JP2023532905A - トランスポソーム担体としてのビーズ - Google Patents

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Abstract

分解性ポリエステルビーズであって、その表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含み、各トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含み、ポリエステルビーズが、５０℃～６５℃の融解温度を有する、分解性ポリエステルビーズが記載される。これらのポリエステルビーズに関連するフローセル及び方法が記載される。ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物、並びにナノ粒子に固定化されたトランスポソーム複合体を含むかかる組成物の使用方法も本明細書に記載される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年７月８日に出願された米国仮特許出願第６３／０４９，１７２号の優先権の利益を主張し、この出願は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
（配列表）
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願されている。配列表は、「２０２１－０６－１７＿０１２４３－００１８－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたファイル（２０２１年６月１７日作成、４，０９６バイトのサイズ）として提供されている。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本出願は、トランスポソーム担体としての分解性ポリエステルビーズ及びこれらのビーズを含むフローセルに関する。これらのビーズは、配列決定ライブラリーを調製するための様々な方法において使用され得る。
ビーズ連結トランスポソームは、配列決定のためのライブラリーを調製するための様々な方法において使用される。いくつかのシステムでは、非分解性Ｍ－２８０磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が、固相可逆的固定化（solid-phase reversible immobilization、ＳＰＲＩ）ビーズとしてライブラリークリーンアップのために使用されるか、又は長いＤＮＡ分子のオンビーズライブラリー調製を可能にし、生成されたＤＮＡライブラリーのフローセルへの直接送達を制御するためのトランスポソーム担体として使用される。しかしながら、Ｍ－２８０ビーズは、シーケンサーの下流のチューブ及びバルブに混入し、自動調製中に機器の詰まり又は損傷を引き起こす可能性がある。
遺伝物質を表面上での捕捉を可能にすることができる物質として、分解性ヒドロゲルビーズが提案されている。しかしながら、これらのヒドロゲルビーズは、遺伝物質を取り囲むか又はカプセル化し、次いで、液体拡散バリア又は非混和性流体の存在下で分解される（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４４６４６号及び同第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４４８５５号を参照のこと）。ヒドロゲルビーズは多孔性であり得、ビーズ表面を越えて酵素を透過し得る。ビーズ表面へのカップリング（例えば、タグメンテーション反応のためのトランスポソーム複合体及び／又は標的核酸の表面カップリング）を可能にするビーズなどの、様々な異なる配列決定フォーマットを支持するために、代替タイプのビーズが必要とされる。
本明細書では、自動調製を含む方法を改善するためにトランスポソーム担体として使用するための分解性ポリカプロラクトン（polycaprolactone、ＰＬＣ）ビーズを記載する。例えば、ストレプトアビジンは、ＰＬＣマイクロスフェア表面の表面にコンジュゲートさせることができ、ＰＬＣマイクロスフェア表面でのビオチンのコンジュゲートしたトランスポソームのアセンブリを可能にし、局在化されたライブラリー放出及びクラスター化のためのビオチン化フローセル表面へのＰＬＣビーズの付着も可能にする。ライブラリー放出及びフローセル表面への播種の後、ＰＬＣビーズを選択的に分解して、シーケンサー流体システムのあらゆる潜在的な損傷又は詰まりを回避することができる。このようにして、本発明のビーズを組み込む方法は、下流プロセスに悪影響を及ぼすことなく、ビーズ表面上でのタグメンテーション及びフローセルに近接したその後の配列決定ライブラリーの放出を可能にする。
本明細書ではまた、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物を使用するライブラリー調製の方法も開示する。ライブラリー調製は、全ての次世代配列決定（next-generation sequencing、ＮＧＳ）用途にとって重要な初期工程である。ビーズ連結トランスポソーム（Bead-linked transposome、ＢＬＴ）ライブラリーの構築は、別個のＤＮＡ断片化工程の必要性を排除し、ＤＮＡ断片間のライゲーションの必要条件を除去することによって、ＤＮＡライブラリー調製プロセスを大幅に改善した。しかしながら、ＢＬＴのライブラリーのインサートサイズは、ビーズ上のＴｎ５トランスポソームの分布に依存する。短すぎる（低出力、短いリード）又は長すぎる（不十分なクラスタリング）ライブラリーを除去するためには、片側又は両側サイズ選択（ＳＰＲＩビーズなどを用いる）が必要である。次いで、これらのサイズ選択されたライブラリーサンプルの濃度及びサイズは、サイズ選択後に定量化される必要があり、ライブラリーは、変性後に適切な濃度に希釈又は正規化される必要がある。次いで、増幅反応（クラスター化）の前に、ライブラリーをフローセルに播種する。ライブラリーサンプルのかなりの部分がこれらの全ての工程の間に消費されるが、ライブラリーサンプルの比較的わずかな割合のみが配列決定され得る。本明細書中に記載されるように、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物は、ライブラリー生成の改善された方法において使用され得る。
本明細書では、分解性ポリエステルビーズを記載する。本明細書ではまた、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物も記載する。
実施形態１．分解性ポリエステルビーズであって、その表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含み、各トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含み、ポリエステルビーズが、５０℃～６５℃、又は６０℃の融解温度を有する、分解性ポリエステルビーズ。
実施形態２．ポリエステルビーズが、ポリカプロラクトンを含む、実施形態１に記載の分解性ポリエステルビーズ。
実施形態３．実施形態１又は実施形態２に記載の分解性ポリエステルビーズであって、それに固定化された複数の磁性ナノ粒子を含み、任意選択的に、磁性ナノ粒子が、磁性コアを有するビーズであり、任意選択的に、磁性コアが、鉄、ニッケル、及び／又はコバルトを含む、分解性ポリエステルビーズ。
実施形態４．各トランスポソーム複合体が、ポリヌクレオチド結合部分を含み、ビーズが、その表面に共有結合した複数のビーズ結合部分を含み、トランスポソーム複合体が、ポリヌクレオチド結合部分のビーズ結合部分への結合を介してビーズ表面に固定化されている、実施形態１～３のいずれか１つに記載のポリエステルビーズ。
実施形態５．各ポリヌクレオチド結合部分が、各トランスポソーム複合体の第１のポリヌクレオチドに共有結合している、実施形態４に記載のポリエステルビーズ。
実施形態６．各ポリヌクレオチド結合部分が、各トランスポソーム複合体の第２のポリヌクレオチドに共有結合している、実施形態４に記載のポリエステルビーズ。
実施形態７．ビーズ結合部分が、ストレプトアビジン又はアビジンであり、ポリヌクレオチド結合部分が、ビオチンである、実施形態４～６のいずれか１つに記載のポリエステルビーズ。
実施形態８．各ビーズ結合部分が、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合しており、リンカーが、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を任意選択的に含む、実施形態４～７のいずれか１つに記載のポリエステルビーズ。
実施形態９．各磁性ナノ粒子が、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合しており、リンカーが、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を任意選択的に含む、実施形態３～６のいずれか１つに記載のポリエステルビーズ。
実施形態１０．ポリエステルビーズが、フローセルの表面上に固定化されている、先行実施形態のいずれか１つに記載のポリエステルビーズ。
実施形態１１．ポリエステルビーズが、フローセルの表面上のフローセル結合部分へのビーズ結合部分の共有結合によって、フローセルの表面上に固定化されている、実施形態１０に記載のポリエステルビーズ。
実施形態１２．ポリヌクレオチド結合部分及びフローセル結合部分が、同じタイプの結合部分であり、トランスポソーム複合体が、ビーズ上のビーズ結合部分の第１の部分に結合し、フローセル結合部分が、ビーズ上のビーズ結合部分の第２の部分に結合する、実施形態１１に記載のポリエステルビーズ。
実施形態１３．標的核酸又はその１つ以上の断片を含み、任意選択的に、大部分のトランスポソーム複合体が、ビーズの表面に固定化されている、先行実施形態のいずれかに記載のポリエステルビーズ。
実施形態１４．フローセルの表面に固定化されたポリエステルビーズを含むフローセルであって、ポリエステルビーズが、その表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含み、各トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含み、ポリエステルビーズが、５０℃～６５℃、又は６０℃の融解温度を有する、フローセル。
実施形態１５．ポリエステルビーズが、ポリカプロラクトンを含む、実施形態１４に記載のフローセル。
実施形態１６．ポリエステルビーズが、それに固定化された複数の固定化ナノ粒子を含む、実施形態１４又は実施形態１５に記載のフローセル。
実施形態１７．各トランスポソーム複合体が、ポリヌクレオチド結合部分を含み、ビーズが、その表面に共有結合した複数のビーズ結合部分を含み、トランスポソーム複合体が、ポリヌクレオチド結合部分のビーズ結合部分への結合を介してビーズ表面に固定化されている、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載のフローセル。
実施形態１８．各ポリヌクレオチド結合部分が、各トランスポソーム複合体の第１のポリヌクレオチドに共有結合している、実施形態１７に記載のフローセル。
実施形態１９．各ポリヌクレオチド結合部分が、各トランスポソーム複合体の第２のポリヌクレオチドに共有結合している、実施形態１７に記載のフローセル。
実施形態２０．ビーズ結合部分が、ストレプトアビジン又はアビジンであり、ポリヌクレオチド結合部分が、ビオチンである、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載のフローセル。
実施形態２１．各ビーズ結合部分が、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合しており、リンカーが、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を任意選択的に含む、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載のフローセル。
実施形態２２．各磁性ナノ粒子が、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合しており、リンカーが、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を任意選択的に含む、実施形態１６～２１のいずれか１つに記載のフローセル。
実施形態２３．ポリエステルビーズが、ビーズ結合部分のフローセルの表面上のフローセル結合部分への共有結合によってフローセルの表面上に固定化されているか、又はビーズが、ビーズに固定化された複数の固定化磁性ナノ粒子を含み、任意選択的に、磁性ナノ粒子が、ポリエステルビーズをフローセルの表面に播種するために使用される、実施形態１４～２２のいずれか１つに記載のフローセル。
実施形態２４．ポリヌクレオチド結合部分及びフローセル結合部分が、同じタイプの結合部分であり、トランスポソーム複合体が、ビーズ上のビーズ結合部分の第１の部分に結合し、フローセル結合部分が、ビーズ上のビーズ結合部分の第２の部分に結合する、実施形態２３に記載のフローセル。
実施形態２５．標的核酸又はその１つ以上の断片を含み、任意選択的に、大部分のトランスポソーム複合体が、ビーズの表面に固定化されている、実施形態１４～２４のいずれか１つに記載のフローセル。
実施形態２６．標的核酸から核酸ライブラリーを調製する方法であって、標的核酸がトランスポソーム複合体によって断片化され第１のポリヌクレオチドの３’トランスポゾン末端配列が断片の少なくとも１つの鎖の５’末端に転移される条件下で、標的核酸を実施形態１～１２のいずれか１つに記載のポリエステルビーズ又は実施形態１４～２５のいずれか１つに記載のフローセルと接触させ、それによって、少なくとも１つの鎖がタグで５’タグ付けされている断片の固定化ライブラリーを生成させることを含む、方法。
実施形態２７．接触させることが、標的核酸を実施形態１～８のいずれか１つに記載のポリエステルビーズと接触させることを含み、方法が、断片の固定化ライブラリーを含むビーズをフローセルの表面に固定化することを含む、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８．ビーズが、フローセルの表面上のフローセル結合部分へのビーズ結合部分の結合を介してフローセルの表面に固定化されるか、又はビーズが、ビーズに固定化された複数の固定化磁性ナノ粒子を含み、任意選択的に、磁性ナノ粒子が、ポリエステルビーズをフローセルの表面に播種するために使用される、実施形態２６又は実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９．接触させることが、標的核酸を実施形態１０～１２のいずれか１つに記載のポリエステルビーズと接触させることを含む、実施形態２２に記載の方法。
実施形態３０．固定化ビーズから断片を放出して使用済みビーズを提供することと、放出された断片をフローセル表面に捕捉して捕捉された断片を生成させることと、を含む、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１．固定化ビーズから断片を放出させることが、ビーズから断片を増幅することを含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２．放出された断片を捕捉することが、放出された断片をフローセルの表面上の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む、実施形態３０又は実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３．フローセル表面上の捕捉された断片を増幅して、固定化された増幅された断片を生成させることを含む、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４．捕捉された断片を増幅することが、断片のクラスターを生成させるためのブリッジ増幅を含む、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５．使用済みビーズを過剰の溶液相フローセル結合部分で処理して、溶液相使用済みビーズを提供することによって、フローセル表面から使用済みビーズを分離することを含む、実施形態３０～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６．溶液相使用済みビーズを分解剤で分解することを含む、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７．フローセルから分解されたビーズを除去することを含む、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．分解剤が、（ａ）５０℃～６５℃、若しくは６０℃の温度であり、及び／又は、（ｂ）水性塩基である、実施形態３６又は実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９．水性塩基が、ＮａＯＨである、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０．水性塩基が、１Ｍ～５Ｍ ＮａＯＨである、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１．水性塩基が、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、又は５Ｍ ＮａＯＨである、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２．水性塩基が３Ｍ ＮａＯＨである、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４３．固定化され、増幅された断片又は断片のクラスターを配列決定することを含む、実施形態３３～４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４．複数のトランスポソーム複合体をポリエステルビーズに固定化することを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のポリエステルビーズを作製する方法であって、各トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含む、方法。
実施形態４５．複数の磁性ナノ粒子をポリエステルビーズに固定化することを含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６．ビーズ及びナノ粒子を含む組成物であって、ビーズが、ナノ粒子に結合することができる官能基を含み、任意選択的に、ナノ粒子又はビーズが磁性を有する、組成物。
実施形態４７．ナノ粒子が、合成デンドロン、ＤＮＡデンドロン、若しくはポリマーブラシであり、かつ／又は、ナノ粒子が、ハードコアビーズを含み、任意選択的に、ナノ粒子が、５０～１５０ｎｍの直径を有し、更に任意選択的に、ナノ粒子が、１００ｎｍの直径を有する、実施形態４６に記載の組成物。
実施形態４８．ナノ粒子が、単一の固定化されたトランスポソーム複合体、又は２つ以上の固定化されたトランスポソーム複合体を含み、任意選択的に、２つ以上の固定化されたトランスポソーム複合体が、ナノ粒子上の各トランスポソーム複合体の間で同等の距離で固定化されている、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４９．固定化されたトランスポソーム複合体又は複数のトランスポソーム複合体が、トランスポザーゼがナノ粒子から離れる方向を向くように配向されている、実施形態４８に記載の組成物。
実施形態５０．トランスポソーム複合体が、（ａ）ビオチン、デスチオビオチン、若しくはデュアルビオチンを含むトランスポゾンの、ナノ粒子上に含まれるアビジン若しくはストレプトアビジンへの結合によって、又は、（ｂ）トランスポゾンに含まれる薬剤とナノ粒子に含まれる薬剤との間のクリックケミストリー反応によって、ナノ粒子に固定化されており、任意選択的に、クリックケミストリー反応が、ナノ粒子上のアジドとトランスポゾン上のジベンジルシクロオクチン（dibenzylcyclooctyne、ＤＢＣＯ）との間の反応である、実施形態４８又は実施形態４９に記載の組成物。
実施形態５１．ビーズが、複数のナノ粒子に結合することができる担体ビーズであり、任意選択的に、ビーズが、１μｍ以上の直径を有し、かつ／又はビーズが、実施形態１～８のいずれか１つに記載の分解性ポリエステルビーズである、実施形態４６～４９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５２．官能基が、化学結合ハンドル及び／若しくはクラスター化プライマーであり、任意選択的に、（ａ）化学結合ハンドル及び／若しくはクラスター化プライマーが、ナノ粒子に直接的に結合している、（ｂ）化学結合ハンドル及び／若しくはクラスター化プライマーが、ナノ粒子に間接的に結合している、又は（ｃ）化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、ビーズ中に含まれるクラスター化プライマー及びナノ粒子の両方に結合している、実施形態４６～５０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５３．ナノ粒子とビーズとの間の相互作用が、可逆的及び／又は非共有結合性相互作用であり、任意選択的に、可逆的及び／又は非共有結合性相互作用が、タンパク質－リガンド相互作用又は金属－キレート剤相互作用であり、更に任意選択的に、タンパク質－リガンド相互作用が、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用であるか、又は金属－キレート剤相互作用が、ニッケル－ポリヒスチジン若しくはコバルト－ポリヒスチジン相互作用である、実施形態４６～５２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５４．ビーズが、クラスター化プライマーを含み、ナノ粒子が、固定化オリゴヌクレオチドを含み、任意選択的に、固定化オリゴヌクレオチド及びクラスター化プライマーが、互いに直接的に結合するか、又は連結オリゴヌクレオチドが、固定化オリゴヌクレオチド及びクラスター化プライマーの両方に結合することができる、実施形態４６～５３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５５．ナノ粒子とビーズとの間の相互作用が、不可逆的及び／又は共有結合性相互作用であり、任意選択的に、共有結合性相互作用が、ビーズとナノ粒子との間の切断可能リンカーであり、更に任意選択的に、切断可能リンカーが、化学的又は酵素的に切断可能なリンカーである、実施形態４６～５２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５６．フローセルに播種する方法であって、（ａ）実施形態４６～５５のいずれか１つに記載の組成物のビーズ及びナノ粒子を解離させることであって、任意選択的に、ビーズ及びナノ粒子を解離させることが、切断可能なリンカーの切断によるか、又はナノ粒子とビーズとの間の可逆的及び／若しくは非共有結合性相互作用の解離による、解離させることと、（ｂ）ナノ粒子をフローセルの表面上に固定化することと、を含む、方法。
実施形態５７．実施形態５６に記載の方法によって調製された、フローセルの表面に固定化されたナノ粒子を含む、フローセル、又は、フローセルの表面に固定化された実施形態４６～５５のいずれか１つに記載の組成物を含む、フローセルであって、任意選択的に、組成物が、フローセルの表面へのナノ粒子の結合によってフローセルに固定化されている、フローセル。
実施形態５８．ナノ粒子上に固定化された少なくとも２つのトランスポソーム複合体に各々結合した標的核酸又はその１つ以上の断片を含む、実施形態５７に記載のフローセル。
実施形態５９．反応溶液中の標的核酸から核酸ライブラリーを調製する方法であって、標的核酸がトランスポソーム複合体によって断片化され、第１のポリヌクレオチドの３’トランスポゾン末端配列が、断片の５’末端に転移される条件下で、標的核酸を、実施形態４８～５５のいずれか１つに記載のビーズ及びナノ粒子を各々含む組成物の混合物と接触させて、それによって、一方の鎖がタグで５’タグ付けされた固定化二本鎖標的核酸断片を生成させることを含む、方法。
実施形態６０．実施形態５９に記載の方法であって、（ａ）断片の生成後にドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate、ＳＤＳ）溶液を添加することであって、ＳＤＳが、追加の断片の生成を停止させる、添加すること、又は、（ｂ）断片の生成後若しくはＳＤＳ溶液の添加後にトランスポソーム複合体から断片を放出させることであって、任意選択的に、放出が８０℃の温度で、若しくは増幅によって、実施される、放出させること、を更に含む、方法。
実施形態６１．トランスポソーム複合体から断片を放出させることが、ナノ粒子から断片を放出させ、任意選択的に、断片が放出後に溶液中にあるものである、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．断片の放出後に反応溶液からビーズを除去することを更に含み、任意選択的に、（ａ）ビーズが、磁性を有し、ビーズの除去が、磁場を用いて行われるか、又は、（ｂ）ビーズが、分解性ポリエステルビーズであり、ビーズの除去が、分解剤を用いて行われ、任意選択的に、分解剤が、（ｉ）５０℃～６５℃若しくは６０℃の温度、及び／若しくは（ｉｉ）水性塩基である、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３．（ａ）溶液中の断片が、増幅され、増幅された断片が、フローセルにロードされ、捕捉され、かつ配列決定されるか、又は、（ｂ）ビーズ及びナノ粒子を含む組成物の混合物に固定化された断片が、フローセルにロードされ、断片が放出され及び／若しくはビーズが除去され、断片が、フローセル上で捕捉され、増幅され、かつ配列決定され、任意選択的に、単一の組成物から放出された断片が、フローセル上で空間的に近接して捕捉される、実施形態５９～６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６４．標的核酸が、複数のトランスポソーム複合体によって断片化され、任意選択的に、全てのトランスポソーム複合体が、同一であり、断片が、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端において同じアダプター配列でタグ付けされている、実施形態５９～６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５．（ａ）トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出させ、任意選択的に断片を次に固体支持体に固定化することと、（ｂ）アダプター配列と、第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的な配列とを含むポリヌクレオチドを、ハイブリダイズさせることであって、ポリヌクレオチドに含まれるアダプター配列が、トランスポソーム複合体に含まれるアダプター配列とは異なる、ハイブリダイズさせることと、（ｃ）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を、任意選択的に伸長させることと、（ｄ）ポリヌクレオチド又は伸長されたポリヌクレオチドを、二本鎖標的核酸断片と任意選択的にライゲーションすることと、（ｅ）二本鎖断片を生成させることと、を更に含む、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．ポリヌクレオチドが、ＵＭＩを更に含み、二本鎖標的核酸断片が、ＵＭＩを含み、任意選択的に、ＵＭＩが、標的核酸断片の３’末端に直接隣接して位置する、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７．生成された二本鎖断片が、一方の鎖の５’末端において、第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において、ポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる、実施形態６５又は実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８．（ａ）トランスポソーム複合体から二本鎖断片を遊離させ、任意選択的に断片を固体支持体に固定化することと、（ｂ）アダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることであって、第１のトランスポゾン内のアダプターが、第１のポリヌクレオチド内のアダプターとは異なる、ハイブリダイズさせることと、（ｃ）第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を含む第２のポリヌクレオチドを、任意選択的に付加して二本鎖アダプターを生成させることと、（ｄ）二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を、任意選択的に伸長させることと、（ｅ）二本鎖アダプターを、二本鎖標的核酸断片と任意選択的にライゲーションすることと、（ｆ）二本鎖断片を生成させることと、を更に含む、実施形態６７に記載の方法。
実施形態６９．第１のポリヌクレオチドが、ＵＭＩを更に含み、二本鎖断片が、ＵＭＩを含み、任意選択的に、ＵＭＩが、標的核酸断片と第１のポリヌクレオチド由来のアダプター配列との間に位置する、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．生成された二本鎖断片が、一方の鎖の５’末端において、第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において、第１のポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる、実施形態６８又は実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１．実施形態５９～７０のいずれか１つに記載の方法であって、ビーズ及びナノ粒子を含む組成物の混合物中のビーズに固定化されたナノ粒子の平均数が、標的核酸断片のサイズを決定し、任意選択的に、方法が、増幅又は配列決定の前に、生成された断片のサイズ選択を必要としない、方法。
実施形態７２．同じビーズ上に含まれるナノ粒子間の立体障害が、３５塩基対未満の断片の生成を低減し、任意選択的に、生成された断片が、ロングリード配列決定を使用して配列決定される、実施形態５９～７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３．ビーズ及びナノ粒子を含む組成物の混合物を調製する方法であって、（ａ）ビーズ及びナノ粒子を混合して、実施形態４６～５５のいずれか１つに記載のビーズ及びナノ粒子を含む組成物を調製することであって、任意選択的に、ビーズが、磁性を有し、混合物が、磁場を用いて行われる、調製することと、（ｂ）混合物からビーズを分離することであって、任意選択的に、ビーズが、磁性を有し、ビーズの分離が、磁場を用いて行われる、分離することと、（ｃ）各ビーズと会合したナノ粒子の平均数を評価することであって、任意選択的に、評価が、実施形態５９～７２のいずれか１つに記載の方法に従って断片を調製し、断片サイズを決定することによって行われる、評価することと、（ｄ）所望の平均数のナノ粒子が、組成物の混合物中の各ビーズと会合するまで、上記の工程を繰り返すことと、を含む、方法。
追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載され、一部は説明から明白であるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的なものであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、１つの（いくつかの）実施形態を図解し、明細書とともに本明細書に記載される原理を説明する役割を果たす。
ストレプトアビジン及び／又は磁性ナノ粒子の分解性ポリカプロラクトン（polycaprolactone、ＰＣＬ）ビーズへのコンジュゲーションの概要を提供する。アミノリシスによるＰＣＬビーズの表面活性化。 ストレプトアビジン及び／又は磁性ナノ粒子の分解性ポリカプロラクトン（polycaprolactone、ＰＣＬ）ビーズへのコンジュゲーションの概要を提供する。ＰＣＬビーズ表面上でのビオチンのコンジュゲートしたトランスポソームのアセンブリ。
分解性ＰＣＬビーズを用いたライブラリー播種／クラスター化、放出、及び融解／洗浄工程の概要を示す。フローセル内でのライブラリーの放出及びクラスター化の後、ＰＣＬビーズは、過剰な遊離ビオチンによってフローセル表面から放出され、６０℃を超える温度で融解された後、フローセルから洗い流される。
ナノ粒子上に含まれるトランスポソーム複合体に固定化された標的核酸を示し、複数のナノ粒子が単一の担体ビーズに固定化されている。複数の固定化ナノ粒子を有するビーズを含むかかる組成物は、所与の標的核酸からの複数の断片が同じ担体ビーズ上で調製されることを可能にする。
合成デンドロンなどの組成物中に含まれ得るいくつかの代表的なタイプのナノ粒子を示す。 ＤＮＡデンドロンなどの組成物中に含まれ得るいくつかの代表的なタイプのナノ粒子を示す。 ポリマーブラシなどの組成物中に含まれ得るいくつかの代表的なタイプのナノ粒子を示す。
ナノ粒子とトランスポソーム複合体の第１のトランスポゾンとの会合に基づく、ビオチン－アビジン相互作用などによる、トランスポソーム複合体をナノ粒子に固定化するいくつかの代表的な手段を示す。図５Ａ及び図５Ｂの両方において、Ｐ５とＡ１４（図５Ａ）及びＰ７とＡ１４（図５Ｂ）の間の波線はスペーサを表す。図５Ａにおいて、ナノ粒子上の波線は、３’ビオチンに結合するアビジン又はストレプトアビジンを表す。 ナノ粒子とトランスポソーム複合体の第１のトランスポゾンとの会合に基づく、アジド－ＤＢＣＯのクリックケミストリー反応などによる、トランスポソーム複合体をナノ粒子に固定化するいくつかの代表的な手段を示す。図５Ａ及び図５Ｂの両方において、Ｐ５とＡ１４（図５Ａ）及びＰ７とＡ１４（図５Ｂ）の間の波線はスペーサを表す。図５Ｂにおいて、波線は、クリックケミストリー反応において３’ＤＢＣＯに結合するアジドを表す。
ビーズ（担体ビーズ）及び少なくとも１つのナノ粒子の組成物の実施形態を示す。化学結合ハンドル及びクラスター化プライマーを含むビーズと、ナノ粒子とを含む組成物。 ビーズ（担体ビーズ）及び少なくとも１つのナノ粒子の組成物の実施形態を示す。固定化オリゴヌクレオチドを含むナノ粒子と、クラスター化プライマーを含むビーズとを含む組成物であって、固定化オリゴヌクレオチドがクラスター化プライマーに結合することができる、組成物。 ビーズ（担体ビーズ）及び少なくとも１つのナノ粒子の組成物の実施形態を示す。固定化オリゴヌクレオチドを含むナノ粒子と、クラスター化プライマーを含むビーズとを含む組成物であって、連結オリゴヌクレオチドが固定化オリゴヌクレオチド及びクラスター化プライマーの両方に結合する、組成物。 ビーズ（担体ビーズ）及び少なくとも１つのナノ粒子の組成物の実施形態を示す。ナノ粒子及びビーズを含む組成物であって、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドがビーズ上のクラスター化プライマーに結合しており、化学修飾もナノ粒子上の官能基に結合することができる、組成物。
固定化ナノ粒子を有するビーズを含む組成物を調製する方法を示す。
固定化されたナノ粒子を有するビーズを含む組成物の混合物を用いて配列決定ライブラリーを調製する方法を要約する。
配列の説明
表１は、本明細書中で参照される特定の配列のリストを示す。
Figure 2023532905000002
ビーズ表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含むことができる分解性ポリエステルビーズが、本明細書に記載される。これらのビーズは、トランスポソーム担体として使用し得る。本明細書で使用される場合、「トランスポソーム担体」は、トランスポソームを固定化することができる薬剤を指し、薬剤は、フローセルに近接したライブラリー生成物の放出を促進することもできる。ビーズは、フローセル上にライブラリー断片を播種した後に分解され得るので、ビーズは、配列決定のような下流プロセスを妨害しない。ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物、並びにこれらの組成物を使用する方法もまた、本明細書に記載される。
Ｉ．ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物
いくつかの実施形態では、組成物は、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、ナノ粒子に結合することができる官能基を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子及び／又はビーズは、磁性を有する。
図３に示すように、ＢＬＴ中の磁性マイクロメートルサイズのビーズ上にＴｎ５を直接固定化する代わりに、Ｔｎ５をナノ粒子（「クラスター化ナノ粒子」）上に固定化し、次いで、マイクロメートルサイズの磁性ビーズ（担体ビーズ）上にロードすることができる。クラスター化ナノ粒子表面は、クラスター化のためにクラスター化オリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ７オリゴヌクレオチド、クラスター化プライマーとしても知られる）で、及びｄｓＤＮＡタグメンテーションのために単一のＴｎ５で、覆われる。タグメンテーションの後、ナノ粒子を溶液に放出することができる。増幅（クラスター増幅など）は、溶液中で、又はナノ粒子がフローセル表面にロードされた（すなわち、捕捉された）後に、行うことができる。
いくつかの実施形態では、ビーズ及びナノ粒子を含む組成物は、統合されたクラスタリング及びライブラリー調製ワークフローによってサンプルの利用率を増加させる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の立体障害は、ライブラリー内の短いインサートサイズの生成を減少させる。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５タグメンテーションは、合成ロングリード配列決定用途のためにインデックス化され得る。
Ａ．ビーズ
いくつかの実施形態では、組成物中に含まれるビーズは、担体ビーズである。いくつかの実施形態では、担体ビーズは、いくつかのナノ粒子に結合している。
いくつかの実施形態では、担体ビーズは、１μｍ以上の直径を有する。いくつかの実施形態では、担体ビーズは、２～５μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズのサイズは、その表面上に固定化されるナノ粒子の数に影響を及ぼす。例えば、より大きなビーズは、より多くのナノ粒子を固定化することができる。固定化されたナノ粒子がトランスポソーム複合体（後述）を含む場合、ナノ粒子の総数は、組成物上のトランスポソーム複合体の総数を決定し得る。
任意のタイプのビーズを担体ビーズとして使用し得る。いくつかの実施形態では、担体ビーズ自体は、その表面上にナノ粒子を固定化すること以外に、ライブラリーの調製において役割を果たさない。いくつかの実施形態では、担体ビーズは、非多孔性であるか、又はほとんど非多孔性であり、したがって、その表面上へのナノ粒子の固定化を可能にする。いくつかの実施形態では、担体ビーズは、中空又は中実である。
いくつかの実施形態では、担体ビーズは、磁性コアを有する固体ビーズである。かかる磁性ビーズは、混合又は精製の工程が磁力（磁性スタンド又は磁性撹拌機など）の存在下で行われる場合、これらの工程を改善するものとして当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、ビーズは、分解性ビーズである。いくつかの実施形態では、担体ビーズは、以下に記載されるような分解性ポリエステルビーズである。分解性ビーズは、制御された様式でのフローセル又は反応溶液からのビーズ除去を可能にするという利点を有する。
いくつかの実施形態では、図３に示すように、いくつかのクラスター化ナノ粒子が担体ビーズ上にロードされる。本明細書で使用される場合、「クラスター化ナノ粒子」は、増幅プライマーとしても知られるクラスター化プライマーを含むナノ粒子を指す。クラスター化プライマーはまた、担体ビーズへのナノ粒子の結合を容易にするために使用され得る。いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子がビーズ上に固定化され、ビーズ上の各ナノ粒子は、単一のトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、２つ以上のトランスポソーム複合体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、担体ビーズ上の複数のナノ粒子によって標的核酸の断片が生成され、断片は、担体ビーズに結合したナノ粒子に固定化される。
１．官能基
いくつかの実施形態では、ビーズは、ナノ粒子に結合することができる官能基を含む。
いくつかの実施形態では、化学結合ハンドル及び／又はクラスター化プライマーは、ナノ粒子に直接的に結合する。ビーズ上の化学結合ハンドルが修飾された表面を有するナノ粒子に結合する実施形態を図６Ａに示す。
いくつかの実施形態では、クラスター化プライマーは、ナノ粒子に結合することができ、かつ、クラスター増幅を媒介することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子及びフローセルは、ビーズ上のクラスター化プライマーに結合することができる同じオリゴヌクレオチドを含む。ビーズ上のクラスター化プライマーが固定化オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子に結合する実施形態を図６Ｂに示す。
いくつかの実施形態では、化学結合ハンドル及び／又はクラスター化プライマーは、ナノ粒子に間接的に結合する。いくつかの実施形態では、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、ビーズに含まれるクラスター化プライマー及びナノ粒子の両方に結合する。連結オリゴヌクレオチドがビーズ上のクラスター化プライマー及びナノ粒子上の固定化オリゴヌクレオチドに結合する実施形態を図６Ｃに示す。
いくつかの実施形態では、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、ビーズ上のクラスター化プライマーに結合しており、化学修飾は、ナノ粒子上の官能基に結合することができる（図６Ｄに示すように）。例示的な化学修飾としては、アビジン又はストレプトアビジンへの結合を媒介し得るビオチン化が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子とビーズとの間の相互作用は、可逆的及び／又は非共有結合性相互作用である。いくつかの実施形態では、可逆的及び／又は非共有結合性相互作用は、タンパク質－リガンド相互作用又は金属－キレート剤相互作用である。いくつかの実施形態、タンパク質－リガンド相互作用は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用であるか、又は金属－キレート剤相互作用は、ニッケル－ポリヒスチジン又はコバルト－ポリヒスチジン相互作用である。
いくつかの実施形態では、ビーズは、クラスター化プライマーを含み、ナノ粒子は、固定化オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、固定化オリゴヌクレオチド及びクラスター化プライマーは、互いに直接的に結合する。いくつかの実施形態では、連結オリゴヌクレオチドは、固定化オリゴヌクレオチド及びクラスター化プライマーの両方に結合することができ、したがって、ナノ粒子をビーズに固定化することができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子とビーズとの間の相互作用は、不可逆的及び／又は共有結合性相互作用である。いくつかの実施形態では、共有結合性相互作用は、ビーズとナノ粒子との間の切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、化学的又は酵素的に切断可能なリンカーである。
Ｂ．ナノ粒子
いくつかの実施形態では、組成物中に含まれるナノ粒子は、トランスポソーム複合体などの活性部位を担体ビーズの表面上に固定化する働きをする。他の活性部位（例えば、様々な酵素）が想定され得る。本明細書で使用される場合、「活性部位」とは、単に、ユーザーによって所望される機能を行い得る分子を指す。いくつかの実施形態では、活性部位は、ユーザーによって所望される機能を実行する酵素の全て又は一部を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、５０ｎｍ～１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、異なるタイプのナノ粒子の混合物を含む。
多種多様な異なるナノ粒子が当技術分野において報告されている。例えば、テンプレートポリヌクレオチドを結合するための単一のテンプレート部位を含むナノ粒子は、米国特許出願第１７／１３０，４８９号（米国特許出願公開第２０２１／０１８７４６９（Ａ１）号として公開）、同第１７／１３０，４９４号（米国特許出願公開第２０２１／０１８７４７０号として公開）及び同第６２／９５２，７９９号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、デンドリマーである。本明細書で使用される場合、「デンドリマー」は、分岐ポリマー分子を有するナノ粒子を指す。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、デンドロンである。本明細書で使用される場合、「デンドロン」は、焦点又はコアなどの単一の化学的に結合可能な基を含有するナノ粒子を指す。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーブラシである。本明細書で使用される場合、「ポリマーブラシ」は、別のポリマー鎖に密に繋がれたポリマー鎖を有する高分子構造を指す。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、合成デンドロンを含む（図４Ａ）。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＤＮＡデンドロンを含む（図４Ｂ）。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーブラシを含む（図４Ｃ）。当業者は、多種多様な異なるナノ粒子を認識しており、組成は特定のタイプのナノ粒子に限定されない。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、担体ビーズに含まれるビーズよりも小さいビーズである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、硬質コアを有するビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは、２０ｎｍ～２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズは、５０ｎｍ～１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズは、９０ｎｍ～１１０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズは、１００ｎｍの直径を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、磁性を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、磁性材料コアを有するビーズである。いくつかの実施形態では、磁性材料は、鉄、ニッケル、又はコバルトである。いくつかの実施形態では、磁性材料のコアは、シリカシェルでコーティングされている。いくつかの実施形態では、シリカシェルは、有機シラン分子による官能化を可能にする。いくつかの実施形態では、この官能化は、担体ビーズ上に含まれる官能基への結合を可能にする。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、トランスポソーム複合体の固定化のために使用される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、Ｔｎ５を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のトランスポゾン内のビオチンとナノ粒子上のアビジンとの相互作用によって固定化される（図５Ａ）。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、アジドとＤＢＣＯとの間のクリックケミストリー反応によってナノ粒子に固定化される（図５Ｂ）。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応の使用は、ナノ粒子及びＴｎ５の放出工程中の、アダプターとナノ粒子との間の連結の安定性を改善する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、それ自体は不活性であるが活性部位を生成させる役割を果たすことができる分子を固定化し得る。かかるナノ粒子は、「活性化可能なナノ粒子」と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、溶液からトランスポソーム複合体を捕捉することができる固定化オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、トランスポソーム複合体に含まれるトランスポゾンに結合することができるハイブリダイゼーション配列を含む固定化オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、固定化オリゴヌクレオチドを含み、固定化オリゴヌクレオチドは、トランスポソーム複合体に含まれる第２のトランスポゾンに含まれるハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするための配列を含む。
活性化可能なナノ粒子を含む組成物は、ユーザーが多段階法においてタグメンテーションのタイミングを制御することを可能にするなど、いくつかの利点を有する。本明細書で使用される場合、ナノ粒子の説明は、トランスポソーム複合体がナノ粒子中に含まれる固定化オリゴヌクレオチドに予め結合されているナノ粒子の状態を指し得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、単一の固定化されたトランスポソーム複合体を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、２つ以上の固定化されたトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子上の各トランスポソーム複合体の間の距離は、生成されるライブラリー断片のサイズに影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、２つ以上の固定化されたトランスポソーム複合体は、ナノ粒子上の各トランスポソーム複合体の間で同様の距離で固定化される。いくつかの実施形態では、この間隔は、均一なサイズのライブラリー断片を生成させるのに役立つ。
いくつかの実施形態では、固定化されたトランスポソーム複合体又は複数のトランスポソーム複合体は、トランスポザーゼがナノ粒子から離れる方向を向くように配向されている。言い換えれば、トランスポソーム複合体の活性ドメインは、トランスポソーム複合体が反応溶液中の標的核酸と相互作用する確率を増加させるために、組成物の外側に（すなわち、担体ビーズから離れて）向けられ得る。
トランスポソームは、様々な方法でナノ粒子に固定化することができる。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ビオチン、デスチオビオチン、又はデュアルビオチンを含むトランスポゾンの、ナノ粒子上に含まれるアビジン又はストレプトアビジンへの結合によって、ナノ粒子に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、クリックケミストリー反応によってナノ粒子に固定化される。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応は、ナノ粒子上のアジドとトランスポゾン上のジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）との間の反応である。いくつかの実施形態では、トランスポゾンに結合することができるオリゴヌクレオチドは、同様の様式で固定化されてもよく、溶液中のトランスポソーム複合体は、固定化されたオリゴヌクレオチドに結合されることができる。
いくつかの実施形態では、担体ビーズは、固定化されたトランスポソーム複合体を含む２つ以上のナノ粒子に結合される。いくつかの実施形態では、全ての固定化されたトランスポソーム複合体は、同じ第１のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、全ての固定化されたトランスポソーム複合体は同一である。いくつかの実施形態では、組成物によって生成された断片は、トランスポソーム複合体によって生成された断片の両端に同じアダプターを組み込む（すなわち、対称タグメンテーション）。いくつかの実施形態では、次いで、ポリヌクレオチドを使用して、断片の一方の末端に第２のアダプターを組み込む。例えば、固定化トランスポソームは、Ａ１４アダプター配列を含み得、ポリヌクレオチドは、Ｂ１５アダプター配列を含み得る（図６Ａ及び図６Ｂに示すように）。以下に記載されるように、かかるトランスポゾン及びポリヌクレオチドを用いる方法は、生成された断片の２つの末端に異なるアダプター配列を有する断片を生成させることができる。
いくつかの実施形態では、２つの異なるトランスポソーム複合体は、ビーズ上に含まれるナノ粒子上に固定化される。いくつかの実施形態では、タグメンテーションは、断片の一方の末端に他方の末端とは異なるアダプターを含む、少なくともいくつかの断片をもたらす（すなわち、非対称タグメンテーション）。
Ｃ．担体ビーズ上へのナノ粒子の固定化
ナノ粒子は、静電固定化（図６Ａ）、ビーズ上のクラスター化プライマーのナノ粒子の表面上の固定化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション（図６Ｂ）、又はこれらのタイプの相互作用の組み合わせ（図６Ｃ）を介することを含む、いくつかの異なる方法で担体ビーズ上に固定化されることができる。
ビーズ上へのナノ粒子の固定化は、ナノ粒子に含まれる活性部位を担体ビーズにロードすることができる。例えば、ナノ粒子がトランスポソーム複合体を含む場合、ロードされた担体ビーズは、ビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）及びタグメント標的核酸を同様に機能させて断片のライブラリーにすることができる。ＢＬＴは、タグメンテーションを使用するライブラリー調製のために一般的に使用されるが、ＢＬＴは、所望よりも小さい断片を含む、広範囲のサイズを有する断片を生成させることもある。
立体障害は、担体ビーズ上のナノ粒子上に固定化されたトランスポソーム複合体間に間隔を生成させるため（すなわち、２つのナノ粒子は担体ビーズ上の同じ表面積を占有することができない）、この間隔は、短すぎるライブラリー断片の調製を防止することができる。この利点は、それらのサイズに基づくナノ粒子の使用に固有であり、ユーザーは、トランスポソーム複合体の間隔を操作するために、より小さい又はより大きいナノ粒子を使用することができる。ユーザーがライブラリーからの小さい断片のより厳密な排除を望む場合、そのユーザーは、トランスポソーム複合体の間隔が近すぎることを回避するために、より大きな直径／サイズを有するナノ粒子を使用することができる。トランスポソーム複合体自体のサイズが小さいと、間隔が近すぎるトランスポソーム複合体の固定化をもたらす可能性が生じるため、トランスポソーム複合体をビーズに直接ロードすること（すなわち、ＢＬＴの調製）は有利ではない。
したがって、ナノ粒子がトランスポソーム複合体を含む、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を有する組成物は、ライブラリー調製後のサイズ排除工程（ＳＰＲＩ精製など）のコスト及び時間を回避することによって、ライブラリー調製プロトコルを簡略化することができる。これらの組成物はまた、ユーザーがトランスポソーム複合体を含むナノ粒子をビーズにロードするプロセスを較正することができるので（以下に記載されるように）、所望のサイズのより均一なライブラリー断片を提供するのに役立ち得る。これらの方法は、（図８に示されるように）ナノ粒子の均一な充填をもたらすために、磁性ナノ粒子及び／又は磁性ビーズを有する溶液を撹拌することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子と担体ビーズとの間の相互作用は可逆的である。可逆的相互作用のための１つのアプローチは、タンパク質－リガンド（例えば、ビオチンストレプトアビジン）、金属－キレート剤（例えば、Ｎｉ－ＮＴＡ－ポリヒスチジン）、又は様々な他のホスト－ゲスト化学などの非共有結合性相互作用を使用することである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ビーズと反応基との間に化学的又は酵素的に切断可能なリンカーを有する担体ビーズ上に共有結合的に固定化することができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子とビーズとの間の結合化学は、アルキン－アジド化学反応（銅触媒によるアジド－アルキンの環化付加化学反応）である。いくつかの実施形態では、連結化学反応は、マレイミド－スルフヒドリル化学反応である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、クラスター化プライマーへのハイブリダイゼーションを介して固定化され得るか、又は別個のオリゴヌクレオチドが、クラスター化プライマーと比較して低濃度で含まれ得る。いくつかの実施形態では、このアプローチは、ナノ粒子が担体ビーズから効率的に放出され得るようにハイブリダイゼーションモチーフの長さを調整することに基づいて可逆的である。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーを、担体ビーズへの付着に含ませることができる。
いくつかの実施形態では、担体ビーズ上にナノ粒子を固定化するための官能基は、配列決定プライマーへの化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して付加される。このアプローチは、上記のアプローチに記載されたストラテジーのいずれかを使用することができ、既存のビーズ表面の化学を使用することができるという事実から、有利である。
Ｄ．ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物の調製
いくつかの実施形態では、組成物を調製する方法は、複数のナノ粒子が担体ビーズに結合することを可能にし得る。いくつかの実施形態では、担体ビーズに結合したナノ粒子の数が、タグメンテーションによって調製されるライブラリー断片のサイズを決定する。
いくつかの実施形態では、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物の混合物中のビーズに固定化されたナノ粒子の平均数が、標的核酸断片のサイズを決定する。いくつかの実施形態では、本方法は、増幅又は配列決定の前に、生成される断片のサイズ選択を必要としない。
いくつかの実施形態では、同じビーズ上に含まれるナノ粒子間の立体障害は、３５塩基対未満の断片の生成を減少させる。いくつかの実施形態では、ライブラリー断片が標準的なライブラリー調製方法よりも多くの塩基対を含むため、生成された断片はロングリード配列決定を使用して配列決定される。
図７に示すように、担体ビーズ上へのナノ粒子のローディング効率は、組成物を調製する方法によって制御することができる。いくつかの実施形態では、担体ビーズ溶液は、クラスター化ナノ粒子溶液に添加される。いくつかの実施形態では、マグネチックスターラーバーが、担体ビーズがナノ粒子と十分に混合された状態を維持するために使用される。いくつかの実施形態では、磁力を使用してビーズを分離し、各ビーズに結合したナノ粒子の平均数を決定することができる。いくつかの実施形態では、ユーザーは、各ビーズに会合するナノ粒子の所望の平均数を達成するよう反応を調整し得る。
いくつかの実施形態では、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物の混合物を調製する方法は、（ａ）ビーズ及びナノ粒子を混合して、ビーズ及びナノ粒子を含む組成物を調製することと、（ｂ）混合物からビーズを分離することと、（ｃ）各ビーズと会合したナノ粒子の平均数を評価することと、（ｄ）所望の平均数のナノ粒子が組成物の混合物中の各ビーズと会合するまで、上記の工程を繰り返すことと、を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズは磁性を有し、混合物は磁場を用いて行われる。いくつかの実施形態では、ビーズは磁性を有し、ビーズの分離は磁場を用いて行われる。いくつかの実施形態では、評価することは、ライブラリー断片を調製し、断片サイズを決定することによって行われる。
ＩＩ．フローセルに播種する方法
いくつかの実施形態では、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物上に生成された断片は、フローセル上に播種される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体が固定化されている間に、組成物がフローセル上に播種される。いくつかの実施形態では、断片はトランスポソーム複合体から放出され、次いでフローセル上に播種される。いくつかの実施形態では、播種は、フローセルの表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドに結合する断片中のアダプター配列の結合に基づく。いくつかの実施形態では、担体ビーズは、捕捉プライマー又は他のオリゴヌクレオチドをフローセルに結合させることによって、（ナノ粒子に付着している標的核酸又は断片によって）フローセル上に固定化される。
いくつかの実施形態では、フローセルに播種する方法は、組成物中のビーズ及びナノ粒子を解離させることと、ナノ粒子をフローセルの表面上に固定化することとを含む。いくつかの実施形態では、ビーズ及びナノ粒子の解離は、切断可能なリンカーの切断によるか、又はナノ粒子とビーズとの間の可逆的及び／若しくは非共有結合性相互作用の解離による。いくつかの実施形態では、フローセルに播種する方法は、ビーズ及びナノ粒子が未だ互いに会合している間に、組成物をフローセルに結合させることを含む。
いくつかの実施形態では、フローセルは、ナノ粒子上に固定化された少なくとも２つのトランスポソーム複合体に各々結合した標的核酸又は１つ以上のその断片を含む。
ＩＩＩ．ビーズ及び少なくとも１種のナノ粒子を含む組成物の使用方法
いくつかの実施形態では、ビーズ及びナノ粒子を含む組成物は、標的核酸由来の断片のライブラリーを調製するために使用される。かかる方法を図８に示す。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡデュプレックスである。
いくつかの実施形態では、組成物に対するタグメンテーションの後、断片がナノ粒子から放出され、溶液中で増幅され、増幅された断片が配列決定のためにフローセルに送達される。いくつかの実施形態では、タグメンテーションの後、断片は、担体ビーズと会合したナノ粒子上に固定化されている間にフローセルに送達され、断片は、フローセル上に放出及び捕捉され、増幅され、配列決定される。
いくつかの実施形態では、増幅工程は省略され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、断片のサイズ選択の工程を必要としない。いくつかの実施形態では、本方法は、担体ビーズ上へのナノ粒子のローディング効率を使用して、生成されるライブラリー断片のサイズを制御する。
いくつかの実施形態では、反応溶液中の標的核酸から核酸ライブラリーを調製する方法は、標的核酸がトランスポソーム複合体によって断片化され、第１のポリヌクレオチドの３’トランスポゾン末端配列が断片の５’末端に転移される条件下で、標的核酸を、各々がビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物の混合物と接触させ、それによって一方の鎖がタグで５’タグ付けされた固定化二本鎖標的核酸断片を生成させることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、断片の生成後にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を添加することを更に含み、ＳＤＳは、更なる断片の生成を停止させる。いくつかの実施形態では、方法は、断片の生成後又はＳＤＳ溶液の添加後に、トランスポソーム複合体から断片を放出させることを更に含む。いくつかの実施形態では、放出させることは、８０℃以上の温度又は増幅によって実施される。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体から断片を放出させることにより、ナノ粒子から断片も放出される。いくつかの実施形態では、断片は放出後に溶液中にある。
いくつかの実施形態では、方法は、断片の放出後に反応溶液からビーズを除去することを更に含む。いくつかの実施形態では、ビーズは磁性を有し、ビーズの除去は磁場を用いて行われる。
いくつかの実施形態では、ビーズは分解性ポリエステルビーズであり、ビーズの除去は分解剤を使用して行われる。いくつかの実施形態では、分解剤は、（ａ）５０℃～６５℃、若しくは６０℃の温度、及び／又は（ｂ）水性塩基（以下に記載される）である。
いくつかの実施形態では、溶液中の断片が増幅され、増幅された断片がフローセルにロードされ、捕捉され、配列決定される。
いくつかの実施形態では、ビーズ及びナノ粒子を含む組成物の混合物に固定化された断片をフローセルにロードし、断片を放出及び／又はビーズを除去し、断片をフローセル上で捕捉し、増幅し、配列決定する。いくつかの実施形態では、単一の組成物から放出された断片は、フローセル上で空間的に近接して捕捉される。いくつかの実施形態では、同じ組成物上で調製された断片は、フローセル上でのそれらの空間的近接性に基づいて決定することができる。いくつかの実施形態では、異なる組成物から生成された断片は、同じ組成物から生成された断片と比較して、フローセル上で更に離れている。いくつかの実施形態では、２つの断片間の距離を使用して、これらの２つの断片が同じビーズ上で調製された可能性が高いか否かを決定することができる。いくつかの実施形態では、同じビーズ上で調製された断片は、同じ標的核酸分子から調製されたものである。
Ａ．対称タグメンテーション
いくつかの実施形態では、標的核酸は、複数のトランスポソーム複合体によって断片化され、全てのトランスポソーム複合体は、同一であり、断片は、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端において同じアダプター配列でタグ付けされる。いくつかの実施形態では、複数のトランスポソーム複合体は、同じ担体ビーズ上に固定化された異なるナノ粒子上に固定化される。
いくつかの実施形態では、対称タグメンテーションを使用する方法は、２つ以上のタイプのトランスポソーム複合体がタグメンテーションに使用される標準的な非対称タグメンテーションの工程と比較して、配列決定可能な断片（すなわち、断片の各末端に異なる配列決定アダプター配列を有する各断片）の収率を増加させる。異なるタグ（Ａ及びＢ、例えば、第１のリード配列決定アダプター及び第２のリード配列決定アダプター）を有する２つのタイプのトランスポソームを使用する非対称的タグメンテーションでは、対称的に及び非対称的にタグ付けされた生成物（Ａ－Ａ、Ｂ－Ｂ、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ａ）が生成されるが、Ａ－Ｂ及びＢ－Ａのみがその後の増幅及び配列決定に好適であるため、増幅されたタグメンテーション生成物からのリードのほぼ半分が無駄となる。対照的に、対称タグメンテーションは、得られた断片が第１リード及び第２リード配列決定アダプターの両方を含む確率を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、対称タグメンテーションを使用する方法は、他のライブラリー調製方法と比較して、ライブラリーの収率を増加させ得る。
タグメンテーション後に第２のアダプターを付加するためのいくつかの異なる方法が本明細書に記載されている。例えば、第１のリード配列決定アダプターは、タグメンテーション中に、二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡデュプレックス断片に組み込まれ、その後の工程において、第２のリード配列決定アダプターが（ライゲーションなどによって）組み込まれ得る。例示的な方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載される組成物を使用する対称タグメンテーションを介して１つの配列決定アダプター配列を組み込み、第２の配列決定アダプター配列を含むプライマー又はオリゴヌクレオチドの使用を介して別の配列決定アダプター配列を組み込むことによって、ライブラリー収率を（非対称タグメンテーションを使用する方法と比較して）改善することができる。
Ｂ．タグメンテーション後に１つ以上のアダプターを組み込むためのポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物中の全てのトランスポソームは同一であり、生成された断片は、タグメンテーション後に両端に同じアダプター配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを使用する方法は、タグメンテーションによって組み込まれるアダプター配列とは異なるアダプター配列を組み込むために行われる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを用いる方法の使用は、一方の末端に第１のアダプター配列を有し、第２の末端に第２のアダプター配列を有する断片をもたらす。
いくつかの実施形態では、方法は、対称タグメンテーションの後に、トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出させることを含む。いくつかの実施形態では、断片は、次いで、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、方法は、アダプター配列と、放出された断片中の第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的な配列とを含むポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることを含み、ポリヌクレオチドに含まれるアダプター配列は、トランスポソーム複合体に含まれるアダプター配列とは異なる。いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖が伸長される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド又は伸長されたポリヌクレオチドは、二本鎖標的核酸断片とライゲーションされて、二本鎖断片を生成させる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ユニーク分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）を更に含み、二本鎖標的核酸断片はＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、標的核酸断片の３’末端に直接隣接して位置する。いくつかの実施形態では、生成された二本鎖断片は、一方の鎖の５’末端において第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端においてポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる。
いくつかの実施形態では、方法は、タグメンテーションの後に、トランスポソーム複合体から二本鎖断片を放出させることを含む。いくつかの実施形態では、断片は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、方法は、アダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドを、放出された断片にハイブリダイズさせることを含み、第１のトランスポゾン中のアダプターは、第１のポリヌクレオチド中のアダプターとは異なる。いくつかの実施形態では、方法は、第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して、二本鎖アダプターを生成させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖アダプターを二本鎖標的核酸断片とライゲーションさせて二本鎖断片を生成させることを含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドはＵＭＩを更に含み、二本鎖断片はＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、標的核酸断片と第１のポリヌクレオチド由来のアダプター配列との間に位置する。いくつかの実施形態では、生成された二本鎖断片は、一方の鎖の５’末端において第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において第１のポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる。
Ｃ．ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）
ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）は、核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列であり、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のソース核酸分子のものであるかどうかを決定するために、それらが会合する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報、及び物理的なポリヌクレオチド自体、の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つのサンプルのリードを他のサンプルのリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々のサンプルからの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸テンプレート断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／１０８９７２号及び同第２０１８／１３６２４８号パンフレットに記載されているように、多くの方法で定義され得る。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリーは、非ランダム配列を含む。いくつかの実施形態では、非ランダムＵＭＩ（nonrandom UMI、ｎｒＵＭＩ）は、特定の実験又は用途のために事前に定義される。ある特定の実施形態では、ルールを適用して、所定のセットの配列を生成させるか、又はそのセットからサンプルを選択してｎｒＵＭＩを得る。例えば、所定のセットの配列は、その配列が特定のパターン（単数又は複数）を有するように生成され得る。いくつかの実施態様では、各配列は、特定の数（例えば、２、３、又は４）のヌクレオチドだけ、セット中の他の全ての配列と異なる。すなわち、ｎｒＵＭＩ配列は、特定の数より少ないヌクレオチドを置換することによって、任意の他の利用可能なｎｒＵＭＩ配列に変換されることができない。いくつかの実施態様では、配列決定プロセスで使用されるＵＭＩのセットは、特定の配列長が与えられた場合に、全ての可能なＵＭＩよりも少ないＵＭＩを含む。例えば、６個のヌクレオチドを有するｎｒＵＭＩのセットは、合計４Ａ６＝４０９６個の可能な異なる配列の代わりに、合計９６個の異なる配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリーは、１２０個の非ランダム配列を含む。
ｎｒＵＭＩが全ての可能な異なる配列よりも少ない配列を有するセットから選択されるいくつかの実施態様において、ｎｒＵＭＩの数は、供給源のＤＮＡ分子の数よりも少なく、場合によっては著しく少ない。かかる実施態様では、ｎｒＵＭＩ情報を、仮想ＵＭＩ、参照配列上のリード位置、及び／又はリードの配列情報などの他の情報と組み合わせて、同じ供給源のＤＮＡ分子に由来する配列リードを同定することができる。
いくつかの実施形態では、ｒＵＭＩｓのライブラリーは、１つ以上の配列長を与えられた全ての可能な異なるオリゴヌクレオチド配列からなるＵＭＩのセットから、置換あり又はなしで、ランダムサンプルとして選択されるランダムＵＭＩ（ＵＭＩ）を含み得る。例えば、ＵＭＩのセット中の各ＵＭＩがｎ個のヌクレオチドを有する場合、セットは、互いに異なる配列を有する４Ａｎ個のＵＭＩを含む。４Ａｎ個のＵＭＩから選択されたランダムサンプルがｒＵＭＩを構成する。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリーは、擬似的にランダム又は部分的にランダムであり、ｎｒＵＭＩとｒＵＭＩとの混合物を含み得る。
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列が、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在し得る。
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列が、各ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’側に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列を表す核酸の配列が、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に位置し得る。
Ｄ．連結ロングリード配列決定
標準的な短い読み取り配列決定は、短い範囲の情報を提供するために正確な塩基レベルの配列を提供するが、短い読み取り配列決定は、長い範囲のゲノム情報を提供しない場合がある。更に、ハプロタイプ情報は、配列決定されたゲノム又は短いリードデータを有する参照について保持されないため、長い範囲のハプロタイプの再構築は、標準的な方法では困難である。したがって、標準的な配列決定及び分析アプローチは、一般に、単一ヌクレオチド変異体（single nucleotide variant、ＳＮＶ）をコールすることができるが、これらの方法は、個々のゲノムにおいて見られる構造変異の全スペクトルを同定しない場合がある。ゲノムの「構造変異」は、本明細書で使用される場合、５０塩基対以上のイベントを含む、ＳＮＶより大きいイベントを指す。代表的な構造変異体には、コピー数変異、逆位、欠失、及び重複が含まれる。
「連結ロングリード配列決定」又は「連結リード配列決定」は、ゲノム配列に関する長い範囲の情報を提供する配列決定方法を指す。
いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、ハプロタイプ再構築のために使用することができる。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、構造変異体のコーリングを改善する。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、アクセス可能性が制限されたゲノムの領域へのアクセスを改善する。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、デノボ二倍体アセンブリのために使用される。いくつかの実施形態では、連結リード配列決定は、デノボアセンブリを必要とする高度に多型の配列（ヒト白血球抗原遺伝子など）の配列決定を改善する。
いくつかの実施形態では、連結ロングリード配列決定は、フローセル上の断片の空間的近接性に基づいて行うことができ、断片は、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む所与の組成物から生成されたものである。
空間的分離に基づく連結ロングリード配列決定
いくつかの実施形態では、全長核酸は、ビーズ及び複数のナノ粒子を含む単一の組成物上に「ラップ」されており、これは、全長核酸が、単一の担体ビーズと結合したナノ粒子上に固定化された複数のトランスポソーム複合体と会合することができることを意味する。本明細書で使用される場合、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ：ＲＮＡデュプレックスであり得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、ビーズに付着した全長核酸を用いて配列決定するために表面に送達される。次いで、所定の全長核酸（同じ組成物上で調製される）から生成された断片が、他の組成物上で調製された断片と比較して、非常に近接して放出されるように、断片が放出され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、断片が組成物に結合した状態で配列決定のために表面に送達される。いくつかの実施形態では、断片は、断片の放出及び捕捉後にフローセル上で増幅され、次いで配列決定される。
ＩＶ．分解性ポリエステルビーズの使用方法
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、その表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、各トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含む。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは担体ビーズである。分解性ポリエステルビーズは、ビーズ及び上記の少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物の任意の実施形態において使用され得る。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、洗浄などのタグメンテーション反応において実施される工程の温度よりも高い融解温度を有する。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、５０℃以上の融解温度を有する。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、ライブラリー断片がフローセルから放出される温度よりも低い融解温度を有する。いくつかの実施形態では、ライブラリー断片は、フローセルの表面に結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得るアダプター配列（例えば、Ｐ５（配列番号１）若しくはＰ７（配列番号２）又はそれらの相補体）の導入に基づいて、フローセルに結合される。いくつかの実施形態では、ビーズの融解温度は、フローセルの表面に結合したオリゴヌクレオチドからアダプター配列が脱ハイブリダイズする温度より低い。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、６５℃以下の融解温度を有する。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、５０℃～６５℃の融解温度を有する。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、６０℃の融解温度を有する。
いくつかの実施形態では、ビーズは、各々がビーズ上の少なくとも２つのトランスポソーム複合体に結合した標的核酸又は１つ以上のその断片を含む。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、トランスポソーム担体であり得る。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズを使用して、ビーズ表面上でのタグメンテーションによるライブラリー調製を媒介し、フローセル上でのライブラリー断片の放出を可能にし得る。
Ａ．分解性ポリエステルビーズ
本明細書で使用される場合、「分解性ポリエステルビーズ」は、ポリエステルを含み、分解されることができる、任意のタイプのビーズを指すことができる。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、ポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリエステルポリマーは架橋されておらず、比較的低いポリマー融解温度（例えば、約６０℃など）を可能にする。
分解性ポリエステルビーズを分解するための代表的な手段としては、温度の上昇による融解又は高温でのアルカリ加水分解が挙げられる。本明細書で使用される場合、「融解」は、ビーズ構造が失われるような、熱によるポリエステルビーズの選択的解重合を指す。解重合は、ポリエステルポリマーの格子構造を減少又は破壊することができる。いくつかの実施形態では、融解は、ポリマーの化学的脱架橋を伴わずにビーズの物理的融解をもたらす。例えば、融解は、ポリエステルビーズをより小さいポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマー又はＰＣＬの個々の分子に変換し得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＬビーズは、ビーズがより小さいＰＣＬポリマー又はＰＣＬの分子に分解するように、５０℃を超える温度で融解することができる。いくつかの実施形態では、ビーズは、５０℃～６５℃の温度で融解する。
いくつかの実施形態では、ビーズは、ＰＣＬ以外のポリエステルを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＬ以外のポリエステルは、５０℃～６５℃の融解温度を有する。言い換えれば、分解性ポリエステルビーズは、適切な熱特性を有する任意のポリエステルを含み得る。例えば、分解性ポリエステルビーズの融解温度は、特定の反応に必要な温度よりも高い。例えば、分解性ポリエステルビーズは、タグメンテーション反応を行うのに必要な温度で無傷のままであり得るが、その後、より高い温度で融解して、配列決定のための表面上での捕捉のためにタグメンテーション後にライブラリー断片を放出し得る。
ストレプトアビジン又は磁性ナノ粒子（図１Ａに示されるような）などのＰＣＬに結合した任意の薬剤は、より小さいＰＣＬポリマー又はＰＣＬの分子に付着したままであってもよく、又はこれらの薬剤は、ＰＣＬポリマー又は分子から放出されてもよい。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、ビーズ表面上に固定化されたライブラリー断片がフローセルの表面上のオリゴヌクレオチドから脱ハイブリダイズする温度の前の温度での融解を可能にする温度で融解する。言い換えれば、分解性ポリエステルビーズは、ライブラリー断片がフローセル上に固定化され、かつ／又は固定化される際の温度で融解し得る。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズの融解（ライブラリー断片がその表面上に固定化され、かつ／又は固定化されたままである間）は、以下で論じるように、フローセル上へのライブラリー断片の局在化された空間的放出を可能にする。
本明細書で使用される場合、「ビーズ」は、マイクロスフェアと交換可能に用いられる。しかしながら、本明細書に記載されるビーズは、球形に限定されない。例えば、ビーズは略球状であってもよい。ビーズは、球状シェルなどの中空であってもよく、又は中実であってもよい。ビーズは、多孔性、半多孔性、又は非多孔性であってもよい。いくつかの実施形態では、ビーズは、９０％超又は９５％超が非多孔性であるなど、一定の限度の多孔性を有する。
いくつかの実施形態では、非多孔性ビーズは固体であってもよい。
いくつかの実施形態では、１００％未満のトランスポソーム複合体がビーズの表面上にある。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の一部はビーズ内に含まれ、トランスポソーム複合体の一部はビーズの表面上に含まれる。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の全てが、ビーズの表面上に含まれる。
いくつかの実施形態では、ほとんどのトランスポソーム複合体が、ポリエステルビーズの表面上に固定化される。いくつかの実施形態では、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上のトランスポソーム複合体が、ビーズの表面に固定化される。いくつかの実施形態では、ほとんどのトランスポソーム複合体をビーズの表面（ビーズの内側とは対照的に）に固定化することは、ほとんどのライブラリー断片がビーズの表面に固定化されることを意味する。いくつかの実施形態では、ビーズの表面上へのほとんどのライブラリー断片の固定化は、空間的に制限された領域におけるビーズからのライブラリー断片の放出を確実にするのに役立つ。いくつかの実施形態では、反応温度がビーズの融解温度まで上昇すると表面ポリエステル分子が急速に融解するため、ビーズ表面上のライブラリー断片は、ビーズが融解し始めると急速に放出される。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは非多孔性である。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体はビーズを透過することができないため、全てのトランスポソーム複合体は非多孔性ビーズの表面上に固定化される。いくつかの実施形態では、非多孔性ビーズは、トランスポソーム複合体がビーズ内に固定化されることを可能にせず、代わりに、全てのトランスポソームがビーズ表面上に固定化される。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、１％固体懸濁液又は１０ｍｇ／ｍｌ懸濁液などの固体懸濁液として供給され得る。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、純粋な固体粒子として供給され得る。
いくつかの実施形態では、ビーズはポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む。ＰＣＬは、長期安定性を有することが知られている半結晶性ポリマーであるが、選択的に分解されることができる。例えば、ＰＣＬビーズは、５０℃を超える温度によって選択的に分解され得る。
いくつかの実施形態では、ポリカプロラクトンはポリ（ε－カプロラクトン）である。いくつかの実施形態では、ビーズは、１００ｎｍ～５０μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズは、１μｍ～５μｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズは、３μｍ～５μｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズは、２μｍ～３μｍの平均直径を有する。
いくつかの実施形態では、ビーズの直径は、生成されたライブラリー断片に対して限定的な効果を有する。いくつかの実施形態では、ビーズの直径は、固定化されたトランスポソーム複合体を用いて生成されたライブラリー断片のサイズを決定しない。いくつかの実施形態では、ライブラリー断片のサイズは、トランスポソームとして使用される分解性ポリエステルビーズの表面上のトランスポソーム複合体（トランスポザーゼを含む）の密度と相関する。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の表面濃度を比較的一定に保つために異なるサイズのビーズが使用される場合、異なる量のトランスポソーム複合体が、分解性ポリエステルビーズの表面上に固定化される。
いくつかの実施形態では、ＰＣＬ密度は１．１４５ｇ／ｃｍ３である。いくつかの実施形態では、ＰＣＬ密度は０．７５ｇ／ｃｍ３～１．５ｇ／ｃｍ３である。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、５０℃～６５℃の融解温度を有する。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、５０℃以上、６０℃以上、又は６５℃以上の温度で融解する。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、６０℃の温度で融解する。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、水性塩基の存在下で分解する。いくつかの実施形態では、水性塩基はＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、ＮａＯＨは、１Ｍ～５ＭのＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、ＮａＯＨは、３ＭのＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、水性塩基は、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、又は５ＭのＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、ＮａＯＨの存在下、５０℃以上、６０℃以上、又は６５℃以上の温度で分解する。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、それに固定化された複数の磁性ナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、各トランスポソーム複合体は、ポリヌクレオチド結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、その表面に共有結合した複数のビーズ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ポリヌクレオチド結合部分のビーズ結合部分への結合を介してビーズ表面に固定化される。
トランスポソーム複合体
いくつかの実施形態では、複数のトランスポソーム複合体を分解性ポリエステルビーズの表面に固定化し得る。本明細書で使用される場合、「固定化」及び「付着」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両用語は、明示的に又は文脈によって別段の指示がない限り、直接的又は間接的、共有結合又は非共有結合を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「トランスポソーム複合体」は、組み込み酵素、及び組み込み認識部位を含む核酸を指す。「トランスポソーム複合体」は、転位反応を触媒することが可能なトランスポザーゼ及びトランスポザーゼ認識部位によって形成される機能的複合体である（例えば、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、国際公開第２０１６／１３０７０４号パンフレットを参照）。組み込み酵素の例としては、インテグラーゼ又はトランスポアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。組み込み認識部位の例としては、トランスポザーゼ認識部位が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体を含む分解性ポリエステルビーズは、様々なライブラリー調製プロセスにおいて使用することができるビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）である。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼを含む。固定化されたトランスポソーム複合体を含むＢＬＴ、及びライブラリー断片を調製するためのそれらの使用は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，６８３，２３０号に記載されているものなど、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、本明細書に記載されるように、固定化トランスポソームを含む少なくとも１つのナノ粒子とともに組成物中に含まれる。
いくつかの実施形態では、トランスポソームは、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６個の複合体の密度でビーズ上に存在する。いくつかの実施形態では、固定化ライブラリー中の二本鎖断片の長さは、ビーズ上に存在するトランスポソーム複合体の密度を増減させることによって調整される。ある特定の実施形態では、得られる架橋断片の長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１，１００ｂｐ、１，２００ｂｐ、１，３００ｂｐ、１，４００ｂｐ、１，５００ｂｐ、１，６００ｂｐ、１，７００ｂｐ、１，８００ｂｐ、１，９００ｂｐ、２，０００ｂｐ、２，１００ｂｐ、２，２００ｂｐ、２，３００ｂｐ、２，４００ｂｐ、２，５００ｂｐ、２，６００ｂｐ、２，７００ｂｐ、２，８００ｂｐ、２，９００ｂｐ、３，０００ｂｐ、３，１００ｂｐ、３，２００ｂｐ、３，３００ｂｐ、３，４００ｂｐ、３，５００ｂｐ、３，６００ｂｐ、３，７００ｂｐ、３，８００ｂｐ、３，９００ｂｐ、４，０００ｂｐ、４，１００ｂｐ、４，２００ｂｐ、４，３００ｂｐ、４，４００ｂｐ、４，５００ｂｐ、４，６００ｂｐ、４，７００ｂｐ、４，８００ｂｐ、４，９００ｂｐ、５，０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ未満、又は１００，０００ｂｐ未満である。いくつかの実施形態では、次に、架橋断片は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、標準的なクラスター化学を使用して、クラスター内に増幅され得、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ビーズ上のトランスポソームの密度は、トランスポソーム複合体を含むポリエステルビーズの調製中にビーズに添加されるビオチン結合トランスポソームの溶液中の、トランスポソームの濃度によって制御される。
いくつかの実施形態では、各トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含む。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、２種類以上のトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、２つの異なるタイプのトランスポソーム複合体を含む。いくつかの実施形態では、２つの異なる種類のトランスポソーム複合体を含む分解性ポリエステルビーズは、非対称的にタグ付けされた断片を生成させることができる。いくつかの実施形態では、２つの異なるトランスポソーム複合体を用いた非対称タグメンテーションは、断片の２つの末端に異なるタグを有するいくつかの断片を生成させる。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、Ａ１４配列を含むタグを含むトランスポソーム複合体の１つのプールと、Ｂ１５を含むタグを含むトランスポソーム複合体の別のプールとを含む。この代表的な例では、後のＰＣＲ増幅のためにＡ１４／Ｂ１５配列で非対称的にタグ付けされた断片を作製することができる。
いくつかの実施形態では、単一タイプのトランスポソーム複合体（すなわち、複数の同一のトランスポソーム）を含む分解性ポリエステルビーズは、対称的にタグ付けされた断片を生成させることができる。いくつかの実施形態では、２つの同一のトランスポソーム複合体による対称的なタグメンテーションは、断片の両端に同じタグを有する断片を生成させる。いくつかの実施形態では、方法は、対称的なタグメンテーションの後に、タグ付けされた断片の一端に異なるアダプターを組み込む工程を含んでもよい。例えば、プライマー又はポリヌクレオチドを使用して、タグメンテーション後に断片の一端に異なるアダプターを組み込むことができる。対称タグメント化を組み込むいくつかの例示的な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６３／１６８８０２号に記載される。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、Ｐ７配列を含むタグを含むトランスポソーム複合体の１つのプールと、Ｐ５配列を含むタグを含むトランスポソーム複合体の別のプールとを含む。この代表的な例では、フローセルの表面上に存在し得る異なる捕捉オリゴヌクレオチドに結合する配列で非対称的にタグ付けされた断片を生成させることができる。
Ｃ．タグ
本明細書で使用される場合、「タグ」は、所望の意図された目的又は用途のための配列を示すポリヌクレオチドの部分又はドメインを指す。本明細書に提示されるいくつかの実施形態には、トランスポゾン末端配列を含む３’部分とタグ領域とを有するポリヌクレオチドを含むトランスポソーム複合体が含まれる。
タグは、任意の所望の目的のために提供される任意の配列を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、タグは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、タグは、クラスター増幅反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、タグは、配列決定反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。任意の他の好適な特徴がタグに組み込まれ得ることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、タグは、５～２００ｂｐの間の長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグは、１０～１００ｂｐの間の長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグは、２０～５０ｂｐの間の長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグは、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００ｂｐの長さを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、タグは、インデックス配列、リード配列決定プライマー配列、増幅プライマー配列、又は他のタイプのアダプターを含む。
いくつかの実施形態では、タグは、アダプターを含む。本明細書で使用される場合、「アダプター」は、例えばライゲーション又はタグメンテーションによって核酸分子に融合され得る直鎖状オリゴヌクレオチドを指す。いくつかの例では、アダプターは、サンプル中に存在する任意の標的配列の３’末端又は５’末端に実質的に非相補的である。いくつかの例では、好適なアダプター長さは、約１０～１００ヌクレオチド、約１２～６０ヌクレオチド、又は１５～５０ヌクレオチドの長さである。一般に、アダプターは、ヌクレオチド及び／又は核酸の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、アダプターは、１つ以上の位置に１つ以上の切断可能な基を含み得る。別の態様では、アダプターは、プライマー、例えば、Ｐ５又はＰ７配列などのユニバーサルヌクレオチド配列を含むプライマーの少なくとも一部分に相補的な配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、アダプターは、Ｐ５’又はＰ７’配列を含む。いくつかの例では、アダプターは、下流エラーの訂正、同定、又は配列決定を支援するために、バーコード（本明細書ではインデックスとも称される）を含み得る。
いくつかの実施形態では、タグは、例えば、クラスター増幅のための領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、タグは、配列決定反応をプライミングするための領域を含むことができる。
いくつかの例では、アダプターは、例えば、一方又は両方の末端でアダプターの伸長を妨げるブロッキング基を付加することによって、コンカテマーの形成を防ぐように修飾することができる。３’ブロッキング基の例には、３’スペーサＣ３、ジデオキシヌクレオチド、及び基質への付着が含まれる。５’ブロッキング基の例には、脱リン酸化された５’ヌクレオチド、及び基質への付着が含まれる。
いくつかの例では、アダプターは、１～２０、例えば、１～１５、又は１～１０ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長であり得る、スペーサポリヌクレオチドを更に含み得る。いくつかの例では、スペーサは、１０ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、スペーサは、１０ＴスペーサなどのポリＴスペーサである。スペーサヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に含まれてもよく、ポリヌクレオチドの５’末端との連結を介して好適な支持体に付着されてもよい。付着は、ポリヌクレオチドの５’末端に存在するホスホロチオエートなどの硫黄含有求核試薬によって達成することができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、ポリＴスペーサ及び５’ホスホロチオエート基を含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸分子の断片に連結されるアダプターは、標的核酸分子の断片に関する配列リードのその後の播種、配列決定、及び分析のための配列を含む。アダプターは、例えば、捕捉配列、配列決定プライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、及びインデックスを含み得る。
いくつかの実施形態では、「インデックス配列」は、核酸をタグ付けするため、及び／又は核酸の供給源を識別するための分子識別子及び／又はバーコードとして使用することができるヌクレオチドの配列を指す。いくつかの例では、インデックスを使用して、単一の核酸、又は核酸の亜集団を識別することができる。
本明細書で使用される場合、「プライマー」は、目的の標的配列にハイブリダイズすることができる核酸分子を指す。いくつかの実施形態では、プライマーは、基材として機能し、その上で、ヌクレオチドをポリメラーゼによって重合させることができる。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、増幅プライマー配列である。
いくつかの実施形態では、アダプターは、ユニバーサルヌクレオチド配列に結合する対応する捕捉オリゴヌクレオチドを有する面（lawn）又はウェルを含有する配列決定フローセルの表面上の配列決定ライブラリーの核酸分子の捕捉のためのユニバーサルヌクレオチド配列を含む。断片の末端に存在するユニバーサル配列は、プライマーとしての役割を果たし、増幅反応で伸長され得るユニバーサルアンカー配列の結合に使用することができる。いくつかの実施態様において、２つの異なるユニバーサルプライマーが使用される。１つのプライマーは、インデックス付き核酸断片の１つの鎖の３’末端でユニバーサル配列とハイブリダイズし、第２プライマーは、インデックス付き核酸断片の他方の鎖の３’末端でユニバーサル配列とハイブリダイズする。したがって、各プライマーのアンカー配列は異なり得る。好適なプライマーは各々、ユニバーサル捕捉配列などの追加のユニバーサル配列、及び別のインデックス配列を含むことができる。各プライマーは、インデックスを含むことができるため、この工程は、互いの逆相補体であり得るか、又は互いの逆相補体ではない配列を有し得る、１つ又は２つのインデックス配列の付加をもたらす。
いくつかの実施形態では、タグは、Ｐ５若しくはＰ７配列、又はそれらの相補体を含む。Ｐ５及びＰ７は、ユニバーサルＰ５若しくはＰ７配列、又はＰ５若しくはＰ７プライマーというときは、捕捉及び／又は増幅目的で用いられ得る。Ｐ５’及びＰ７’は、各々Ｐ５及びＰ７の相補体を示す。本明細書に提示される方法において、任意の好適なユニバーサル配列を使用し得ること、またＰ５及びＰ７の使用が例示に過ぎないことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、Ｐ５配列は、配列番号１（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）により定義される配列を含み、Ｐ７配列は、配列番号２（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）により定義される配列を含む。フローセル上でのＰ５及びＰ７、又はそれらの相補体の使用は、限定されないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０１０２５１号、同第２００６／０６４１９９号、同第２００５／０６５８１４号、同第２０１５／１０６９４１号、同第１９９８／０４４１５１号及び同第２０００／０１８９５７号パンフレットの開示によって例示されるように、技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、複数の異なるタイプのアダプターを含むタグを含む。いくつかの実施形態では、タグは、２、３、４、又は５つのタイプのアダプターを含む。
Ｄ．標的核酸
［００５３］いくつかの実施形態では、ビーズは、各々がビーズ上の少なくとも２つのトランスポソーム複合体に結合した標的核酸又は１つ以上のその断片を含む。図２に示すように、標的核酸は、ビーズの表面に固定化された２つ以上のトランスポソーム複合体に結合することができる。
本明細書で使用される場合、「核酸」とは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含み得る。これらの用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの類似体を含み、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドにも適用可能であることを理解されるべきである。本明細書で使用するこの用語はまた、例えば逆転写酵素の作用によって、ＲＮＡテンプレートから生成される相補的又はコピーＤＮＡであるｃＤＮＡも包含する。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語には、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖のＤＮＡ、並びに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖の「ＲＮＡ」が含まれる。用語核酸分子及びポリヌクレオチドは、本明細書において互換的に使用される。
「標的」という用語は、核酸を参照して使用する場合、本明細書に記載の方法の文脈においては核酸の意味的な識別子として意図され、別途明示的に示されるものを超える核酸の構造又は機能を必ずしも限定するものではない。
核酸分子中のヌクレオチドとして、天然に存在する核酸及びそれらの機能性類似体を含ませることができる。特に有用な機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることができ、又は特定のヌクレオチド配列を複製するためのテンプレートとして使用することができる。天然に存在する核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有するバックボーンを有する。アナログ構造は、当技術分野において既知の様々なもののいずれかを含む、代替的バックボーン結合を有することができる。天然に存在する核酸は、一般に、デオキシリボース糖（例えば、ＤＮＡに見られる）又はリボース糖（例えば、ＲＮＡに見られる）を有する。核酸は、当技術分野において既知のこれらの糖部分の様々な類似体のいずれかを含有することができる。核酸は、天然又は非天然塩基を含み得る。この点に関して、天然のＤＮＡは、アデニン、チミン、シトシン、又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、アデニン、ウラシル、シトシン、又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができる。核酸に含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野において既知である。非天然の塩基の例としては、ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）及び架橋核酸（bridged nucleic acid、ＢＮＡ）が挙げられる。ＬＮＡ及びＢＮＡ塩基をＤＮＡオリゴヌクレオチドに組み込んで、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション強度及び特異性を高めることができる。
遺伝物質（標的核酸分子など）を得ることができる代表的な生体サンプルの例としては、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒト若しくは非ヒト霊長類などの哺乳動物；例えば、シロイヌナズナ、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、小麦、米、キャノーラ、若しくは大豆などの植物；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの藻類；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、蚊、ショウジョウバエ、ミツバチ、若しくはクモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚；爬虫類；カエル若しくはアフルカツメガエルなどの両生類；Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ、酵母、Ｓａｃｃｈａｒａｍｏｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、若しくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどの真菌；又は熱帯熱マラリア原虫由来のものが挙げられる。遺伝物質はまた、細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ若しくはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの原核生物；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス若しくはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；又はビロイドに由来し得る。標的核酸分子は、上記の生物の均質な培養物若しくは生物の集団に由来し得るか、又は代替的に、例えば、群衆若しくは生態系におけるいくつかの異なる生物のコレクションから得ることができる。遺伝物質は、天然源から得る必要はなく、その代わりに既知の技術を用いて合成することができる。
生体サンプルは、核酸を含み、タグメンテーションのために固体表面上に堆積させることができる任意の種類であり得る。例えば、サンプルは、精製ＤＮＡなどの様々な精製状態のＤＮＡを含むことができる。しかしながら、サンプルは完全に精製される必要はなく、例えば、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又は任意の他の夾雑物が混入しているＤＮＡを含んでいてもよい。
生体サンプルは、例えば、粗細胞溶解物又は全細胞を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法において固体支持体に適用される粗細胞溶解物は、他の細胞成分から核酸を単離するために従来から使用している分離工程のうちの１つ以上が行われる必要はない。例示的な分離工程は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌに記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、いくつかの実施形態では、生体サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引物、糞便、及びこれらの浸軟組織、若しくはこれらの溶解物、又はＤＮＡを含む任意の他の生体標本を含み得る。
標的核酸分子を含むサンプルは、ゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）、並びに標的核酸分子を含有する細胞及び細胞溶解物であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸を含む生体サンプルは、細胞溶解物、全細胞、又はホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed paraffin-embedded、ＦＦＰＥ）組織サンプルを含む。
Ｅ．ポリヌクレオチド結合部分
いくつかの実施形態では、各トランスポソーム複合体は、ポリヌクレオチド結合部分を含む。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド結合部分は、ポリヌクレオチドの別の剤への結合を可能にする任意の部分である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、ポリヌクレオチドをビーズに結合させる働きをする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分はビオチンである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、ストレプトアビジン又はアビジンである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分はビオチンであり、ビーズ結合部分はストレプトアビジン又はアビジンである。いくつかの実施形態では、ビーズ結合部分はビオチンであり、ポリヌクレオチド結合部分はストレプトアビジン又はアビジンである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、ポリヌクレオチド結合部分のビーズ結合部分への結合を介してポリヌクレオチドをビーズに結合させる働きをする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分としてのビオチンの存在は、ビオチンコンジュゲートトランスポソームを生成させることができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、ポリヌクレオチド結合部分のビーズ結合部分への結合を介して、１つ以上のポリヌクレオチドをビーズに固定化するように機能する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド結合部分のビーズ結合部分への結合は、１つ以上のトランスポソーム複合体をビーズに固定化する働きをする。いくつかの実施形態では、１つ以上のトランスポソーム複合体は、ビーズの表面に結合される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、ポリヌクレオチドに共有結合される。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチド結合部分は、各トランスポソーム複合体の第１のポリヌクレオチドに共有結合される。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチド結合部分は、各トランスポソーム複合体の第２のポリヌクレオチドに共有結合される。
ポリヌクレオチド結合部分は、ポリヌクレオチドの５’又は３’に結合され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、第１のポリヌクレオチドの５’末端に結合される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、第２のポリヌクレオチドの３’末端に結合される。
Ｆ．ビーズ結合部分
いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズ結合部分を含む。本明細書で使用される場合、ビーズ結合部分は、別の剤へのビーズの結合を可能にする任意の部分である。様々な潜在的ビーズ結合部分を含むビーズは、当技術分野において周知であり、市販されているものもある。
いくつかの実施形態では、ビーズ結合部分はストレプトアビジン又はアビジンである。いくつかの実施形態では、ビーズ結合部分はビオチンである。いくつかの実施形態では、ビーズ結合部分はストレプトアビジン又はアビジンであり、ポリヌクレオチド結合部分はビオチンである。いくつかの実施形態では、ビーズ結合部分はビオチンであり、ポリヌクレオチド結合部分はストレプトアビジン又はアビジンである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、ポリヌクレオチド結合部分のビーズ結合部分への結合を介してポリヌクレオチドをビーズに結合させる働きをする。
いくつかの実施形態では、各ビーズ結合部分は、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は
－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を含む。
本方法は、連結部を調製するために、様々な異なるクリックケミストリーを使用し得る。いくつかの実施形態では、ビーズ表面は、様々な連結ケミストリーを可能にする態様で官能化される。いくつかの実施形態では、連結ケミストリーは、アルキン－アジドの化学反応（銅触媒アジド－アルキン環化付加化学反応）である。いくつかの実施形態では、連結ケミストリーは、マレイミド－スルフヒドリルの化学反応である。
Ｇ．磁性ナノ粒子
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは磁性ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、これらの磁性粒子は、ポリエステルビーズの選別及び／又は洗浄のために使用される。上記の任意のナノ粒子は、ポリエステルビーズとともに磁性ナノ粒子として使用され得る。
いくつかの実施形態では、各磁性ナノ粒子は、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は
－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を含む。
いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、磁性材料コアを含むビーズである。いくつかの実施形態では、磁性材料コアは、鉄、ニッケル、又はコバルトである。いくつかの実施形態では、磁性コアは、シリカシェルでコーティングされる。いくつかの実施形態では、シリカシェルは、有機シラン材料による官能化を可能にする。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、５０ｎｍ～１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、１００ｎｍの直径を有する。
いくつかの実施形態では、ビーズに含まれる磁性ナノ粒子を使用して、フローセルの複数の表面にビーズを播種することができる。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、フローセルなどの配列決定表面の上面及び底面への播種を可能にする。
いくつかの実施形態では、フローセルの複数の表面（例えば、上面及び底面）に播種することは、フローセルの表面上に固定化されたビーズを使用することによって行うことができる。フローセルの表面に播種するためのビーズの使用は、フローセルの表面上に形成される空間的に分離した特徴の作製を可能にする。より具体的には、ビーズの層は、ビーズに存在又は結合しているポリヌクレオチドが、ビーズに最も近い表面位置でフローセル表面に接触又はハイブリダイズするように、フローセルの複数の表面上に形成することができる。このようにして、層内でのビーズ同士の近接性が、フローセル表面上でハイブリダイズされるか又は接触されるポリヌクレオチドの近接性を決定する。例えば、球状ビーズの密に充填された単層からのポリヌクレオチドは、フロー表面上のビーズの直径に等しい中心間間隔を有するハイブリダイズされたアレイを生成させる。したがって、フローセル表面上に所望のパターンを得るために、ビーズ形状、ビーズサイズ及びビーズ充填密度などのビーズ層の特性を操作することができる。
いくつかの実施形態では、「穏やかな浮遊」試薬、例えば、１ｇ／ｃｍ３を超えるが２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する試薬中の磁性ビーズを磁性ストリップとともに使用することにより、磁性ビーズがあまりにも速く底に沈むことを防止することができる。いくつかの実施形態では、その全体が本明細書に組み込まれる米国仮出願第６３／０６６，７２７号に記載されているように、ビーズのおよそ半分がフローセルの上面に残る一方で、磁性ビーズの残りの半分はフローセルの底面に沈む。
Ｈ．固定化ポリエステルビーズ
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、フローセルの表面上に固定化される。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、フローセルの表面上のフローセル結合部分へのビーズ結合部分の結合を介してフローセルの表面上に固定化される。いくつかの実施形態では、この結合は共有結合である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分及びフローセル結合部分は、同じタイプの結合部分である。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ビーズ上のビーズ結合部分の第１の部分に結合され、フローセル結合部分は、同じビーズ上のビーズ結合部分の第２の部分に結合される。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ビーズ上のビーズ結合部分の第１の部分に結合され得、フローセル結合部分は、同じビーズ上のビーズ結合部分の第２の部分に結合される。例えば、ストレプトアビジンを含むビーズ上のいくつかのビーズ結合部分は、ビオチン化フローセルに結合し得るが、同じビーズ上の他のビーズ結合部分は、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して、トランスポソーム複合体のビオチン化ポリヌクレオチドに結合する。このようにして、ライブラリー播種及びクラスター化の後、分解性ポリエステルビーズは、フローセルから放出され（例えば、過剰な遊離ビオチンによって）、分解され得る。
したがって、分解性ポリエステルビーズは、トランスポソームを固定化するためのトランスポソーム担体として働くことができ、ビーズの表面上でのタグメンテーションを可能にし、次いでビーズをフローセルに近接させることができる。ビーズをフローセルに固定化した後、ライブラリー断片を放出させて、フローセル上でのライブラリー播種及びクラスター化を可能にすることができ、次いで、ライブラリー調製、クラスター化、及び配列決定（合成による配列決定など）に関連する自動化を妨げないように、ポリエステルビーズを分解することができる。いくつかの実施形態では、分解されたポリエステルビーズは、非分解性ビーズで起こり得るチューブの詰まりが回避される。
Ｖ．トランスポソーム複合体を含むポリエステルビーズの調製
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体を含むポリエステルビーズを作製する方法は、複数のトランスポソーム複合体をポリエステルビーズに固定化することを含み、各トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の磁性ナノ粒子をポリエステルビーズに固定化することを更に含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体を含む分解性ポリエステルビーズは、ＰＣＬビーズから調製される。いくつかの実施形態では、ＰＣＬビーズは、活性アミノ基の導入を介して官能化される。例えば、１，６－ヘキサンジアミン中の１０％（ｗ／ｗ）イソプロパノール溶液中でのアミノ分解によって、活性アミン基をビーズ表面に導入することができる。本明細書で使用される場合、「官能化ビーズ」は、その表面上に活性基を有するビーズを指す。
いくつかの実施形態では、官能化ビーズ上の活性アミンをストレプトアビジンのリジン残基上のアミンにコンジュゲートして、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを生成させる。いくつかの実施形態では、官能化ビーズ上の活性アミンは、グルタルアルデヒドによってアミン官能化磁性ナノ粒子にコンジュゲートされて、磁性ナノ粒子コーティングビーズが生成する。いくつかの実施形態では、ビーズは、ストレプトアビジン及び磁性ナノ粒子の両方でコーティングされる。図１Ａは、ＰＣＬビーズを官能化するためのいくつかの例示的な手段を示す。
磁性ビーズ（すなわち、磁性ナノ粒子を含むビーズ）は、ビーズ使用の方法の範囲内で多くの用途を有する（Ｈｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｆａｒａｄａｙ Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ，１７５：７３－８２（２０１４）を参照）。例えば、洗浄工程の間、磁性ビーズは、マグネチックスタンドを介してウェル又はチューブ内に保持され得る。更に、磁性ビーズを使用して、上述のように、フローセルの上面及び底面にビーズを播種することができる。
トランスポソームは、多くの方法で官能化ビーズ上で構築することができる。例示的な方法では、ビオチンコンジュゲートトランスポソーム（ビオチン化されたポリヌクレオチド結合部分を含むものなど）を、ストレプトアビジンで官能化されたＰＣＬビーズ上に構築することができる（図１Ｂ）。ＰＣＬビーズは、単一タイプのトランスポソーム複合体と構築されてもよく、又はＰＣＬビーズは、２つ以上のタイプのトランスポソーム複合体と構築されてもよい。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズを作製する方法は、複数のトランスポソーム複合体をポリエステルビーズに固定化することを含み、各トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、複数の磁性ナノ粒子をポリエステルビーズに固定化することを更に含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、複数のトランスポソーム複合体をポリエステルビーズに固定化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の磁性ナノ粒子をポリエステルビーズに固定化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のトランスポソーム複合体及び複数の磁性ナノ粒子をポリエステルビーズに固定化することを含む。
ＶＩ．ポリエステルビーズを含むフローセル
いくつかの実施形態では、フローセルは、フローセルの表面に固定化された本明細書に記載のポリエステルビーズを含み、ポリエステルビーズは、その表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含み、各トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、第２のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつトランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含み、ポリエステルビーズは、５０℃～６５℃の融解温度を有する。
いくつかの実施形態では、ポリエステルビーズは、フローセルの表面上のフローセル結合部分へのビーズ結合部分の共有結合を介してフローセルの表面上に固定化される。いくつかの実施形態では、ビーズ結合部分はストレプトアビジン又はアビジンであり、フローセル結合部分はビオチンである。いくつかの実施形態では、ビーズ結合部分はビオチンであり、フローセル結合部分はストレプトアビジン又はアビジンである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分及びフローセル結合部分は、同じタイプの結合部分であり、トランスポソーム複合体は、ビーズ上のビーズ結合部分の第１の部分に結合され、フローセル結合部分は、ビーズ上のビーズ結合部分の第２の部分に結合される。
いくつかの実施形態では、フローセルは、配列決定フローセルである。本明細書で使用される場合、「配列決定フローセル」とは、１つ以上の流体試薬を流すことができ、配列決定ライブラリーの適合された断片を輸送及び結合できる表面を含む、チャンバーを指す。本開示の方法において容易に使用することができる配列決定フローセル及び関連する流体システム及び検出プラットフォームの非限定的な例としては、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列決定フローセルは、配列決定ライブラリーが結合する表面を有する固体支持体を含む。いくつかの例では、表面は、配列決定ライブラリーの適合された断片に結合することができる、一面の捕捉ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、表面はパターン化された表面である。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出された表面内又はその上の異なる領域（増幅部位など）の配列（アレイなど）を指し得る。例えば、１つ以上の領域は、１つ以上の増幅及び／又は捕捉プライマーが存在する特徴部であり得る。この特徴部は、プライマーが存在しない介在領域によって分離され得る。いくつかの例では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットとすることができる。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は中間部領域の反復配置とすることができる。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は中間部領域のランダム配置とすることができる。いくつかの例では、表面は、配列決定ライブラリーの適合された断片に結合する捕捉ヌクレオチド及び／又は増幅ヌクレオチドを有するウェルのアレイを含有するパターン化された表面であり、捕捉ヌクレオチド及び／又は増幅ヌクレオチドを欠くウェル間の中間部領域を有する。
パターン化された表面内の特徴は、ガラス、シリコン、プラスチック、又はポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミルペンチル）アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ、例えば、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／１８４７９６号、国際公開第２０１６／０６６５８６号及び同第２０１５／００２８１３号を参照されたい）などのパターン化された共有結合ゲルを有する他の好適な固体支持体上のウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）がアレイ状になったものとすることができる。このプロセスは、配列決定のために使用されるゲルパッドを作成し、これは、多数のサイクルで配列決定動作にわたって安定であり得る。ポリマーをウェルに共有結合することは、様々な用途の間に、構造化基材の寿命全体にわたってゲルを構造化特徴部に維持するのに有用である。しかしながら、多くの例では、ゲルは、ウェルに共有結合される必要はない。例えば、いくつかの条件では、表面内のどのウェルにも共有結合されていないシランフリーのアクリルアミド（ｓｉｌａｎｅ ｆｒｅｅ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、ＳＦＡ、例えば、米国特許第８，５６３，４７７号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をゲル材料として使用することができる。本明細書に記載の方法及び組成物で使用することができるパターン化された表面を有するフローセルの例は、米国特許第８，７７８，８４８号、同第８，７７８，８４９号、及び同第９，０７９，１４８号、並びに米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
パターン化された表面における特徴は、例えば、少なくとも１０個、例えば、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、又は少なくとも５，０００，０００個、又はそれ以上の、特徴／ｃｍ２などの、様々な密度のいずれかを有することができる。
いくつかの例では、フローセルデバイスは、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、若しくは１５０μｍ、又は前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内のチャネル高さを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている固体支持体は、フローセルの少なくとも一部を形成するか、又はフローセル内に位置する。
本明細書中の「固体表面」、「固体支持体」という用語及び他の文法上の等価物は、核酸のプロセシングのための物質（例えば、トランスポソーム複合体を含む核酸ライブラリー調製のための物質を含む）の結合に適切であるか、又は適切であるように改変され得る任意の物質を指す。当技術分野の当業者に理解されるように、利用可能な固体支持体の数は非常に多い。使用可能な材料としては、ガラス及び変性又は機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、並びにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）などを含む）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカ又はケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバ束、並びに様々な他のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、特に有用な固体支持体及び固体表面は、フローセル装置内に配置される。
いくつかの例では、固体支持体は、ガラス、融解シリカ、又は他のシリカ含有材料などのシリカベースの基材を含む。いくつかの例では、シリカベースの基材は、ケイ素、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、又はシリコーンヒドリド（silicone hydride）とすることもできる。いくつかの例では、固体支持体には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、環状オレフィンポリマー、又はポリ（メチルメタクリレート）などのプラスチック材料が含まれる。いくつかの例では、固体支持体は、シリカベースの材料又はプラスチック材料である。いくつかの例では、固体支持体は、ガラスを含む少なくとも１つの表面を有する。
いくつかの例では、固体支持体は、金属であり得るか、又は金属を含み得る。いくつかのかかる例では、金属は金である。いくつかの例では、固体支持体は、金属酸化物を含む少なくとも１つの表面を有する。一例では、固体支持体は、酸化タンタル又は酸化スズを含む。
アクリルアミド、エノン、又はアクリレートもまた、固体支持体材料として利用され得る。他の固体支持体の材料としては、限定するものではないが、ヒ化ガリウム、リン化インジウム、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、石英、樹脂、ポリマー及びコポリマーを挙げることができる。上述のリストは、本出願を例示することが意図されているが、本出願を限定するものではない。
いくつかの例では、固体支持体及び／又は固体表面は、石英とすることができる。いくつかの例では、固体支持体及び／又は固体表面は、ＧａＡｓ又はインジウムスズ酸化物（indium tin oxide、ＩＴＯ）などの半導体とすることができる。
固体支持体は、単一材料又は複数の様々な材料を含むことができる。固体支持体は、複合体又は積層体とすることができる。固体支持体は、平坦であってもよく、円形であってもよく、テクスチャ加工されていてもよく、またパターン化されていてもよい。パターンは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７８，８４９号に記載されているように、例えば、非金属表面上に特徴を形成する金属パッドによって形成することができる。別の有用なパターン化された表面は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４（Ａ１）号、同第２０１１／０１７２１１８（Ａ１）号又は米国特許第７，６２２，２９４号に記載されるように、表面上に形成されたウェル特徴を有するものであり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。パターン化された表面を使用する例では、ゲルをパターンフィーチャに会合させるか、若しくはパターンフィーチャ上に堆積させることができ、又は代替的に、ゲルをパターンフィーチャ及び中間部領域の両方にわたって均一に堆積させることができる。
いくつかの例では、固体支持体はパターン化された表面を含む。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出層内又はその上における、異なる領域の配置を指す。いくつかの例では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットとすることができる。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は中間部領域の反復配置とすることができる。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は中間部領域のランダム配置とすることができる。本明細書に記載される方法及び組成物において使用することができる例示的なパターン化表面は、米国特許出願第１３／６６１，５２４号又は米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される方法及び組成物において使用することができるパターン化表面の例は、米国特許出願第１３／６６１，５２４号又は米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、固体支持体は、表面にウェル又は凹部のアレイを含む。これは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、当技術分野において一般的に知られているように製造することができる。当技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基板の組成及び形状に依存する。いくつかの例では、ウェル又は凹部のアレイは、直径１０μｍ～５０μｍ、例えば直径１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、若しくは５０μｍ、又は前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の直径である。いくつかの例では、ウェル又は凹部は、０．５μｍ～１μｍの深さ、例えば、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、若しくは１μｍの深さ、又は前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の深さを有する。いくつかの例では、ウェル又は凹部は、疎水性材料から作製される。いくつかの例では、疎水性材料は、例えば、ＣＹＴＯＰ、Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ（登録商標）フルオロアクリルコポリマー溶液、又はＴｅｆｌｏｎ（登録商標）フルオロポリマーを含む非晶質フルオロポリマーを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３３１６９号を参照されたい。
ＶＩＩ．分解性ビーズを用いて核酸ライブラリーを調製する方法
本明細書に記載されるポリエステルビーズは、核酸ライブラリー調製の方法において使用することができる。
いくつかの実施形態では、標的核酸から核酸ライブラリーを調製する方法は、標的核酸を本明細書に記載のポリエステルビーズ又はフローセルと接触させ、それによって標的核酸をトランスポソーム複合体によって断片化し、第１のポリヌクレオチドの３’トランスポゾン末端配列を断片の少なくとも１つの鎖の５’末端に移動させ、それによって少なくとも１つの鎖がタグで５’タグ付けされた断片の固定化ライブラリーを生成させることを含む。
ベッド上のタグの固定化ライブラリーの調製後、本方法は、フローセル上にビーズを固定化する工程、ライブラリー断片を放出する工程（すなわち、ライブラリー播種）及びフローセル上でライブラリー断片をクラスター化する工程、使用済みビーズを放出する工程、並びに使用済みビーズを分解する工程を更に含み得る。したがって、本方法は、ライブラリーのビーズベースの調製、及びトランスポソーム担体としてビーズを使用するフローセル上へのライブラリーの固定化を可能にすることができ、その後、ビーズが放出され、分解される。このようにして、ビーズは、配列決定などの下流の方法に影響を及ぼすことなく、トランスポソーム担体としての目的を果たす。
本明細書に提供されるシステム及び方法の実施形態には、任意の１つ以上の分解性ポリエステルビーズを含むキットが含まれ、更に、キットには、遺伝物質の処理に有用な成分、例えば、遺伝物質の各処理に使用されるような、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポゼース（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプター配列）、及びリガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、緩衝剤、又は二価カチオンを含む、細胞溶解、並びに核酸増幅及び配列決定のため、又は核酸ライブラリー調製のための試薬が含まれる。
Ａ．ビーズ上でのライブラリー断片の調製
クラスター形成及び配列決定の準備が整った溶液中において核酸をアダプターで修飾されたテンプレートに転換するために必要な工程の数は、トランスポザーゼに媒介される断片化及びタグ付けの使用によって減少させることができ、いくつかの例では、最小限に抑えることができる。本明細書では「タグメンテーション」と称されるこのプロセスは、トランスポゾン末端配列及び１つ以上のタグを含むポリヌクレオチドと複合体化したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体による核酸の修飾を伴う。タグメンテーションは、核酸分子を断片化し、その断片の５’及び３’末端にアダプターを単一工程でライゲーションするためのトランスポソーム複合体による核酸分子の修飾を含み得る。タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのタグのライゲーションを同時にもたらし得る。タグメンテーション反応は、配列決定ライブラリーの調製のために使用され得る。タグメンテーション反応では、ランダム断片化とアダプターライゲーションとを組み合わせて単一工程とし、それにより、配列決定ライブラリー調製プロセスの効率を向上させる。一例では、トランスポザーゼ酵素を除去する精製工程に続いて、ＰＣＲにより適合された断片の末端に追加の配列を加える。いくつかの例では、溶液ベースのタグメンテーションは欠点を有し、いくつかの手間を要する工程が必要となり得る。加えて、ＰＣＲ増幅工程中に偏り（bias）が導入される可能性がある。
本明細書に提示されるデバイス、システム、及び方法は、これらの欠点を克服し、偏りのないサンプル調製、クラスター形成、及び配列決定が、サンプル操作又は移動のための最小限の要件にて、単一の固体支持体上で行うことを可能にし、また、固体支持体上での別個の遺伝物質の配列決定を可能にする。いくつかの実施態様では、配列決定ライブラリーの空間的インデックス付けは、（例えば、バーコード付け工程の必要性を低減又は排除することによって）配列決定ライブラリーが生成される遺伝物質（例えば、標的核酸分子）の単純化された処理及び配列再構築を可能にする。本明細書に記載される実施態様はまた、標的核酸分子の配列決定のためのデータ分解能を増加させ、（例えば、新しい生物のための）ゲノムのアセンブリを更に単純化し、標的核酸分子における稀な遺伝的変異及び突然変異の共起性の同定作業を改善する。
いくつかの実施形態では、ライブラリー断片は、（ＢＬＴ上又は担体ビーズ上に固定化されたナノ粒子上の固定化されたトランスポソーム複合体に含まれる）トランスポザーゼと断片との会合によりビーズ上に保持される。いくつかの実施形態では、断片は、プロテアーゼ又はＳＤＳが添加されて断片がトランスポザーゼから放出されるまで、又はビーズが融解するまで、ビーズ上に固定化されたままである。いくつかの実施形態では、固定化されたライブラリー断片を有するビーズ（例えば、タグメンテーション後）は、配列決定のために固体支持体（例えば、フローセル）に送達され、次いで、ライブラリーは、ビーズから放出され、固体支持体上に捕捉される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ビーズに固定化され、配列決定のために固体支持体に送達され、タグメンテーションが行われ、次いで、ライブラリーがビーズから放出され、固体支持体上に捕捉される。ビーズからのライブラリー断片の放出と、それに続くフローセル上での捕捉は、フローセル上での空間的読み取りを可能にすることができ、単一ビーズからの断片は、互いに近接して放出される。このようにして、フローセル上で空間的に近接している断片は、同じビーズ上で調製された核酸に由来する可能性が高いと決定することができる。かかる方法は、「ビーズコード」又は他のバーコードを断片に組み込む必要なく、所定のビーズ上で調製された断片を他のビーズ上で調製された断片から分離するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ライブラリー断片は、ビーズコード又は他のバーコードを組み込むためにタグメンテーションによって調製されてもよく、また空間情報に基づいてビーズ情報を取得する能力は、任意のタイプのバーコードの使用を排除するものではない。
いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーの調製は、分解性ポリエステルビーズに結合した標的核酸分子に対してタグメンテーション反応を行うことを含む。本明細書で使用される場合、配列決定ライブラリーは、１つ以下の標的核酸分子の核酸断片のコレクション、又はその断片のアンプリコンのコレクションを含み得る。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーの核酸断片は、それらの３’末端及び５’末端で既知のユニバーサル配列（Ｐ５配列及びＰ７配列など）に連結される。いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーは、本明細書に記載される分解性ポリエステルビーズ上に固定化された１つ以上の標的核酸分子から調製される。
適合された断片（すなわち、配列決定ライブラリーに含まれる断片）は、その後の播種及び配列決定工程のための任意の適切なサイズとすることができる。いくつかの例では、適合された断片は、１５０～４００ヌクレオチド長、例えば１５０～３００ヌクレオチド長である。
例えば、タグメンテーション反応は、ビーズが配列決定フローセル上に捕捉されるとき、又はビーズを配列決定フローセル上にロードする前に、行うことができる。いくつかの例では、タグメンテーション反応は、標的核酸分子を、１つ以上のアダプター配列を含むタグを含むポリヌクレオチドを含むトランスポソームと接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーは、少なくとも１５０ヌクレオチド長のＤＮＡ又はＲＮＡ断片を含む。
いくつかの実施形態では、断片のギャップ充填及びライゲーションは、ポリメラーゼ及びリガーゼを使用して行われる。いくつかの実施形態では、断片のギャップ充填及びライゲーションは、ビーズをフローセルに固定化する前又は後に実施される。
Ｂ．ビーズの固定化
いくつかの実施形態、本方法は、断片の固定化ライブラリーを含むビーズをフローセルの表面に固定化する工程を含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、固定化ライブラリー断片がビーズ上に調製された後にフローセルの表面に固定化される。
いくつかの実施形態では、ビーズは、フローセルの表面上のフローセル結合部分へのビーズ結合部分の結合を介してフローセルの表面に固定化される。
Ｃ．ライブラリー断片の放出及び捕捉
いくつかの実施形態では、本方法は、固定化ビーズからライブラリー断片を放出させて、使用済みビーズを提供することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル表面上に放出された断片を捕捉して、捕捉された断片を生成させることを含む。本明細書で使用される場合、「使用済みビーズ」とは、標的核酸が断片化され、続いて固定化ビーズから放出された後のビーズを指す。
いくつかの実施形態では、分解性ポリエステルビーズは、標的核酸又はライブラリー断片がビーズに固定化され、ビーズがフローセルに送達される、固相担体として機能し得る。国際公開第２０１５／０９５２２６号パンフレットは、固相担体としてのビーズの使用を記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、標的核酸が（例えば、ビーズ表面上のトランスポソーム複合体への二本鎖ＤＮＡ結合によって）ビーズ上に固定化され、ライブラリー断片が（例えば、タグメンテーションによって）ビーズ上に生成され、ビーズがフローセルに送達され、ライブラリー断片が放出されフローセル上に捕捉される。代替的に、標的核酸をビーズに固定化し、ビーズをフローセルに送達し、ライブラリー断片をビーズ上に生成させ、ライブラリー断片を放出させてフローセル上に捕捉することができる。
いくつかの実施形態では、断片は、ビーズがフローセルから放出される前にビーズから放出される。いくつかの実施形態では、固定化されたライブラリー断片は、ビーズ上に生成され（ここで、断片は、ビーズがフローセル上に固定化される前又は後のいずれかに生成される）、断片は、ビーズから放出され、断片は、フローセル上に捕捉され、次いで、ビーズは、フローセルから放出され、分解される。いくつかの実施形態では、洗浄剤又は界面活性剤が、ライブラリー断片を放出するために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＤＳが、ライブラリー断片を放出するために使用される。いくつかの実施形態では、ビーズの精製により、トランスポザーゼが除去され、ライブラリー断片が放出される。いくつかの実施形態では、ビーズの融解によりライブラリー断片が放出され、次いで、これがフローセルによって捕捉される。
いくつかの実施形態では、放出されたライブラリー断片の捕捉は、放出された断片をフローセルの表面上の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、放出後、配列決定ライブラリーは、フローセルの表面に送達され、そこで捕捉される。次いで、単一ビーズ由来の配列決定ライブラリー断片を用いたフローセル上への播種が、ビーズがフローセルに結合している場所に近接して起こる。播種は、各ビーズのフローセル上へのフットプリントにごく近接して生じるため、各ビーズ由来の播種された配列決定ライブラリーは、ビーズの位置に基づいてフローセル上で空間的に分離される（又は「インデックス化される」）。
本明細書で使用される場合、「捕捉」とは、目的の表面（フローセル表面など）上への標的対象（ポリエステルビーズなど）の固定化を指す。捕捉部位は、標的核酸分子の１つ以上のビーズ又は適合された断片が捕捉され得る、配列決定フローセルの表面上の部位である。本明細書で使用される場合、「捕捉オリゴヌクレオチド」は、ライブラリー断片の少なくとも一部に相補的である核酸を指す。いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、プライマー配列を含み、「捕捉プライマー」と称され得る。
いくつかの例では、配列決定ライブラリーは、フローセル上の捕捉オリゴヌクレオチドと配列決定ライブラリーの適合された断片との相互作用によってフローセル上に捕捉される。
いくつかの例では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列決定フローセル上に位置する特異的結合対の第１のメンバーであり、配列決定ライブラリーの適合断片（すなわち、タグメンテーションによって生成された断片）上に位置する特異的結合対の第２のメンバーに結合する。例えば、フローセルは、特異的結合対の第１のメンバーで官能化され得、適合された断片のアダプターは、特異的結合対の第２のメンバーを含有する。
いくつかの例では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列決定フローセルの表面に付着させることができる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、パターン化されたフローセルの表面上のウェルに付着させることができる。付着は、ビーズ、粒子、又はゲルなどの中間構造を介するものとすることができる。ゲルを介した配列決定フローセルの表面への捕捉オリゴヌクレオチドの付着は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているフローセルによって例示されるか、又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０９３０９８号パンフレットに記載されている。
いくつかの実施形態では、パターン化されたフローセルは、ウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）を用いて固体支持材料をパターニングし、パターン化された支持体をゲル材料（例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡ、又はその化学的に修飾されたバリアント、例えば、ＳＦＡのアジド化バージョン（アジド－ＳＦＡ））でコーティングし、ゲルコーティングされた支持体を、例えば、化学研磨又は機械研磨により研磨することによって作製された配列決定ライブラリーと結合するための表面を含み、これにより、ウェル内にゲルが保持されるが、ウェル間の構造化された基質の表面の中間部領域の実質的に全てのゲルが除去又は不活性化される。捕捉オリゴヌクレオチドは、配列決定ライブラリーの捕捉及び増幅のためにゲル材料に付着させることができる。次いで、配列決定ライブラリーは、ライブラリー中の個々の適合された断片が、ゲル材料に付着したプライマーとの相互作用を介して個々のウェルに播種されるように、パターン化された表面に送達することができるが、ゲル材料が存在しないか不活性であるため、適合された断片は、ウェル間の中間部領域を占有しない。適合された断片の増幅は、ウェル間の中間部領域内のゲルの不存在又は非活性が、増殖する核酸コロニーの外向きの移動を防止するため、ウェルに限定されるであろう。プロセスは、好都合に製造可能であり、スケール変更可能であり、従来のマイクロ又はナノ製造方法を利用する。
いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチド配列を含み得る。本明細書で使用される場合、ユニバーサルヌクレオチド配列とは、互いに異なる配列の領域を有する２つ以上の核酸分子に共通の配列の領域を指す。分子の集合の異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル捕捉核酸の集団、例えば、ユニバーサル配列の一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド、例えば、ユニバーサル捕捉配列を使用して、複数の異なる核酸を捕捉することができる。ユニバーサル捕捉配列の非限定的な例としては、Ｐ５及びＰ７プライマーと同一又は相補的な配列が挙げられる。同様に、分子の集合の異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列の一部に相補的なユニバーサルプライマーの集団、例えば、ユニバーサルアンカー配列を使用して、複数の異なる核酸を増幅又は複製（例えば、配列決定）することができる。したがって、捕捉オリゴヌクレオチド又はユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を含む。ハイブリダイズする２つのユニバーサル配列は、ユニバーサル結合対と称される。例えば、ハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチド及びユニバーサル捕捉配列は、ユニバーサル結合対である。
本明細書で使用される場合、配列決定ライブラリーの播種とは、固体支持体（例えば、配列決定フローセル）上への標的核酸分子の適合された断片の固定化を指す。
Ｄ．断片の増幅
いくつかの実施形態では、本方法は、ビーズから断片を増幅することを含む。
いくつかの例では、播種された配列決定ライブラリーは、配列決定の前に増幅され得る。例えば、播種された配列決定ライブラリーは、アダプター配列中のプライマー部位を使用して増幅され得、その後、１つ以上のタグ中のアダプター配列中の配列決定プライマー部位を使用して配列決定され得る。
いくつかの実施形態では、標的核酸分子はゲノムＤＮＡであり、増幅は全ゲノム増幅を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル表面上の捕捉された断片を増幅して、固定化され増幅された断片を生成させることを含む。いくつかの実施形態では、捕捉された断片の増幅は、断片のクラスターを生成させるためのブリッジ増幅を含む。
本明細書で使用される場合、「増幅」は、核酸分子の少なくとも一部が少なくとも１つの追加の核酸分子に複製又はコピーされる任意の作用又はプロセスを指す。いくつかの例では、かかる増幅は、等温条件を使用して行うことができ、他の例では、かかる増幅は、熱サイクリングを含み得る。いくつかの例では、増幅は、単一増幅反応における複数の標的配列の同時増幅を含む多重増幅である。増幅反応の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応（strand displacement amplification reaction、ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅反応（rolling circle amplification reaction、ＲＣＡ）、多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル（multiple annealing and looping based amplification cycle、ＭＡＬＢＡＣ）、ＮＡＳＢＡなどの転写媒介増幅法（transcription-mediated amplification、ＴＭＡ）、ループ媒介増幅法（例えば、ループ形成配列を使用した「ＬＡＭＰ」増幅）が挙げられる。増幅される核酸分子は、ＤＮＡ若しくはリボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）、又は修飾されたＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡを含む、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含むか、それらからなるか、又はそれらに由来するＤＮＡとすることができる。１つ以上の核酸分子の増幅から得られる生成物（例えば「増幅生成物」又は「アンプリコン」）は、出発核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方であるかどうかに関わらず、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれか、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド若しくはヌクレオチドの両方の混合物であり得るか、又は修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシド若しくはヌクレオチドを含むことができる。「コピー」は、必ずしも標的配列に対する完全な配列相補性又は同一性を意味するわけではない。例えば、コピーは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンなどのヌクレオチド類似体、意図的な配列改変（標的配列にハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列改変など、及び／又は増幅中に起こる配列エラーを含むことができる。
いくつかの例では、「固相増幅」、すなわち、形成時に増幅生成物の全て又は一部が固体支持体上に固定されるように、固体支持体上又は固体支持体と関連して実施される任意の核酸増幅反応を含む。固相増幅の非限定的な例としては、順方向及び逆方向増幅プライマーの一方又は両方が固体支持体上に固定されていることを除いて、標準溶液相増幅に類似した反応である、固相ポリメラーゼ連鎖反応（固相ＰＣＲ）及び固相等温増幅が包含される。
更なる例では、増幅としては、限定されないが、米国特許第８，００３，３５４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、及び核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification、ＮＡＳＢＡ）を挙げることができる。上記の増幅方法を使用して、目的の１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して封入された核酸を増幅することができる。いくつかの例では、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーが、増幅反応に含まれる。
いくつかの例では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（oligonucleotide ligation assay、ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの例では、増幅方法としては、目的の核酸に対して特異的に向けられるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を挙げることができる。目的の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に使用されるプライマーを含むことができる。
本開示において有用な別の核酸増幅法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されているように、定常５’領域の後にランダム３’領域が続く２ドメインプライマーの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の第１のラウンドは、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性ＤＮＡ上で多数の開始を可能にするために行われる。３’領域の性質により、開始部位はゲノム全体にランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマーを除去し、定常５’領域に相補的なプライマーを使用して、更なる複製を行うことができる。
いくつかの例では、播種された配列決定ライブラリーは、固相増幅によって増幅される。固相増幅用のプライマー（捕捉プライマーなど）は、プライマーの５’末端又はその付近で固体支持体への単一点共有結合によって固定されることで、プライマーのテンプレート特異的部分がその同族テンプレートへのアニーリングのために用意され、また３’ヒドロキシル基がプライマー伸長のために用意され得る。この目的のために、任意の好適な共有結合的手段を使用することができる。選択された結合化学は、固体支持体の性質、及びそれに適用される任意の誘導体化又は官能化に依存する。プライマー自体は、付着を促進するために非ヌクレオチド化学修飾であってもよい部分を含んでもよい。特定の例では、プライマーは、５’末端にホスホロチオエート又はチオホスフェートなどの硫黄含有求核剤を含み得る。固体に支持されたポリアクリルアミドヒドロゲルの場合、この求核剤はヒドロゲルに存在するブロモアセトアミド基に結合する。プライマー及びテンプレートを固体支持体に付着させるより具体的な手段は、全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０５／０６５８１４号に記載されるように、重合アクリルアミド及びＮ－（５－ブロモアセトアミドイルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）からなるヒドロゲルへの、５’ホスホロチオエート結合を介するものである。
本開示は、１つの増幅プライマーのみが固定化される「固相」増幅法（他のプライマーは通常は遊離溶液中に存在する）を包含するが、いくつかの例では、固体支持体は、固定化された順方向及び逆方向プライマーの両方とともに提供される。実際には、増幅プロセスは増幅を維持するために過剰なプライマーを使用するため、「複数」の同一の順方向プライマー及び／又は固体支持体上に固定化された「複数」の同一の逆方向プライマーが存在するであろう。本明細書における順方向及び逆方向プライマーへの言及は、文脈上別段の指示がある場合を除き、「複数の」かかるプライマーを包含するものとして解釈されるべきである。
配列決定フローセルの表面は、フローセル上に播種された配列決定ライブラリーからアンプリコンを生成させるために使用される複数のプライマーを含むことができる。いくつかの例では、プライマーは、各標的核酸にライゲートされたアダプター配列中に存在するユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライミング配列を有することができる。特定の例では、複数のプライマーを増幅部位に付着させることができる。プライマーは、捕捉核酸について上述した増幅部位に付着させることができる。
いくつかの例では、播種された配列決定ライブラリーは、各々の内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスター増幅法を使用して増幅することができる。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている資料は、固定化された核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅生成物を固体支持体上に固定化することを可能にする核酸増幅の方法を記載する。かかるアレイ上の各クラスター又はコロニーは、複数の同一又は実質的に同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスター化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の生成物は、固定化されたポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「ブリッジ（bridged）」構造体であり、両方の鎖は、いくつかの場合、共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定化されている。クラスター増幅法は、固定化された核酸テンプレートを使用して固定化されたアンプリコンを生成する方法の例である。
後続の配列決定反応に悪影響を及ぼすことなく、コロニー又はクラスター中に少量の混入物が存在し得ることが理解されるであろう。特定の用途のために個々の増幅部位で許容できる汚染のレベルの例としては、最大で０．１％、０．５％、１％、５％、１０％又は２５％の混入アンプリコンが挙げられるが、これらに限定されない。
他の好適な方法を使用して、本明細書で提供される方法に従って生成された固定化されたＤＮＡ断片から固定化されたアンプリコンを生成することもできる。例えば、１つ以上のクラスター又はコロニーは、増幅プライマーの各対の一方又は両方のプライマーが固定化されているかどうかに関わらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。いくつかの例では、カプセル化された核酸は、ビーズ内で増幅され、次いで、アレイ中に、又はクラスター中の固体支持体上に堆積する。
Ｅ．ビーズの放出
いくつかの実施形態では、本方法は、使用済みビーズを過剰な溶液相フローセル結合部分で処理して、溶液相使用済みビーズを提供することによって、フローセル表面から使用済みビーズを分離することを含む。遊離ビオチンは、ビーズの表面上のストレプトアビジンへの結合を完了することができ、ビオチン結合フローセルからのビーズの放出を可能にする。
Ｆ．ビーズの分解
いくつかの実施形態では、本方法は、分解剤で溶液相使用済みビーズを分解することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、フローセルから分解されたビーズを除去することを含む。本明細書で使用される場合、「分解されたビーズ」は、（５０℃を超える温度での解重合などによって）分解されたビーズを指す。一般に、分解されたビーズは、ライブラリー断片が放出され、次いで分解された使用済みビーズであり得る。
ライブラリー生成物のいくらかの損失は許容されるため、本方法は、分解される前に全てのビーズがライブラリー断片を放出することを必要としない。いくつかの実施形態では、ビーズの大部分は、ビーズが分解される前に、固定化されたライブラリー断片を放出している。いくつかの実施形態では、ビーズが分解される前に、ビーズの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％が消費されている（すなわち、ライブラリー断片が放出されている）。
いくつかの実施形態では、分解されたビーズからのポリエステルは、反応緩衝液と混合し、フローセルから除去される。いくつかの実施形態では、分解されたポリエステルは、チューブを通る緩衝液の流れを妨げることなく、チューブを通ってフローセルを出る。いくつかの実施形態では、分解されたポリエステルと緩衝液との混合は、緩衝液溶液中のポリエステルの比較的均一な密度を生じ、その結果、この密度は、チューブを通る緩衝液の流れを妨げない。
いくつかの実施形態では、ビーズの分解は、ビーズ凝集の機会を減少させ、ここで、ビーズ凝集は、ビーズが互いに会合しているか、又はランダムに近接していることを指す。いくつかの実施形態では、ビーズ凝集を低減することはまた、ビーズによるチューブ又はフローセルの閉塞を低減する。
いくつかの実施形態では、非分解ビーズは、緩衝液よりも高いそれらの密度のために、チューブ又はフローセル中に沈降し得るが、分解されたビーズからのポリエステルは沈降しない（分解されたビーズからのポリエステルは、緩衝液内で比較的均一な密度であるため）。
更に、本方法は、全てのビーズが本方法によって分解されることを必要としない。比較的小さい割合のビーズは、下流のプロセスに影響を与えず、及び／又は、溶液交換中の詰まりのリスクを増加させないと考えられる。言い換えれば、トランスポソーム担体として使用されるビーズの一部を分解することは、全く分解しないビーズを使用する方法と比較して、本方法を改善する。いくつかの実施形態では、ビーズの大部分が分解される。いくつかの実施形態では、ビーズの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％が分解剤で分解される。
いくつかの実施形態では、分解剤は、５０℃～６５℃の温度である。いくつかの実施形態では、分解剤は、５０℃超、６０℃超、又は６５℃超の温度である。いくつかの実施形態では、分解剤は、６０℃の温度である。
いくつかの実施形態では、分解剤は、水性塩基である。いくつかの実施形態では、水性塩基は、ＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、ＮａＯＨは、１Ｍ～５ＭのＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、ＮａＯＨは、３ＭのＮａＯＨである（Ｙｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ｂ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒ ８７（２）：５６２－９（２００８）を参照）。
いくつかの実施形態では、分解剤は、水性塩基及び５０℃～６５℃の温度の両方を含む。いくつかの実施形態では、分解剤は、５０℃～６５℃の温度のＮａＯＨ水溶液を含む。いくつかの実施形態では、分解剤は、５０℃超、６０℃超、又は６５℃超の温度のＮａＯＨ水溶液を含む。いくつかの実施形態では、分解剤は、６０℃の温度のＮａＯＨ水溶液を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、フローセルから分解ビーズを除去することを含む。いくつかの実施形態では、洗浄工程は、フローセルから分解したビーズを除去する。
Ｇ．配列決定
いくつかの実施形態では、本方法は、固定化され、増幅された断片又は断片のクラスターを配列決定することを含む。
いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーは、個々のビーズを同定するためにバーコード化されない。いくつかの実施形態では、本方法は、フローセルの表面上に播種された配列決定ライブラリーを配列決定することを更に含む。いくつかの例では、各々の分解性ポリエステルビーズから播種された配列決定ライブラリーのフローセルの表面上の位置は、配列ライブラリーの配列決定から生成されたリードの空間インデックスとして使用される。
いくつかの実施形態では、播種された配列決定ライブラリーは、完全に又は部分的に配列される。播種された配列決定ライブラリーは、ＳＢＳ、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノ細孔配列決定などの直接配列決定などの任意の好適な配列決定法に従って配列決定することができる。固定化された核酸断片の配列を決定するための方法の非限定的な例は、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌら（米国特許第８，０５３，１９２号）、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら（国際公開第２０１６／１３０７０４号）、Ｓｈｅｎら（米国特許第８，８９５，２４９号）、及びＰｉｐｅｎｂｕｒｇら（米国特許第９，３０９，５０２号）に記載されており、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法は、様々な核酸配列決定技術と併せて使用することができる。特に適用可能な技術は、核酸を、それらの相対的位置が変化しないようにアレイ内の固定位置に付着させ、アレイが繰り返し撮像されるものである。例えば、１つのヌクレオチド塩基型を別のヌクレオチド塩基型と区別するために使用される異なる標識と一致する異なる色チャネルで画像が得られる実施態様が、特に適用可能である。いくつかの例では、断片のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動プロセスとすることができる。
１つの配列決定方法論は、ＳＢＳである。ＳＢＳでは、核酸テンプレート（例えば標的核酸又はそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長を監視して、テンプレート中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。いくつかのポリマー系ＳＢＳの実施態様では、プライマーに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用してテンプレートの配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドをテンプレート依存様式でプライマー（それによってプライマーを伸長させる）に添加する。
一例では、ヌクレオチドモノマーは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）又は架橋核酸（ＢＮＡ）を含む。ヌクレオチドモノマーにおけるＬＮＡ又はＢＮＡの使用は、ヌクレオチドモノマーと固定化された断片上に存在する配列決定プライマー配列との間のハイブリダイゼーション強度を増加させる。
ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマー、又はターミネーター部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用することができる。ターミネーターを含まないヌクレオチドモノマーを使用する方法としては、例えば、本明細書で更に詳細に記載されるように、γ－リン酸標識ヌクレオチドを用いたパイロシークエンシング及び配列決定が挙げられる。ターミネーターを含まないヌクレオチドモノマーを使用する方法では、各サイクルに添加されるヌクレオチドの数は、一般に可変であり、テンプレート配列及びヌクレオチド送達のモードに依存する。ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマーを利用するＳＢＳ技術では、ターミネーターは、ジデオキシリヌクレオチドを利用する従来のＳａｎｇｅｒ配列決定の場合のように使用される配列決定条件下で有効に不可逆的であり得るか、又はターミネーターは、Ｓｏｌｅｘａ社（現在はＩｌｌｕｍｉｎａ社）によって開発された配列決定方法の場合のように可逆的であり得る。
ＳＢＳ技術は、標識部分を有するヌクレオチドモノマー、又は標識部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用することができる。したがって、標識の蛍光などの標識の特性、分子量又は電荷などのヌクレオチドモノマーの特性、ピロリン酸の放出などのヌクレオチドの組み込みの副生成物などに基づいて、組み込みイベントを検出することができる。２つ以上の異なるヌクレオチドが配列決定試薬中に存在する実施形態では、異なるヌクレオチドは互いに区別可能であってもよく、又は代替的に２つ以上の異なる標識は、使用される検出技術の下で区別可能であり得る。例えば、配列決定試薬中に存在する異なるヌクレオチドは、異なる標識を有することができ、それらは、Ｓｏｌｅｘａ社（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）によって開発された配列決定方法によって例示される適切な光学系を使用して区別することができる。
いくつかの例としては、パイロシークエンシング技術が挙げられる。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれるときの無機ピロリン酸（inorganic pyrophosphate、ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４２（１）：８４－９，１９９６、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１１（１）：３－１１，２００１、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｕｈｌｅｎ，ａｎｄ Ｎｙｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１（５３７５），３６３，１９９８、及び米国特許第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号、及び同第６，２７４，３２０号、各々の全開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシークエンシングにおいて、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフラーゼによってアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）に即座に変換されることによって検出することができ、生成されたＡＴＰのレベルはルシフェラーゼで生成された光子を介して検出される。配列決定される核酸は、アレイ中の特徴部に付着させることができ、アレイは、アレイの特徴部にヌクレオチドを組み込むことにより生成される化学発光シグナルを捕捉するために画像化することができる。アレイを特定のヌクレオチド型（例えば、Ｔ、Ｃ、又はＧ）で処理した後に、画像を得ることができる。各ヌクレオチド型の添加後に得られる画像は、アレイ内のどの特徴部が検出されるかに関して異なる。画像内のこれらの差異は、アレイ上の特徴部の異なる配列コンテンツを反映する。しかしながら、各特徴部の相対的な位置は、画像内で変わらないままである。画像は、本明細書に記載の方法を使用して記憶、処理、及び分析することができる。例えば、アレイを各異なるヌクレオチド型で処理した後に得られる画像は、可逆的ターミネーターベースの配列決定方法のための異なる検出チャネルから得られる画像について、本明細書に例示されるものと同じ方法で処理することができる。
別の例示的な種類のＳＢＳでは、サイクル配列決定は、例えば、国際公開第０４／０１８４９７号、同第９１／０６６７８号、同第０７／１２３，７４４号、及び米国特許第７，０５７，０２６号に記載されているような開裂可能な又は光漂白可能な染料標識を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドを段階的に添加することによって達成され、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。終端の両方を逆転させることができ、蛍光標識が開裂された蛍光標識ターミネーターの可用性は、効率的な循環可逆的終端（cyclic reversible termination、ＣＲＴ）配列決定を容易にする。ポリメラーゼはまた、これらの修飾されたヌクレオチドを効率的に組み込み、かつそこから伸長するように共操作することもできる。
いくつかの可逆的ターミネーターベースの配列決定実施形態では、標識は、ＳＢＳ反応条件下での伸長を実質的に阻害しない。しかしながら、検出標識は、例えば、開裂又は分解によって取り外し可能であり得る。画像は、アレイ化された核酸特徴部への標識の組み込み後に捕捉することができる。特定の例では、各サイクルは、アレイへの４つの異なるヌクレオチド型の同時送達を伴い、各ヌクレオチド型は、スペクトル的に異なる標識を有する。次に、４つの異なる標識の１つに選択的な検出チャネルをそれぞれ使用して、４つの画像を得ることができる。代替的に、異なるヌクレオチド型を順次追加することができ、各追加工程の間にアレイの画像を得ることができる。かかる例では、各画像は、特定の型のヌクレオチドを組み込んだ核酸特徴部を示す。各特徴部のシーケンスコンテンツが異なるため、様々な画像に様々な特徴部が存在するか、存在しない。しかしながら、特徴部の相対的な位置は、画像内で変わらないままである。かかる可逆的ターミネーター－ＳＢＳ法から得られる画像は、本明細書に記載されるように保存、処理、及び分析することができる。画像捕捉工程に続いて、標識を除去することができ、その後のヌクレオチド添加及び検出のサイクルのために可逆的ターミネーター部分を除去することができる。特定のサイクルで検出された後、及び後続のサイクルの前に標識を除去すると、サイクル間のバックグラウンド信号及びクロストークを低減できるという利点がある。有用な標識及び除去方法の例を本明細書に記載する。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドモノマーの一部又は全ては、可逆的ターミネーターを含み得る。かかる実施形態では、可逆的ターミネーター／開裂可能なフルオロフォアは、３’エステル結合を介してリボース部分に結合されたフルオロフォアを含み得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１５：１７６７－１７７６（２００５年）を参照）。他の手法は、ターミネーターの化学を蛍光標識の切断から分離している（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｕｐａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：５９３２－７，（２００５）を参照）。Ｒｕｐａｒｅｌらは、少量の３’アリル基を使用して伸長をブロックするが、パラジウム触媒で短時間処理することで簡単にブロックを解除できる可逆性ターミネーターの開発について説明している。フルオロフォアは、長波長ＵＶ光への３０秒の曝露によって容易に開裂することができる光開裂可能リンカーを介して基に付着された。したがって、ジスルフィド還元又は光開裂のいずれかを開裂可能なリンカーとして使用することができる。可逆的終端への別の手法は、ｄＮＴＰ上に嵩高な染料を配置した後に続く自然終端の使用である。ｄＮＴＰ上の帯電した嵩高な染料の存在は、立体障害及び／又は静電障害を介して効果的なターミネーターとして作用することができる。１つの組み込みイベントの存在は、染料が除去されない限り、それ以上の結合を防止する。染料の開裂は、フルオロフォアを除去し、終端を効果的に逆転させる。修飾されたヌクレオチドの例はまた、米国特許第７，４２７，６７３号、及び同第７，０５７，０２６号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法及びシステムとともに利用することができる追加のＳＢＳシステム及び方法の例は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号、同第２００６／０１８８９０１号、同第２００６／０２４０４３９号、同第２００６／０２８１１０９号、同第２０１２／０２７０３０５号、及び同第２０１３／０２６０３７２号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号、並びに国際公開第０６／０６４１９９号及び同第０７／０１０，２５１号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの例は、４つ未満の異なる標識を使用する４つの異なるヌクレオチドの検出を使用することができる。例えば、ＳＢＳは、米国特許公開第２０１３／００７９２３２号に記載される方法及びシステムを使用して実施することができ、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。第１の例として、ヌクレオチド型の対は、同じ波長で検出することができるが、対のうちの１つのメンバーに対する強度の差に基づいて、又は、対の他の部材について検出された信号と比較して明らかなシグナルを出現又は消失させる、対の１つのメンバーへの変化（例えば、化学修飾、光化学修飾、又は物理的改質を行うことを介して）に基づいて区別され得る。第２の例として、４つの異なるヌクレオチド型のうちの３つを特定の条件下で検出することができ、一方、第４のヌクレオチド型は、それらの条件下で検出可能な標識がないか、又はそれらの条件下で最小限に検出される（例えば、バックグラウンド蛍光による最小限の検出など）。最初の３つのヌクレオチド型を核酸に組み込むことは、それらの対応するシグナルの存在に基づいて決定することができ、第４のヌクレオチド型を核酸に組み込むことは、任意のシグナルの不在又は最小限の検出に基づいて決定することができる。第３の例として、１つのヌクレオチド型は、２つの異なるチャネルで検出される標識を含むことができ、一方、他のヌクレオチド型は、チャネルのうちの１つ以下で検出される。前述の３つの構成の例は、相互に排他的であるとはみなされず、様々な組み合わせで使用することができる。３つ全ての実施例を組み合わせた実施形態の例は、第１のチャネルで検出される第１のヌクレオチド型（例えば、第１の励起波長によって励起されたときに第１のチャネルで検出される標識を有するｄＡＴＰ）、第２のチャネルで検出される第２のヌクレオチド型（例えば、第２の励起波長によって励起されたときに第２のチャネルで検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１及び第２のチャネルの両方において検出される第３のヌクレオチド型（例えば、第１及び／又は第２の励起波長によって励起されたときに両方のチャネルで検出される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴＰ）、及びいずれのチャネルでも検出されないか、又は最小限に検出される、標識のない第４のヌクレオチド型（例えば、標識のないｄＧＴＰ）を使用する蛍光ベースのＳＢＳ法である。
更に、本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号に記載のように、配列決定データは、単一のチャネルを使用して得ることができる。このようないわゆる１つの染料配列決定方法では、第１のヌクレオチド型は標識されるが、第１の画像が生成された後に標識が除去され、第２のヌクレオチド型は、第１の画像が生成された後にのみ標識される。第３のヌクレオチド型は、第１及び第２の画像の両方においてその標識を保持し、第４のヌクレオチド型は、両方の画像において標識されていないままである。
いくつかの例は、ライゲーション技術による配列決定を使用することができる。このような技術は、ＤＮＡリガーゼを使用してオリゴヌクレオチドを組み込み、そのようなオリゴヌクレオチドの組み込みを識別する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列中の特定のヌクレオチドの同一性と相関する異なる標識を有する。他のＳＢＳ方法と同様に、標識された配列決定試薬で核酸配列のアレイを処理した後、画像を得ることができる。各画像は、特定の型の標識を組み込んだ核酸特徴部を示す。各特徴部のシーケンスコンテンツが異なるため、様々な画像に様々な特徴部が存在するか、存在しないが、特徴部の相対的な位置は、画像内で変わらないままである。ライゲーションベースの配列決定方法から得られる画像は、本明細書に記載されるように保存、処理、及び分析することができる。本明細書に記載の方法及びシステムとともに利用することができるＳＢＳシステム及び方法の例は、米国特許第６，９６９，４８８号、６、同第１７２，２１８号、及び同第６，３０６，５９７号に記載されている。
いくつかの例は、ナノポア配列決定を使用することができる（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ａｋｅｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，１４７－１５１，２０００，Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ｂｒａｎｔｏｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３５：８１７－８２５，２００２、Ｌｉ，Ｇｅｒｓｈｏｗ，Ｓｔｅｉｎ，Ｂｒａｎｄｉｎ，ａｎｄ Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２：６１１－６１５，２００３を参照されたい）。かかる例では、断片は、ナノ細孔を通過する。ナノ細孔は、α－ヘモリジンなどの合成孔又は生体膜タンパク質であり得る。断片がナノ細孔を通過するとき、各塩基対は、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別することができる（例えば、各々の内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１，２００７、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．，２，４５９－４８１，２００７、及びＣｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３０，８１８－８２０，２００８を参照されたい）。ナノ細孔配列決定から得られるデータは、本明細書に記載されるように、保存、処理、及び分析することができる。具体的には、データは、本明細書に記載される光学画像及び他の画像の処理の例に従って、画像として処理することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを利用する。ヌクレオチドの組み込みは、例えば、米国特許第７，３２９，４９２号及び同第７，２１１，４１４号（両方ともその内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなフルオロフォア含有ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）相互作用を介して検出することができ、又はヌクレオチドの組み込みは、例えば、米国特許第７，３１５，０１９号（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなゼロモード導波路、並びに、例えば、米国特許第７，４０５，２８１号及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号（両方ともその内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような蛍光ヌクレオチド類似体及び操作ポリメラーゼを使用して検出することができる。照明は、蛍光標識されたヌクレオチドの組み込みが低バックグラウンドで観察され得るように、表面繋留ポリメラーゼの周囲のゼプトリットルスケールの体積に制限することができる（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＬｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，６８２－６８６，２００３、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．，３３：１０２６－１０２８，２００８；ａｎｄ Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：１１７６－１１８１，２００８を参照）。かかる方法から得られる画像は、本明細書に記載されるように、記憶、処理、及び分析することができる。
いくつかのＳＢＳの例は、伸長生成物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ社（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術、又は米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号、同第２００９／０１２７５８９号、同第２０１０／０１３７１４３号、及び同第２０１０／０２８２６１７号に記載されている配列決定方法及びシステムを使用することができ、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。結合平衡除外を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生成することができる。
Ｈ．データ分析
任意の適切なバイオインフォマティクスのワークフローを使用して、開示された方法を使用して得られた配列リードを分析及び処理することができる。
いくつかの例では、同じ長いＤＮＡ断片に由来するリードを同じバーコードで標識して、連結リード分析を可能にする。同じＤＮＡ断片に属するクラスターは、フローセル上で、ビーズがフローセル上に固定化された位置に比較的近接して空間的に同じ場所に位置するため、正確なバーコード割り当ては、フローセル上のビーズ位置（又は「クラスターパッチ」）の同定に基づくことができる。ビーズ位置の同定は、リアルタイム分析（real-time analysis、ＲＴＡ）イメージを直接使用して（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム上で利用可能である）、及び／又はＲＴＡによって報告されるクラスター座標を使用して実施することができる。したがって、このワークフローは、例えば、クラスター座標の問い合わせをサポートするプラットフォーム上で使用することができる。
いくつかの例では、（適切な場合、両方の表面及び全てのタイルスワスを考慮して）各タイル上のＲＴＡｘ，ｙリード座標を所与として、密度ベースの空間クラスタリングを実行して、各タイル上のビーズ位置を特定することができ、ここで、各ビーズは、中間部空間に漏出したリードによって作成された低密度バックグラウンドと比較して、リードの高密度クラスターに対応すると仮定される。クラスタリング手順は、未知の数のクラスターを検出し（各タイル上のビーズの数が固定されていないため）、可変クラスター形状及びサイズを処理し（ビーズが一貫したサイズ及び融解後の円形形状でない場合）、中間部リードをノイズとして分類する。任意の適切な密度ベースのクラスタリングアルゴリズム、例えばＤＢＳＣＡＮクラスタリングアルゴリズムを使用して、クラスターを定義することができる。いくつかの実施態様では、ビーズ境界は、クラスターに割り当てられた点の凸包を見出すことによって、得られた各クラスターから計算される。クラスタリング結果を向上させるために、密度ベースのリードフィルタリング手順をクラスタリングの前に適用してもよく、これは、タイル上のそれらの近傍のスパース性に基づいてリードを排除する（例えば、タイル上のその周りの半径ｒ内にｎ個未満の他のリードが存在する場合、リードはフィルタリングされ、ｎ及びｒは構成可能なパラメータである）。いくつかの例では、クラスタリング手順の最終結果を評価し修正するための手動キュレーション工程を実施してもよい。
更なる例では、ビーズ位置は、深層学習を使用してＲＴＡ座標から決定される。例えば、画像セグメンテーションのためのＵ－Ｎｅｔコンボリューショナル・ニューラル・ネットワーク・アーキテクチャ又は適切なコンボリューショナル・ニューラル・ネットワーク（convolutional neural network、ＣＮＮ）モデルを使用して、クラスターパッチ境界及び対応するビーズ位置を決定することができる。いくつかのかかる例では、訓練データセットは、座標ベースのプロットから得られた手動で注釈を付けられた画像、並びに合成的に生成された画像を含む。合成データ拡張は、１組の変換を手動で注釈付けされた画像に適用することによって達成される。変換は、形状変形、サイズ、数、及び配置の変動、並びにビーズ間及びビーズ内の密度変動を含む。
既知の参照ゲノムからＤＮＡを配列決定する場合、ゲノムアラインメント情報を使用して、ビーズ同定を更に精密化し、中間部のリードをレスキューし、得られるバーコード割り当てを改善することができる。例えば、同じクラスターに割り当てられたビーズは、それらの空間的近接性とともに、それらのリードがマッピングされたゲノムウィンドウを考慮することによって更に分離することができる。代替的に、ビーズ間クロストークを、隣接ビーズ中の同じゲノムウィンドウにマッピングされるリードをカウントすることによって定量化することができる。次いで、有意に高いクロストークを有するビーズ対をマージして、フェージングなどのいくつかの標的用途におけるアイランドの連続性及び性能を改善することができる。確率的又は「ソフト」バーコード割り当てはまた、フェージング及びアセンブリなどのいくつかの標的用途における更なる性能向上のために考慮される。
いくつかの例では、同定後、各検出されたビーズは固有のバーコードと関連付けられ、ビーズ境界内に含まれるリードはこのバーコードで標識される。結果として、同じビーズに最初に固定化された長いＤＮＡ断片に由来するリードは、同じバーコードに割り当てられ、その後の分析中に連結されることができる。特に、ヒトゲノムフェージングのために、バーコード化されたリードは、それらのゲノムアライメント位置における近接性を使用してアイランド（リードが由来するより長いＤＮＡ断片に対応する）にリンクされ得（例えば、同じバーコードにおけるリードは、それらがヒトゲノム上で近くにマッピングされる場合にリンクされ得る）、はるかに大きいフェーズブロックの再構築を可能にする。ゲノムアセンブリにおいて、バーコーディング情報は、例えば、最初にリードを部分的にアセンブルされたコンティグにマッピングし、次いでバーコーディング情報を使用してコンティグを連結することによって、反復を明確にし、アセンブリ連続性を顕著に増加させるために使用することができる。フェージング及びアセンブリパイプラインは、リンクリード分析のためのベストプラクティスに従うデータ分析ワークフローの後続の工程として実施されている。
実施例１．ＰＣＬビーズの調製及び使用
平均直径３μｍのＰＬＣビーズを購入することができる（例えば、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｘ，ＭＡから）。ＰＣＬビーズを官能化するために、活性アミノ基を、１，６－ヘキサンジアミン中の１０％（ｗ／ｗ）イソプロパノール溶液中、４０℃で６０分間のアミノリシスによってミクロスフェア表面に導入する（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ３：８６７０－８３（２０１５）に記載のように）。次いで、ＰＣＬビーズ表面上の活性アミンを、（ｉ）ストレプトアビジンのリジン残基上のアミン、及び（ｉｉ）グルタルアルデヒドによってアミン官能化磁性ナノ粒子、にコンジュゲートさせる（図１Ａ）（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＲＳＣ Ａｄｖ ６：６７８７５－８２（２０１６）及びＨａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｒｅｓ １１（１）：１－４１（２０１８）を参照されたい）。ビオチンのコンジュゲートしたトランスポソームは、ビオチン－ストレプトアビジン結合によってＰＣＬビーズの表面上に構築される（図１Ｂ）。これらのビオチンのコンジュゲートしたトランスポソームは、ビオチンにコンジュゲートしたポリヌクレオチドを含み得る。次いで、ＰＣＬビーズは、ＤＮＡ断片化及びライブラリー調製並びにオンフローセル空間クラスタークラウド生成における使用のために準備される。
ＰＣＬビーズをフローセルに導入し、ここで、ＰＣＬマイクロスフェア表面上の残りのストレプトアビジンが、フローセル表面にパターン化されたビオチンに結合し、ビーズを固定化する（図２）。ライブラリーの放出及びクラスター化の後、ＰＣＬビーズは、過剰な遊離ビオチンによって表面から放出される。次いで、ＰＣＬビーズを６０℃を超える温度で融解させ、その後、洗浄によってフローセルから除去する。代替的に、高温でのＮａＯＨによるアルカリ加水分解を使用して、ＰＣＬビーズを分解することができる（Ｒａｍｉｒｅｚ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ，３（４）：７０－７５（２０１３）を参照）。
実施例２．ビーズ及びナノ粒子を含む組成物の使用
ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子（各ナノ粒子は１つ以上のトランスポソーム複合体を含む）を含む組成物の混合物を使用して、配列決定のためのライブラリーを調製することができる。かかる組成物は、本明細書中に記載されるもののいずれかであり得る。
図８は、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物の混合物を使用して配列決定ライブラリーを調製する代表的な方法の概要を示す。標的核酸（例えば、高分子量ゲノムＤＮＡ）を組成物に添加し、タグメンテーションを５５℃で行う。５％ＳＤＳ溶液でタグメンテーションを停止させる。この時点で、ライブラリー断片はナノ粒子上に固定化される。磁力を適用して組成物を固定化し（ビーズは磁性ビーズであってもよい）、上清を除去した後、３回洗浄する。
反応容器を８０℃に加熱して、クラスター化ナノ粒子及びＴｎ５トランスポザーゼを放出させる。次いで、磁力を使用して、磁性ビーズを反応の残りから分離することができる。この時点で、ライブラリー断片は溶液中にあり、溶液中で増幅することができる。組成物が同一のトランスポソームを含む場合、増幅前に第２のアダプター配列を組み込む工程を実施してもよい。次いで、増幅された断片は、配列決定のためにフローセルにロードされ得る。ライブラリー断片は、フローセル上に固定化されたオリゴヌクレオチドに結合するための相補的アダプター配列を有するように生成され得る。
代替的に、ビーズを含む組成物は、フローセル上にロードされ得、次いで、ライブラリー断片が放出され、フローセル上に捕捉される。かかる断片は、異なるトランスポソーム複合体を使用して異なるアダプター配列を組み込む非対称タグメンテーションによって生成させ得る。次いで、ビーズは、高い温度又は分解剤（組成物が本明細書に記載されるような分解性ビーズを含む場合）で分解することなどによって除去され得る。固定化された断片は、フローセル中で増幅され得、続いて配列決定され得る。全てのこれらの方法において、配列決定前の増幅もまた省略され得る。
図８に示すように、ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物の混合物を用いる方法は、ライブラリー断片のサイズ選択に通常費やされる費用及び時間を節約することができる。この方法では、単一のビーズ上に含まれる複数のナノ粒子からの立体障害により、トランスポソーム複合体の間隔を空けることによって短い断片の生成を回避する方法が可能になる。したがって、配列決定は、ロングリード配列決定のための周知の方法を用いて実施され得る。
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、約という用語は、明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、割合、及び百分率を含む数値を指す。用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と同等であると考えられる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の±５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリスト内に提供される値又は範囲の全てを修飾する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含んでもよい。

Claims (48)

  1. 分解性ポリエステルビーズであって、その表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含み、各トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、
    前記第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、前記第２のポリヌクレオチドが、前記トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつ前記トランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含み、
    前記ポリエステルビーズが、５０℃～６５℃の融解温度を有し、任意選択的に、前記ポリエステルビーズが、６０℃の融解温度を有し、任意選択的に、前記ポリエステルビーズが、ポリカプロラクトンを含む、分解性ポリエステルビーズ。
  2. 前記分解性ポリエステルビーズに固定化された複数の磁性ナノ粒子を含み、任意選択的に、前記磁性ナノ粒子が、磁性コアを有するビーズであり、任意選択的に、前記磁性コアが、鉄、ニッケル、及び／又はコバルトを含む、請求項１に記載の分解性ポリエステルビーズ。
  3. 各トランスポソーム複合体が、ポリヌクレオチド結合部分を含み、前記ビーズが、その表面に共有結合した複数のビーズ結合部分を含み、前記トランスポソーム複合体が、前記ポリヌクレオチド結合部分の前記ビーズ結合部分への結合を介して前記ビーズ表面に固定化されている、請求項１又は２に記載のポリエステルビーズ。
  4. ａ．各ポリヌクレオチド結合部分が、各トランスポソーム複合体の前記第１のポリヌクレオチドに共有結合しているか、若しくは各トランスポソーム複合体の前記第２のポリヌクレオチドに共有結合しており、
    ｂ．前記ビーズ結合部分が、ストレプトアビジン若しくはアビジンであり、前記ポリヌクレオチド結合部分が、ビオチンであり、かつ／又は
    ｃ．各ビーズ結合部分が、リンカーを介して前記ポリエステルビーズに共有結合しており、前記リンカーが、任意選択的に、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を含む、請求項３に記載のポリエステルビーズ。
  5. 各磁性ナノ粒子が、リンカーを介して前記ポリエステルビーズに共有結合しており、前記リンカーが、任意選択的に、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載のポリエステルビーズ。
  6. 前記ポリエステルビーズが、フローセルの表面上に固定化され、任意選択的に、前記ポリエステルビーズが、ビーズ結合部分の前記フローセルの表面上のフローセル結合部分への共有結合を介して前記フローセルの表面上に固定化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリエステルビーズ。
  7. 前記ポリヌクレオチド結合部分及び前記フローセル結合部分が、同じタイプの結合部分であり、前記トランスポソーム複合体が、前記ビーズ上の前記ビーズ結合部分の第１の部分に結合し、前記フローセル結合部分が、前記ビーズ上の前記ビーズ結合部分の第２の部分に結合している、請求項６に記載のポリエステルビーズ。
  8. 標的核酸又はその１つ以上の断片を含み、各々が前記ビーズ上の少なくとも２つのトランスポソーム複合体に結合しており、任意選択的に、大部分のトランスポソーム複合体が、前記ビーズの表面に固定化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリエステルビーズ。
  9. フローセルの表面に固定化されたポリエステルビーズを含むフローセルであって、前記ポリエステルビーズが、その表面に固定化された複数のトランスポソーム複合体を含み、
    各トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、
    前記第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、前記第２のポリヌクレオチドが、前記トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつ前記トランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含み、
    前記ポリエステルビーズが、５０℃～６５℃、又は６０℃の融解温度を有し、任意選択的に、前記ポリエステルビーズが、ポリカプロラクトンを含み、かつ／又はそれに固定化された複数の固定化磁性ナノ粒子を含む、フローセル。
  10. 各トランスポソーム複合体が、ポリヌクレオチド結合部分を含み、前記ビーズが、その表面に共有結合した複数のビーズ結合部分を含み、前記トランスポソーム複合体が、前記ポリヌクレオチド結合部分の前記ビーズ結合部分への結合を介して前記ビーズ表面に固定化され、任意選択的に、
    ａ．各ポリヌクレオチド結合部分が、各トランスポソーム複合体の前記第１のポリヌクレオチドに共有結合しているか、若しくは各トランスポソーム複合体の前記第２のポリヌクレオチドに共有結合しており、
    ｂ．前記ビーズ結合部分が、ストレプトアビジン若しくはアビジンであり、前記ポリヌクレオチド結合部分が、ビオチンであり、かつ／又は
    ｃ．各ビーズ結合部分が、リンカーを介してポリエステルビーズに共有結合しており、前記リンカーが、任意選択的に、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を含む、請求項９に記載のフローセル。
  11. 各磁性ナノ粒子が、リンカーを介して前記ポリエステルビーズに共有結合しており、前記リンカーが、任意選択的に、－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）６－Ｎ＝ＣＨ－（ＣＨ２）３ＣＨ＝Ｎ－を含み、かつ／又は前記磁性ナノ粒子が、前記ポリエステルビーズを前記フローセルの表面に播種するために使用される、請求項９又は１０に記載のフローセル。
  12. 前記ポリエステルビーズが、ビーズ結合部分の前記フローセルの表面上のフローセル結合部分への共有結合を介して前記フローセルの表面上に固定化されるか、又は、前記ポリヌクレオチド結合部分及び前記フローセル結合部分が、同じタイプの結合部分であり、前記トランスポソーム複合体が、前記ビーズ上の前記ビーズ結合部分の第１の部分に結合され、前記フローセル結合部分が、前記ビーズ上の前記ビーズ結合部分の第２の部分に結合されている、請求項９～１１のいずれか一項に記載のフローセル。
  13. 標的核酸又はその１つ以上の断片を含み、各々が前記ビーズ上の少なくとも２つのトランスポソーム複合体に結合しており、任意選択的に、大部分のトランスポソーム複合体が、前記ビーズの表面に固定化されている、請求項９～１２のいずれか一項に記載のフローセル。
  14. 標的核酸から核酸ライブラリーを調製する方法であって、前記標的核酸を、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリエステルビーズ又は請求項９～１３のいずれか一項に記載のフローセルと、前記標的核酸が前記トランスポソーム複合体によって断片化され、前記第１のポリヌクレオチドの３’トランスポゾン末端配列が前記断片の少なくとも１つの鎖の５’末端に転移される条件下で接触させ、それによって、少なくとも１つの鎖が前記タグで５’タグ付けされた断片の固定化ライブラリーを生成させることを含む、方法。
  15. ａ．接触させることが、前記標的核酸を、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリエステルビーズと接触させることを含み、前記方法が、前記断片の固定化ライブラリーを含む前記ビーズをフローセルの表面に固定化することを含み、
    ｂ．前記ビーズが、前記ビーズ結合部分の前記フローセルの表面上のフローセル結合部分への結合を介して前記フローセルの表面に固定化され、
    ｃ．前記ビーズが、それに固定化された複数の固定化された磁性ナノ粒子を含み、任意選択的に、前記磁性ナノ粒子が、前記ポリエステルビーズを前記フローセルの表面に播種するために使用され、かつ／又は
    ｄ．接触させることが、前記標的核酸を、請求項６に記載のポリエステルビーズと接触させることを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ａ．固定化された前記ビーズから前記断片を放出させて使用済みビーズを提供し、放出された前記断片を前記フローセル表面に捕捉して捕捉された断片を生成させることであって、任意選択的に、前記固定化されたビーズから前記断片を放出させることが、前記ビーズから前記断片を増幅することを含み、任意選択的に、前記放出された断片を捕捉することが、前記放出された断片をハイブリダイズして前記フローセルの表面上にオリゴヌクレオチドを捕捉することを含む、生成させること、
    ｂ．前記フローセル表面上に捕捉された前記断片を増幅して、固定化され増幅された断片を生成させることであって、任意選択的に、前記捕捉された断片を増幅することが、前記断片のクラスターを生成させるためのブリッジ増幅を含む、生成させること、
    ｃ．前記使用済みビーズを過剰の溶液相フローセル結合部分で処理することによって、前記フローセル表面から前記使用済みビーズを分離させ、溶液相使用済みビーズを提供すること、
    ｄ．分解剤を用いて、前記溶液相使用済みビーズを分解させること、及び／又は
    ｅ．分解された前記ビーズを、前記フローセルから除去することと、を更に含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 前記分解剤が、（ａ）５０℃～６５℃、若しくは６０℃の温度、及び／又は（ｂ）水性塩基である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記水性塩基が、ＮａＯＨであり、任意選択的に、前記ＮａＯＨが、１Ｍ～５ＭのＮａＯＨであり、任意選択的に、前記水性塩基が１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ又は５ＭのＮａＯＨであり、任意選択的に、前記水性塩基が３ＭのＮａＯＨである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記固定化され、増幅された断片又は前記断片のクラスターを配列決定することを含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 複数のトランスポソーム複合体をポリエステルビーズに固定化することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリエステルビーズを作製する方法であって、各トランスポソーム複合体が、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記第１のポリヌクレオチドが、トランスポゾン末端配列及びタグを含む３’部分を含み、前記第２のポリヌクレオチドが、前記トランスポゾン末端配列に相補的であり、かつ前記トランスポゾン末端配列にハイブリダイズする５’部分を含み、任意選択的に、前記方法が、複数の磁性ナノ粒子を前記ポリエステルビーズに固定化することを更に含む、方法。
  21. ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む組成物であって、前記ビーズが、前記ナノ粒子に結合することができる官能基を含み、任意選択的に、前記ナノ粒子又は前記ビーズが、磁性を有する、組成物。
  22. 前記ナノ粒子が、
    ａ．合成デンドロン、ＤＮＡデンドロン、若しくはポリマーブラシであり、かつ／又は
    ｂ．磁性コアを有するビーズであり、任意選択的に、前記磁性コアが、鉄、ニッケル、及び／若しくはコバルトを含み、かつ／又は
    ｃ．５０～１５０ｎｍの直径を有し、任意選択的に、前記ナノ粒子が、１００ｎｍの直径を有する、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記ナノ粒子が、
    ａ．単一の固定化されたトランスポソーム複合体、又は
    ｂ．２つ以上の固定化されたトランスポソーム複合体であって、任意選択的に、前記２つ以上の固定化されたトランスポソーム複合体が、前記ナノ粒子上の各トランスポソーム複合体の間が同等の距離で固定化されている、トランスポソーム複合体、を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記固定化されたトランスポソーム複合体又は複数のトランスポソーム複合体が、前記トランスポザーゼが前記ナノ粒子から離れる方向を向くように配向されている、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記トランスポソーム複合体が
    ａ．ビオチン、デスチオビオチン、若しくはデュアルビオチンを含むトランスポゾンの、前記ナノ粒子上に含まれるアビジン若しくはストレプトアビジンへの結合、又は
    ｂ．トランスポゾンに含まれる薬剤と前記ナノ粒子に含まれる薬剤との間のクリックケミストリー反応、により、前記ナノ粒子に固定化され、任意選択的に、前記クリックケミストリー反応が、前記ナノ粒子上のアジドと前記トランスポゾン上のジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）との間の反応である、請求項２３又は２４に記載の組成物。
  26. 前記ビーズが、複数のナノ粒子に結合することができる担体ビーズであり、任意選択的に、前記ビーズが、１μｍ以上の直径を有し、かつ／又は前記ビーズが、請求項１～８のいずれか一項に記載の分解性ポリエステルビーズである、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記官能基が、化学結合ハンドル及び／又はクラスター化プライマーであり、任意選択的に
    ａ．前記化学結合ハンドル及び／若しくはクラスター化プライマーが、前記ナノ粒子に直接的に結合しているか、
    ｂ．前記化学結合ハンドル及び／若しくはクラスター化プライマーが、前記ナノ粒子に間接的に結合しているか、又は
    ｃ．化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、前記ビーズに含まれる前記クラスター化プライマー及び前記ナノ粒子の両方に結合する、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ナノ粒子と前記ビーズとの間の相互作用が、可逆的及び／又は非共有結合性相互作用であり、任意選択的に、前記可逆的及び／又は非共有結合性相互作用が、タンパク質－リガンド相互作用又は金属－キレート剤相互作用であり、更に任意選択的に、前記タンパク質－リガンド相互作用が、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用であるか、又は前記金属－キレート剤相互作用が、ニッケル－ポリヒスチジン若しくはコバルト－ポリヒスチジン相互作用である、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記ビーズが、クラスター化プライマーを含み、前記ナノ粒子が、固定化オリゴヌクレオチドを含み、任意選択的に、前記固定化オリゴヌクレオチド及び前記クラスター化プライマーが、互いに直接的に結合するか、又は連結オリゴヌクレオチドが、前記固定化オリゴヌクレオチド及び前記クラスター化プライマーの両方に結合することができる、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記ナノ粒子と前記ビーズとの間の相互作用が、不可逆的及び／又は共有結合性相互作用であり、任意選択的に、前記共有結合性相互作用が、前記ビーズと前記ナノ粒子との間の切断可能なリンカーであり、更に任意選択的に、前記切断可能なリンカーが、化学的又は酵素的に切断可能なリンカーである、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  31. フローセルに播種する方法であって、
    ａ．請求項２１～３０のいずれか一項に記載の組成物の前記ビーズと前記ナノ粒子とを解離させることであって、任意選択的に、前記ビーズと前記ナノ粒子との解離が、切断可能なリンカーの切断によるか、又は前記ナノ粒子と前記ビーズとの間の可逆的及び／若しくは非共有結合性相互作用の解離によるものである、解離させることと、
    ｂ．前記ナノ粒子をフローセルの表面に固定化することと、を含む、方法。
  32. 請求項３１に記載の方法によって調製された、フローセルの表面に固定化されたナノ粒子を含む、フローセル、又は、前記フローセルの前記表面に固定化された請求項２１～３０のいずれか一項に記載の組成物を含む、フローセルであって、任意選択的に、前記組成物が、前記フローセルの前記表面への前記ナノ粒子の結合によって前記フローセルに固定化されている、フローセル。
  33. ナノ粒子上に固定化された少なくとも２つのトランスポソーム複合体に各々結合した標的核酸又はその１つ以上の断片を含む、請求項３２に記載のフローセル。
  34. 反応溶液中の標的核酸から核酸ライブラリーを調製する方法であって、前記標的核酸が、前記トランスポソーム複合体によって断片化され、前記第１のポリヌクレオチドの３’トランスポゾン末端配列が、断片の５’末端に転移される条件下で、前記標的核酸を、ビーズ及び請求項２３～３０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのナノ粒子を各々含む組成物の混合物と接触させ、それによって、一方の鎖がタグで５’タグ化された固定化二本鎖標的核酸断片を生成させることを含む、方法。
  35. ａ．前記断片の生成後にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を添加することであって、前記ＳＤＳが、更なる断片の生成を停止させる、添加すること、又は
    ｂ．前記断片の生成後若しくは前記ＳＤＳ溶液の添加後に前記トランスポソーム複合体から断片を放出させることであって、任意選択的に、前記放出が、８０℃の温度で、若しくは増幅によって、行われる、放出させること、を更に含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記トランスポソーム複合体から前記断片を放出させることが、前記ナノ粒子から前記断片を放出させ、任意選択的に、前記断片が、前記放出後に溶液中にある、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記断片の放出後に、前記反応溶液からビーズを除去することを更に含み、任意選択的に、
    ａ．前記ビーズが、磁性を有し、前記ビーズの除去が、磁場を用いて行われるか、又は
    ｂ．前記ビーズが、分解性ポリエステルビーズであり、前記ビーズの除去が、分解剤を用いて行われ、任意選択的に、前記分解剤が、（ａ）５０℃～６５℃、若しくは６０℃の温度、及び／若しくは（ｂ）水性塩基である、請求項３６に記載の方法。
  38. ａ．溶液中の断片が、増幅され、増幅された前記断片が、フローセルにロードされ、捕捉され、かつ配列決定されるか、又は
    ｂ．ビーズ及びナノ粒子を含む組成物の混合物に固定化された断片がフローセルにロードされ、断片が放出され、及び／若しくはビーズが除去され、断片が、前記フローセル上で捕捉され、増幅され、かつ配列決定され、任意選択的に、単一の組成物から放出された断片が、前記フローセル上で空間的に近接して捕捉される、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 標的核酸が複数のトランスポソーム複合体によって断片化され、任意選択的に、全ての前記トランスポソーム複合体が、同一であり、断片が、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端において同じアダプター配列でタグ付けされる、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. ａ．前記トランスポソーム複合体から二本鎖標的核酸断片を放出させることであって、任意選択的に、次に前記断片が固体支持体に固定化される、放出させることと、
    ｂ．アダプター配列と、第１の３’末端トランスポゾン配列に完全に又は部分的に相補的な配列とを含むポリヌクレオチドを、ハイブリダイズさせることであって、前記ポリヌクレオチドに含まれる前記アダプター配列が、前記トランスポソーム複合体に含まれる前記アダプター配列と異なる、ハイブリダイズさせることと、
    ｃ．任意選択的に、前記二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、
    ｄ．任意選択的に、前記ポリヌクレオチド又は伸長させたポリヌクレオチドを、前記二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、
    ｅ．二本鎖断片を生成することと、を更に含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ポリヌクレオチドが、ＵＭＩを更に含み、前記二本鎖標的核酸断片が、前記ＵＭＩを含み、任意選択的に、前記ＵＭＩが、前記標的核酸断片の３’末端に直接隣接して位置する、請求項４０に記載の方法。
  42. 生成された二本鎖断片が、一方の鎖の５’末端において第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において前記ポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. ａ．前記トランスポソーム複合体から前記二本鎖断片を放出させることであって、任意選択的に、前記断片が、固体支持体に固定化されている、放出させることと、
    ｂ．アダプター配列を含む第１のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることであって、前記第１のトランスポゾン中のアダプターが第１のポリヌクレオチド中のアダプターとは異なる、ハイブリダイズさせることと、
    ｃ．任意選択的に、前記第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を含む第２のポリヌクレオチドを付加して、二本鎖アダプターを生成させることと、
    ｄ．任意選択的に、前記二本鎖標的核酸断片の第２の鎖を伸長させることと、
    ｅ．任意選択的に、前記二本鎖アダプターを、前記二本鎖標的核酸断片とライゲーションすることと、
    ｆ．二本鎖断片を生成することと、を更に含む、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記第１のポリヌクレオチドが、ＵＭＩを更に含み、前記二本鎖断片が、前記ＵＭＩを含み、任意選択的に、前記ＵＭＩが、前記標的核酸断片と前記第１のポリヌクレオチド由来の前記アダプター配列との間に位置する、請求項４３に記載の方法。
  45. 生成された二本鎖断片が、一方の鎖の５’末端において前記第１のトランスポゾンからの第１のリード配列アダプター配列でタグ付けされ、他方の鎖の５’末端において前記第１のポリヌクレオチドからの第２のリード配列アダプター配列でタグ付けされる、請求項４３又は４４に記載の方法。
  46. ビーズ及び少なくとも１つのナノ粒子を含む前記組成物の混合物中のビーズに固定化されたナノ粒子の平均数が、標的核酸断片のサイズを決定し、任意選択的に、前記方法が、増幅又は配列決定の前に、生成された断片のサイズ選択を必要としない、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 同じビーズ上に含まれるナノ粒子間の立体障害が、３５塩基対未満の断片の生成を低減し、任意選択的に、生成された断片が、ロングリード配列決定を使用して配列決定される、請求項３４～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. ビーズと少なくとも１つのナノ粒子とを含む組成物の混合物を調製する方法であって、
    ａ．ビーズ及びナノ粒子を混合して、請求項２１～３０のいずれか一項に記載のビーズ及びナノ粒子を含む組成物を調製することであって、任意選択的に、前記ビーズが磁性を有し、前記混合物が磁場を用いて行われる、調製することと、
    ｂ．前記混合物から前記ビーズを分離することであって、任意選択的に、前記ビーズが磁性を有し、前記ビーズの分離が磁場を用いて行われる、分離することと、
    ｃ．各ビーズと会合したナノ粒子の平均数を評価することであって、任意選択的に、前記評価が、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法に従って断片を調製し、断片サイズを決定することによって行われる、評価することと、
    ｄ．所望の平均数のナノ粒子が、前記組成物の混合物中の各ビーズと会合するまで、上記の工程を繰り返すことと、を含む、方法。
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