米金；引物1带有标记基团，标记基团为巯基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为巯基-纳米金，第二固相载体3与引物1的结合方式为纳米金-巯基。

本实施例由于采用了不规则形状的金属，并通过其表面的纳米金分别与引物的巯基、玻片表面的异硫氰基结合，因此本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，本实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图11示出了本发明的另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物，包括引物1和固相载体，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为玻片，其表面为平面，玻片表面有多个修饰基团，修饰基团为醛基；第二固相载体3为半球状，材质为尼龙，尼龙表面有多个功能基团，功能基团为氨基；引物1带有标记基团，标记基团为醛基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为醛基-氨基，第二固相载体3与引物1的结合方式为氨基-醛基。

本实施例由于采用了半球状的尼龙，并通过其表面的氨基分别与引物的醛基、玻片表面的醛基结合，因此本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，本实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

需要说明的是：

第一固相载体与第二固相载体之间的结合方式还可以是通过连接子携带的基团与第一固相载体、第二固相载体携带的基团分别配对，实现间接结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

图12示出了本发明的另一种引物-固相载体复合物的结构，该种引物-固相载体复合物包括引物1、固相载体和连接子4，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个连接子4结合，该连接子4与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

需要说明的是：

连接子4包括至少一个第一基团和至少一个第二基团，该第一基团与第一固相载体2结合，该第二基团与第二固相载体3结合。

连接子4能够进一步加强第一固相载体2和第二固相载体3之间的连接稳定性，当连接子4具有多个第一基团时，还能进一步提高第一固相载体表面的引物结合密度，从而进一步提高固相表面的PCR扩增效率，此外，连接子4的加入进一步扩大了连接在第二固相载体3上的引物1的可能延伸空间范围，也有利于引物在后续的PCR扩增过程中充分与PCR反应液接触，从而提高PCR扩增效率。

连接子4可采用多种化合物，包括但不限于：烷烃、单链核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。

引物1与第二固相载体3之间的结合方式为通过引物1与第二固相载体3自身携带的基团相互配对，实现直接结合基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

第一固相载体2和第二固相载体3均可采用各种材质，包括但不限于：玻片、硅片、陶瓷、金属、金属氧化物、塑料、橡胶、尼龙。

第一固相载体2的表面可为各种表面，包括但不限于：平面、弧面、波浪形表面、不规则表面或这些表面类型的结合。

第二固相载体3可为各种形状，包括但不限于：球状固相载体、半球状固相载体、椭球状固相载体、方形固相载体或不规则形状的固相载体。

第一固相载体2与第二固相载体3之间的结合方式为第一固相载体1与第二固相载体3自身携带的基团相互配对，实现直接结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

对于图12所示的引物-固相载体复合物的结构，其包含的各种技术方案将在下述的多个实施例中进行详细阐释。

在该种引物-固相载体复合物的一个典型实施例中，第一固相载体2材质为玻片，其表面为平面，玻片表面有多个修饰基团，修饰基团为异硫氰基；第二固相载体3为无荧光标记的磁珠，磁珠带有链霉亲和素修饰，优选为购于invitrogen的DynabeadsMyOne^TMStreptavidinC1；连接子4为带有氨基末端和双生物素标记的单链核苷酸分子；引物1为双生物素标记的引物。即第一固相载体2与连接子4的结合方式为异硫氰基-氨基，连接子4与第二固相载体3的结合方式为生物素-链霉亲和素，第二固相载体3与引物1的结合方式为链霉亲和素-生物素。

该典型实施例由于采用了无荧光标记的磁珠，并通过磁珠表面的链霉亲和素分别与引物1的双生物素标记、连接子4的双生物素标记结合，然后再通过连接子4的氨基末端与玻片表面的异硫氰基结合，从而使得本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，上述典型实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

需要说明的是：

在上述典型实施例中，连接子4的碱基数优选在15至40之间，更优选20至30之间。

连接子4的碱基序列为重复或非重复序列，优选为重复序列，包括但不限于：CA、GT、GCAT。

图13示出了本发明的另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1、固相载体和连接子4，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个连接子4结合，该连接子4与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

该实施例中，第一固相载体2材质为硅片，其表面为弧面，硅片表面有多个修饰基团，修饰基团为丙烯酰胺；第二固相载体3为半球状，材质为尼龙，尼龙表面有多个功能基团，功能基团为异硫氰基和碘乙酰，其中异硫氰基至少有2个；连接子4为硅烷基修饰的带有多个巯基基团的烷烃；引物1带有标记基团，标记基团为氨基。即第一固相载体2与连接子4的结合方式为丙烯酰胺-硅烷基，连接子4与第二固相载体3的结合方式为巯基-碘乙酰，第二固相载体3与引物1的结合方式为异硫氰基-氨基。

本实施例由于采用了半球状尼龙，并通过半球状尼龙表面的异硫氰基和碘乙酰分别与引物的氨基、连接子的巯基结合，然后再通过连接子的硅烷基与弧形硅片表面的丙烯酰胺结合，从而使得本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，上述实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图14示出了本发明另一个实施例中引物-固相载体复合物的结构，该引物-固相载体复合物包括引物1、固相载体和连接子4，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个连接子4结合，该连接子4与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体3与至少一个引物1结合。

在该实施例中，第一固相载体2材质为硅片，其表面为平面，硅片表面有多个修饰基团，修饰基团为生物素；第二固相载体3有两种，分别是球状和半球状，材质均为塑料，球状和半球状塑料表面带有多个功能基团，功能基团为羧基；连接子4为带有多聚物部分的化合物，该化合物带有亲和素基团，而其多聚物部分中的每个单体均带有一个氨基；引物1带有标记基团，标记基团为氨基。即第一固相载体2与连接子4的结合方式为生物素-亲和素，连接子4与第二固相载体3的结合方式为氨基-羧基，第二固相载体3与引物1的结合方式为羧基-氨基。

本实施例由于采用了半球状和球状塑料，并通过半球状和球状塑料表面的羧基分别与引物的氨基、连接子的氨基结合，然后再通过连接子的亲和素与硅片表面的生物素结合，从而使得本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，上述实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

需要说明的是：

引物1与第二固相载体3之间的结合方式还可以是通过中间子携带的基团与引物1、第二固相载体3携带的基团分别配对，实现间接结合。该中间子用于结合引物和第二固相载体。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

图15示出了本发明的另一种引物-固相载体复合物的结构，该种引物-固相载体复合物包括引物1、固相载体和中间子5，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体与至少一个中间子5结合，该中间子5与至少一个引物1结合。

需要说明的是：

中间子5包括至少一个第三基团和至少一个第四基团，该第三基团与引物1结合，该第四基团与第二固相载体3结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

中间子5能够进一步加强第一固相载体2和第二固相载体3之间的连接稳定性，当中间子5具有多个第三基团时，中间子5的加入进一步提高了第一固相载体表面的引物结合密度，扩大了引物1的可能延伸空间范围，有利于引物在后续的PCR扩增过程中充分与PCR反应液接触，从而提高PCR扩增效率。

中间子5可采用多种化合物，包括但不限于：烷烃、单链核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。

第一固相载体2和第二固相载体3均可采用各种材质，包括但不限于：玻片、硅片、陶瓷、金属、金属氧化物、塑料、橡胶、尼龙。

第一固相载体2的表面可为各种表面，包括但不限于：平面、弧面、波浪形表面、不规则表面或这些表面类型的结合。

第二固相载体3可为各种形状，包括但不限于：球状固相载体、半球状固相载体、椭球状固相载体、方形固相载体或不规则形状的固相载体。

第一固相载体2与第二固相载体3之间的结合方式为第一固相载体1与第二固相3自身携带的基团相互配对，实现直接结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

在该种引物-固相载体复合物的一个典型实施例中，第一固相载体2材质为硅片，其表面为平面，硅片表面有多个修饰基团，修饰基团为硅烷基；第二固相载体3为球状，材质为尼龙，尼龙表面有多个功能基团，功能基团为丙烯酰胺和碘乙酰，其中碘乙酰至少有2个；中间子5为同时带有巯基和氨基的烷烃，其中氨基至少有2个；引物1带有标记基团，标记基团为醛基。即第一固相载体2与第二固相载体3的结合方式为硅烷基-丙烯酰胺，第二固相载体3与中间子5的结合方式为碘乙酰-巯基，中间子5与引物1的结合方式为氨基-醛基。

在本典型实施例中，由于采用了球状尼龙，并通过球状尼龙表面的丙烯酰胺和碘乙酰分别与第一固相载体2的硅烷基、中间子5的巯基结合，然后在通过中间子5的氨基与引物1的醛基结合，从而使得本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，上述实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图16示出了本发明的另一种引物-固相载体复合物的结构，该种引物-固相载体复合物包括引物1、固相载体、连接子4和中间子5，该固相载体包括第一固相载体2和第二固相载体3，该第一固相载体2与至少一个连接子4结合，连接子4与至少一个第二固相载体3结合，该第二固相载体与至少一个中间子5结合，该中间子5与至少一个引物1结合。

中间子5包括至少一个第三基团和至少一个第四基团，该第三基团与引物1结合，该第四基团与第二固相载体3结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

中间子5能够进一步加强第一固相载体2和第二固相载体3之间的连接稳定性，当中间子5具有多个第三基团时，中间子5的加入进一步提高了第一固相载体表面的引物结合密度，扩大了引物1的可能延伸空间范围，有利于引物在后续的PCR扩增过程中充分与PCR反应液接触，从而提高PCR扩增效率。

中间子5可采用多种化合物，包括但不限于：烷烃、单链核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。

第一固相载体2和第二固相载体3均可采用各种材质，包括但不限于：玻片、硅片、陶瓷、金属、金属氧化物、塑料、橡胶、尼龙。

第一固相载体2的表面可为各种表面，包括但不限于：平面、弧面、波浪形表面、不规则表面或这些表面类型的结合。

第二固相载体3可为各种形状，包括但不限于：球状固相载体、半球状固相载体、椭球状固相载体、方形固相载体或不规则形状的固相载体。

第一固相载体2与第二固相载体3之间的结合方式为通过连接子4携带的基团与第一固相载体2、第二固相载体3携带的基团分别配对，实现间接结合。基团的配对可采用各种形式，包括但不限于：生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

在该种引物-固相载体复合物的一个典型实施例中，第一固相载体2材质为玻片，其表面为平面，玻片表面有多个修饰基团，修饰基团为异硫氰基；第二固相载体为球状的玻璃珠，玻璃珠带有亲和素修饰；连接子4为带有氨基末端和双生物素标记的单链核苷酸分子；中间子5为生物素标记带有多个羧基基团的烷烃；引物1带有标记基团，标记基团为氨基。即第一固相载体2与连接子4的结合方式为异硫氰基-氨基，连接子4与第二固相载体3的结合方式为生物素-亲和素，第二固相载体3与中间子5的结合方式为亲和素-生物素，中间子5与引物1的结合方式为羧基-氨基。

本实施例由于采用球状玻璃珠，并通过球状玻璃珠表面的亲和素与连接子4的生物素、中间子5的生物素结合，然后分别通过连接子4的氨基与第一固相载体2的异硫氰基结合，中间子5的羧基与引物1的氨基结合，从而使得本方案的固相载体表面结合的引物密度比直接结合引物的平面型固相载体(如玻片)高，进而在后续的PCR过程中，提高固相表面的PCR扩增效率，并降低对操作人员的操作要求。应当说明，上述实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

一种引物-固相载体复合物的制备方法，该方法包括：

A.第二固相载体与至少一个引物结合；

B.第一固相载体与至少一个第二固相载体结合；

该步骤A、B无先后顺序。

需要说明的是：

引物-固相载体复合物为上述任一种引物-固相载体复合物。

步骤A中的第二固相载体与引物之间的结合为直接结合或通过中间子间接结合。

该中间子用于结合引物和第二固相载体。

步骤B中的第一固相载体与第二固相载体之间的结合为直接结合或通过连接子间接结合。

该连接子用于结合第一固相载体和第二固相载体。

在本发明的一个实施例中，第二固相载体与至少一个引物结合，同时第一固相载体与至少一个第二固相载体结合，形成引物-固相载体复合物。应当说明，上述实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图17示出了本发明的一个实施例中引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S101.至少一个引物与第二固相载体结合形成引物-第二固相载体复合物；

S102至少一个引物-第二固相载体复合物与第一固相载体结合形成引物-固相载体复合物。应当说明，上述实施例仅为本发明中的一种实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图18示出了本发明的一个实施例中引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S111.至少一个第二固相载体与第一固相载体结合形成固相载体复合物；

S112.至少一个引物与固相载体复合物结合形成引物-固相载体复合物。

应当说明，上述实施例仅为本发明中的一种实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

无论第一固相载体与第二固相载体的结合方式是否与第二固相载体与引物的结合方式相同，均能通过上述三种制备方法实施例进行引物-固相载体复合物的制备。上述制备方法实施例步骤简单，当第一固相载体和第二固相载体的结合方式与第二固相载体与引物的结合方式不同时，使用上述后两个实施例进行引物-固相载体复合物的制备尤佳。

当上述引物-固相载体复合物含有连接子时，引物-固相载体复合物的制备方法包括：

A.第二固相载体与至少一个引物结合；

B.第一固相载体与至少一个连接子结合；

C.连接子与至少一个第二固相载体结合。

所述步骤A、B、C无先后顺序。

图19示出了本发明的一个实施例中含有连接子的引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S121.第二固相载体与至少一个引物结合，同时连接子与至少一个第二固相载体结合，形成引物-第二固相载体-连接子复合物；

S122.第一固相载体与至少一个引物-第二固相载体-连接子复合物结合形成引物-固相载体复合物。

在步骤S121的一个实施例中，步骤S121具体如下：

1).吸取大约10μL磁珠(invitrogen，DynabeadsMyOneTMStreptavidinC1)于0.6mLEP管中，加入1％TritonX-1000.6μL，混匀。用磁铁吸附磁珠，小心除去上清，注意不要吸到磁珠。用10μLTE清洗2次，磁铁吸附磁珠，用移液器除去上清。

2).加入10μL的Bindingbuffer悬浮磁珠，然后再加入1μL浓度为100μM的引物混合物，立即螺旋振荡均匀。

3).将震荡均匀后的EP管放于旋转转盘上低速转动，18至25℃孵育大约1小时，每10至15min轻弹管壁或短暂涡旋混匀磁珠，使生物素引物充分结合到磁珠上。注意：轻弹管壁混匀时不要将磁珠弹到管壁上。

4).利用磁铁吸附住磁珠，小心除去上清，然后用TE清洗磁珠3次。重新用10μLTE悬浮磁珠，即得引物-磁珠-连接子复合物(于4℃保存备用，至少能保存3个月)。

需要说明的是：

在该实施例中，引物混合物包括连接子、双生物素标记的上游引物和双生物素标记的下游引物。

另外，该引物混合物的各组分比例优选如下：

上游引物和下游引物的摩尔数相同，上下游引物摩尔数之和与连接子的摩尔数之比在9∶1至19∶1之间。

更优选地，该连接子为5’双生物素标记的，3’带有氨基末端的单链核苷酸分子，其碱基序列为重复或非重复序列，优选为重复序列，包括但不限于：CA、GT、GCAT。

更进一步优选地，该连接子的碱基数在15至40之间，优选20至30之间，更优选为20。

应当说明，本实施例仅是本发明的步骤S121中的一种实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S122的一个具体实施例中，步骤S122具体如下：

1).将引物-第二固相载体-连接子复合物溶于碱性溶液中，混匀，然后点样至第一固相载体上。

2).将点样后的第一固相载体置于湿润的平皿中，25至42℃固定0.5至3h，即得引物-固相载体复合物。

需要说明的是：

在该实施例中，第一固相载体为表面带有异硫氰基末端的第一固相载体，材质可为各种形式，包括但不限于：玻片、硅片、陶瓷、金属、金属氧化物、塑料、橡胶、尼龙。

该碱性溶液为pH值在8.5至9.5之间的溶液，包括但不限于：碳酸氢钠溶液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris盐酸缓冲液。

步骤2)中固定的时间优选为1h，固定的温度优选为37℃。

应当说明，本实施例仅是本发明的步骤S122中的一种实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图20示出了本发明的一个实施例中含有连接子的引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S131.至少一个引物和第二固相载体形成引物-第二固相载体复合物；

S132.至少一个引物-第二固相载体复合物与连接子结合形成引物-第二固相载体-连接子复合物；

S133.至少一个引物-第二固相载体-连接子复合物与第一固相载体结合形成引物-固相载体复合物。

图21示出了本发明的一个实施例中含有连接子的引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S141.至少一个第二固相载体与连接子结合形成第二固相载体-连接子复合物；

S142.至少一个引物与第二固相载体-连接子复合物结合形成引物-第二固相载体-连接子复合物；

S143.至少一个引物-第二固相载体-连接子复合物与第一固相载体结合形成引物-固相载体复合物。

图22示出了本发明的一个实施例中含有连接子的引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S151.第一固相载体与至少一个连接子结合，同时连接子与至少一个第二固相载体结合，形成第一固相载体-连接子-第二固相载体复合物；

S152.至少一个引物与第一固相载体-连接子-第二固相载体复合物结合形成引物-固相载体复合物。

图23示出了本发明的一个实施例中含有连接子的引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S161.第一固相载体与至少一个连接子结合，形成连接子-第一固相载体复合物；

S162.至少一个第二固相载体与连接子-第一固相载体复合物结合，形成第一固相载体-连接子-第二固相载体复合物；

S163.至少一个引物与第一固相载体-连接子-第二固相载体复合物结合形成引物-固相载体复合物。

图24示出了本发明的一个实施例中含有连接子的引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S171.至少一个第二固相载体与连接子结合，形成连接子-第二固相载体复合物；

S172.至少一个连接子-第二固相载体复合物与第一固相载体结合，形成第一固相载体-连接子-第二固相载体复合物；

S173.至少一个引物与第一固相载体-连接子-第二固相载体复合物结合形成引物-固相载体复合物。

图25示出了本发明的一个实施例中含有连接子的引物-固相载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S181.至少一个引物与第二固相载体结合，形成引物-第二固相载体复合物；至少一个连接子与第一固相载体结合，形成连接子-第一固相载体复合物；

S182.至少一个引物-第二固相载体复合物与连接子-第一固相载体复合物结合形成引物-固相载体复合物。

图26示出了本发明的一个实施例中利用引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法，该方法包括以下步骤：

S201.将核酸分子结合到引物-固相载体复合物上；

S202.在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的核酸分子为模版进行PCR扩增反应，得到扩增产物。

该引物-固相载体复合物为上述任一种引物-固相载体复合物，包括引物和固相载体，所述固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，所述第一固相载体与至少一个第二固相载体结合，所述第二固相载体与至少一个引物结合。

本方案具有以下优点：

1)不同核酸分子之间的扩增互不干扰，分别固定在第二固相载体表面上；

2)与现有的表面桥式PCR相比，因为上述的引物-固相载体复合物具有更高的引物结合密度，且固相载体上结合的引物可能的延伸空间范围也更大，所以本方案的固相表面的PCR扩增效率更高，同时又保持了现有的表面桥式PCR操作要求较低这一优点；

3)与现有的乳液PCR相比，本方法能够缩短PCR扩增的时间，提高效率，且对PCR操作的要求更低；

4)如果PCR扩增产物用于测序反应，那么扩增效率的提高能够降低测序反应时对系统光源的要求；

5)本发明方法，通用性高，可在测序仪上直接进行样品制备。

需要说明的是：

该核酸分子可以是DNA，也可以是RNA；当其为RNA时，相应的引物-固相载体复合物上的引物带有RNA逆转录酶初始序列，步骤B的PCR扩增反应是在RNA逆转录酶的作用下进行的。

步骤S201的核酸分子可以只有一种或多种；核酸分子的序列可以是已知或未知。

步骤S201的引物-固相载体复合物上的引物至少有一种。

当该引物-固相载体复合物上的引物只有1种，且核酸分子为双链DNA时，有以下几种情况：

1)步骤S201的核酸分子的两个末端不存在反向重复序列，即引物-固相载体复合物中的引物只能与核酸分子中一条链的3’末端互补配对或部分互补配对时，PCR扩增反应为非桥式PCR扩增，可以有两种PCR扩增形式。

一种是单引物扩增，这种扩增的扩增效率虽然不如双引物扩增那么高，但是引物-固相载体复合物上固定的PCR产物的最大量仍然是等于引物-固相载体复合物上固定的引物数量。

另一种是在PCR反应时加入自由引物，所述自由引物在PCR反应液中处于游离状态，与核酸分子中另一条条链的3’末端互补配对或部分互补配对，这种PCR扩增反应同样是双引物扩增，扩增效率高，且被固定在引物-固相载体复合物上的扩增产物均处于同一方向，有利于扩增产物的应用，特别是在测序反应中的应用。

2)步骤S201的核酸分子的两个末端存在反向重复序列，即引物-固相载体复合物中的引物能同时与核酸分子中一条链的3’末端和5’末端互补配对或部分互补配对，PCR扩增反应为桥式PCR扩增，单链核酸分子或PCR扩增产物可在同一固相载体上成桥或在不同固相载体之间成桥。

当该引物-固相载体复合物上的引物有2种，且核酸分子为双链DNA时，优选地，引物-固相载体复合物上的这两种引物分别与核酸分子的两条链的3’末端互补配对或部分互补配对。这样，步骤B的PCR扩增反应即为桥式PCR扩增，单链核酸分子或PCR扩增产物可在同一固相载体上成桥或在不同固相载体之间成桥。

步骤S202所述PCR扩增反应为等温PCR扩增反应或热循环PCR扩增反应。等温扩增反应，即在PCR反应过程中，变性、退火和延伸的温度保持一致的PCR扩增反应。热循环PCR扩增反应，即在PCR反应过程中，变性温度和退火温度、延伸温度不同，需循环进行加热、降温的PCR扩增反应。

步骤S202所述PCR扩增反应为桥式PCR反应或非桥式PCR反应。桥式PCR反应，即在PCR反应中用于扩增的上下游引物均被固定，这样扩增产物、用于扩增的模版链分别通过与上下游引物结合而成桥。

更进一步的，步骤S202所述PCR扩增反应为桥式PCR等温扩增反应。该桥式PCR等温扩增反应，指其既是等温扩增反应，又是桥式PCR反应。

根据引物-固相载体复合物的不同，步骤S201和步骤S202会有所不同。

对于图26所示的利用引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法，其包含的各种技术方案将在下述的多个实施例中进行详细阐释。

以该核酸分子为双链DNA分子为例：

1)该引物-固相载体复合物包括引物、固相载体和连接子；该引物的5’端带有标记基团，该标记基团为生物素，且为双生物素标记，该引物包括双生物素标记的上游引物和双生物素标记的下游引物，它们分别与核酸分子的两条链的3’末端互补配对或部分互补配对；该固相载体包括第一固相载体和第二固相载体；该第一固相载体材质为玻片，与第二固相载体结合的表面为平面，该第一固相载体的修饰基团为异硫氰基，玻片表面有多个修饰基团；该第二固相载体为无荧光标记的磁珠，该第二固相载体表面的功能基团为链霉亲和素，该第二固相载体优选为购于invitrogen的DynabeadsMyOne^TMStreptavidinC1；该连接子为3’带有氨基末端，5’端带有双生物素标记的单链核苷酸分子。该单链核苷酸分子的碱基数在15至40之间，优选20至30之间；该单链寡核苷酸分子的碱基序列为重复或非重复序列，优选为重复序列，如CA、GT、GCAT。

在步骤S201的第一实施例中，将双链DNA分子在70℃条件下变性，形成单链核酸分子，然后退火使单链核酸分子结合到引物-固相载体复合物上。

在步骤S201的第二实施例中，将双链DNA分子在80℃条件下变性，形成单链核酸分子，然后退火使单链核酸分子结合到引物-固相载体复合物上。

在步骤S201的第三实施例中，将双链DNA分子在稀碱溶液(如：0.1MNaOH溶液)中变性，形成单链，然后用1×PCRbuffer快速冲洗或稀释，然后使单链核酸分子结合到引物-固相载体复合物上。

应当说明，上述实施例，仅为本发明的步骤S201的几种实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S202的第一实施例中，PCR扩增反应为等温PCR扩增反应，包括以下步骤：

a.37℃，meltingbuffer冲洗10s，后用ReactionBuffer冲洗2次，400ul/次；

b.37℃，加入150ulReactionBuffer，静置5min；

c.37℃，加入PCR反应液，反应10min，然后用washingbuffer冲洗1次，300ul/次；

重复步骤a至c80次；

d.10℃，加入ReactionBuffer，保温。

该meltingbuffer为0.1MNaOH溶液；该ReactionBuffer即klenowbuffer，为pH为7.9的Tris-HCl溶液，含有50mMNaCl，10mMTris-HCl，10mMMgCl₂，1mMDTT；该washbuffer为pH7.5的Tris-HCl溶液，含有10mMTris-HCl，2mMEDTA，50mMKCl；该PCR反应液体系如下：

通过上述PCR扩增反应，每平方微米的玻片可固定有5万多个PCR扩增产物链，而现有的表面桥式PCR中每平方微米的玻片仅固定有1000个左右的PCR扩增产物链。

本实施例的PCR扩增反应过程中，变性、退火和延伸的温度均为37℃，温度较低，在保证了PCR扩增的效率的前提下，既能够让引物-固相载体复合物在PCR反应过程中保持稳定，又避免了升降温过程，防止PCR反应体系溶液因为高温而蒸发，进而影响PCR扩增的进行，且对仪器的要求较低，无需专门的PCR仪。

应当说明，上述实施例，仅为本发明的步骤S202的一种实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

2)该引物-固相载体复合物包括引物和固相载体，该引物5’带有标记基团，该标记基团为巯基，该引物有两种，它们分别与核酸分子的两条链的3’端互补配对或部分互补配对；该固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，该第一固相载体是表面为平面的玻片，玻片表面有多个修饰基团，该修饰基团为巯基，该第二固相载体为无荧光标记的玻璃珠，该第二固相载体表面有功能基团，该功能基团为纳米金。上述每个第二固相载体与多个引物结合，上述每个第一固相载体与多个第二固相载体结合。

在步骤S201的一个实施例中，将双链DNA分子在95℃变性60s，然后将变性后的模板迅速加至引物-固相载体复合物上，退火，使模板结合至引物-固相载体复合物的引物上，用1×PCRbuffer冲洗去除未结合的模板。

在步骤S202的一个实施例中，PCR扩增反应为热循环PCR扩增反应，包括以下步骤：

a.配置PCR反应液；

b.按以下程序进行PCR扩增：

b1.94℃变性15s；

b2.56℃退火15s；

b3.72℃延伸60s；

b1至b3循环30次；

c.72℃延伸10min；

d.4℃保温。

该PCR反应液体系如下：

应当说明，上述2种基于不同的引物-固相载体复合物而进行PCR扩增的方法，仅为本发明的2种实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图27示出了一种PCR扩增方法，包括以下步骤：

S211.制备引物-固相载体复合物；

S212.将核酸分子结合到所述引物-固相载体复合物上；

S213.在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的单链核酸分子为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物。

该引物-固相载体复合物是上述任一种引物-固相载体复合物，其制备方法，即步骤S211可采用上述任一种引物-固相载体复合物的制备方法。

图28示出了一种核酸测序方法，包括以下步骤：

S301.将核酸分子结合到引物-固相载体复合物上；

S302.在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的核酸分子为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；

S303.对扩增产物进行核酸测序。

该引物-固相载体复合物包括引物和固相载体，所述固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，所述第一固相载体与至少一个第二固相载体结合，所述第二固相载体与至少一个引物结合。

本方法利用上述引物-固相载体复合物，大大提高了固相表面的PCR扩增效率，有利于后续测序反应的顺利进行。

在步骤S303的一个实施例中，包括以下步骤：

S3031.变性扩增产物，使其形成单链，得到固定在引物-固相载体复合物上的单链扩增产物；

S3032.利用碱基互补原则，对固定在引物-固相载体复合物上的扩增产物进行核酸测序反应。

在步骤S3031的一个实施例中，扩增产物的变性是通过稀碱溶液将扩增产物变性成单链，该稀碱溶液包括但不限于：0.1M的NaOH溶液。

在步骤S3031的一个实施例中，扩增产物的变性是通过高温来实现的，例如95℃60s。

另外，在步骤S3031之后，S3032之前，往往还需要进行步骤S3031’：将未结合在引物-固相载体上的单链分子去除。

应当说明，上述实施例，仅为本发明的步骤S303的几种实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S3032的具体实施例中，进行核酸测序反应的方法包括但不限于：Sanger测序法、焦磷酸测序法或循环可切除测序法。

循环可切除测序法，即在测序过程中，依次逐个添加带有荧光标记的核苷酸或寡核苷酸序列，继而检测荧光信号，切除荧光信号，如此往复最终获得扩增产物的碱基序列。

具体的来说，循环可切除测序法包括但不限于：合成测序法、连接测序法。

1)以合成测序法为例

本方法是基于带可去除标记的四种核苷酸进行的，该带可去除标记的四种核苷酸因其自身带有的可去除标记，在每次合成反应中，每个模板链至多只能延伸一次，该合成测序法的大致流程如下：

a.测序引物通过互补配对结合在单链扩增产物共有的已知序列上(该单链扩增产物固定在引物-固相载体复合物上)，在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的四种核苷酸进行单碱基延伸合成反应，收集该次加入核苷酸的标记信号，即可得到与测序引物3’最末端碱基互补的单链扩增产物(固定在引物-固相载体复合物上)的下一位的碱基序列信息。

b.切除可去除标记，然后在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的四种核苷酸继续进行单碱基延伸合成反应，收集加入核苷酸的标记信号，即可得到与测序引物3’末端碱基互补的单链扩增产物(固定在引物-固相载体复合物上)的下两位的碱基序列信息。

重复b步骤，直至不能继续进行合成反应，从而获得单链扩增产物的全部序列信息。

在这个实施例中，由于采用了引物-固相载体复合物，大大提高了固相表面的PCR扩增效率，进而降低了后续测序反应对系统光源的要求；且因为利用上述引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法通用性高，可在测序仪上直接进行测序样本的制备(PCR扩增)，而且制备的产物只需简单的处理即能用于测序反应，如去除PCR扩增时加入的反应试剂，将制备的产物变性成单链，所以能够简化核酸测序的操作步骤和流程，提高高通量核酸测序的效率。

2)以连接测序法为例

本方法是基于在特定位置带有荧光标记的寡核苷酸探针进行的，该寡核苷酸探针带有n个碱基，从其5’端数起的第a位带有荧光标记，其中不同的碱基对应不同的荧光标记，因为该寡核苷酸探针的3’端进行了特定的修饰，在去除该荧光标记之前不能继续进行连接反应，该连接测序法的大致流程如下：

a.寡核苷酸链通过互补配对结合在单链扩增产物共有的已知序列上(该单链扩增产物固定在引物-固相载体复合物上)上，利用上述的寡核苷酸探针，在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，，然后采集荧光信号，即可得到与单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后第a位碱基序列信息。

b.切除寡核苷酸上的荧光标记，在连接酶的作用下，以上述的寡核苷酸探针为原料，继续进行连接反应，然后采集荧光信号，从而得到单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后第2a位的碱基序列信息。

重复b步骤，直至不能继续进行连接反应，从而获得单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后第a、2a、3a、4a......位的碱基序列信息。

然后将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单链扩增产物上变性洗脱下来，换用与原测序引物的3’末端少一个碱基的引物重复上述反应，从而获得单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后第a-1、2a-1、3a-1、4a-1......位的碱基序列信息。重复此步骤，最后获得单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后第a-(a-1)、2a-(a-1)、3a-(a-1)、4a-(a-1)......位的碱基序列信息，从而获得单链扩增产物的全部序列信息。

在这个实施例中，由于采用了引物-固相载体复合物，大大提高了固相表面的PCR扩增效率，进而降低了后续测序反应对系统光源的要求；且因为利用上述引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法通用性高，可在测序仪上直接进行测序样本的制备(PCR扩增)，而且制备的产物只需简单的处理即能用于测序反应，如去除PCR扩增时加入的反应试剂，将制备的产物变性成单链，所以能够简化核酸测序的操作步骤和流程，提高高通量核酸测序的效率。

应当说明，上述两个实施例仅是本发明的两个具体实施例，对本发明的保护范围无具体限定作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (20)

1.一种引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A．第二固相载体与至少一个引物结合；

B．第一固相载体与至少一个第二固相载体结合；

所述步骤B中的第一固相载体与第二固相载体之间的结合为通过连接子间接结合，所述步骤B包括以下步骤：

B1．第一固相载体与至少一个连接子结合；

B2．连接子与至少一个第二固相载体结合；

所述连接子包括一个第一基团和至少一个第二基团；所述第一基团与第一固相载体结合，所述第二基团与第二固相载体结合；

所述步骤A、B2无先后顺序，形成引物-第二固相载体-连接子复合物；然后再进行步骤B1，形成引物-固相载体复合物；

所述步骤B1包括：

B11．将引物-第二固相载体-连接子复合物溶于碱性溶液中，混匀，然后点样至第一固相载体上，所述第一固相载体为表面带有异硫氰基末端的第一固相载体；所述碱性溶液为pH值在8.5至9.5之间的碳酸氢钠溶液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris盐酸缓冲液；

B12．将点样后的第一固相载体于25至42℃固定0.5至3h，得到引物-固相载体复合物。

2.根据权利要求1所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的第二固相载体与引物之间的结合为直接结合或通过中间子间接结合。

3.根据权利要求2所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的第二固相载体与引物之间的结合为通过中间子间接结合，所述步骤A包括以下步骤：

A1．第二固相载体与至少一个中间子结合；

A2．中间子与至少一个引物结合；

所述步骤A1、A2无先后顺序。

4.根据权利要求1所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述连接子为烷烃、单链核苷酸分子或含多聚物部分的化合物。

5.根据权利要求4所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述连接子为带有氨基末端和双生物素标记的单链核苷酸分子，该连接子中第一基团为氨基，第二基团为生物素标记；或

所述连接子为硅烷基修饰的带有多个巯基基团的烷烃，该连接子中第一基团为硅烷基，第二基团为巯基；或

所述连接子为带有多聚物部分的化合物，该化合物带有亲和素基团，且多聚物部分中的每个单体均带有一个氨基，该连接子中第一基团为亲和素基团，第二基团为氨基。

6.根据权利要求5所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述单链核苷酸分子的碱基数在15至40之间。

7.根据权利要求5或6所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述单链核苷酸分子的碱基序列为重复序列。

8.根据权利要求2所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述中间子包括至少一个第三基团和至少一个第四基团；所述第三基团与引物结合，所述第四基团与第二固相载体结合。

9.根据权利要求8所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述中间子为烷烃、单链核苷酸分子或含多聚物部分的化合物。

10.根据权利要求9所述的引物-固相载体复合物的制备方法，其特征在于，所述中间子为带有巯基和至少两个氨基的烷烃，该中间子中第三基团为氨基，第四基团为巯基；或

所述中间子为生物素标记的带有多个羧基基团的烷烃，该中间子中第三基团为羧基，第四基团为生物素标记。

11.一种基于引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A’：采用权利要求1所述的方法制备引物-固相载体复合物；

A．将单链核酸分子结合到引物-固相载体复合物上；

B．在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的单链核酸分子为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物。

12.根据权利要求11所述的PCR扩增的方法，其特征在于，所述引物-固相载体复合物上的引物只有一种，所述单链核酸分子的两个末端不存在反向重复序列；

在所述步骤B在进行PCR反应时加入自由引物；

所述自由引物在PCR反应液中处于游离状态，与单链核酸分子的互补链的3’末端互补配对或部分互补配对。

13.根据权利要求11所述的PCR扩增的方法，其特征在于，所述步骤B中的PCR扩增反应为桥式PCR扩增反应。

14.根据权利要求13所述的PCR扩增的方法，其特征在于，所述步骤B中的PCR扩增反应为桥式PCR等温扩增反应。

15.根据权利要求14所述的PCR扩增的方法，其特征在于，所述桥式PCR等温扩增反应包括以下步骤：

a、37℃，meltingbuffer冲洗10s，后用ReactionBuffer冲洗2次，400μL/次；

b、37℃，加入150μLReactionBuffer，静置5min；

c、37℃，加入PCR反应液，反应10min，然后用washingbuffer冲洗1次，300μL/次；

重复步骤a至c80次；

d、10℃，加入ReactionBuffer，保温。

16.一种利用引物-固相载体复合物进行核酸测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A’：采用权利要求1所述的方法制备引物-固相载体复合物；

A．将核酸分子结合到引物-固相载体复合物上;

B．在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的核酸分子为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；

C．对扩增产物进行核酸测序。

17.根据权利要求16所述的核酸测序的方法，其特征在于，所述步骤B中的PCR扩增反应为桥式PCR等温扩增反应。

18.根据权利要求17所述的核酸测序的方法，其特征在于，所述桥式PCR等温扩增反应包括以下步骤：

a、37℃，meltingbuffer冲洗10s，后用ReactionBuffer冲洗2次，400μL/次；

b、37℃，加入150μLReactionBuffer，静置5min；

c、37℃，加入PCR反应液，反应10min，然后用washingbuffer冲洗1次，300μL/次；

重复步骤a至c80次；

d、10℃，加入ReactionBuffer，保温。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的核酸测序的方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤：

C1．变性扩增产物，使其形成单链，得到固定在引物-固相载体复合物上的单链扩增产物；

C2．利用碱基互补原则，对固定在引物-固相载体复合物上的扩增产物进行核酸测序反应。

20.根据权利要求19所述的核酸测序的方法，其特征在于，所述步骤C2中的进行核酸测序反应的方法采用Sanger测序法、焦磷酸测序法或循环可切除测序法。