KR20230038145A - 트랜스포좀 담체로서의 비드 - Google Patents

트랜스포좀 담체로서의 비드 Download PDF

Info

Publication number
KR20230038145A
KR20230038145A KR1020227045558A KR20227045558A KR20230038145A KR 20230038145 A KR20230038145 A KR 20230038145A KR 1020227045558 A KR1020227045558 A KR 1020227045558A KR 20227045558 A KR20227045558 A KR 20227045558A KR 20230038145 A KR20230038145 A KR 20230038145A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
beads
bead
flow cell
immobilized
optionally
Prior art date
Application number
KR1020227045558A
Other languages
English (en)
Inventor
이얼-쉬위엔 우
타룬 쿠마르 쿠라나
엘리자벳 로자스-칸옐레스
페이 션
제프리 브로딘
레나 스톰스
제프리 에스. 피셔
Original Assignee
일루미나, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일루미나, 인코포레이티드 filed Critical 일루미나, 인코포레이티드
Publication of KR20230038145A publication Critical patent/KR20230038145A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/096—Polyesters; Polyamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/507—Recombinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/131—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a member of a cognate binding pair, i.e. extends to antibodies, haptens, avidin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/514—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the use of the arrayed oligonucleotides as identifier tags, e.g. universal addressable array, anti-tag or tag complement array
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)

Abstract

표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함하는 분해성 폴리에스터 비드가 기술되며, 상기 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하고, 상기 폴리에스터 비드는 50℃ 내지 65℃의 융점을 갖는다. 이러한 폴리에스터 비드와 관련된 플로우 셀 및 방법이 기술된다. 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물 및 나노입자에 고정화된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 이러한 조성물의 사용 방법이 또한 본원에 기술된다.

Description

트랜스포좀 담체로서의 비드
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2020년 7월 8일에 출원된 미국 가출원 제63/049,172호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 임의의 목적을 위해 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원되었다. 서열 목록은 2021년 6월 17일에 생성되었으며 파일명이 "2021-06-17_01243-0018-00PCT_Seq_List_ST25.txt"인 파일로서 제공되었으며, 이의 크기는 4,096 바이트이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
기술분야
본 출원은 트랜스포좀 담체로서 분해성(degradeble) 폴리에스터 비드 및 이러한 비드를 포함하는 플로우 셀(flow cell)에 관한 것이다. 이러한 비드는 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 다양한 방법에서 사용될 수 있다.
비드-연결된 트랜스포좀은 서열분석을 위한 라이브러리를 제조하기 위한 다양한 방법에서 사용된다. 일부 시스템에서, 비-분해성 M-280 자기 비드(Dynabeads®, Thermo Fisher)는 고상 가역 고정화(SPRI: Solid-Phase Reversible Immobilization) 비드로서 라이브러리 정리에 사용되거나 트랜스포좀 담체로서 사용되어 긴 DNA 분자에 대한 온-비드(on-bead) 라이브러리 제조를 가능케 하고 생산된 DNA 라이브러리를 플로우 셀로 직접 전달하는 것을 제어한다. 그러나, M-280 비드는 서열분석기의 다운스트림 튜브 및 밸브에 혼입되어 자동화된 제조 동안 기기가 막히거나 손상될 수 있다.
유전 물질을 캡슐화할 수 있고 서열분석 플로우 셀의 표면 상에 포획을 가능케 하는 분해성 하이드로겔 비드가 기술되어 있다. 그러나, 이러한 하이드로겔 비드는 유전 물질을 둘러싸거나 캡슐화한 다음 액체 확산 장벽 또는 비혼화성 유체의 존재 하에서 분해된다(PCT 출원 번호 제PCT/US18/44646호 및 제PCT/US18/44855호 참조). 하이드로겔 비드는 다공성일 수 있으며 비드 표면을 넘어 효소의 투과성을 가능케 한다. 비드 표면에 커플링을 허용하는 비드와 같은 다양한 서열분석 형식을 지원하려면 대체 유형의 비드가 필요하다(예컨대 태깅 반응을 위한 트랜스포좀 복합체 및/또는 표적 핵산의 표면 커플링).
자동화된 제조를 포함하는 방법을 개선하기 위해 트랜스포좀 담체로서 사용하기 위한 분해성 폴리카프로락톤(PLC: polycaprolactone) 비드가 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘은 PLC 미소구체(microsphere) 표면의 표면에 접합될 수 있으며 PLC 미소구체 표면에 비오틴-접합된 트랜스포좀의 조립을 가능케 하고 또한 국소화된 라이브러리 방출 및 클러스터링을 위해 비오티닐화된 플로우 셀 표면에 PLC 비드를 부착할 수 있다. 라이브러리 방출 및 플로우 셀 표면에 시딩한 후, PLC 비드는 서열분석기 유체 시스템의 잠재적인 손상 또는 막힘을 방지하기 위해 선택적으로 분해될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 비드를 통합하는 방법은 다운스트림 공정에 부정적인 영향을 미치지 않으면서, 비드 표면에 태깅을 허용하고 후속 서열분석 라이브러리 방출을 플로우 셀에 매우 근접하게 한다.
또한 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물을 사용하는 라이브러리 제조 방법이 본원에 개시된다. 라이브러리 제조는 모든 차세대 서열 분석(NGS: next-generation sequencing) 적용의 중요한 초기 단계이다. 비드-연결된 트랜스포좀(BLT: Bead-linked transposome) 라이브러리 구축은 별도의 DNA 단편화 단계의 필요성을 제거하고 DNA 단편 간의 결찰을 위한 전제 조건을 제거하여 DNA 라이브러리 준비 공정을 크게 개선하였다. 그러나, BLT 라이브러리의 삽입 크기는 비드에 대한 Tn5 트랜스포좀의 분포에 따라 달라진다. 너무 짧거나(낮은 출력, 짧은 판독) 너무 긴(불량한 클러스터링) 라이브러리를 제거하기 위해 단면 또는 양면 크기 선택(예컨대 SPRI 비드 사용)이 필요하다. 이러한 크기 선택된 라이브러리 샘플의 농도와 크기는 크기 선택 후 정량화되어야 하며, 라이브러리는 변성 후 적절한 농도로 희석되거나 정규화되어야 한다. 그런 다음 증폭 반응(클러스터링) 전에 라이브러리가 플로우 셀에 시딩된다. 이러한 모든 단계 동안 라이브러리 샘플의 상당 부분이 소비되는 반면, 상대적으로 적은 비율의 라이브러리 샘플만이 서열분석될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물은 개선된 라이브러리 생성 방법에 사용될 수 있다.
본 명세서에 따르면, 분해성 폴리에스터 비드가 본원에 기술되어 있다. 또한 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다.
실시형태 1. 분해성 폴리에스터 비드로서, 표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함하며, 상기 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하고, 상기 폴리에스터는 50℃ 내지 65℃, 또는 60℃의 융점을 갖는, 분해성 폴리에스터 비드.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 폴리에스터 비드가 폴리카프로락톤을 포함하는, 분해성 폴리에스터 비드.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 이에 고정화된 복수의 자기 나노입자를 포함하고, 선택적으로 상기 자기 나노입자가 자기 코어를 갖는 비드이고, 선택적으로 상기 자기 코어가 철, 니켈, 및/또는 코발트를 포함하는, 분해성 폴리에스터 비드.
실시형태 4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 각각의 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하고, 비드가 이의 표면에 공유적으로 결합된 복수의 비드 결합 모이어티를 포함하고, 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합을 통해 비드 표면에 고정화되는, 폴리에스터 비드.
실시형태 5. 실시형태 4에 있어서, 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 각각의 트랜스포좀 복합체의 제1 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합된, 폴리에스터 비드.
실시형태 6. 실시형태 4에 있어서, 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 각각의 트랜스포좀 복합체의 제2 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합된, 폴리에스터 비드.
실시형태 7. 실시형태 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 비드 결합 모이어티가 스트렙타비딘 또는 아비딘이고 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 비오틴인, 폴리에스터 비드.
실시형태 8. 실시형태 4 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 각각의 비드 결합 모이어티가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되고, 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하는, 폴리에스터 비드.
실시형태 9. 실시형태 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 각각의 자기 나노입자가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되고, 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하는, 폴리에스터 비드.
실시형태 10. 전술된 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 폴리에스터 비드가 플로우 셀의 표면 상에 고정화되는, 폴리에스터 비드.
실시형태 11. 실시형태 10에 있어서, 폴리에스터 비드가 플로우 셀의 표면 상에서 비드 결합 모이어티의 플로우 셀 결합 모이어티로의 공유 결합을 통해 플로우 셀의 표면 상에 고정화되는, 폴리에스터 비드.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티 및 플로우 셀 결합 모이어티가 동일한 유형의 결합 모이어티이고, 트랜스포좀 복합체가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제1 부분에 결합되고 플로우 셀 결합 모이어티가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제2 부분에 결합되는, 폴리에스터 비드.
실시형태 13. 전술된 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함하며, 선택적으로 대부분의 트랜스포좀 복합체가 비드의 표면 상에 고정화되는, 폴리에스터 비드.
실시형태 14. 플로우 셀의 표면 상에 고정화된 폴리에스터 비드를 포함하는 플로우 셀로서, 상기 폴리에스터 비드는 표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함하고, 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하고; 상기 폴리에스터 비드는 50℃ 내지 65℃, 또는 60℃의 융점을 갖는, 플로우 셀.
실시형태 15. 실시형태 14에 있어서, 폴리에스터 비드가 폴리카프로락톤을 포함하는, 플로우 셀.
실시형태 16. 실시형태 14 또는 실시형태 15에 있어서, 폴리에스터 비드가 이에 고정화된 복수의 고정화된 나노입자를 포함하는, 플로우 셀.
실시형태 17. 실시형태 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 각각의 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하고, 비드가 이의 표면에 공유적으로 결합된 복수의 비드 결합 모이어티를 포함하고, 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합을 통해 비드 표면에 고정화되는, 플로우 셀.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 각각의 트랜스포좀 복합체의 제1 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합되는, 플로우 셀.
실시형태 19. 실시형태 17에 있어서, 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 각각의 트랜스포좀 복합체의 제2 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합되는, 플로우 셀.
실시형태 20. 실시형태 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 비드 결합 모이어티가 스트렙타비딘 또는 아비딘이고 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 비오틴인, 플로우 셀.
실시형태 21. 실시형태 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 각각의 비드 결합 모이어티가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되고, 상기 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하는, 플로우 셀.
실시형태 22. 실시형태 16 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 각각의 자기 나노입자가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되고, 상기 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하는, 플로우 셀.
실시형태 23. 실시형태 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 폴리에스터 비드가 플로우 셀의 표면 상의 플로우 셀 결합 모이어티에 대한 비드 결합 모이어티의 공유 결합을 통해 플로우 셀의 표면 상에 고정화되거나, 비드가 이에 고정화된 복수의 고정화된 자기 나노입자를 포함하고, 선택적으로 상기 자기 나노입자가 플로우 셀의 표면에 폴리에스터 비드를 시딩하는데 사용되는, 플로우 셀.
실시형태 24. 실시형태 23에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티 및 플로우 셀 결합 모이어티가 동일한 유형의 결합 모이어티이고, 트랜스포좀 복합체가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제1 부분에 결합되고 플로우 셀 결합 모이어티가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제2 부분에 결합되는, 플로우 셀.
실시형태 25. 실시형태 14 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함하며, 선택적으로 대부분의 트랜스포좀 복합체가 비드의 표면 상에 고정화된, 플로우 셀.
실시형태 26. 표적 핵산이 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되고 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 트랜스포존 말단 서열이 단편의 적어도 하나의 가닥의 5' 말단으로 전달되는 조건 하에서 표적 핵산을 실시형태 1 내지 12 중 임의의 하나의 폴리에스터 비드 또는 실시형태 14 내지 25 중 임의의 하나의 플로우 셀과 접촉함으로써, 단편의 고정화된 라이브러리를 생산하는 단계를 포함하는 표적 핵산으로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 적어도 하나의 가닥이 태그로 5'-태깅되는, 방법.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 접촉 단계가 표적 핵산을 실시형태 1 내지 8 중 임의의 하나의 폴리에스터 비드와 접촉하는 단계를 포함하고, 방법이 단편의 고정화된 라이브러리를 포함하는 비드를 플로우 셀의 표면에 고정화하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 28. 실시형태 26 또는 실시형태 27에 있어서, 비드가 플로우 셀의 표면 상에서 비드 결합 모이어티의 플로우 셀 결합 모이어티로의 결합을 통해 플로우 셀의 표면에 고정화되거나, 비드가 이에 고정화된 복수의 고정화된 자기 나노입자를 포함하며, 선택적으로 상기 자기 나노입자가 폴리에스터 비드를 플로우 셀의 표면에 시딩하기 위해 사용되는, 방법.
실시형태 29. 실시형태 22에 있어서, 접촉 단계가 표적 핵산을 실시형태 10 내지 12 중 임의의 하나의 폴리에스터 비드와 접촉하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 30. 실시형태 27 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 고정화된 비드로부터 단편을 방출시켜 소비된 비드를 제공하는 단계 및 플로우 셀 표면 상에 방출된 단편을 포획하여 포획된 단편을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 31. 실시형태 30에 있어서, 고정화된 비드로부터 단편을 방출하는 단계가 비드로부터 단편을 증폭하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 32. 실시형태 30 또는 실시형태 31에 있어서, 방출된 단편을 포획하는 단계가 방출된 단편을 혼성화하여 플로우 셀의 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 포획하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 33. 실시형태 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 플로우 셀 표면 상에서 포획된 단편을 증폭하여 고정화된, 증폭된 단편을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 34. 실시형태 33에 있어서, 포획된 단편을 증폭하는 단계가 단편의 클러스터를 생산하기 위한 브리지 증폭을 포함하는, 방법.
실시형태 35. 실시형태 30 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 소비된 비드를 과량의 용액-상(solution-phase) 플로우 셀 결합 모이어티로 처리하여 플로우 셀 표면으로부터 소비된 비드를 분리하여 용액-상 소비된 비드를 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 36. 실시형태 35에 있어서, 용액-상 소비된 비드를 분해제로 분해하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 37. 실시형태 36에 있어서, 분해된 비드를 플로우 셀에서 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 38. 실시형태 36 또는 실시형태 37에 있어서, 분해제가 (a) 50℃ 내지 65℃, 또는 60℃의 온도, 및/또는 (b) 수성 염기인, 방법.
실시형태 39. 실시형태 38에 있어서, 수성 염기가 NaOH인, 방법.
실시형태 40. 실시형태 39에 있어서, 수성 염기가 1M 내지 5M NaOH인, 방법.
실시형태 41. 실시형태 40에 있어서, 수성 염기가 1M, 2M, 3M, 4M, 또는 5M NaOH인, 방법.
실시형태 42. 실시형태 40에 있어서, 수성 염기가 3M NaOH인, 방법.
실시형태 43. 실시형태 33 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 고정화된, 증폭된 단편 또는 단편의 클러스터를 서열분석하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 44. 복수의 트랜스포좀 복합체를 폴리에스터 비드에 고정화하는 단계를 포함하는 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나의 폴리에스터 비드의 제조 방법으로서, 상기 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하는, 방법.
실시형태 45. 실시형태 44에 있어서, 복수의 자기 나노입자를 폴리에스터 비드에 고정화하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 46. 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물로서, 상기 비드는 나노입자에 결합할 수 있는 작용기를 포함하고, 선택적으로 나노입자 또는 비드는 자기(magnetic)인, 조성물.
실시형태 47. 실시형태 46에 있어서, 나노입자가 합성 수지상돌기(dendron), DNA 수지상돌기, 또는 중합체 브러쉬(polymer brush)이고/이거나; 나노입자가 하드코어 비드를 포함하고, 선택적으로 상기 나노입자가 50 내지 150 nm의 직경을 갖고, 추가로 선택적으로 상기 나노입자가 100 nm의 직경을 갖는, 조성물.
실시형태 48. 실시형태 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 나노입자가 단일 고정화된 트랜스포좀 복합체, 또는 1개 초과의 고정화된 트랜스포좀 복합체를 포함하고, 선택적으로 상기 1개 초과의 고정화된 트랜스포좀 복합체가 나노입자 상의 각각의 트랜스포좀 복합체 사이의 유사한 거리로 고정화되는, 조성물.
실시형태 49. 실시형태 48에 있어서, 고정화된 트랜스포좀 복합체 또는 트랜스포좀 복합체가 나노입자로부터 멀리 향하는 트랜스포사제로 배향되는, 조성물.
실시형태 50. 실시형태 48 또는 실시형태 49에 있어서, 트랜스포좀 복합체가 (a) 비오틴, 데스티오비오틴, 또는 이중 비오틴을 포함하는 트랜스포존의 나노입자에 포함된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로의 결합에 의해, 또는 (b) 트랜스포존에 포함된 제제와 나노입자에 포함된 제제 사이의 클릭 화학 반응에 의해 나노입자에 고정화되고, 선택적으로 상기 클릭 화학 반응이 나노입자 상의 아지드와 트랜스포존 상의 디벤질사이클로옥틴(DBCO) 사이의 반응인, 조성물.
실시형태 51. 실시형태 46 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 비드가 다수 나노입자에 결합할 수 있는 담체 비드이고, 선택적으로 상기 비드가 1 μm 이상의 직경을 갖고/갖거나 비드가 실시형태 1 내지 8 중 임의의 하나의 분해성 폴리에스터 비드인, 조성물.
실시형태 52. 실시형태 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 작용기가 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머이고, 선택적으로 상기 (a) 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머가 나노입자에 직접적으로 결합하거나; (b) 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머가 나노입자에 간접적으로 결합하거나; (c) 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 비드에 포함된 클러스터링 프라이머 및 나노입자 둘 모두에 결합하는, 조성물.
실시형태 53. 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 나노입자와 비드 사이의 상호작용이 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용이고, 선택적으로 상기 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용이 단백질-리간드 상호작용 또는 금속-킬레이터 상호작용이고, 추가로 선택적으로 상기 단백질-리간드 상호작용이 비오틴-스트렙타비딘 상호작용이거나 금속-킬레이터 상호작용이 니켈-폴리히스티딘 또는 코발트-폴리히스티딘 상호작용인, 조성물.
실시형태 54. 실시형태 46 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 비드가 클러스터링 프라이머를 포함하고 나노입자가 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 선택적으로 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 상기 클러스터링 프라이머가 서로 직접적으로 결합하거나 연결 올리고뉴클레오티드가 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 상기 클러스터링 프라이머 둘 모두에 결합할 수 있는, 조성물.
실시형태 55. 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 나노입자와 비드 사이의 상호작용이 비가역적 및/또는 공유적 상호작용이고, 선택적으로 상기 공유적 상호작용이 비드와 나노입자 사이의 절단가능한 링커이고, 추가로 선택적으로 상기 절단가능한 링커가 화학적으로 또는 효소적으로 절단가능한 링커인, 조성물.
실시형태 56. 플로우 셀의 시딩 방법으로서, (a) 실시형태 46 내지 55 중 임의의 하나의 조성물의 비드와 나노입자를 해리하는 단계로서, 선택적으로 상기 비드와 나노입자를 해리하는 단계는 절단가능한 링커의 절단에 의해 또는 나노입자와 비드 사이의 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용의 해리에 의한 것인 단계; (b) 나노입자를 플로우 셀의 표면 상에 고정시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 57. 실시형태 56의 방법에 의해 제조된, 표면에 고정화된 나노입자를 포함하는 플로우 셀 또는 플로우 셀의 표면에 고정화된 실시형태 46 내지 55 중 임의의 하나의 조성물을 포함하는 플로우 셀로서, 선택적으로 상기 조성물은 나노입자의 플로우 셀의 표면으로의 결합을 통해 플로우 셀에 고정화되는, 플로우 셀.
실시형태 58. 실시형태 57에 있어서, 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함하며, 각각은 나노입자 상에 고정화된 적어도 2개의 트랜스포좀 복합체에 결합되는, 플로우 셀.
실시형태 59. 표적 핵산이 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되고 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 트랜스포존 말단 서열이 단편의 5' 말단에 전달되는 조건 하에서 표적 핵산을 실시형태 48 내지 55 중 임의의 하나의 비드 및 나노입자를 각각 포함하는 조성물의 혼합물과 접촉함으로써, 고정화된 이중 가닥 표적 핵산 단편을 생산하는 단계를 포함하는 반응 용액 중의 표적 핵산으로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 하나의 가닥이 태그로 5'-태깅되는, 방법.
실시형태 60. 실시형태 59에 있어서, (a) 단편 생산 후 소듐 도데실 설페이트(SDS: sodium dodecyl sulfate) 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 SDS가 추가 단편 생산을 중단시키는 단계; 또는 (b) 단편 생산 후 또는 SDS 용액 첨가 후 트랜스포좀 복합체로부터 단편을 방출시키는 단계로서, 선택적으로 상기 방출 단계는 80℃의 온도에서 또는 증폭에 의해 수행되는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 61. 실시형태 60에 있어서, 트랜스포좀 복합체로부터 단편을 방출하는 단계가 나노입자로부터 단편을 방출하며, 선택적으로 상기 단편이 방출 후 용액 중에 있는, 방법.
실시형태 62. 실시형태 61에 있어서, 단편 방출 후 반응 용액으로부터 비드를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 선택적으로 상기 (a) 비드는 자기이고 비드 제거가 자기장을 사용하여 수행되거나, (b) 비드가 분해성 폴리에스터 비드이고 비드 제거가 분해제를 사용하여 수행되고, 선택적으로 상기 분해제가 (i) 50℃ 내지 65℃, 또는 60℃의 온도, 및/또는 (ii) 수성 염기인, 방법.
실시형태 63. 실시형태 59 내지 62 중 어느 하나에 있어서, (a) 용액 중의 단편이 증폭되고, 증폭된 단편이 플로우 셀 내로 로딩되고, 포획되어, 서열분석되거나; (b) 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물에 고정화된 단편이 플로우 셀 내로 로딩되고, 단편이 방출되고/되거나 비드가 제거되고, 단편이 플로우 셀 상에 포획되고, 증폭되고, 서열분석되는 방법으로서, 선택적으로 단일 조성물로부터 방출된 단편이 플로우 셀 상에서 공간적으로 근접하여 포획되는, 방법.
실시형태 64. 실시형태 59 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 표적 핵산이 다수 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되는 방법으로서, 선택적으로 모든 상기 트랜스포좀 복합체는 동일하고 단편은 이중-가닥 단편의 두 가닥 모두의 5' 말단에서 동일한 어댑터 서열로 태깅되는, 방법.
실시형태 65. 실시형태 64에 있어서, (a) 트랜스포좀 복합체로부터 이중-가닥 표적 핵산 단편을 방출하는 단계로서, 선택적으로 상기 단편이 이어서 고체 지지체에 고정화되는 단계, (b) 어댑터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 제1 3' 말단 트랜스포존 서열에 대해 모두 또는 부분적으로 상보적인 서열을 혼성화하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오티드에 포함된 어댑터 서열은 트랜스포좀 복합체에 포함된 어댑터 서열과 상이한 단계, (c) 선택적으로 이중-가닥 표적 핵산 단편의 제2 가닥을 연장하는 단계, (d) 선택적으로 폴리뉴클레오티드 또는 연장된 폴리뉴클레오티드를 이중-가닥 표적 핵산 단편과 결찰하는 단계, 및 (e) 이중-가닥 단편을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 66. 실시형태 65에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 UMI를 포함하고 이중-가닥 표적 핵산 단편이 UMI를 포함하고, 선택적으로 상기 UMI가 표적 핵산 단편의 3' 말단에 바로 인접하여 위치하는, 방법.
실시형태 67. 실시형태 65 또는 실시형태 66에 있어서, 생산된 이중 가닥 단편이 하나의 가닥의 5' 말단에서 제1 트랜스포존으로의 제1 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되고 다른 가닥의 5' 말단에서 폴리뉴클레오티드의 제2 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되는, 방법.
실시형태 68. 실시형태 67에 있어서, (a) 트랜스포좀 복합체로부터 이중-가닥 단편을 방출하는 단계로서, 선택적으로 상기 단편이 고체 지지체 상에 고정화되는 단계, (b) 어댑터 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 단계로서, 제1 트랜스포존의 어댑터는 제1 폴리뉴클레오티드의 어댑터와 상이한 단계, (c) 선택적으로 제1 폴리뉴클레오티드와 상보성인 영역을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 첨가하여 이중-가닥 어댑터를 생산하는 단계, (d) 선택적으로 이중-가닥 표적 핵산 단편의 제2 가닥을 연장하는 단계, (e) 선택적으로 이중-가닥 어댑터를 이중-가닥 표적 핵산 단편과 결찰하는 단계, 및 (f) 이중 가닥 단편을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 69. 실시형태 68에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드가 UMI를 추가로 포함하고 이중-가닥 단편이 UMI를 포함하는 방법으로서, 선택적으로 상기 UMI가 표적 핵산 단편과 제1 폴리뉴클레오티드의 어댑터 서열 사이에 위치하는, 방법.
실시형태 70. 실시형태 68 또는 실시형태 69에 있어서, 생산된 이중 가닥 단편이 하나의 가닥의 5' 말단에서 제1 트랜스포존의 제1 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되고 다른 가닥의 5' 말단에서 제1 폴리뉴클레오티드의 제2 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되는, 방법.
실시형태 71. 실시형태 59 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물 중의 비드에 고정화된 나노입자의 평균 수가 표적 핵산 단편의 크기를 결정하는 방법으로서, 선택적으로 상기 방법은 증폭 또는 서열분석 전에 생산된 단편의 크기 선별을 필요로 하지 않는, 방법.
실시형태 72. 실시형태 59 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 동일한 비드 상에 포함된 나노입자 사이의 입체 장애가 35개 미만의 염기쌍의 단편의 생성을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 생산된 단편이 긴 판독(long read) 서열분석을 사용하여 서열분석되는, 방법.
실시형태 73. (a) 비드 및 나노입자를 혼합하여 실시형태 46 내지 55 중 임의의 하나의 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계로서, 선택적으로 상기 비드는 자기이고 혼합물은 자기장을 사용하여 수행되는 단계; (b) 혼합물로부터 비드를 분리하는 단계로서, 선택적으로 상기 비드는 자기이고 비드를 분리하는 단계가 자기장을 사용하여 수행되는 단계; (c) 각각의 비드와 결합된 나노입자의 평균 수를 평가하는 단계로서, 선택적으로 상기 평가 단계는 실시형태 59 내지 72 중 어느 하나의 방법에 따라 단편을 제조하는 단계 및 단편 크기를 결정하는 단계에 의해 수행되는 단계; 및 (d) 원하는 평균 수의 나노입자가 조성물의 혼합물에서 각각의 비드와 결합될 때까지 이전 단계를 반복하는 단계를 포함하는 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물을 제조하는, 방법.
부가적인 목적 및 이점은 다음의 설명에서 부분적으로 설명될 것이며, 부분적으로는 설명으로부터 명백하거나, 실시에 의해 학습될 수 있다. 목적 및 이점은 특히 첨부된 청구범위에서 지적된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
전술한 일반적인 설명과 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며 청구범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 포함되어 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 하나의(몇몇의) 실시형태(들)를 예시하고 설명과 함께 본 명세서에 설명된 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a 내지 1b는 분해성 폴리카프로락톤(PCL) 비드에 대한 스트렙타비딘 및/또는 자기 나노입자의 접합의 개요를 제공한다. (a) 아미노분해(aminolysis)에 의한 PCL 비드의 표면 활성화. (b) PCL 비드 표면에 비오틴-접합된 트랜스포좀의 조립.
도 2는 분해성 PCL 비드를 사용한 라이브러리 시딩/클러스터링, 방출 및 용융/세척 단계의 개요를 도시한다. 인-플로우(in-flow) 셀 라이브러리 방출 및 클러스터링 후, PCL 비드는 과량의 유리 비오틴에 의해 플로우 셀 표면에서 방출되고 플로우 셀에서 씻겨 나가기 전에 60℃ 초과의 온도에서 용융된다.
도 3은 나노입자에 포함된 트랜스포좀 복합체에 고정화된 표적 핵산을 도시하며, 여기서 다수 나노입자는 단일 담체 비드에 고정화되어 있다. 다수의 고정화된 나노입자를 갖는 비드를 포함하는 이러한 조성물은 주어진 표적 핵산으로부터 다수의 단편이 동일한 담체 비드 상에 제조될 수 있게 한다.
도 4a 내지 4c는 합성 수지상돌기(a), DNA 수지상돌기(b) 또는 중합체 브러쉬(c)와 같은 조성물에 포함될 수 있는 일부 대표적인 유형의 나노입자를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 비오틴-아비딘 상호작용(a) 또는 아지드-DBCO의 클릭 화학 반응(b)과 같이 나노입자와 트랜스포좀 복합체의 제1 트랜스포존과의 결합에 기초하여 트랜스포좀 복합체를 나노입자에 고정화하는 일부 대표적인 수단을 도시한다. 도 5a와 5b 모두에서, P5와 A14(도 5a) 사이 및 P7과 A14(도 5b) 사이의 구불구불한 선은 스페이서이다. 도 5a에서, 나노입자의 구불구불한 선은 3' 비오틴에 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 나타낸다. 도 5b에서, 구불구불한 선은 클릭 화학 반응에서 3' DBCO에 결합하는 아지드를 나타낸다.
도 6a 내지 6d는 비드(담체 비드) 및 적어도 하나의 나노입자의 조성의 실시형태를 도시한다. (a) 화학적 부착 핸들 및 클러스터링 프라이머를 포함하는 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물. (b) 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 나노입자 및 클러스터링 프라이머를 포함하는 비드를 포함하는 조성물로서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드가 클러스터링 프라이머에 결합할 수 있는 조성물. (c) 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 나노입자 및 클러스터링 프라이머를 포함하는 비드를 포함하는 조성물로서, 상기 연결 올리고뉴클레오티드는 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 클러스터링 프라이머 모두에 결합하는 조성물. (d) 나노입자 및 비드를 포함하는 조성물로서, 여기서 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 비드 상의 클러스터링 프라이머에 결합되고 상기 화학적 변형이 또한 나노입자 상의 작용기에 결합할 수 있는 조성물.
도 7은 고정화된 나노입자를 갖는 비드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 도시한다.
도 8은 고정화된 나노입자를 갖는 비드를 포함하는 조성물의 혼합물을 사용하여 서열분석 라이브러리를 제조하는 방법을 요약한 것이다.
서열의 설명
표 1은 본원에서 언급된 특정 서열의 목록을 제공한다.
[표 1]
Figure pct00001
비드 표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함할 수 있는 분해성 폴리에스터 비드가 본원에 기술되어 있다. 이러한 비드는 트랜스포좀 담체로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "트랜스포좀 담체"는 트랜스포좀이 고정화될 수 있는 제제를 지칭하며, 상기 제제는 또한 플로우 셀에 매우 근접한 라이브러리 생성물의 방출을 용이하게 할 수 있다. 플로우 셀에 라이브러리 단편을 시딩한 후 비드가 분해될 수 있으므로, 비드는 서열분석과 같은 다운스트림 공정을 방해하지 않는다. 또한 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물 및 이들 조성물을 사용하는 방법이 본원에 기술된다.
I. 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물
일부 실시형태에서, 조성물은 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 나노입자에 결합할 수 있는 작용기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자 및/또는 비드는 자기이다.
도 3에 도시된 바와 같이, BLT에서 자기 마이크로미터 크기 비드 상에 Tn5를 직접 고정화하는 대신에, Tn5는 나노입자 상에 고정화된 후에("클러스터링 나노입자") 마이크로미터 크기 자기 비드(담체 비드) 상에 로딩될 수 있다. 클러스터링 나노입자 표면은 클러스터링을 위한 클러스터링 올리고뉴클레오티드(예컨대, P7 올리고뉴클레오티드, 클러스터링 프라이머로도 알려짐) 및 dsDNA 태깅을 위한 단일 Tn5로 덮여 있다. 태깅 후, 나노입자는 용액으로 방출될 수 있다. 증폭(예컨대 클러스터 증폭)은 용액에서 또는 나노입자가 플로우 셀 표면에 로딩(즉, 포획)된 후에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물은 통합된 클러스터링 및 라이브러리 제조 워크플로우에 의해 샘플의 이용률을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 입체 장애는 라이브러리 내에서 짧은 삽입 크기의 생성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, Tn5 태깅은 합성 긴 판독 서열분석 적용을 위해 인덱싱될 수 있다.
A. 비드
일부 실시형태에서, 조성물에 포함된 비드는 담체 비드이다. 일부 실시형태에서, 담체 비드는 다수의 나노입자에 결합한다.
일부 실시형태에서, 담체 비드는 직경이 1 μm 이상이다. 일부 실시형태에서, 담체 비드는 직경이 2 내지 5 μm이다. 일부 실시형태에서, 비드의 크기는 얼마나 많은 나노입자가 그 표면에 고정화되는지에 영향을 미친다. 예를 들어, 더 큰 비드는 더 많은 나노입자를 고정화할 수 있다. 고정화된 나노입자가 트랜스포좀 복합체를 포함하는 경우(아래에 기재된 바와 같이), 나노입자의 총 수는 조성물 상의 트랜스포좀 복합체의 총 수를 나타낼 수 있다.
임의의 유형의 비드가 담체 비드로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 비드 자체는 그 표면에 나노입자를 고정화하는 것 외에 라이브러리의 제조에서 역할을 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 담체 비드는 비-다공성 또는 대부분 비-다공성이어서, 표면에 나노입자의 고정화를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 담체 비드는 중공(hollow) 또는 중실(solid)이다.
일부 실시형태에서에서, 담체 비드는 자기 코어를 갖는 고체 비드이다. 이러한 자기 비드는 자기력(예컨대 자기 스탠드 또는 자기 교반기)의 존재 하에 수행될 때 혼합 또는 정제 단계를 개선하기 위한 기술 분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 담체 비드는 분해성 비드이다. 일부 실시형태에서, 담체 비드는 후술되는 바와 같은 분해성 폴리에스터 비드이다. 분해성 비드는 제어된 방식으로 플로우 셀 또는 반응 용액으로부터 비드를 제거할 수 있도록 하는 이점을 갖는다.
일부 실시형태에서, 도 3에 도시된 바와 같이, 다수의 클러스터링 나노입자가 담체 비드 상에 로딩된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "클러스터링 나노입자"는 증폭 프라이머로도 알려진, 클러스터링 프라이머를 포함하는 나노입자를 지칭한다. 클러스터링 프라이머는 또한 나노입자의 담체 비드로의 결합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수 나노입자는 비드 상에 고정화될 수 있으며, 비드 상의 각각의 나노입자는 단일 트랜스포좀 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1개 초과의 트랜스포좀 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 단편은 담체 비드 상에서 다수 나노입자에 의해 생산되며, 상기 단편은 담체 비드에 결합된 나노입자에 고정화된다.
1. 작용기
일부 실시형태에서, 비드는 나논입자에 결합할 수 있는 작용기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머는 나노입자에 직접적으로 결합한다. 비드 상의 화학적 부착 핸들이 변형된 표면을 갖는 나노입자에 결합하는 실시형태가 도 6a에 도시되어 있다.
일부 실시형태에서, 클러스터링 프라이머는 나노입자에 결합할 수 있을뿐만 아니라 클러스터 증폭을 매개할 수 있는 것이다. 일부 실시형태에서, 나노입자 및 플로우 셀은 비드 상의 클러스터링 프라이머에 결합할 수 있는 동일한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 비드 상의 클러스터링 프라이머가 고정화된 올리고뉴클레오티드를 갖는 나노입자와 결합하는 실시형태가 도 6b에 도시되어 있다.
일부 실시형태에서, 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머는 나노입자에 간접적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 비드에 포함된 클러스터링 프라이머 및 나노입자 둘 모두에 결합한다. 연결 올리고뉴클레오티드가 비드 상의 클러스터링 프라이머 및 나노입자 상의 고정화된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 실시형태가 도 6c에 도시되어 있다.
일부 실시형태에서 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 비드 상의 클러스터링 프라이머에 결합되며, 상기 화학적 변형은 나노입자 상의 작용기에 결합할 수 있다(도 6d에 도시된 바와 같음). 예시적인 화학적 변형은 비오티닐화를 포함할 수 있으며, 이는 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 결합을 매개할 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자와 비드 사이의 상호작용은 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용이다. 일부 실시형태에서, 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용은 단백질-리간드 상호작용 또는 금속-킬레이터 상호작용이다. 일부 실시형태에서, 단백질-리간드 상호작용은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용이거나 금속-킬레이터 상호작용은 니켈-폴리히스티딘 또는 코발트-폴리히스티딘 상호작용이다.
일부 실시형태에서, 비드는 클러스터링 프라이머를 포함하고 나노입자는 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 클러스터링 프라이머는 서로 직접적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 연결 올리고뉴클레오티드는 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 클러스터링 프라이머 둘 모두와 결합할 수 있으며, 따라서 비드 상의 나노입자에 고정화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자와 비드 사이의 상호작용은 비가역적 및/또는 공유적 상호작용이다. 일부 실시형태에서, 공유적 상호작용은 비드와 나노입자 사이의 절단가능한 링커이다. 일부 실시형태에서, 절단가능한 링커는 화학적으로 또는 효소적으로 절단가능한 링커이다.
B. 나노입자
일부 실시형태에서, 조성물에 포함된 나노입자는 담체 비드의 표면 상의 활성 부위, 예컨대 트랜스포좀 복합체를 고정하는 역할을 한다. 다양한 효소와 같이 다른 활성 부위가 고려될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "활성 부위"는 사용자가 원하는 기능을 수행할 수 있는 분자를 단순히 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성 부위는 사용자가 원하는 기능을 수행하는 효소의 전부 또는 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 50 nm 내지 150 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 100 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 상이한 유형의 나노입자의 혼합물을 포함한다.
매우 다양한 상이한 나노입자가 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드 결합을 위한 단일 주형 부위를 포함하는 나노입자는 미국 특허 출원 제17/130,489호(미국 특허 공개 제US20210187469A1호로 공개됨), 제17/130,494호(미국 특허 공개 제US20210187470호로 공개됨) 및 제62/952,799호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 인용되어 본원에 포함된다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 덴드리머(dendrimer)이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "덴드리머"는 분지형 중합체 분자를 갖는 나노입자를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 수지상돌기(dendron)이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "수지상돌기"는 결절점(focal point) 또는 코어와 같이 단일의 화학적으로 주소지정이 가능한(addressable) 기를 함유하는 나노입자를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 중합체 브러쉬이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "중합체 브러쉬"는 또 다른 중합체 사슬에 조밀하게 연결된 중합체 사슬을 갖는 거대분자 구조를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 합성 수지상돌기를 포함한다(도 4a). 일부 실시형태에서, 나노입자는 DNA 수지상돌기를 포함한다(도 4b). 일부 실시형태에서, 나노입자는 중합체 브러쉬를 포함한다(도 4c). 당업자는 매우 다양한 상이한 나노입자를 알고 있을 것이며, 조성물은 특정 유형의 나노입자로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 비드이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 담체 비드에 포함된 비드보다 작은 비드이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 하드코어 비드이다. 일부 실시형태에서, 비드는 20 nm 내지 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 비드는 50 nm 내지 150 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 비드는 90 nm 내지 110 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 비드는 100 nm의 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 자기이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 자기 물질 코어를 갖는 비드이다. 일부 실시형태에서, 자기 물질은 철, 니켈, 또는 코발트이다. 일부 실시형태에서, 자기 물질 코어는 실리카 쉘로 코팅된다. 일부 실시형태에서, 실리카 쉘은 유기-실란 분자와 함께 작용화를 가능케 한다. 일부 실시형태에서, 이러한 작용화는 담체 비드에 포함된 작용기와의 결합을 가능케 한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 트랜스포좀 복합체의 고정화에 사용된다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 Tn5를 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 제1 트랜스포존에서의 비오틴의 상호작용에 의해 나노입자 상의 아비딘에 고정화된다(도 5a). 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 아지드와 DBCO 사이의 클릭 화학 반응에 의해 나노입자에 고정화된다(도 5b). 일부 실시형태에서, 클릭 화학 반응의 사용은 나노입자 및 Tn5 방출 단계 동안 어댑터와 나노입자 사이의 연결의 안정성을 개선한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 그 자체로는 비활성이지만, 활성 부위를 생성하는 역할을 할 수 있는 분자를 고정화할 수 있다. 이러한 나노입자는 "활성화가능한 나노입자"로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 용액으로부터 트랜스포좀 복합체를 포획할 수 있는 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 트랜스포좀 복합체에 포함된 트랜스포존에 결합할 수 있는 혼성화 서열을 포함하는 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드는 트랜스포좀 복합체에 포함된 제2 트랜스포존에 포함된 혼성화 서열과의 혼성화를 위한 서열을 포함한다.
활성화가능한 나노입자를 포함하는 조성물은 사용자가 다단계 방법으로 태깅화 타이밍을 제어할 수 있게 하는 것과 같이 많은 이점을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 나노입자라함은 트랜스포좀 복합체가 나노입자에 포함된 고정화된 올리고뉴클레오티드에 이미 결합되어 있는 나노입자의 상태를 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 단일 고정화된 트랜스포좀 복합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 1개 초과의 고정화된 트랜스포좀 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자 상의 각각의 트랜스포좀 복합체 사이의 거리는 생산되는 라이브러리 단편의 크기에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 1개 초과의 고정화된 트랜스포좀 복합체는 나노입자 상의 각각의 트랜스포좀 복합체 사이의 유사한 거리로 고정화된다. 일부 실시형태에서, 이러한 간격(spacing)은 균일한 크기의 라이브러리 단편을 생성하는데 도움이 된다.
일부 실시형태에서, 고정화된 트랜스포좀 복합체 또는 트랜스포좀 복합체는 나노입자로부터 멀리 향하는 트랜스포사제로 배향된다. 즉, 트랜스포좀 복합체의 활성 도메인은 조성물의 바깥쪽을 향하여(즉, 담체 비드로부터 멀리 떨어져) 지시되어 트랜스포좀 복합체가 반응 용액에서 표적 핵산과 상호작용할 확률을 증가시킬 수 있다.
트랜스포좀은 다양한 방식으로 나노입자에 고정화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 비오틴, 데스티오비오틴, 또는 이중 비오틴을 포함하는 트랜스포존의 나노입자 상에 포함된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로의 결합에 의해 나노입자에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 클릭 화학 반응에 의해 나노입자에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 클릭 화학 반응은 나노입자 상의 아지드와 트랜스포존 상의 디벤질사이클로옥틴(DBCO) 사이의 반응이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 유사한 방식으로 고정화될 수 있으며, 용액 중의 트랜스포좀 복합체는 고정화된 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 담체 비드는 고정화된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 1개 초과의 나노입자에 결합된다. 일부 실시형태에서, 모든 고정화된 트랜스포좀 복합체는 동일한 제1 트랜스포존을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모든 고정화된 트랜스포좀 복합체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 조성물에 의해 생성된 단편은 동일한 어댑터를 트랜스포좀 복합체에 의해 생성된 단편의 양 말단에 혼입한다(즉, 대칭적 태깅). 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드가 이어서 단편의 한쪽 말단의 제2 어댑터에 혼입시키는데 사용된다. 예를 들어, 고정화된 트랜스포좀은 A14 어댑터 서열을 포함할 수 있는 반면, 폴리뉴클레오티드는 B15 어댑터 서열을 포함할 수 있다(도 6a 및 6b에 도시된 바와 같음). 후술되는 바와 같이, 이러한 트랜스포존 및 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법은 생산되는 단편의 양 말단에 상이한 어댑터 서열을 갖는 단편을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 2개의 상이한 트랜스포좀 복합체는 비드에 포함된 나노입자 상에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 태깅은 단편의 하나의 말단과 다른 말단에 상이한 어댑터를 포함하는(즉, 비대칭적 태깅) 적어도 일부 단편을 야기한다.
C. 담체 비드 상에 나노입자의 고정화
나노입자는 정전기적 고정화(도 6a), 비드 상의 클러스터링 프라이머와 나노입자의 표면 상의 고정화된 올리고뉴클레오티드와의 혼성화(도 6b), 또는 이러한 유형의 상호작용의 조합(도 6c)을 통한 것을 비롯하여, 다수의 상이한 방식으로 담체 비드 상에 고정화될 수 있다.
비드 상에 나노입자의 고정화는 나노입자에 포함된 활성 부위를 담체 비드에 로딩할 수 있다. 예를 들어, 나노입자가 트랜스포좀 복합체를 포함할 때, 로딩된 담체 비드는 유사하게 비드-연결된 트랜스포좀(BLT: bead-linked transposome) 및 태그 표적 핵산을 단편 라이브러리로 기능할 수 있다. BLT는 일반적으로 태깅을 사용하는 라이브러리 제비에 사용되지만 BLT는 때때로 원하는 것보다 작은 단편을 포함하여 다양한 크기의 단편을 생성한다.
입체 장애가 담체 비드 상의 나노입자 상에 고정화된 트랜스포좀 복합체 사이의 간격을 생성하기 때문에(즉, 2개의 나노입자가 담체 비드 상의 동일한 표면적을 점유할 수 없음), 이러한 간격은 너무 짧은 라이브러리 단편의 제조를 방지할 수 있다. 이러한 이점은 크기에 따라 나노입자를 사용하는데 내재되어 있으며, 사용자는 더 작거나 더 큰 나노입자를 사용하여 트랜스포좀 복합체의 간격을 조작할 수 있다. 사용자가 라이브러리에서 작은 단편을 더 엄격하게 제외하려는 경우, 더 큰 직경/크기의 나노입자를 사용하여 트랜스포좀 복합체의 너무 가까운 간격을 피할 수 있다. 트랜스포좀 복합체(즉, BLT의 제조)로 비드를 직접 로딩하는 것은 작은 크기의 트랜스포좀 복합체 자체가 너무 가까운 간격으로 트랜스포좀 복합체의 고정화를 허용할 수 있기 때문에 이러한 이점이 없을 것이다.
따라서, 나노입자가 트랜스포좀 복합체를 포함하는 적어도 하나의 나노입자 및 비드를 갖는 조성물은 라이브러리 제조 후 크기 배제 단계(예를 들어, SPRI 정제)에 대한 비용 및 시간을 피함으로써 라이브러리 제조 프로토콜을 단순화할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 원하는 크기의 더 균일한 라이브러리 단편을 제공하는 역할을 할 수 있는데, 이는 사용자가 트랜스포좀 복합체를 포함하는 나노입자로 비드를 로딩하는 과정을 보정할 수 있기 때문이다(아래에 설명됨). 이러한 방법은(도 8에 도시된 바와 같이) 자기 나노입자 및/또는 자기 비드로 용액을 교반하여 나노입자를 균일하게 로딩하는 방법을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자와 담체 비드 사이의 상호작용은 가역적이다. 가역적 상호작용에 대한 한 가지 접근 방식은 단백질-리간드(예컨대 비오틴 스트렙타비딘), 금속-킬레이터(예컨대 Ni-NTA-폴리히스티딘) 또는 다양한 기타 호스트-게스트 화학과 같은 비-공유적 상호작용을 사용하는 것이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 비드와 반응기 사이에 화학적으로 또는 효소적으로 절단가능한 링커를 사용하여 담체 비드 상에 공유적으로 고정화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자와 비드 사이의 결합 화학은 알킨 아지드 화학(구리-촉매된 아지드-알킨 환화첨가 화학)이다. 일부 실시형태에서, 연결 화학은 말레이미드 설프히드릴 화학이다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 클러스터링 프라이머에 대한 혼성화를 통해 고정화될 수 있거나 별도의 올리고뉴클레오티드가 클러스터링 프라이머에 비해 낮은 농도로 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 접근법은 나노입자가 담체 비드로부터 효율적으로 방출될 수 있도록 혼성화 모티프의 길이를 조정하는 것에 기초하여 가역적이다. 일부 실시형태에서, 절단가능한 링커는 담체 비드에 대한 부착물에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 서열분석 프라이머에 대한 혼성화를 통해 담체 비드 상에 나노입자를 고정시키기 위한 작용기가 부가된다. 이 접근 방식은 위의 접근 방식에 설명된 임의의 전략을 사용할 수 있으며 기존 비드 표면 화학을 사용할 수 있다는 사실로부터 이점을 얻는다.
D. 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 제조
일부 실시형태에서, 조성물을 제조하는 방법은 다수의 나노입자가 담체 비드에 결합하도록 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 비드에 결합된 나노입자의 수는 태깅화에 의해 제조된 라이브러리 단편의 크기를 결정한다.
일부 실시형태에서, 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물에서 비드에 고정화된 나노입자의 평균 수는 표적 핵산 단편의 크기를 결정한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 증폭 또는 서열분석 전에 생성된 단편의 크기 선별을 요구하지 않는다.
일부 실시형태에서, 동일한 비드에 포함된 나노입자 사이의 입체 장애는 35개 염기쌍 미만의 단편 생성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 생산된 단편은 라이브러리 단편이 표준 라이브러리 제조 방법보다 더 많은 염기쌍을 포함하기 때문에 긴 판독 서열분석을 사용하여 서열분석된다.
도 7에 도시된 바와 같이, 담체 비드 상의 나노입자의 로딩 효율은 조성물을 제조하는 방법에 의해 제어될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 비드 용액이 클러스터링 나노입자 용액에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 자기 교반 막대는 나노입자와 잘 혼합된 담체 비드를 유지하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 각 비드와 결합된 나노입자의 평균 수를 결정하기 위해 비드를 분리하기 위해 자기력이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 사용자는 각각의 비드와 관련된 나노입자의 원하는 평균 수를 달성하기 위해 반응을 조정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물을 제조하는 방법은 (a) 비드 및 나노입자를 혼합하여 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계, (b) 혼합물로부터 비드를 분리하는 단계, (c) 각각의 비드와 결합된 나노입자의 평균 수를 평가하는 단계, 및 (d) 원하는 평균 수의 나노입자가 조성물의 혼합물에서 각 비드와 혼합될 때까지 이전 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비드는 자기이며 혼합물은 자기장을 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 비드는 자기이며 비드를 분리하는 단계는 자기장을 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 평가하는 단계는 라이브러리 단편을 제조하고 단편 크기를 결정함으로써 수행된다.
II. 플로우 셀의 시딩 방법
일부 실시형태에서, 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물 상에 생성된 단편은 플로우 셀 상에 시딩된다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체가 고정화되는 동안 조성물은 플로우 셀 상에 시딩된다. 일부 실시형태에서, 단편은 트랜스포좀 복합체로부터 방출된 후 플로우 셀에 시딩된다. 일부 실시형태에서, 시딩은 플로우 셀의 표면에 고정화된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 단편에서 어댑터 서열의 결합을 기반으로 한다. 일부 실시형태에서, 담체 비드는 플로우 셀에 대한 포획 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 플로우 셀(나노입자에 부착된 표적 핵산 또는 단편과 함께) 상에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 플로우 셀을 시딩하는 방법은 비드 및 조성물의 나노입자를 해리시키는 단계 및 플로우 셀의 표면 상에 나노입자를 고정시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드와 나노입자의 해리는 절단가능한 링커의 절단에 의하거나 나노입자와 비드 사이의 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용의 해리에 의한다. 일부 실시형태에서, 플로우 셀을 시딩하는 방법은 비드와 나노입자가 여전히 서로 결합되어 있는 동안 조성물을 플로우 셀에 결합시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 플로우 셀은 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함하며, 각각은 나노입자 상에 고정화된 적어도 2개의 트랜스포좀 복합체에 결합된다.
III. 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 사용 방법
일부 실시형태에서, 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물은 표적 핵산으로부터 단편의 라이브러리를 제조하는데 사용된다. 이러한 방법은 도 8에 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 게놈 DNA이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 이중 가닥 DNA 또는 DNA:RNA 듀플렉스이다.
일부 실시형태에서, 조성물 상의 태깅 후에, 단편은 나노입자로부터 방출되고, 용액에서 증폭되고, 증폭된 단편은 서열분석을 위해 플로우 셀로 전달된다. 일부 실시형태에서, 태깅 후에, 단편은 담체 비드와 결합된 나노입자 상에 고정화되는 동안 플로우 셀로 전달되고, 단편은 방출되고 플로우 셀 상에 포획되고, 증폭되고, 서열분석된다.
일부 실시형태에서, 증폭 단계는 생략될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 단편의 크기 선별 단계를 필요로 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 생산된 라이브러리 단편의 크기를 제어하기 위해 담체 비드 상에 나노입자의 로딩 효율을 사용한다.
일부 실시형태에서, 반응 용액 내의 표적 핵산으로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 방법은 표적 핵산이 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되고 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 트랜스포존 말단 서열이 단편의 5' 말단에 전달되는 조건 하에서 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 각각 포함하는 조성물의 혼합물을 표적 핵산과 접촉하여, 고정화된 이중 가닥 표적 핵산 단편을 생산하는 단계를 포함하며 여기서 하나의 가닥은 태그로 5'태깅된다.
일부 실시형태에서, 방법은 단편 생산 후에 소듐 도데실 설페이트(SDS) 용액을 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 SDS는 추가 단편 생산을 중지시킨다. 일부 실시형태에서, 방법은 단편의 생성 후 또는 SDS 용액을 첨가한 후 트랜스포좀 복합체로부터 단편을 방출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방출은 80℃의 온도에서 또는 증폭에 의해 수행된다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체로부터 단편을 방출하는 것은 또한 나노입자로부터 단편을 방출한다. 일부 실시형태에서, 단편은 방출 후 용액에 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 단편의 방출 후에 반응 용액으로부터 비드를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 자기이며 비드 제거는 자기장을 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 비드는 분해성 폴리에스터 비드이고 비드 제거는 분해제를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 분해제는 (a) 50℃ 내지 65℃, 또는 60℃의 온도, 및/또는 (b) 수성 염기(아래에 기재된 바와 같음)이다.
일부 실시형태에서, 용액 중의 단편이 증폭되고, 증폭된 단편이 플로우 셀에 로딩되고, 포획되고, 서열분석된다.
일부 실시형태에서, 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물에 고정화된 단편이 플로우 셀에 로딩되고, 단편은 방출되고/되거나 비드가 제거되고, 단편은 플로우 셀 상에 포획되고, 증폭되고, 서열분석된다. 일부 실시형태에서, 단일 조성물로부터 방출된 단편은 플로우 셀 상에서 공간적으로 근접하여 포획될 것이다. 일부 실시형태에서, 동일한 조성물 상에서 제조된 단편은 플로우 셀에 대한 공간적 근접성을 기반으로 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 조성으로부터 생성된 단편은 동일한 조성물로부터 생성된 단편과 비교할 때 플로우 셀에서 더 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 단편 사이의 거리는 이들 2개의 단편이 동일한 비드 상에 제조되었을 가능성이 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동일한 비드 상에 제조된 단편은 동일한 표적 핵산 분자로부터 제조되었다.
A. 대칭적 태깅
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 다수 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되며, 상기 모든 트랜스포좀 복합체는 동일하고 단편은 이중-가닥 단편의 두 가닥 모두의 5' 말단에서 동일한 어댑터 서열로 태깅된다. 일부 실시형태에서, 다수 트랜스포좀 복합체는 동일한 담체 비드 상에 고정화된 상이한 나노입자 상에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 대칭적 태깅을 사용하는 방법은 한 가지 이상의 유형의 트랜스포좀 복합체가 태깅을 위해 사용되는 표준의 비대칭적 태깅 단계에 비해 서열분석가능한 단편(단편의 각각의 말단에 상이한 서열분석 어댑터 서열을 갖는 각각의 단편)의 수율을 증가시킨다. 상이한 태그(A 및 B, 예컨대 제1-판독 서열분석 어댑터 및 제2-판독 서열분석 어댑터)를 갖는 2가지 유형의 트랜스포좀을 사용하는 비대칭적 태깅은 증폭된 태깅 생산물에서 거의 절반의 판독물의 손실을 유발하는데, 이는 대칭적으로 및 비대칭적으로 태깅된 생성물(A-A, B-B, A-B, B-A)이 생성되지만, A-B와 B-A만 후속 증폭 및 서열분석에 적합하기 때문이다. 대조적으로, 대칭적 태깅은 결과 단편이 제1-판독 및 제2-판독 서열분석 어댑터를 모두 포함할 가능성을 높일 수 있다.
일부 실시형태에서, 대칭적 태깅을 사용하는 방법은 다른 라이브러리 제조 방법에 비해 라이브러리의 수율을 증가시킬 수 있다.
태깅 후에 제2 어댑터를 추가하기 위한 다수의 상이한 방법이 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 제1-판독 서열분석 어댑터 어댑터는 태깅 동안 이중-가닥 DNA 또는 DNA:RNA 듀플렉스 단편에 통합될 수 있으며, 제2-판독 서열분석 어댑터는 이후 단계에 통합될 수 있다(예컨대 결찰에 의해). 예시적인 방법이 본원에서 설명될 것이다. 일부 실시형태에서에서, 본 방법은 본원에 기술된 조성물을 사용하여 대칭적 태깅을 통해 하나의 서열분석 어댑터 서열을 대칭도입하고 또 다른 것은 제2 서열분석 어댑터 서열을 포함하는 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드의 사용을 통해 도입함으로써 (비대칭적 태깅을 사용하는 방법과 비교하여) 라이브러리 수율을 개선할 수 있다.
B. 태깅 후 하나 이상의 어댑터(들)를 통합하기 위한 폴리뉴클레오티드
일부 실시형태에서, 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물 내의 모든 트랜스포좀은 동일하고, 생성된 단편은 태깅 후 양 말단에서 동일한 어댑터 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 태깅에 의해 통합되는 어댑터 서열과 상이한 어댑터 서열을 통합하기 위해 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법이 수행된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드를 사용한 방법의 사용은 한 말단에 제1 어댑터 서열 및 제2 말단에 제2 어댑터 서열을 갖는 단편을 생성한다.
일부 실시형태에서, 방법은 대칭 태깅 후, 트랜스포좀 복합체로부터 이중-가닥 표적 핵산 단편을 방출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편은 이어서 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 방법은 어댑터 서열 및 방출된 단편 내의 제1 3' 말단 트랜스포존 서열에 전부 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 단계를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드에 포함된 어댑터 서열은 트랜스포좀 복합체에 포함된 어댑터 서열과 상이하다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 표적 핵산 단편의 제2 가닥이 연장된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 연장된 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 표적 핵산 단편과 결찰되어 이중-가닥 단편을 생산한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 고유 분자 식별자(UMI: unique molecular identifier)를 추가로 포함하고 이중-가닥 표적 핵산 단편은 UMI를 포함한다. 일부 실시형태에서, UMI는 표적 핵산 단편의 3' 말단에 바로 인접하여 위치한다. 일부 실시형태에서, 생산된 이중 가닥 단편은 한 가닥의 5' 말단에 있는 제1 트랜스포존으로부터의 제1 판독 서열 어댑터 서열 및 다른 가닥의 5' 말단에 있는 폴리뉴클레오티드로부터의 제2 판독 서열 어댑터 서열로 태깅된다.
일부 실시형태에서, 방법은 태깅 후에 트랜스포좀 복합체로부터 이중-가닥 단편을 방출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편은 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 방법은 어댑터 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 방출된 단편에 혼성화시키는 단계를 포함하며, 상기 제1 트랜스포존의 어댑터는 제1 폴리뉴클레오티드의 어댑터와 상이하다. 일부 실시형태에서, 방법은 이중-가닥 어댑터를 생산하기 위해 제1 폴리뉴클레오티드에 상보적인 영역을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이중-가닥 표적 핵산 단편의 제2 가닥을 연장하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이중-가닥 어댑터를 이중-가닥 표적 핵산 단편과 결찰하여 이중 가닥 단편을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 UMI를 추가로 포함하고 이중-가닥 단편은 UMI를 포함한다. 일부 실시형태에서, UMI는 표적 핵산 단편과 제1 폴리뉴클레오티드로부터의 어댑터 서열 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 생산된 이중 가닥 단편은 한 가닥의 5' 말단에 있는 제1 트랜스포존으로부터의 제1 판독 서열 어댑터 서열 및 다른 가닥의 5' 말단에 있는 제1 폴리뉴클레오티드로부터의 제2 판독 서열 어댑터 서열로 태깅된다. 다른 가닥.
C. 고유 분자 식별자(UMI: Unique Molecular Identifier)
고유 분자 식별자(UMI)는 개별 핵산 분자를 서로 구별하는데 사용될 수 있는 핵산 분자에 적용되거나 핵산 분자에서 식별되는 뉴클레오티드의 서열이다. UMI는 판독 서열이 하나의 공급원 핵산 분자 또는 다른 공급원 핵산 분자의 것인지 여부를 결정하기 위해 결합된 핵산 분자와 함께 서열분석될 수 있다. "UMI"라는 용어는 본원에서 폴리뉴클레오티드의 서열 정보 및 물리적 폴리뉴클레오티드 자체를 지칭하는데 사용될 수 있다. UMI는 일반적으로 한 샘플의 판독값을 다른 샘플의 판독값과 구별하는데 사용되는 바코드와 유사하지만, UMI는 대신 개별 샘플의 많은 단편이 함께 서열분석될 때 핵산 주형 단편을 다른 것과 구별하는데 사용된다. UMI는 본원에 인용되어 포함된 국제 공개 WO 2019/108972호 및 WO 2018/136248호에 기재된 바와 같이 다양한 방식으로 정의될 수 있다.
일부 실시형태에서, UMI의 라이브러리는 비무작위(nonramdom) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비무작위 UMI(nrUMI)는 특정 실험 또는 적용을 위해 미리 정의된다. 특정 실시형태에서, nrUMI를 얻기 위해 세트에 대한 서열을 생성하거나 세트로부터 샘플을 선택하기 위해 규칙이 사용된다. 예를 들어, 세트의 서열은 서열이 특정 패턴 또는 패턴들을 갖도록 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 서열은 특정 수(예를 들어, 2, 3 또는 4)의 뉴클레오티드에 의해 세트 내의 모든 다른 서열과 상이하다. 즉, nrUMI 서열은 특정 수의 뉴클레오티드보다 적은 수의 뉴클레오티드를 교체함으로써 다른 이용가능한 nrUMI 서열로 전환될 수 없다. 일부 실시형태에서, 서열분석 과정에 사용되는 UMI 세트는 특정 서열 길이가 주어진 모든 가능한 UMI보다 적은 수를 포함한다. 예를 들어, 6개의 뉴클레오티드를 갖는 nrUMI 세트는 총 4A6=4096개의 가능한 상이한 서열 대신에 총 96개의 상이한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, UMI의 라이브러리는 120개의 비무작위 서열을 포함한다.
nrUMI가 모든 가능한 상이한 서열보다 적은 세트로부터 선택되는 일부 실시형태에서, nrUMI의 수는 공급원의 DNA 분자의 수보다 더 적고, 때때로 상당히 그렇다. 이러한 실시형태에서, nrUMI 정보는 가상 UMI, 참조 서열 상의 판독 위치, 및/또는 판독의 서열 정보와 같은 다른 정보와 결합되어 동일한 공급원 DNA 분자에서 유래하는 서열 판독을 식별할 수 있다.
일부 실시형태에서에서, UMI 라이브러리는 하나 이상의 서열 길이가 주어진 모든 가능한 상이한 올리고뉴클레오티드 서열로 이루어진 UMI 세트로부터 교체가 있거나 없는 무작위 샘플로서 선택되는 무작위(random) UMI(rUMI)를 포함할 수 있다. 예를 들어, UMI 세트의 각 UMI가 n개의 뉴클레오티드를 갖는 경우, 세트는 서로 다른 서열을 갖는 4An UMI를 포함한다. 4An UMI에서 선택된 무작위 샘플이 rUMI를 구성한다.
일부 실시형태에서, UMI의 라이브러리는 nrUMI 및 rUMI의 혼합물을 포함할 수 있는 위(pseudo)-무작위 또는 부분적으로 무작위이다.
일부 실시형태에서, UMI와 삽입 DNA 사이에 어댑터 서열 또는 다른 뉴클레오티드 서열이 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 어댑터 서열 또는 다른 뉴클레오티드 서열은 각각의 UMI와 삽입 DNA 사이에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, UMI는 삽입 DNA의 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 어댑터 서열을 나타내는 핵산 서열은 UMI와 삽입 DNA 사이에 위치할 수 있다.
D. 연결된 긴 판독 서열분석
표준 짧은 판독 서열분석은 단거리 정보를 제공하기 위해 정확한 염기 수준 서열을 제공하지만, 짧은 판독 서열분석은 장거리 게놈 정보를 제공하지 않을 수 있다. 또한, 일배체형(haplotype) 정보는 서열분석된 게놈 또는 짧은 판독 데이터가 있는 참조에 대해 유지되지 않기 때문에, 표준 방법으로는 장거리 일배체형의 재구성이 어렵다. 이와 같이 표준 서열분석 및 분석 접근법은 일반적으로 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV: single nucleotide variant)를 호출할 수 있지만, 이러한 방법은 개별 게놈에서 보이는 구조적 변이의 전체 스펙트럼을 식별하지 못할 수 있다. 본원에서 사용되는 게놈의 "구조적 변이"는 50개 염기쌍 이상의 이벤트를 포함하는 SNV보다 큰 이벤트를 지칭한다. 대표적인 구조적 변이는 카피 수 변이, 역위, 결실 및 중복을 포함한다.
"연결된 긴 판독 서열분석" 또는 "연결된-판독 서열분석"은 게놈 서열에 대한 장거리 정보를 제공하는 서열분석 방법을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 연결된-판독 서열분석은 일배체형 재구성을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결된-판독 서열분석은 구조적 변이의 호출을 개선한다. 일부 실시형태에서, 연결된-판독 서열분석은 제한된 접근성으로 게놈 영역에 대한 접근을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 연결된-판독 서열분석이 새로운(de novo) 배수체(diploid) 조립에 사용된다. 일부 실시형태에서, 연결된-판독 서열분석은 새로운 조립체를 필요로 하는 고도의 다형성 서열(예컨대 인간 백혈구 항원 유전자)의 서열분석을 개선한다.
일부 실시형태에서, 연결된 긴-판독 서열분석은 플로우 셀 상의 단편의 공간적 근접성을 기반으로 수행될 수 있으며, 상기 단편은 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 주어진 조성물로부터 생성되었다.
E. 공간적 분리에 기반한 연결된 긴-판독 서열분석
일부 실시형태에서, 전장(full-length) 핵산은 비드 및 다수 나노입자를 포함하는 단일 조성물 상에 "래핑(wrapping)"되며, 이는 전장 핵산이 단일 담체 비드에 의해 결합된 나노입자 상에 고정화된 다수 트랜스포좀 복합체와 결합할 수 있음을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, cDNA 또는 DNA:RNA 듀플렉스일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 비드에 부착된 전장 핵산으로 서열분석을 위해 표면으로 전달된다. 그런 다음 단편이 방출될 수 있어서, (동일한 조성물에서 제조된) 주어진 전장 핵산으로부터 생성된 단편이 다른 조성물에서 제조된 단편과 비교하여 매우 근접하게 방출될 것이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 조성물에 부착된 단편으로 서열분석을 위해 표면으로 전달된다. 일부 실시형태에서, 단편은 단편의 방출 및 포획 후에 플로우 셀 상에서 증폭된 다음 서열분석된다.
IV. 분해성 폴리에스터 비드의 사용 방법
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 담체 비드이다. 분해성 폴리에스터 비드는 전술된 바와 같은 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 임의의 실시형태에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 세척과 같은 태깅 반응에서 수행되는 단계의 온도보다 높은 융점을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 50℃ 이상의 용융 온도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 라이브러리 단편이 플로우 셀로부터 방출되는 온도 미만의 융점을 갖는다. 일부 실시형태에서, 라이브러리 단편은 플로우 셀의 표면과 결합된 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 어댑터 서열(예를 들어, P5(SEQ ID NO: 1) 또는 P7(SEQ ID NO: 2) 또는 이들의 상보체)의 혼입에 기초하여 플로우 셀과 결합된다. 일부 실시형태에서, 비드의 용융 온도는 어댑터 서열이 플로우 셀의 표면과 결합된 올리고뉴클레오티드로부터 탈혼성화되는 온도 미만이다. 일부 실시형태에에서, 폴리에스터 비드는 65℃ 이하의 융점을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 50℃ 내지 65℃의 융점을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 60℃의 융점을 갖는다.
일부 실시형태에서, 비드는 각각 비드 상의 적어도 2개의 트랜스포좀 복합체에 결합된 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 트랜스포좀 담체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 비드 표면 상의 태깅에 의해 라이브러리 제조를 매개하고 플로우 셀 상에서 라이브러리 단편의 방출을 허용하기 위해 사용될 수 있다.
A. 분해성 폴리에스터 비드
본원에서 사용된 바와 같이 "분해성 폴리에스터 비드"는 폴리에스터를 포함하고 분해될 수 있는 임의의 유형의 비드를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 중합체는 가교결합되지 않아 상대적으로 낮은 중합체 용융 온도(예를 들어, 약 60℃)를 가능하게 한다.
분해성 폴리에스터 비드를 분해하는 대표적인 수단은 온도 증가에 의한 용융 또는 증가된 온도에서의 알칼리성 가수분해를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "용융"은 폴리에스터 비드가 열에 의해 선택적으로 해중합되어 비드 구조가 손실되는 것을 지칭한다. 해중합은 폴리에스터 중합체의 격자 구조를 감소시키거나 파괴시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 용융은 중합체의 화학적 가교결합 없이 비드의 물리적 용융을 유도한다. 예를 들어, 용융은 폴리에스터 비드를 더 작은 폴리카프로락톤(PCL) 중합체 또는 PCL의 개별 분자로 전환시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, PCL 비드는 50℃ 초과의 온도에서 용융될 수 있어, 비드는 더 작은 PCL 중합체 또는 PCL 분자로 분해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 50℃ 내지 65℃의 온도에서 용융된다.
일부 실시형태에서, 비드는 PCL 이외의 폴리에스터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, PCL 이외의 폴리에스터는 50℃ 내지 65℃의 용융 온도를 갖는다. 즉, 분해성 폴리에스터 비드는 적절한 열 특성을 가진 임의의 폴리에스터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분해성 폴리에스터 비드의 용융 온도는 특정 반응에 필요한 온도보다 높다. 예를 들어, 분해성 폴리에스터 비드는 태깅 반응을 수행하는데 필요한 온도에서 온전한 상태로 남아 있을 수 있지만, 서열분석을 위해 표면에 포획하기 위해 태깅 후 라이브러리 단편을 방출하기 위해 더 높은 온도에서 용융된다.
(도 1a에 도시된 바와 같이)스트렙타비딘 또는 자기 나노입자와 같은 PCL에 결합된 임의의 제제는 보다 작은 PCL 중합체 또는 PCL 분자에 부착된 상태로 유지될 수 있거나, 이러한 제제는 PCL 중합체 또는 분자로부터 방출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 비드 표면에 고정화된 라이브러리 단편이 플로우 셀 표면의 올리고뉴클레오티드로부터 탈혼성화되는 온도 이전의 온도에서 용융을 허용하는 온도에서 용융된다. 즉, 분해성 폴리에스터 비드는 라이브러리 단편이 플로우 셀에 고정화되고/되거나 고정화된 상태로 유지되는 온도에서 용융될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드 용융(라이브러리 단편이 고정화되고/되거나 그 표면에 고정화된 상태로 유지되는 동안)은 라이브러리 단편이 하기에 논의된 바와 같이 플로우 셀 상에 국소화된 공간 방출을 가능하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "비드"는 미소구체와 상호교환가능하다. 그러나, 본원에에 기술된 비드는 구형에 한정되지 않는다. 예를 들어, 비드는 대부분 구형일 수 있다. 비드는 구형 쉘과 같이 중공(hollow)일 수 있거나 중실(solid)일 수 있다. 비드는 다공성, 반다공성 또는 비다공성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 90% 초과 또는 95% 초과의 비-다공성과 같이 제한된 다공성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 비다공성 비드는 중실(solid)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 100% 미만의 트랜스포좀 복합체가 비드의 표면 상에 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체의 일부는 비드 내에 포함되고 트랜스포좀 복합체의 일부는 비드의 표면에 포함된다. 일부 실시형태에서, 모든 트랜스포좀 복합체는 비드의 표면에 포함된다.
일부 실시형태에서, 대부분의 트랜스포좀 복합체는 폴리에스터 비드의 표면에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 트랜스포좀 복합체가 비드의 표면 상에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 대부분의 트랜스포좀 복합체가 비드의 표면에 고정화된다는 것은 (비드의 내부와 반대로) 대부분의 라이브러리 단편이 비드의 표면 상에 고정화된다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 비드의 표면 상의 대부분의 라이브러리 단편의 고정화는 공간적으로 제한된 영역에서 비드로부터 라이브러리 단편의 방출을 보장하는 것을 돕는다. 일부 실시형태에서, 표면 폴리에스터 분자는 반응 온도가 비드의 용융 온도로 증가될 때 신속하게 용융되기 때문에, 비드가 용융되기 시작할 때 비드 표면 상의 라이브러리 단편이 신속하게 방출될 것이다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 비-다공성이다. 일부 실시형태에서, 모든 트랜스포좀 복합체는 비-다공성 비드의 표면에 고정화되는데, 그 이유는 어떤 트랜스포좀 복합체도 비드를 투과할 수 없기 때문이다. 일부 실시형태에서, 비-다공성 비드는 트랜스포좀 복합체가 비드 내에 고정화되는 것을 허용하지 않고 대신에 모든 트랜스포좀이 비드 표면에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 1% 고체 현탁액 또는 10 mg/ml 현탁액과 같은 고체 현탁액으로서 공급될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 순수한 고체 입자로서 공급될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드는 폴리카프로락톤(PCL)을 포함한다. PCL은 장기 안정성을 갖는 것으로 알려진 반결정질 중합체이지만, 선택적으로 분해될 수 있다. 예를 들어, PCL 비드는 50℃ 초과의 온도에 의해 선택적으로 분해될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리카프로락톤은 폴리 (ε-카프로락톤)이다. 일부 예에서, 비드는 약 100 nm 내지 약 50 nm의 직경을 가진다. 일부 실시형태에서, 비드는 1 μm 내지 5 μm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 비드는 3 μm 내지 5 μm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 비드는 2 μm 내지 3 μm의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 비드의 직경은 생성된 라이브러리 단편에 대한 제한된 효과를 갖는다. 일부 실시형태에서, 비드의 직경은 고정화된 트랜스포좀 복합체로 생성된 라이브러리 단편의 크기를 결정하지 않는다. 일부 실시형태에서, 라이브러리 단편 크기는 트랜스포좀으로서 사용되는 분해성 폴리에스터 비드의 표면 상에 트랜스포좀 복합체(트랜스포사제를 포함함)의 밀도와 상관관계가 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체의 표면 농도를 비교적 일정하게 유지하기 위해 상이한 크기 비드가 사용될 때 상이한 양의 트랜스포좀 복합체가 분해성 폴리에스터 비드의 표면에 고정화된다.
일부 실시형태에서, PCL 밀도는 1.145 g/㎤이다. 일부 실시형태에서, PCL 밀도는 75 g/㎤ 내지 1.5 g/cm 3이다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 50℃ 내지 65℃의 융점을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 50℃ 이상, 60℃ 이상, 또는 65℃ 이상의 온도에서 용융된다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 60℃의 온도에서 용융된다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 수성 염기의 존재 하에 분해된다. 일부 실시형태에서, 수성 염기는 NaOH이다. 일부 실시형태에서, NaOH는 1M 내지 5M NaOH이다. 일부 실시형태에서, NaOH는 3M NaOH이다. 일부 실시형태에서, 수성 염기는 1M, 2M, 3M, 4M 또는 5M NaOH이다. 일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 50℃ 이상, 60℃ 이상, 또는 65℃ 이상의 온도에서 NaOH의 존재 하에 분해된다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 이에 고정화된 복수의 자기 나노입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 트랜스포좀 복합체는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 표면에 공유적으로 결합된 복수의 비드 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 비드 결합 모이어티에 대한 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 결합을 통해 비드 표면에 고정화된다.
B. 트랜스포좀 복합체
일부 실시형태에서, 복수의 트랜스포좀 복합체는 분해성 폴리에스터 비드의 표면 상에 고정화될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고정화된" 및 "부착된"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 명시적으로 또는 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 두 용어 모두 직접 또는 간접, 공유 또는 비공유 부착을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "트랜스포좀 복합체"는 통합 인식 부위를 포함하는 통합 효소 및 핵산을 지칭한다. 트랜스포좀 복합체는 트랜스포사제 및 전위(transposition) 반응을 촉매할 수 있는 트랜스포사제 인식 부위에 의해 형성된 기능적 복합체이다(예를 들어, Gunderson 등의, 국제 특허 공개 제WO 2016/130704호 참조). 통합 효소의 예는 인테그라제 또는 트랜스포사제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 통합 인식 부위의 예는 트랜스포사제 인식 부위를 포함되나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체를 포함하는 분해성 폴리에스터 비드는 다양한 라이브러리 제조 공정에서 사용될 수 있는 비드-연결된 트랜스포좀(BLT)이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 과활성 Tn5 트랜스포사제를 포함한다. 고정화된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 BLT 및 라이브러리 단편을 제조하기 위한 이들의 용도는 미국 특허 제9,683,230호에 기술된 것과 같이 당업계에 잘 알려져 있으며, 상기 미국 특허는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다. 일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 본원에 기술된 바와 같이 고정화된 트랜스포좀을 포함하는 적어도 하나의 나노입자를 갖는 조성물에 포함된다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 ㎟ 당 적어도 103, 104, 105, 106 복합체의 밀도로 비드 상에 존재한다. 일부 실시형태에서, 고정화된 라이브러리에서 이중-가닥 단편의 길이는 비드 상에 존재하는 트랜스포좀 복합체의 밀도를 증가시키거나 감소시킴으로써 조정된다. 특정 실시형태에서, 생성된 가교된 단편의 길이는 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp, 1400 bp, 1500 bp, 1600 bp, 1700 bp, 1800 bp, 1900 bp, 2000 bp, 2100 bp, 2200 bp, 2300 bp, 2400 bp, 2500 bp, 2600 bp, 2700 bp, 2800 bp, 2900 bp, 3000 bp, 3100 bp, 3200 bp, 3300 bp, 3400 bp, 3500 bp, 3600 bp, 3700 bp, 3800 bp, 3900 bp, 4000 bp, 4100 bp, 4200 bp, 4300 bp, 4400 bp, 4500 bp, 4600 bp, 4700 bp, 4800 bp, 4900 bp, 5000 bp, 10000 bp, 30000 bp 미만 또는 100,000 bp 미만이다. 일부 실시형태에서, 이어서 가교된 단편은 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 개시내용에 의해 예시된 바와 같이 표준 클러스터 화학을 사용하여 클러스터로 증폭될 수 있으며, 상기 미국 특허 각각의 내용은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
일부 실시형태에서, 비드 상의 트랜스포좀의 밀도는 트랜스포좀 복합체를 포함하는 폴리에스터 비드의 제조 동안 비드에 첨가되는 비오틴-접합된 트랜스포좀 용액 중의 트랜스포좀의 농도에 의해 조절된다.
일부 실시형태에서, 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 하나 이상의 유형의 트랜스포좀 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 2가지 상이한 유형의 트랜스포좀 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개의 상이한 유형의 트랜스포좀 복합체를 포함하는 분해성 폴리에스터 비드는 비대칭적으로 태깅된 단편을 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 상이한 트랜스포좀 복합체를 사용한 비대칭적 태깅은 단편의 2개의 말단에서 상이한 태그를 갖는 일부 단편을 생산한다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 A14 서열을 포함하는 태그를 포함하는 트랜스포좀 복합체의 하나의 풀 및 B15를 포함하는 태그를 포함하는 트랜스포좀 복합체의 또 다른 풀을 포함한다. 이러한 대표적인 예에서, 나중에 PCR 증폭을 위해 A14/B15 서열로 비대칭적으로 태깅된 단편이 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일 유형의 트랜스포좀 복합체(즉, 다수의 동일한 트랜스포좀)를 포함하는 분해성 폴리에스터 비드는 대칭적으로 태깅된 단편을 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 동일한 트랜스포좀 복합체를 사용한 대칭적 태깅은 단편의 양 말단에서 동일한 태그를 갖는 단편을 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 태깅된 단편의 한 말단에 상이한 어댑터를 통합하기 위한 대칭적 태깅 이후의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 태깅 후 단편의 한쪽 말단에 상이한 어댑터를 통합할 수 있다. 대칭적 태깅을 포함하는 일부 예시적인 방법이 미국 임시 출원 제63/168,802호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 P7 서열을 포함하는 태그를 포함하는 하나의 트랜스포좀 복합체 풀 및 P5 서열을 포함하는 태그를 포함하는 트랜스포좀 복합체의 또 다른 풀을 포함한다. 이러한 대표적인 예에서, 플로우 셀의 표면에 존재할 수 있는 다른 포획 올리고뉴클레오티드에 결합하기 위해 비대칭적으로 서열이 태깅된 단편이 생산될 수 있다.
C. 태그
본원에서 사용된 바와 같이, "태그"는 원하는 의도된 목적 또는 적용을 위한 서열을 나타내는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 도메인을 지칭한다. 본원에 제시된 일부 실시형태는 트랜스포존 말단 서열을 포함하는 3' 부분을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 태그를 포함하는 트랜스포좀 복합체를 포함한다.
태그는 임의의 원하는 목적을 위해 제공된 임의의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 태그는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 클러스터 증폭 반응을 위한 프라이머와의 혼성화에 적합한 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 서열분석 반응을 위한 프라이머와의 혼성화에 적합한 하나 이상의 영역을 포함한다. 임의의 다른 적합한 특징이 태그에 통합될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 태그는 5 내지 200 bp 길이를 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 10 내지 100 bp 길이를 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 20 내지 50 bp 길이를 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200 bp 길이를 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 태그는 인덱스 서열, 판독 서열분석 프라이머 서열, 증폭 프라이머 서열, 또는 다른 유형의 어댑터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 태그는 어댑터를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "어댑터"는 예를 들어 결찰 또는 태깅에 의해 핵산 분자에 융합될 수 있는 선형 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 예에서, 어댑터는 샘플에 존재하는 임의의 표적 서열의 3' 말단 또는 5' 말단에 대해 실질적으로 비-상보적이다. 일부 예에서, 적합한 어댑터 길이는 10 내지 100개 뉴클레오티드, 12 내지 60개 뉴클레오티드 또는 15 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일반적으로, 어댑터는 뉴클레오티드 및/또는 핵산의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 어댑터는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 절단가능한 기를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 어댑터는 프라이머, 예를 들어 P5 또는 P7 서열과 같은 범용 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 어댑터는 P5' 또는 P7' 서열을 포함한다. 일부 예에서, 어댑터는 다운스트림 오류 정정, 식별 또는 서열분석을 지원하기 위해 바코드(본원에서 인덱스라고도 함)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 태그는 예를 들어 클러스터 증폭을 위한 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 태그는 서열분석 반응을 프라이밍하기 위한 영역을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 어댑터는 예를 들어 한쪽 또는 양쪽 끝에서 어댑터의 연장을 방지하는 차단기(blocking group)를 추가하여 연쇄체의 형성을 방지하도록 수정될 수 있다. 3' 차단기의 예에는 3'-스페이서 C3, 디데옥시뉴클레오티드 및 기질에 대한 부착을 포함한다. 5' 차단기의 예는 탈인산화된 5' 뉴클레오티드 및 기질에 대한 부착을 포함한다.
일부 예에서, 어댑터는 1 내지 20개, 예컨대 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드 길이일 수 있는 스페이서 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 스페이서는 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 스페이서는 10T 스페이서와 같은 폴리T 스페이서이다. 스페이서 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 포함될 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과의 결합을 통해 적합한 지지체에 부착될 수 있다. 부착은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 존재하는 포스포로티오에이트와 같은 황-함유 친핵체를 통해 달성될 수 있다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리T 스페이서 및 5' 포스포로티오에이기를 포함할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 분자의 단편에 연결된 어댑터는 표적 핵산 분자의 단편에 속하는 서열 판독의 후속 시딩, 서열분석 및 분석을 위한 서열을 포함한다. 어댑터는 예를 들어 포획 서열, 서열분석 프라이머 결합 부위, 증폭 프라이머 결합 부위 및 인덱스를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, "인덱스 서열"은 분자 식별자 및/또는 핵산에 태그를 지정하고/하거나 핵산의 공급원을 식별하기 위한 바코드로서 사용될 수 있는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 인덱스는 단일 핵산 또는 핵산 하위 집단을 식별하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "프라이머"는 관심 표적 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 뉴클레오티드가 폴리머라제에 의해 중합될 수 있는 기질로서 기능한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 서열은 증폭 프라이머 서열이다.
일부 실시형태에서, 어댑터는 범용 뉴클레오티드 서열에 결합하는 상응하는 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 론(lawn) 또는 웰을 함유하는 서열분석 플로우 셀의 표면 상의 서열분석 라이브러리의 핵산 분자를 포획하기 위한 범용 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단편의 말단에 존재하는 범용 서열은 프라이머로 작용할 수 있고 증폭 반응에서 연장될 수 있는 범용 앵커 서열의 결합에 사용될 수 있다. 여러 실시형태에서 두 가지 상이한 범용 프라이머가 사용된다. 하나의 프라이머는 인덱싱된 핵산 단편의 한 가닥의 3' 말단에서 범용 서열과 혼성화하고, 두 번째 프라이머는 인덱싱된 핵산 단편의 다른 가닥의 3' 말단에서 범용 서열과 혼성화된다. 따라서, 각 프라이머의 앵커 서열은 다를 수 있다. 적합한 프라이머는 각각 범용 포획 서열과 같은 추가적인 범용 서열 및 또 다른 인덱스 서열을 포함할 수 있다. 각 프라이머는 인덱스를 포함할 수 있기 때문에, 이러한 단계는 서로의 역보완이거나 서로의 역보완이 아닌 서열을 가질 수 있는 1 또는 2개의 인덱스 서열을 추가하는 결과를 낳는다.
일부 실시형태에서, 태그는 P5 또는 P7 서열, 또는 이들의 상보체를 포함한다. 포획 및/또는 증폭 목적을 위해 범용 P5 또는 P7 서열 또는 P5 또는 P7 프라이머를 언급할 때 P5 및 P7이 사용될 수 있다. P5' 및 P7'은 각각 P5 및 P7의 상보체를 지정한다. 임의의 적합한 범용 서열이 본원에 제시된 방법에서 사용될 수 있고, P5 및 P7의 사용은 단지 예임을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, P5 서열은 SEQ ID NO: 1(AATGATACGGCGACCACCGA)에 의해 정의된 서열을 포함하고 P7 서열은 SEQ ID NO: 2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)에 의해 정의된 서열을 포함한다. 플로우 셀에 대한 P5 및 P7 또는 이들의 상보체의 비-제한적인 사용은 국제 공개 WO 2007/010251호, WO 2006/064199호, WO 2005/065814호, WO 2015/106941호, WO 1998/044151호 및 WO 2000/018957호의 개시에 의해 예시되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 다수의 상이한 유형의 어댑터를 포함하는 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 2, 3, 4 또는 5가지 유형의 어댑터를 포함한다.
D. 표적 핵산
[0053] 일부 실시형태에서, 비드는 각각 비드 상의 적어도 2개의 트랜스포좀 복합체에 결합된 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 표적 핵산은 비드 표면에 고정화된 하나 이상의 트랜스포좀 복합체에 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하고, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 용어는 등가물로서 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하고 단일 가닥(예컨대 정방향 또는 역방향) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같은 이러한 용어는 또한 예를 들어 역전사효소의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 또는 복제 DNA인 cDNA를 포함한다. 이러한 용어는 분자의 1차 구조만을 지칭한다. 따라서 이러한 용어는 삼중-, 이중- 및 단일- 가닥 DNA와 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 RNA를 포함한다. 핵산 분자 및 폴리뉴클레오티드라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "표적"은 핵산 분자와 관련하여 사용될 때 본원에 제시된 방법의 맥락에서 핵산에 대한 의미론적 식별자로 의도되며 달리 명시적으로 표시된 것 이상으로 핵산의 구조 또는 기능을 반드시 제한하지는 않는다.
핵산 분자의 뉴클레오티드는 자연 발생 핵산 및 이의 기능적 유사체를 포함할 수 있다. 특히 유용한 기능적 유사체는 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화할 수 있거나 특정 뉴클레오티드 서열의 복제를 위한 주형으로 사용될 수 있다. 자연 발생 핵산은 일반적으로 포스포디에스터 결합을 포함하는 백본을 가지고 있다. 유사체 구조는 당업계에 공지된 임의의 다양한 것들을 포함하는 대체 백본 연결을 가질 수 있다. 자연 발생 핵산은 일반적으로 데옥시리보스 당(예컨대 DNA에서 발견됨) 또는 리보스 당(예컨대 RNA에서 발견됨)을 가지고 있다. 핵산은 당업계에 공지된 이들 당 모이어티의 다양한 유사체 중 임의의 것을 함유할 수 있다. 핵산은 천연 또는 비-천연 염기를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 DNA는 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있고 리보핵산은 아데닌, 우라실, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산에 포함될 수 있는 유용한 비-천연 염기는 당업계에 공지되어 있다. 비-천연 염기의 예는 잠금 핵산(LNA: nucleic acid) 및 가교 핵산(BNA: bridged nucleic acid)을 포함한다. LNA 및 BNA 염기는 DNA 올리고뉴클레오티드에 통합되어 올리고뉴클레오티드 혼성화 강도 및 특이성을 증가시킬 수 있다.
유전 물질(예컨대 표적 핵산 분자)이 수득될 수 있는 대표적인 예시적인 생물학적 샘플은 예를 들어 포유류 예컨대 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 유제류, 말, 양, 돼지, 염소, 소, 고양이, 개, 영장류, 인간 또는 비-인간 영장류; 식물 예컨대 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 옥수수, 수수, 귀리, 밀, 벼, 유채, 또는 대두; 조류(algae) 예컨대 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii); 선충류 예컨대 캐노하브디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans); 곤충류 예컨대 드로소필라 멜라노게스터(Drosophila melanogaster), 모기, 초파리, 꿀벌 또는 거미; 어류 예컨대 제브라피쉬와; 파충류; 양서류 예컨대 개구리 또는 제노푸스 라비스(Xenopus laevis); 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum); 진균류 예컨대 뉴모시스티스 카리니(pneumocystis carinii), 타키푸구 루브리프(Takifugu rubripes), 효모, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharamoyces cerevisiae) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 또는 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 것들을 포함한다. 유전 물질은 또한 원핵세포 예컨대 박테리아, 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스(staphylococcus) 또는 마이코플라즈마 뉴모니애(mycoplasma pneumoniae); 고세균(archae); 바이러스 예컨대 C형 간염 바이러스 또는 인간 면역결핍 바이러스; 또는 비리오드로부터 수득될 수 있다. 표적 핵산 분자는 상기 유기체의 균질한 배양물 또는 집단으로부터 또는 대안적으로 예를 들어 공동체 또는 생태계에서 여러 상이한 유기체의 집합체로부터 수득될 수 있다. 유전 물질은 천연 공급원에서 수득될 필요가 없으며 대신 알려진 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
생물학적 샘플은 핵산을 포함하고 태깅을 위해 고체 표면 상에 침착될 수 있는 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 정제된 DNA를 포함하여 다양한 정제 상태의 DNA를 포함할 수 있다. 그러나, 샘플은 완전히 정제될 필요는 없으며, 예를 들어 단백질, 다른 핵산 종, 다른 세포 성분 및/또는 기타 오염 물질과 혼합된 DNA를 포함할 수 있다.
생물학적 샘플은 예를 들어 조(crude) 세포 용해물 또는 전체 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에서 고체 지지체에 적용되는 조 세포 용해물은 다른 세포 성분으로부터 핵산을 단리하기 위해 전통적으로 사용되는 하나 이상의 분리 단계를 거칠 필요가 없다. 예시적인 분리 단계는 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989], 및 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al]에 기술되어 있으며, 본원에 인용되어 포함된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 점액, 가래, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 흡인물, 대변 및 침연된 조직 또는 이의 용해물, 또는 DNA를 포함하는 임의의 다른 생물학적 표본을 포함할 수 있다.
표적 핵산 분자를 포함하는 샘플은 표적 핵산 분자를 포함하는 세포 및 세포 용해물뿐만 아니라 게놈 DNA(예를 들어, 인간 게놈 DNA)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산을 포함하는 생물학적 샘플은 세포 용해물, 전체 세포 또는 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE: formalin-fixed paraffin-embedded) 조직 샘플을 포함한다.
E. 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티
일부 실시형태에서, 각각의 트랜스포좀 복합체는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드를 또 다른 제제에 결합시키는 것을 허용하는 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드를 비드에 결합시키는 역할을 한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 비오틴이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 비오틴이고, 비드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이다. 일부 실시형태에서, 비드 결합 모이어티는 비오틴이고, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합을 통해 폴리뉴클레오티드를 비드에 결합시키는 역할을 한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티로서 비오틴의 존재는 비오틴-접합된 트랜스포좀을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합을 통해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 비드에 결합시키는 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합은 하나 이상의 트랜스포좀 복합체를 비드에 고정화하는 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 트랜스포좀 복합체는 비드의 표면에 결합된다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 각각의 트랜스포좀 복합체의 제1 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 각각의 트랜스포좀 복합체의 제2 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합된다.
폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3'에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 제1 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 제2 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합된다.
F. 비드 결합 모이어티
일부 실시형태에서, 비드는 비드 결합 모이어티를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 비드 결합 모이어티는 비드를 다른 제제에 결합시키는 것을 허용하는 임의의 모이어티이다. 다양한 잠재적인 비드 결합 모이어티를 포함하는 비드는 당업계에 잘 알려져 있으며 상업적으로 이용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이다. 일부 실시형태에서, 비드 결합 모이어티는 비오틴이다. 일부 실시형태에서, 비드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 비오틴이다. 일부 실시형태에서, 비드 결합 모이어티는 비오틴이고, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합을 통해 폴리뉴클레오티드를 비드에 결합시키는 역할을 한다.
일부 실시형태에서, 각각의 비드 결합 모이어티는 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는
-C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함한다.
본 방법은 결합을 제조하기 위해 다양한 상이한 클릭 화학을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드 표면은 상이한 결합 화학을 허용하는 방식으로 작용화된다. 일부 실시형태에서, 연결 화학은 알킨 아지드 화학(구리-촉매화된 아지드-알킨 환첨가 화학)이다. 일부 실시형태에서, 연결 화학은 말레이미드 설프히드릴 화학이다.
G. 자기 나노입자
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 자기 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 자기 입자는 폴리에스터 비드의 분류 및/또는 세척에 사용된다. 전술된 임의의 나노입자가 폴리에스터 비드와 함께 자기 나노입자로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 자기 나노입자는 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는
-C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함한다.
일부 실시형태에서, 자기 나노입자는 자기 물질 코어를 포함하는 비드이다. 일부 실시형태에서, 자기 물질 코어는 철, 니켈, 또는 코발트이다. 일부 실시형태에서, 자기 코어는 실리카 쉘로 코팅된다. 일부 실시형태에서, 실리카 쉘은 유기-실란 재료로 작용화를 가능케 한다. 일부 실시형태에서, 자기 나노입자는 50 nm 내지 150 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 자기 나노입자는 100 nm의 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 비드에 포함된 자기 나노입자는 플로우 셀의 다수 표면에 비드를 시딩하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 자기 나노입자는 플로우 셀과 같이, 서열분석 표면의 상부 및 하부 표면에 시딩하는 것을 가능케 한다.
일부 실시형태에서, 플로우 셀의 다수 표면(예를 들어, 상부 및 하부 표면)의 시딩은 플로우 셀의 표면 상에 고정화된 비드를 사용하여 수행될 수 있다. 플로우 셀의 표면을 시딩하기 위해 비드를 사용하면 플로우 셀의 표면에 형성될 공간적으로 분리된 특징을 생성할 수 있다. 보다 구체적으로, 비드에 존재하거나 결합된 폴리뉴클레오티드가 비드에 가장 가까운 표면 위치에서 플로우 셀 표면에 접촉되거나 혼성화되도록 플로우 셀의 다수 표면 상에 비드 층이 형성될 수 있다. 이러한 방식으로 층에서 서로에 대한 비드의 근접성은 플로우 셀 표면에서 혼성화되거나 접촉되는 폴리뉴클레오티드의 근접성을 결정한다. 예를 들어, 구형 비드의 빽빽하게 패킹된 단층의 폴리뉴클레오티드는 플로우 표면(들)의 비드 직경과 동일한 중심 간 간격을 갖는 혼성화된 어레이를 생성한다. 따라서, 비드 형상, 비드 크기 및 비드 패킹 밀도와 같은 비드 층의 특성을 조작하여 플로우 셀 표면에서 원하는 패턴을 수득할 수 있다.
일부 실시형태에서, "약한 부유(mild floating)" 제제, 예를 들어, 1 g/㎤ 초과 내지 2 g/㎤ 미만인 밀도를 갖는 제제 중의 자기 비드를 자기 스트립과 함께 사용하면 자기 비드가 바닥으로 너무 빨리 가라앉는 것을 방지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 그 전체가 본원에 포함된 미국 임시 출원 제63/066,727호에 기술된 바와 같이, 자기 비드의 나머지 절반이 플로우 셀의 바닥 표면으로 가라앉는 동안 비드의 대략 절반은 플로우 셀의 상부 표면에 남아있다.-C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함한다.
H. 고정화된 폴리에스터 비드
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 플로우 셀의 표면에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 플로우 셀의 표면 상의 플로우 셀 결합 모이어티에 대한 비드 결합 모이어티의 결합을 통해 플로우 셀의 표면 상에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 이러한 결합은 공유적이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티와 플로우 셀 결합 모이어티는 동일 유형의 결합 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제1 부분에 결합되고 플로우 셀 결합 모이어티는 동일한 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제2 부분에 결합된다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제1 부분에 결합될 수 있고 플로우 셀 결합 모이어티는 동일한 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제2 부분에 결합될 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘을 포함하는 비드 상의 일부 비드 결합 모이어티는 비오티닐화된 플로우 셀과 결합할 수 있는 반면 동일한 비드 상의 다른 비드 결합 모이어티는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해, 트랜스포좀 복합체의 비오티닐화된 폴리뉴클레오티드에 결합한다. 이러한 방식으로, 라이브러리 서열분석 및 클러스터링 후에, 분해성 폴리에스터 비드는 플로우 셀로부터 방출(예를 들어 과량의 유리 비오틴에 의해) 및 분해될 수 있다.
따라서, 분해성 폴리에스터 비드는 트랜스포좀을 고정화하고 비드의 표면에 태깅을 허용한 다음 비드를 플로우 셀에 근접하게 만드는 트랜스포좀 담체로서 작용할 수 있다. 비드를 플로우 셀에 고정한 후, 라이브러리 단편이 방출되어 플로우 셀 상에 라이브러리 시딩 및 클러스터링을 가능케 할 수 있으며, 폴리에스터 비드는 라이브러리 제조, 클러스터링 및 서열분석(합성에 의한 이러한 서열분석)과 관련된 자동화를 방해하지 않도록 분해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분해된 폴리에스터 비드는 비-분해성 비드에서 발생할 수 있는 튜빙의 막힘을 방지한다.
V. 트랜스포좀 복합체를 포함하는 폴리에스터 비드의 제조
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체를 포함하는 폴리에스터 비드를 제조하는 방법은 폴리에스터 비드에 복수의 트랜스포좀 복합체를 고정화하는 단계를 포함하며, 상기 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 폴리에스터 비드에 복수의 자기 나노입자를 고정화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체를 포함하는 분해성 폴리에스터 비드는 PCL 비드로부터 제조된다. 일부 실시형태에서, PCL 비드는 활성 아미노기의 도입을 통해 작용화된다. 예를 들어, 활성 아민 기는 1,6-헥산디아민 중 10%(w/w) 이소프로판올 용액에서 아미노분해에 의해 비드 표면에 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "작용화된 비드"는 표면에 활성기를 갖는 비드를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 작용화된 비드 상의 활성 아민은 스트렙타비딘-코팅된 비드를 생성하기 위해 스트렙타비딘의 리신 잔기 상의 아민에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용화된 비드 상의 활성 아민은 자기 나노입자-코팅된 비드를 생성하기 위해 글루타르알데히드에 의해 아민-작용화된 자기 나노입자에 접합된다. 일부 실시형태에서, 비드는 스트렙타비딘 및 자기 나노입자 모두로 코팅된다. 도 1a는 PCL 비드를 작용화하는 몇 가지 예시적인 수단을 제공한다.
자기 비드(즉, 자기 나노입자를 포함하는 비드)는 비드 사용 방법 내에서 많은 용도를 갖는다(문헌[Huy et al., Faraday Discussion, 175:73-82 (2014)] 참조). 예를 들어, 세척 단계 중에, 자기 비드는 자기 스탠드를 통해 웰 또는 튜브 내부에 고정될 수 있다. 또한, 위에서 논의한 바와 같이 자기 비드를 사용하여 플로우 셀의 상단 및 하단 표면에 비드를 시딩할 수 있다.
트랜스포좀은 여러 방식으로 작용화된 비드에 조립될 수 있다. 예시적인 방법에서, 비오틴-접합된 트랜스포좀(예컨대 비오티닐화된 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하는 것)은 스트렙타비딘으로 작용화된 PCL 비드 상에 조립될 수 있다(도 1b). PCL 비드는 단일 유형의 트랜스포좀 복합체와 조립될 수 있거나, PCL 비드는 하나 이상의 유형의 트랜스포좀 복합체와 조립될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드를 제조하는 방법은 폴리에스터 비드에 복수의 트랜스포좀 복합체를 고정화하는 단계를 포함하며, 상기 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 폴리에스터 비드에 복수의 자기 나노입자를 고정화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 복수의 트랜스포좀 복합체를 폴리에스터 비드에 고정화하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 복수의 자기 나노입자를 폴리에스터 비드에 고정화하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 복수의 트랜스포좀 복합체 및 복수의 자기 나노입자를 폴리에스터 비드에 고정화하는 단계를 포함한다.
VI. 폴리에스터 비드를 포함하는 플로우 셀
일부 실시형태에서, 플로우 셀은 플로우 셀의 표면에 고정화된 본원에 기술된 폴리에스터 비드를 포함하고, 상기 폴리에스터 비드는 표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함하고, 상기 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하고; 상기 폴리에스터 비드는 50℃ 내지 65℃의 융점을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리에스터 비드는 플로우 셀의 표면 상의 플로우 셀 결합 모이어티에 대한 비드 결합 모이어티의 공유 결합을 통해 플로우 셀의 표면 상에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 비드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 플로우 셀 결합 모이어티는 비오틴이다. 일부 실시형태에서, 비드 결합 모이어티는 비오틴이고, 플로우 셀 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티 및 플로우 셀 결합 모이어티는 동일한 유형의 결합 모이어티이고, 트랜스포좀 복합체는 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제1 부분에 결합되고 플로우 셀 결합 모이어티는 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제2 부분에 결합된다.
일부 실시형태에서, 플로우 셀은 서열분석 플로우 셀이다. 본원에 사용된 바와 같이, "서열분석 플로우 셀"은 하나 이상의 유체 시약이 흐를 수 있고 서열분석 라이브러리의 적응된(adapted) 단편이 수송 및 결합할 수 있는 표면을 포함하는 챔버를 지칭한다. 본 개시내용의 방법에서 용이하게 사용될 수 있는 서열분석 플로우 셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼의 비-제한적 예가 예를 들어 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], 국제 특허 공개 제WO 04/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 국제 특허 공개 제WO 91/06678호; 국제 특허 공개 제WO 07/123744호; 미국 특허 제7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 미국 특허 제7,315,019호; 미국 특허 제7,405,281호, 및 미국 특허 공개 제2008/0108082호에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
서열분석 플로우 셀은 서열분석 라이브러리가 결합하는 표면을 갖는 고체 지지체를 포함한다. 일부 예에서, 표면은 서열분석 라이브러리의 적응된 단편에 결합할 수 있는 포획 뉴클레오티드 론(lawn)을 포함한다. 일부 예에서, 표면은 패턴화된 표면이다. "패턴화된 표면"은 고체 지지체의 노출된 표면 내 또는 노출된 표면 상의 상이한 영역(예컨대 증폭 부위)의 배열(예컨대 어레이)을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 영역은 하나 이상의 증폭 및/또는 포획 프라이머가 존재하는 피처(feature)일 수 있다. 피처는 프라이머가 존재하지 않는 틈새(interstitial) 영역에 의해 분리될 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 행과 열에 있는 피처의 x-y 형식일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 피처 및/또는 틈새 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 피처 및/또는 틈새 영역의 무작위 배열일 수 있다. 일부 예에서, 표면은 서열분석 라이브러리의 적응된 단편에 결합하는 포획 및/또는 증폭 뉴클레오티드가 있는 웰 어레이를 포함하는 패턴화된 표면이며, 웰 사이에는 포획 및/또는 증폭 뉴클레오티드가 결여된 틈새 영역이 있다.
패턴화된 표면의 피처는 유리, 실리콘, 플라스틱 또는 패턴화된, 공유적으로-연결된 겔이 있는 다른 적합한 고체 지지체 예컨대 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드)(PAZAM, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2013/184796호, 국제 특허 공개 제WO 2016/066586호, 및 국제 특허 공개 제WO 2015/002813호, 이들 각각은 그 전체가 인용되어 본원에 포함됨)의 웰(예컨대, 마이크로웰 또는 나노웰) 어레이의 웰일 수 있다. 이러한 공정은 많은 수의 주기로 실행되는 서열분석 실행에서 안정적일 수 있는 서열분석에 사용되는 겔 패드를 생성한다. 웰에 대한 중합체의 공유 결합은 다양한 사용 중에 구조화된 기판의 수명 동안 구조화된 피처에서 겔을 유지하는데 도움이 된다. 그러나, 많은 예에서 겔은 웰에 공유 결합될 필요가 없다. 예를 들어, 일부 조건에서 표면의 웰에 공유 부착되지 않은 실란이 없는 아크릴아미드(SFA: silane free acrylamide, 예를 들어 미국 특허 제8,563,477호 참조)는 겔 재료로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있는 패턴화된 표면을 갖는 플로우 셀의 예는 미국 특허 제8,778,848호, 제8,778,849호 및 제9,079,148호, 및 미국 특허 공개 제2014/0243224호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
패턴화된 표면의 피처는 예를 들어, 예를 들어, 적어도 10(예를 들어 적어도 100, 적어도 500, 적어도, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 5,000,000, 또는 그 이상) 피처/㎠를 포함하는 임의의 다양한 밀도를 가질 수 있다.
일부 예에서, 플로우 셀 장치는 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 110 μm, 120 μm, 130 μm, 140 μm, 또는 150 μm, 또는 전술한 값 중 임의의 두 값으로 정의되는 범위 내의 양의 채널 높이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 고체 지지체는 플로우 셀의 적어도 일부를 형성하거나 플로우 셀에 위치한다.
본원에서 용어 "고체 표면", "고체 지지체" 및 기타 문법적 등가물은 예를 들어, 트랜스포좀 복합체를 포함하는 핵산 라이브러리 제조를 위한 재료를 포함하여, 핵산 처리를 위한 재료의 부착에 적합하거나 적합하도록 변형될 수 있는 임의의 재료를 지칭한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 가능한 고체 지지체 재료의 수는 매우 많다. 가능한 재료는 비제한적으로 유리 및 변형된 또는 작용화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 기타 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, Teflon™ 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 세라믹, 수지, 실리카 또는 실리콘 및 변성 실리콘을 포함하는 실리카-기반 재료, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광섬유 번들 및 기타 다양한 중합체를 포함한다. 일부 예에서 특히 유용한 고체 지지체 및 고체 표면은 플로우 셀 장치 내에 위치한다.
일부 예에서, 고체 지지체는 유리, 용융 실리카 또는 기타 실리카-함유 재료와 같은 실리카-기반 기판을 포함한다. 일부 예에서, 실리카-기반 기판은 또한 실리콘, 이산화규소, 질화규소 또는 수소화규소일 수 있다. 일부 예에서, 고체 지지체는 플라스틱 재료 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스터, 폴리카보네이트, 사이클릭 올레핀 중합체 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 일부 예에서, 고체 지지체는 실리카-기반 재료 또는 플라스틱 재료이다. 일부 예에서, 고체 지지체는 유리를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다.
일부 예에서, 고체 지지체는 금속일 수 있거나 금속을 함유할 수 있다. 일부 이러한 예에서, 금속은 금이다. 일부 예에서, 고체 지지체는 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 한 예에서, 고체 지지체는 탄탈륨 산화물 또는 주석 산화물을 포함한다.
아크릴아미드, 에논 또는 아크릴레이트가 또한 고체 지지체 재료로서 사용될 수 있다. 다른 고체 지지체 재료는 비제한적으로 갈륨 비소, 인듐 인화물, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 예시하기 위한 것이지만 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 고체 지지체 및/또는 고체 표면은 석영일 수 있다. 일부 예에서, 고체 지지체 및/또는 고체 표면은 GaAs 또는 인듐 주석 산화물(ITO)과 같은 반도체일 수 있다.
고체 지지체는 단일 재료 또는 복수의 상이한 재료를 포함할 수 있다. 고체 지지체는 복합재 또는 라미네이트일 수 있다. 고체 지지체는 평평하고 둥글며 질감이 있고 패턴화될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 인용되어 포함된 미국 특허 제8,778,849호에 기술된 바와 같이, 패턴은 비-금속 표면 상에 피처를 형성하는 금속 패드에 의해 형성될 수 있다. 다른 유용한 패턴화된 표면은 예를 들어, 각각이 그 전체가 인용되어 본원에 포함된 미국 특허 공개 제2014/0243224 A1호, 미국 특허 공개 제2011/0172118 A1호 또는 미국 특허 제7,622,294호에 기술된 바와 같이, 표면 상에 형성된 웰 피처를 갖는 것이다. 패턴화된 표면을 사용하는 예를 들어, 겔은 패턴 피처와 연관되거나 그 위에 침착될 수 있거나 대안적으로 겔은 패턴 피처 및 틈새 영역 모두에 걸쳐 균일하게 침착될 수 있다.
일부 예에서, 고체 지지체는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 고체 지지체의 노출된 층 내 또는 노출된 층 상의 상이한 영역의 배열을 지칭한다. 일부 예에서, 패턴은 행과 열에 있는 피처의 x-y 형식일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 피처 및/또는 틈새 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 피처 및/또는 틈새 영역의 무작위 배열일 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면은 미국 특허 출원 제13/661,524호 또는 미국 특허 공개 제2012/0316086 A1호에 기술된 것들이며, 상기 특허 각각은 인용되어 본원에 포함된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면은 미국 특허 출원 제13/661,524호 또는 미국 특허 공개 제2012/0316086 A1호에 기술된 것들이며, 상기 특허 각각은 인용되어 본원에 포함된다.
일부 예에서, 고체 지지체는 표면의 웰 또는 오목부의 어레이를 포함한다. 이는 비제한적으로 포토리소그래피, 스탬핑 기술, 몰딩 기술 및 마이크로에칭 기술을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 사용되는 기술은 어레이 기판의 조성 및 형상에 따라 달라질 것이다. 일부 예에서, 웰 또는 오복부의 어레이는 직경이 10 μm 내지 50 μm, 예컨대 직경이 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 또는 50 μm이거나, 전술된 값의 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 이내의 직경이다. 일부 예에서, 웰 또는 오복부는 깊이(depth)가 0.5 μm 내지 1 μm, 예컨대 깊이가 0.5 μm, 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm, 또는 1 μm이거나, 전술된 값의 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 이내의 깊이를 갖는다. 일부 예에서, 웰 또는 오목부는 소수성 재료로 제조된다. 일부 예에서, 소수성 재료는 예를 들어 CYTOP, Fluoropel® 플루오로아크릴 공중합체용액, 또는 Teflon® 플루오로중합체를 비롯하여, 비정형 플루오로중합체를 포함한다. 예를 들어, 국제 출원 제PCT/US2017/033169호를 참조하며, 이는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
VII. 분해성 비드를 사용하는 핵산 라이브러리의 제조 방법
본원에 기술된 폴리에스터 비드는 핵산 라이브러리 제조 방법에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산으로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 방법은 표적 핵산을 폴리에스터 비드 또는 본원에 기술된 플로우 셀과 접촉하는 단계를 포함하며, 이로써 표적 핵산은 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되고 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 트랜스포존 말단 서열은 단편의 적어도 하나의 가닥의 5' 말단으로 전달되어, 적어도 하나의 가닥이 태그로 5'-태깅된 단편의 고정화된 라이브러리를 생성한다.
베드에 태그의 고정화된 라이브러리를 제조한 후, 이러한 방법은 플로우 셀에 비드를 고정시키는 단계, 라이브러리 단편을 방출(즉, 라이브러리 시딩) 및 플로우 셀에 라이브러리 단편을 클러스터링하는 단계, 소비된 비드를 방출하는 단계, 및 소비된 비드를 분해하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 비드-기반 라이브러리의 제조 및 비드를 트랜스포좀 담체로서 사용하는 플로우 셀 상에 라이브러리의 고정화를 가능하게 할 수 있으며, 그 후에 비드가 방출되고 분해된다. 이러한 방식으로, 비드는 서열분석과 같은 다운스트림 방법에 영향을 주지 않고 트랜스포좀 담체 역할을 한다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 실시형태는 임의의 하나 이상의 분해성 폴리에스터 비드를 함유하고, 세포 용해, 핵산 증폭 및 서열분석을 위한 시약, 또는 리소자임, 프로티네이즈 K, 무작위 육량체, 폴리머라제(예를 들어, Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액, 또는 본원에 기술된 바와 같은 2가 양이온, 및 각각의 유전 물질의 처리에 사용되는 것들을 비롯한 핵산 라이브러리 제조를 위한 시약을 비롯하여, 유전 물질의 처리에 유용한 구성성분을 추가로 포함하는, 키트를 포함한다.
A. 비드 상에서 라이브러리 단편의 제조
핵산을 클러스터 형성 및 서열분석을 위해 준비된 용액에서 어댑터-변형된 주형으로 변환하는데 수반되는 단계의 수는 트랜스포사제 매개 단편화 및 태깅의 사용에 의해 감소될 수 있거나, 일부 경우에는 최소화될 수 있다. 본원에서 "태깅"으로 지칭되는 이러한 공정은 트랜스포존 말단 서열 및 하나 이상의 태그를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 복합된 트랜스포사제 효소를 포함하는 트랜스포좀 복합체에 의한 핵산의 변형을 수반한다. 태깅은 단일 단계에서 핵산 분자 및 단편의 5' 및 3' 말단에 어댑터를 결찰시키기 위한 트랜스포좀 복합체에 의한 핵산 분자의 변형을 포함할 수 있다. 태깅은 DNA의 동시 단편화와 듀플렉스 단편의 두 가닥 모두의 5' 말단에 대한 태그 결찰을 초래할 수 있다. 태깅 반응은 서열분석 라이브러리 제조에 사용될 수 있다. 태깅 반응은 무작위 단편화와 어댑터 결찰을 단일 단계로 결합하여 서열분석 라이브러리 제조 공정의 효율성을 높인다. 한 예에서, 트랜스포사제 효소를 제거하기 위한 정제 단계 후에, 추가 서열이 PCR에 의해 적응된 단편의 말단에 추가된다. 일부 경우에, 용액-기반 태깅은 단점이 있으며 여러 노동 집약적 단계가 필요할 수 있다. 또한 바이어스는 PCR 증폭 단계 중에 도입될 수 있다.
본원에 제시된 장치, 시스템 및 방법은 이러한 단점을 극복하고 편향되지 않은 시료 제조, 클러스터 형성 및 서열분석이 샘플 조작 또는 전달에 대한 최소한의 요구사항으로 단일 고체 지지체에서 발생하도록 허용하고, 또한 고체 지지체 상에서 별개의 유전 물질의 서열분석을 가능케 한다. 일부 실시형태에서, 서열분석 라이브러리의 공간 인덱싱은 (예를 들어, 바코딩 단계에 대한 필요성을 줄이거나 제거함으로써) 서열분석 라이브러리가 생성되는 유전 물질(예를 들어, 표적 핵산 분자)의 단순화된 공정 및 서열 재구성을 허용한다. 본원에 기술된 구현은 또한 표적 핵산 분자의 서열분석을 위한 데이터 해상도를 증가시키고, 게놈(예를 들어, 새로운 유기체에 대한)의 조립을 더욱 단순화하고, 표적 핵산 분자에서 희귀 유전적 변이 및 돌연변이의 동시 발생에 대한 개선된 식별을 제공한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리 단편은 트랜스포사제(BLT 상의 고정화된 트랜스포좀 복합체에 포함되거나 담체 비드 상에 고정화된 나노입자 상에 포함되어 있음)와 단편의 결합으로 인해 비드 상에 유지된다. 일부 실시형태에서, 단편은 트랜스포사제로부터 단편을 방출하기 위해 프로테아제 또는 SDS가 첨가될 때까지 또는 비드가 용융될 때까지 비드 상에 고정화된 채로 남아 있다. 일부 실시형태에서, 고정화된 라이브러리 단편을 갖는 비드(예를 들어 태깅 후)는 서열분석을 위해 고체 지지체(예를 들어 플로우 셀)에 전달되고, 그 다음 라이브러리가 비드로부터 방출되고 고체 지지체 상에 포획된다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 비드에 고정화되고, 서열분석을 위해 고체 지지체로 전달되고, 태깅이 수행되고, 그 다음 라이브러리가 비드로부터 방출되어 고체 지지체 상에 포획된다. 비드에서 라이브러리 단편을 방출한 후 플로우 셀에서 포획하면 온-플로우 셀 공간 판독이 가능하며, 여기에서 단일 비드의 단편은 서로 매우 근접하게 방출될 것이다. 이러한 방식으로, 플로우 셀에서 매우 공간적으로 근접한 단편은 동일한 비드에서 제조된 핵산에서 유래했을 가능성이 높은 것으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 "비드 코드" 또는 기타 바코드를 단편에 통합할 필요 없이 주어진 비드에서 제조된 단편을 다른 비드에서 제조된 단편과 분리하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 라이브러리 단편은 비드 코드 또는 기타 바코드를 통합하기 위해 태깅에 의해 제조될 수 있으며, 공간 정보를 기반으로 비드 정보를 획득하는 능력은 임의 유형의 바코드 사용을 배제하지 않는다.
일부 실시형태에서, 서열분석 라이브러리를 제조하는 단계는 분해성 폴리에스터 비드에 결합된 표적 핵산 분자에 대한 태깅 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 서열분석 라이브러리는 하나 이상의 표적 핵산 분자의 핵산 단편 집합, 또는 단편의 앰플리콘을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열분석 라이브러리의 핵산 단편은 3' 및 5' 말단에서 공지된 범용 서열(예컨대 P5 및 P7 서열)에 연결된다. 일부 실시형태에서, 서열분석 라이브러리는 본원에 기술된 분해성 폴리에스터 비드 상에 고정화된 하나 이상의 표적 핵산 분자로부터 제조된다.
적응된 단편(즉, 서열분석 라이브러리에 포함된 단편)은 후속 시딩 및 서열분석 단계를 위한 임의의 적절한 크기일 수 있다. 일부 예에서, 적응된 단편은 길이가 150 내지 400개의 뉴클레오티드, 예컨대 150 내지 300개의 뉴클레오티드이다.
예를 들어, 태깅 반응은 비드가 서열분석 플로우 셀에 포획될 때 또는 비드를 서열분석 플로우 셀에 로딩하기 전에 수행될 수 있다. 일부 예에서, 태깅 반응은 하나 이상의 어댑터 서열을 포함하는 태그를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스포좀과 표적 핵산 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열분석 라이브러리는 적어도 150개 뉴클레오티드 길이의 DNA 또는 RNA 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단편의 갭-필링(gap-filling) 및 결찰은 폴리머라제 및 리가제를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 단편의 갭-필링 및 결찰은 플로우 셀에 비드를 고정하기 전 또는 후에 수행된다.
B. 비드 고정화
일부 실시형태에서, 방법은 단편의 고정화된 라이브러리를 포함하는 비드를 플로우 셀의 표면에 고정화하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 고정화된 라이브러리 단편이 비드 상에 제조된 후에 플로우 셀의 표면에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 비드는 플로우 셀의 표면 상의 플로우 셀 결합 모이어티에 대한 비드 결합 모이어티의 결합을 통해 플로우 셀의 표면에 고정화된다.
C. 라이브러리 단편의 방출 및 포획
일부 실시형태에서, 방법은 고정화된 비드로부터 라이브러리 단편을 방출하여 소비된 비드를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 포획된 단편을 생산하기 위해 플로우 셀 표면 상에 방출된 단편을 포획하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "소비된 비드"는 표적 핵산이 단편화되고 이어서 고정화된 비드로부터 방출된 후의 비드를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 분해성 폴리에스터 비드는 고상(solid-phase) 담체로서 기능할 수 있으며, 여기서 표적 핵산 또는 라이브러리 단편은 비드에 고정화되고 비드는 플로우 셀로 전달된다. 국제 특허 공개 제WO 2015/095226호는 고상 담체로서 비드의 용도를 기술하고 있으며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 비드 상에 고정화되고(예를 들어, 비드 표면 상의 트랜스포좀 복합체에 결합하는 이중-가닥 DNA에 의해), 라이브러리 단편이 비드 상에 생성되고(예를 들어, 태깅에 의해), 비드는 플로우 셀로 전달되고, 라이브러리 단편이 방출되어 플로우 셀에 포획된다. 대안적으로, 표적 핵산은 비드에 고정화될 수 있고, 비드는 플로우 셀로 전달되고, 라이브러리 단편은 비드에서 생성되고, 라이브러리 단편은 방출되어 플로우 셀에서 포획된다.
일부 실시형태에서, 비드가 플로우 셀로부터 방출되기 전에 비드로부터 단편이 방출된다. 일부 실시형태에서, 고정화된 라이브러리 단편은 비드 상에 생성되고(상기 단편은 비드가 플로우 셀 상에 고정화되기 전 또는 후에 생성됨), 단편은 비드로부터 방출되고, 단편은 플로우 셀 상에 포획되고, 이어서 비드는 플로우 셀에서 방출되어 분해된다. 일부 실시형태에서, 라이브러리 단편을 방출하기 위해 세제 또는 계면활성제가 사용된다. 일부 실시형태에서, SDS는 라이브러리 단편을 방출하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 비드 정제는 트랜스포사제를 제거하고 라이브러리 단편을 방출한다. 일부 실시형태에서, 비드의 용융은 라이브러리 단편을 방출하고, 이는 이후 플로우 셀에 의해 포획된다.
일부 실시형태에서, 방출된 라이브러리 단편을 포획하는 단계는 방출된 단편을 혼성화하여 플로우 셀의 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 포획하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방출 후, 서열분석 라이브러리는 플로우 셀의 표면으로 운반되며, 여기서 라이브러리가 포획된다. 그런 다음, 단일 비드의 서열분석 라이브러리 단편으로 플로우 셀에 시딩이 플로우 셀에 결합된 비드와 매우 근접하게 발생한다. 시딩은 각 비드의 플로우 셀에 있는 풋프린트(footprint)에 매우 근접하게 발생하기 때문에, 각 비드에서 시딩된 서열분석 라이브러리는 비드의 위치에 따라 플로우 셀에서 공간적으로 분리(또는 "인덱싱")된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포획"은 관심 표면(예컨대 플로우 셀 표면)에 표적 실체(예컨대 폴리에스터 비드)의 고정화를 지칭한다. 포획 부위는 표적 핵산 분자의 하나 이상의 비드 또는 적응된 단편이 포획될 수 있는 서열분석 플로우 셀 표면의 부위이다. 본원에서 사용된 바와 같이 "포획 올리고뉴클레오티드"는 라이브러리 단편의 적어도 일부에 상보적인 핵산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 프라이머 서열을 포함하고 "포획 프라이머"로 지칭될 수 있다.
일부 예에서, 서열분석 라이브러리는 서열분석 라이브러리의 적응된 단편과 플로우 셀 상의 포획 올리고뉴클레오티드의 상호작용에 의해 플로우 셀 상에 포획된다.
일부 예에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열분석 플로우 셀에 위치한 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이며 서열분석 라이브러리의 적응된 단편(즉, 태깅에 의해 생성된 단편)에 위치한 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 결합한다. 예를 들어, 플로우 셀은 특정 결합 쌍의 첫 번째 구성원으로 작용화될 수 있으며 적응된 단편의 어댑터는 특정 결합 쌍의 두 번째 구성원을 함유한다.
일부 예에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 서열분석 플로우 셀의 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드는 패턴화된 플로우 셀 표면의 웰에 부착될 수 있다. 부착은 비드, 입자 또는 겔과 같은 중간 구조를 통해 이루어질 수 있다. 겔을 통한 서열분석 플로우 셀의 표면에 대한 포획 올리고뉴클레오티드의 부착은 Illumina Inc.(San Diego, CA)로부터 시판되거나 국제 특허 공개 제WO 2008/093098호에 기술된 플로우 셀에 의해 예시되며, 상기 특허는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
일부 실시형태에서, 패턴화된 플로우 셀은 웰(예를 들어 마이크로웰 또는 나노웰)로 고체 지지체 재료를 패턴화하고, 패턴화된 지지체를 겔 재료(예컨대 PAZAM, SFA 또는 이들의 화학적으로 변형된 변이체, 예컨대 SFA의 아지돌화된 버전(아지도-SFA))로 코팅하고 예를 들어 화학적 또는 기계적 연마를 통해 겔 코팅된 지지체를 연마하여, 웰에 겔을 유지하지만 웰 사이의 구조화된 기판의 표면 상의 틈새 영역으로부터 실질적으로 모든 겔을 제거 또는 비활성화함으로써 제조된 서열분석 라이브러리와의 결합을 위한 표면을 함유한다. 포획 올리고뉴클레오티드는 서열분석 라이브러리의 포획 및 증폭을 위해 겔 물질에 부착될 수 있다. 서열분석 라이브러리는 라이브러리의 개별 적응 단편이 겔 재료에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개별 웰에 시딩하도록 패턴화된 표면으로 운반될 수 있다; 그러나 적응된 단편은 겔 물질의 부재 또는 비활성으로 인해 웰 사이의 틈새 영역을 차지하지 않는다. 적응된 단편의 증폭은 웰 사이의 틈새 영역에서 겔의 부재 또는 비활성이 성장하는 핵산 콜로니의 외부 이동을 방지하기 때문에 웰에 국한될 것이다. 이러한 공정은 확장가능하고 기존의 마이크로 또는 나노 제조 방법을 활용하여 편리하게 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 범용 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 범용 뉴클레오티드 서열은 분자가 또한 서로 상이한 서열 영역을 갖는 2개 이상의 핵산 분자에 공통인 서열 영역을 지칭한다. 분자 집합체의 상이한 구성원에 존재하는 범용 서열은 범용 포획 핵산 집단, 예를 들어 범용 서열의 일부, 예를 들어 범용 포획 서열에 상보적인 포획 올리고뉴클레오티드를 사용하여 다수의 상이한 핵산을 포획할 수 있게 한다. 범용 포획 서열의 비-제한적 예는 P5 및 P7 프라이머와 동일하거나 상보적인 서열을 포함한다. 유사하게, 분자 집합체의 상이한 구성원에 존재하는 범용 서열은 범용 서열의 일부, 예를 들어, 범용 앵커 서열에 상보적인 범용 프라이머 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산의 증폭 또는 복제(예컨대, 서열분석)를 가능케 할 수 있다. 따라서 포획 올리고뉴클레오티드 또는 범용 프라이머는 범용 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 혼성화하는 2개의 범용 서열은 범용 결합 쌍이라고 지칭된다. 예를 들어, 혼성화하는 포획 올리고뉴클레오티드 및 범용 포획 서열은 범용 결합 쌍이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 서열분석 라이브러리 시딩은 서열분석 플로우 셀과 같은 고체 지지체 상에 표적 핵산 분자의 적응된 단편의 고정화를 지칭한다.
D. 단편 증폭
일부 실시형태에서, 방법은 비드로부터 단편을 증폭시키는 단계를 포함한다.
일부 예에서, 시딩된 서열분석 라이브러리는 서열분석 전에 증폭될 수 있다. 예를 들어, 시딩된 서열분석 라이브러리는 어댑터 서열의 프라이머 부위를 사용하여 증폭될 수 있으며, 이어서 하나 이상의 태그의 어댑터 서열의 서열분석 프라이머 부위를 사용하여 서열분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 분자는 게놈 DNA이고 증폭은 전체-게놈 증폭을 수반한다.
일부 실시형태에서, 방법은 플로우 셀 표면에서 포획된 단편을 증폭하여 고정화된, 증폭된 단편을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획된 단편을 증폭하는 단계는 단편의 클러스터를 생성하기 위한 브리지 증폭을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "증폭"은 핵산 분자의 적어도 일부가 복제되거나 적어도 하나의 추가 핵산 분자로 복사되는 작용 또는 공정을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 증폭은 등온 조건을 사용하여 수행될 수 있다; 다른 예에서, 이러한 증폭은 열순환을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 증폭은 단일 증폭 반응에서 복수의 표적 서열의 동시 증폭을 포함하는 다중 증폭이다. 증폭 반응의 비-제한적 예는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭 반응(SDA: strand displacement amplification reaction), 롤링 서클 증폭 반응(RCA: rolling circle amplification reaction), 다수 어닐링 및 루핑 기반 증폭 사이클(MALBAC: multiple annealing and looping based amplification cycles), 전사-매개 증폭(TMA: transcription-mediated amplification) 방법 예컨대 NASBA, 루프 매개 증폭 방법(예를 들어, 루프-형성 서열을 사용하는 "LAMP" 증폭)을 포함한다. 증폭되는 핵산 분자는 DNA 또는 리보핵산(RNA)을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로부터 유도된 DNA 또는 변형된 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 DNA와 RNA의 혼합물일 수 있다. 출발 핵산이 DNA, RNA 또는 둘 모두인지 여부에 관계없이 핵산 분자 또는 분자(예를 들어 "증폭 산물" 또는 "앰플리콘")의 증폭 결과 산물은 DNA 또는 RNA이거나 DNA와 RNA 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있거나, 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "복사본"은 반드시 표적 서열에 대한 완벽한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 복사본은 데옥시이노신 또는 데옥시우리딘과 같은 뉴클레오티드 유사체, 의도적인 서열 변경(예컨대 표적 서열에 혼성화할 수 있지만 상보적이지 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경) 및/또는 증폭하는 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
몇몇 예는 고상 증폭을 포함하며, 이는 증폭된 산물의 전부 또는 일부가 형성될 때 고체 지지체 상에 고정화되도록 고체 지지체 상에서 또는 이와 관련하여 수행되는 증폭 반응이다. 고상 증폭의 비-제한적인 예는 고상 폴리머라제 연쇄 반응(고상 PCR) 및 고상 등온 증폭을 포함하며, 이는 순방향 및 역방향 증폭 프라이머 중 하나 또는 둘 모두가 고체 지지체 상에 고정화되는 것을 제외하고는, 표준 용액상 증폭과 유사한 반응이다.
추가 예에서, 증폭은 비제한적으로 PCR, SDA, TMA, 및 미국 특허 제8,003,354호에 기술된 바와 같은 핵산 서열-기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence-based 증폭)을 포함할 수 있으며, 상기 특허는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다. 상기 증폭 방법은 하나 이상의 관심 핵산을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중 PCR, SDA, TMA, NASBA 등을 포함하는 PCR을 이용하여 캡슐화된 핵산을 증폭할 수 있다. 일부 예에서, 관심 있는 핵산에 특이적으로 지시된 프라이머가 증폭 반응에 포함된다.
일부 예에서, 증폭 방법은 결찰 프로브 증폭 또는 관심 핵산에 특이적으로 지시된 프라이머를 함유하는 올리고뉴클레오티드 결찰 분석(OLA: oligonucleotide ligation assay) 반응을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 지시된 프라이머를 함유하는 프라이머 연장-결찰 반응을 포함할 수 있다. 관심 핵산을 증폭하기 위해 특이적으로 설계될 수 있는 프라이머 연장 및 결찰 프라이머의 비-제한적인 예로서, 증폭은 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호에 의해 예시되는 바와 같은 GoldenGate 분석법(Illumina, Inc., San Diego, Calif.)에 대해 사용된 프라이머를 포함할 수 있으며, 상기 특허 각각은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
본 개시내용에서 유용한 또 다른 핵산 증폭 방법은 예를 들어 문헌[Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5): 1321-2 (1993)]에 기술된 바와 같이 불변 5' 영역 이후 무작위 3' 영역을 갖는 2-도메인 프라이머 집단을 사용하하는 태깅 PCR이며, 상기 문헌은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다. 증폭의 첫 번째 라운드는 무작위로 합성된 3' 영역의 개별 혼성화를 기반으로 열 변성 DNA에서 다중의 개시를 허용하도록 수행된다. 3' 영역의 특성으로 인해, 개시 부위는 게놈 전체에 걸쳐 무작위인 것으로 간주된다. 그 후, 결합되지 않은 프라이머가 제거되고 불변 5' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 추가 복제가 발행할 수 있다.
일부 예에서, 시딩된 서열분석 라이브러리는 고상 증폭에 의해 증폭된다. 고상 증폭을 위한 프라이머(예컨대 포획 프라이머)는 프라이머의 5' 말단 또는 그 근처에서 고체 지지체에 대한 단일 점 공유 부착에 의해 고정화될 수 있으며, 프라이머의 주형-특이적 부분은 동족 주형에 어닐링할 수 있도록 하고 3' 히드록실기는 프라이머 확장을 위해 자유롭게 남겨진다. 임의의 적합한 공유 부착 수단이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 선택한 부착 화학은 고체 지지체의 특성과 이에 적용된 유도체화 또는 작용화에 따라 달라진다. 프라이머 자체는 부착을 용이하게 하기 위해 비-뉴클레오티드 화학적 변형일 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 프라이머는 5' 말단에 포스포로티오에이트 또는 티오포스페이트와 같은 황-함유 친핵체를 포함할 수 있다. 고체-지지된 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 경우, 이 친핵체는 하이드로겔에 존재하는 브로모아세트아미드기에 결합한다. 프라이머 및 주형을 고체 지지체에 부착하는 보다 구체적인 수단은 국제 특허 공개 WO 05/065814호에 기술된 바와 같이 중합된 아크릴아미드 및 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드(BRAPA)로 구성된 하이드로겔에 대한 5' 포스포로티오에이트 부착을 통한 것이며, 상기 특허는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
본 개시내용은 단 하나의 증폭 프라이머가 고정화되는(다른 프라이머는 일반적으로 유리 용액에 존재함) 고상 증폭 방법을 포함하지만, 일부 예에서, 고정화된 정방향 및 역방향 프라이머 모두와 함께 고체 지지체가 제공될 수 있다. 실제로, 증폭 과정은 증폭을 유지하기 위해 과량의 프라이머를 사용하기 때문에, 고체 지지체에 고정화된 '복수'의 동일한 정방향 프라이머 및/또는 '다수'의 동일한 역방향 프라이머가 있을 것이다. 정방향 및 역방향 프라이머에 대한 본원의 언급은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 이러한 프라이머의 '복수'를 포함하는 것으로 그에 따라 해석되어야 한다.
서열분석 플로우 셀의 표면은 플로우 셀에 시딩된 서열분석 라이브러리로부터 앰플리콘을 생성하는데 사용되는 복수의 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 프라이머는 각각의 표적 핵산에 결찰된 어댑터 서열에 존재하는 범용 서열에 상보적인 범용 프라이밍 서열을 가질 수 있다. 특정 예에서, 복수의 프라이머가 증폭 부위에 부착될 수 있다. 프라이머는 포획 핵산을 위해 상기 기재된 바와 같이 증폭 부위에 부착될 수 있다.
일부 예에서, 시딩된 서열분석 라이브러리는 미국특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 개시내용에 의해 예시된 클러스터 증폭 방법론을 사용하여 증폭될 수 있으며, 상기 특허의 각각의 내용은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다. 미국특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 혼입된 물질은 고정화된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위해 증폭 산물이 고체 지지체에 고정화되도록 하는 핵산 증폭 방법을 기술한다. 이러한 어레이 상의 각각의 클러스터 또는 콜로니는 다수의 동일하거나 실질적으로 동일한 고정화된 폴리뉴클레오티드 가닥 및 복수의 동일한 고정화된 상보적 폴리뉴클레오티드 가닥으로부터 형성된다. 그렇게 형성된 어레이는 본원에서 일반적으로 "클러스터 어레이"로 지칭된다. 미국특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 기술된 것과 같은 고상 증폭 반응의 생성물은 고정화된 폴리뉴클레오티드 가닥 및 고정화된 상보적 가닥 쌍의 어닐링에 의해 형성된 소위 "가교" 구조이며, 두 가닥 모두 5' 말단에서 고체 지지체 상에 일부 경우에 공유 부착을 통해 고정화된다. 클러스터 증폭 방법론은 고정화된 앰플리콘을 생산하기 위해 고정화된 핵산 주형이 사용되는 방법의 예이다.
후속 서열분석 반응에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 콜로니 또는 클러스터에 소량의 오염이 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 특정 적용을 위해 개별 증폭 부위에서 허용될 수 있는 오염 수준의 예는 비제한적으로 최대 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 25% 오염 앰플리콘을 포함한다.
본원에 제공된 방법에 따라 생성된 고정된 DNA 단편으로부터 고정된 앰플리콘을 생성하기 위해 다른 적합한 방법론이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 각 쌍의 증폭 프라이머 중 하나 또는 둘 다의 프라이머가 고정화되어 있는지 여부에 관계없이 하나 이상의 클러스터 또는 콜로니가 고상 PCR을 통해 형성될 수 있다. 일부 예에서, 캡슐화된 핵산은 비드 내에서 증폭된 다음, 어레이 또는 클러스터의 고체 지지체에 증착된다.
E. 비드 방출
일부 실시형태에서, 방법은 용액-상 소비된 비드를 제공하기 위해 소비된 비드를 과량의 용액-상 플로우 셀 결합 모이어티로 처리함으로써 플로우 셀 표면으로부터 소비된 비드를 분리하는 단계를 포함한다. 유리 비오틴은 비드 표면의 스트렙타비딘에 대한 결합을 완료할 수 있으며 비오틴이 결합된 플로우 셀에서 비드를 방출할 수 있다.
F. 비드 분해
일부 실시형태에서, 방법은 분해제로 용액-상 소비된 비드를 분해하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 플로우 셀로부터 분해된 비드를 제거하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "분해된 비드"는 (예를 들어 50℃ 초과의 온도에서 해중합에 의해) 분해된 비드를 지칭한다. 일반적으로, 분해된 비드는 라이브러리 단편이 방출된 후 분해된 소비된 비드일 수 있다.
본 방법은 모든 비드가 분해되기 전에 라이브러리 단편을 방출할 것을 요구하지 않는데, 그 이유는 라이브러리 생성물의 일부 손실이 허용될 수 있기 때문이다. 일부 실시형태에서, 대부분의 비드는 비드가 분해되기 전에 고정화된 라이브러리 단편을 방출한다. 일부 실시형태에서, 비드가 분해되기 전에 비드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%가 소비되었다(즉, 라이브러리 단편은 방출됨).
일부 실시형태에서, 분해된 비드로부터의 폴리에스터는 반응 완충액과 혼합되고 플로우 셀로부터 제거된다. 일부 실시형태에서, 분해된 폴리에스터는 튜빙을 통한 완충액 흐름을 방해하지 않고 튜빙을 통해 플로우 셀을 빠져나간다. 일부 실시형태에서, 분해된 폴리에스터와 완충액의 혼합은 완충액 용액에서 비교적 균일한 폴리에스터 밀도를 야기하여, 이러한 밀도가 튜빙을 통한 완충액 흐름을 방해하지 않는다.
일부 실시형태에서, 비드의 분해는 비드 응집의 가능성을 감소시키며, 여기서 비드 응집은 비드가 서로 결합되거나 무작위로 매우 근접한 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 비드 응집을 감소시키는 것은 또한 비드에 의한 튜빙 또는 플로우 셀의 막힘을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 분해되지 않은 비드는 완충액보다 더 높은 밀도로 인해 튜빙 또는 플로우 셀에서 침전될 수 있는 반면, 분해된 비드로부터의 폴리에스터는 침전되지 않는다(분해된 비드로부터의 폴리에스터는 완충액 내에서 상대적으로 균일한 밀도에 있기 때문임).
또한, 본 방법은 모든 비드가 이러한 방법에 의해 분해될 것을 요구하지 않는다. 비교적 적은 분획의 비드가 다운스트림 공정에 영향을 미치고/미치거거나 용액 변경 중에 막힘 위험을 증가시키지 않을 것이다. 즉, 트랜스포좀 담체로서 사용되는 비드의 일부를 분해하는 것은 전혀 분해되지 않는 비드를 사용하는 방법에 비해 본 방법을 개선한다. 일부 실시예에서, 대부분의 비드가 분해된다. 일부 실시형태에서, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%의 비드가 분해제로 분해된다.
일부 실시형태에서, 분해제는 50℃ 내지 65℃의 온도이다. 일부 실시형태에서, 분해제는 50℃ 초과, 60℃ 초과, 또는 65℃ 초과의 온도이다. 일부 실시형태에서, 분해제는 60℃의 온도이다.
일부 실시형태에서, 분해제는 수성 염기이다. 일부 실시형태에서, 수성 염기는 NaOH이다. 일부 실시형태에서, NaOH는 1M 내지 5M의 NaOH이다. 일부 실시형태에서, NaOH는 3M NaOH이다(문헌[Yeo et al., J Biomed Mater Res B Appl Biomater 87(2):562-9 (2008)] 참조).
일부 실시형태에서, 분해제는 수성 염기와 50℃ 내지 65℃의 온도 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분해제는 50℃ 내지 65℃의 온도의 수성 NaOH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분해제는 50℃ 초과, 60℃ 초과, 또는 65℃ 초과의 온도의 수성 NaOH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분해제는 60℃의 온도의 수성 NaOH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 플로우 셀에서 분해된 비드를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세척 단계는 플로우 셀에서 분해된 비드를 제거한다.
G. 서열분석
일부 실시형태에서, 방법은 고정화된, 증폭된 단편 또는 단편의 클러스터를 서열분석하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열분석 라이브러리는 개별 비드를 식별하기 위해 바코드화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은 플로우 셀의 표면에 시딩된 서열분석 라이브러리를 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 각각의 분해성 폴리에스터 비드로부터 시딩된 서열분석 라이브러리의 플로우 셀 표면 상의 위치는 서열 라이브러리의 서열분석으로부터 생성된 판독을 위한 공간 인덱스로서 사용된다.
일부 실시형태에서, 시딩된 서열분석 라이브러리는 전체적으로 또는 부분적으로 서열분석된다. 시딩된 서열분석 라이브러리는 SBS를 포함하는 직접 서열분석, 결찰에 의한 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 나노포어 서열분석 등과 같은 임의의 적합한 서열분석 방법론에 따라 서열분석될 수 있다. 고정화된 핵산 단편의 서열을 결정하기 위한 방법의 비-제한적 예는 예를 들어 Bignell 등(미국 특허 제8,053, 192호), Gunderson 등(국제 특허 공개 제WO2016/130704호), Shen 등(미국 특허 제8,895,249호) 및 Pipenburg 등(미국 특허 US 9,309,502호)에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
본원에 기술된 방법은 다양한 핵산 서열분석 기술과 함께 사용될 수 있다. 특히 적용가능한 기술은 상대적인 위치가 변경되지 않도록 핵산이 어레이의 고정된 위치에 부착되고 어레이가 반복적으로 영상화되는 기술이다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오티드 염기 유형을 다른 것으로부터 구별하기 위해 사용되는 상이한 표지와 일치하는 것과 같이, 상이한 색상 채널에서 영상이 얻어지는 구현이 특히 적용가능하다. 일부 예에서, 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 공정은 자동화된 공정일 수 있다.
하나의 서열분석 방법론은 SBS이다. SBS에서, 핵산 주형(예컨대 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)을 따라 핵산 프라이머의 확장을 모니터링하여 주형의 뉴클레오티드 서열을 결정된다. 기본 화학 공정은 중합(예컨대 폴리머라제 효소에 의해 촉매됨)일 수 있다. 일부 폴리머라제-기반 SBS 구현에서, 형광 표지된 뉴클레오티드는 프라이머에 추가된 뉴클레오티드의 순서 및 유형의 검출이 주형의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있도록 주형 의존적인 방식으로 프라이머에 추가된다(따라서 프라이머가 확장됨).
한 예에서, 뉴클레오티드 단량체는 잠금 핵산(LNA) 또는 가교 핵산(BNA)을 포함한다. 뉴클레오티드 단량체에 LNA 또는 BNA를 사용하면 뉴클레오티드 단량체와 고정화 단편에 존재하는 서열분석 프라이머 서열 간의 혼성화 강도가 증가한다.
SBS는 터미네이터 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 단량체 또는 임의의 터미네이터 모이어티가 결여된 뉴클레오티드 단량체를 사용할 수 있다. 터미네이터가 결여된 뉴클레오티드 단량체를 사용하는 방법은 예를 들어 파이로서열분석(pyrosequencing) 및 본 명세서에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오티드를 사용하는 서열분석을 포함한다. 터미네이터가 결여된 뉴클레오티드 단량체를 사용하는 방법에서, 각 주기에 추가되는 뉴클레오티드의 수는 일반적으로 가변적이며 주형 서열 및 뉴클레오티드 전달 방식에 따라 다르다. 터미네이터 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 단량체를 이용하는 SBS 기술의 경우, 디데옥시 뉴클레오티드를 이용하는 전통적인 Sanger 서열분석의 경우와 같이 사용된 서열분석 조건 하에서 터미네이터가 효과적으로 비가역적일 수 있거나, 터미네이터는 Solexa(현재 Illumina, Inc.)에 의해 개발된 서열분석 방법의 경우와 같이 가역적일 수 있다.
SBS 기술은 표지 모이어티가 있거나 표지 모이어티가 없는 뉴클레오티드 단량체를 사용할 수 있다. 따라서, 혼입 이벤트는 표지의 특성 예컨대 표지의 형광; 뉴클레오티드 단량체의 특성 예컨대 분자량 또는 전하; 뉴클레오티드 도입의 부산물 예컨대 파이로포스페이트의 방출; 등에 기초하여 검출될 수 있다. 실시형태에서, 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드가 서열분석 시약에 존재하는 경우, 상이한 뉴클레오티드는 서로 구별가능할 수 있거나, 대안적으로 2개 이상의 상이한 표지는 사용되는 검출 기술 하에서 구별불가능할 수 있다. 예를 들어, 서열분석 시약에 존재하는 상이한 뉴클레오티드는 상이한 표지를 가질 수 있으며 Solexa(현재 Illumina, Inc.)에서 개발한 서열분석 방법에 의해 예시된 바와 같이 적절한 광학 장치를 사용하여 구별될 수 있다.
일부 예는 파이로서열분석(pyrosequencing) 기술을 포함한다. 파이로서열분석은 특정 뉴클레오티드가 초기 가닥에 통합됨에 따라 무기 파이로포스페이트(PPi: inorganic pyrophosphate)의 방출을 검출한다(문헌[Ronaghi et al., Analytical Biochemistry, 242(1):84-9, 1996], 문헌[Ronaghi, Genome Res., 11(1):3-11, 2001], 문헌[Ronaghi, Uhlen, 및 Nyren, Science, 281(5375), 363, 1998], 및 미국 특허 제6,210,891호; 제6,258,568호 및 제6,274,320호, 이들 각각은 그 전체가 인용되어 본원에 포함됨). 파이로서열분석에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼라제에 의해 즉시 아데노신 삼인산(ATP: adenosine triphosphate)으로 전환되어 검출될 수 있으며, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제-생성 광자를 통해 검출된다. 서열분석될 핵산은 어레이의 피처에 부착될 수 있고, 어레이의 특징에서 뉴클레오티드의 혼입으로 인해 생성되는 화학발광 신호를 포획하기 위해 어레이가 영상화화될 수 있다. 어레이를 특정 뉴클레오티드 유형(예컨대 A, T, C 또는 G)으로 처리한 후 영상이 수득될 수 있다. 각 뉴클레오티드 유형을 추가한 후 수득된 영상은 어레이의 피처가 검출되는 것과 관련하여 상이하다. 영상의 이러한 차이는 어레이에 있는 피처의 상이한 서열 내용을 반영한다. 그러나, 각 피처의 상대적 위치는 영상에서 변경되지 않은 상태로 유지된다. 영상은 본원에 설명된 방법을 사용하여 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 예를 들어, 각각의 상이한 뉴클레오티드 유형으로 어레이를 처리한 후 수득된 영상은 가역적 터미네이터-기반 서열분석 방법에 대해 서로 상이한 검출 채널에서 수득된 영상에 대해 본원에 예시된 것과 동일한 방식으로 처리될 수 있다.
SBS의 또 다른 예 유형에서, 순환 서열분석(cycle sequencing)은 예를 들어 각각이 그 전체가 본원에 인용되어 포함된 국제 특허 공개 제WO 04/018497호, 제WO 91/06678호, 제WO 91/06678호, 제WO 07/123,744호 및 미국 특허 제7,057,026호에 기술된 바와 같은 절단가능한 또는 광표백가능한 염료 표지를 함유하는 가역적 터미네이터 뉴클레오티드의 단계적 첨가에 의해 달성된다. 종결이 역전될 수 있고 형광 표지가 절단되는 형광-표지된 터미네이터의 가용성은 효율적인 순환 가역 종결(CRT: cyclic reversible termination) 서열분석을 용이하게 한다. 폴리머라제는 또한 이러한 변형된 뉴클레오티드로부터 효율적으로 통합되고 연장되도록 공동-조작될 수 있다.
일부 가역적 터미네이터-기반 서열분석 실시형태에서, 표지는 SBS 반응 조건 하에서 연장을 실질적으로 억제하지 않는다. 그러나, 검출 표지는 예를 들어 절단 또는 분해에 의해 제거될 수 있다. 표지를 배열된 핵산 피처에 통합한 후 영상이 캡쳐될 수 있다. 특정 예에서, 각 주기는 4개의 상이한 뉴클레오티드 유형을 어레이로의 동시 전달을 포함하고 각 뉴클레오티드 유형은 스펙트럼적으로 구별되는 표지를 갖는다. 그런 다음 4개의 영상이 수득될 수 있으며, 각각은 4개의 상이한 표지 중 하나에 대해 선택적인 검출 채널을 사용한다. 대안적으로, 상이한 뉴클레오티드 유형이 순차적으로 첨가될 수 있으며 각 첨가 단계 사이에 어레이의 영상이 수득될 수 있다. 이러한 예에서, 각 영상은 특정 유형의 뉴클레오티드가 통합된 핵산 피처를 나타낸다. 각 피처의 서열 내용이 상이하기 때문에 상이한 영상에 상이한 피처가 있거나 없을 수 있다. 그러나, 피처의 상대적 위치는 영상에서 변경되지 않은 상태로 유지된다. 이러한 가역 터미네이터-SBS 방법에서 수득된 영상은 본원에 명시된 대로 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 영상 캡처 단계 후, 표지는 제거될 수 있으며 후속 뉴클레오티드 추가 및 검출 주기를 위해 가역적 터미네이터 모이어티가 제거될 수 있다. 표지 특정 주기에서 검출된 후 후속 주기 이전에 표지가 제거되면 배경 신호와 주기 사이의 누화를 줄이는 이점을 제공할 수 있다. 유용한 표지 및 제거 방법의 예가 본원에 설명되어 있다.
일부 실시형태에서, 뉴클레오티드 단량체의 일부 또는 전부는 가역적 터미네이터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가역적 터미네이터/절단가능한 형광단은 3' 에스터 결합을 통해 리보스 모이어티에 연결된 형광단을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Metzker, Genome Res., 15:1767-1776, 2005] 참조, 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨). 다른 접근법은 터미네이터 화학을 형광 표지의 절단으로부터 분리시켰다(예를 들어, 문헌[Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7, 2005] 참조, 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨). Ruparel 등은 연장을 차단하기 위해 작은 3' 알릴기를 사용하지만 팔라듐 촉매로 짧은 처리로 쉽게 차단이 해제될 수 있는 가역적 터미네이터의 개발을 설명하였다. 형광단은 장파장 UV 광에 30초 노출되면 쉽게 절단될 수 있는 광절단가능한 링커를 통해 염기에 부착되었다. 따라서, 디설파이드 환원 또는 광절단이 절단가능한 링커로서 사용될 수 있다. 가역적 종결에 대한 또 다른 접근 방식은 dNTP에 부피가 큰 염료를 배치한 후 발생하는 자연 종결을 사용하는 것이다. dNTP에 하전된 부피가 큰 염료의 존재는 입체 및/또는 정전기 장애를 통해 효과적인 터미네이터로서 작용할 수 있다. 하나의 통합 이벤트가 있으면 염료가 제거되지 않는 한 추가 통합이 방지된다. 염료의 절단은 형광단을 제거하고 효과적으로 종결을 역전시킨다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 또한 미국 특허 제7,427,673호 및 제7,057,026호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
본 명세서에 기술된 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 추가적인 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 공개 제2007/0166705호, 제2006/0188901호, 제2006/0240439호, 제2006/0281109호, 제2012/0270305호, 및 제2013/0260372호, 미국 특허 제7,057,026호, PCT 특허 공개 제WO 05/065814호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0100900호, 및 PCT 특허 공개 제WO 06/064199호 및 제WO 07/010,251호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
일부 예는 4개 미만의 상이한 표지를 사용하여 4개의 상이한 뉴클레오티드 검출을 사용한다. 예를 들어, SBS는 미국 특허 공개 제2013/0079232호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다. 첫 번째 예로서, 한 쌍의 뉴클레오티드 유형은 동일한 파장에서 검출될 수 있지만, 쌍의 한 구성원이 다른 구성원과 비교하여 강도 차이를 기준으로 하거나 쌍 중 한 구성원의 변화(예컨대 화학적 변형, 광화학적 변형 또는 물리적 변형을 통해) 쌍의 다른 구성원에 대해 검출된 신호와 비교하여 명백한 신호가 나타나거나 사라지게 한다. 두 번째 예로서, 4개의 상이한 뉴클레오티드 유형 중 3개가 특정 조건 하에서 검출될 수 있는 반면, 네 번째 뉴클레오티드 유형은 이러한 조건 하에서 검출가능한 표지가 없거나, 이러한 조건 하에서 최소한으로 검출된다(예컨대, 배경 형광으로 인한 최소 검출 등). 핵산으로의 처음 3개의 뉴클레오티드 유형의 혼입은 그들 각각의 신호의 존재에 기초하여 결정될 수 있고 핵산으로의 네 번째 뉴클레오티드 유형의 혼입은 임의의 신호의 부재 또는 최소 검출에 기초하여 결정될 수 있다. 세 번째 예로서, 하나의 뉴클레오티드 유형은 두 개의 상이한 채널에서 검출되는 표지(들)를 포함할 수 있는 반면, 다른 뉴클레오티드 유형은 하나 이상의 채널에서 검출되지 않는다. 앞서 언급한 세 가지 예시 구성은 상호 배타적인 것으로 간주되지 않으며 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 세 가지 예를 모두 결합한 예는 첫 번째 채널에서 검출되는 첫 번째 뉴클레오티드 유형(예컨대, 첫 번째 여기 파장에 의해 여기될 때 첫 번째 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dATP), 두 번째 채널에서 검출되는 두 번째 뉴클레오티드 유형(예컨대, 두 번째 여기 파장에 의해 여기될 때 두 번째 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dCTP), 첫 번째 및 두 번째 채널 모두에서 검출되는 세 번째 뉴클레오티드 유형(예컨대, 첫 번째 및/또는 두 번째 여기 파장에 의해 여기될 때 두 채널 모두에서 검출되는 적어도 하나의 표지를 갖는 dTTP) 및 어떠한 채널에서 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는 표지가 결여된 네 번째 뉴클레오티드 유형(예컨대, 표지가 없는 dGTP)을 사용하는 형광-기반 SBS 방법이다.
또한, 미국 특허 공개 제2013/0079232호에 포함된 재료에 기술된 바와 같이, 단일 채널을 사용하여 서열분석 데이터가 수득될 수 있다. 이러한 소위 1-염료(one-dye) 서열분석 접근법에서, 첫 번째 뉴클레오티드 유형에 표지되어 있지만 첫 번째 영상이 생성된 후 표지가 제거되고, 두 번째 뉴클레오티드 유형은 첫 번째 영상이 생성된 후에만 표지된다. 세 번째 뉴클레오티드 유형은 첫 번째 영상과 두 번째 영상 모두에서 표지를 유지하고, 네 번째 뉴클레오티드 유형은 두 영상 모두에서 표지가 지정되지 않은 상태로 유지된다.
일부 예는 결찰 기술에 의한 서열분석을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 DNA 리가제를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 통합하고 이러한 올리고뉴클레오티드의 통합을 확인한다. 여러 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 서열에서 특정 뉴클레오티드의 동일성과 상관관계가 있는 상이한 표지를 갖는다. 다른 SBS 방법과 마찬가지로, 표지된 서열분석 시약으로 핵산 피처 어레이를 처리한 후 영상이 수득될 수 있다. 각 영상은 특정 유형의 표지가 포함된 핵산 피처를 나타낸다. 각 피처의 서열 내용이 다르기 때문에 상이한 피처가 상이한 피처에 있거나 없을 수 있지만, 피처의 상대적 위치는 영상에서 변경되지 않은 채로 유지된다. 결찰-기반 서열분석 방법에서 수득된 영상은 본원에 명시된 대로 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 제6,969,488호, 제6,172,218호 및 제6,306,597호에 기술되어 있다.
일부 예는 나노포어 서열분석을 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Deamer and Akeson, Trends Biotechnol., 18, 147- 151, 2000], 문헌[Deamer and Branton, Acc. Chem. Res., 35:817-825, 2002], 문헌[Li, Gershow, Stein, Brandin, and Golovchenko, Nat. Mater., 2:611-615, 2003] 참조, 이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨). 이러한 예에서, 단편은 나노포어를 통과한다. 나노포어는 α-헤몰리신과 같은 합성 포어 또는 생물학적 막 단백질일 수 있다. 단편이 나노포어를 통과함에 따라, 각 염기쌍은 포어의 전기 전도도 변동을 측정함으로써 식별될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni and Meller, Clin. Chem. 53, 1996-2001, 2007]; 문헌[Healy, Nanomed., 2, 459-481, 2007]; 및 문헌[Cockroft et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 818-820, 2008] 참조, 이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨). 나노포어 서열분석에서 수득된 데이터는 본원에 명시된 대로 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 특히, 데이터는 본원에 명시된 광학 영상 및 기타 영상의 예시적인 처리에 따라 영상으로 처리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 DNA 폴리머라제 활성의 실시간 모니터링을 포함한다. 뉴클레오티드 혼입은 예를 들어 미국 특허 제7,329,492호 및 제7,211,414호(이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨)에 기술된 바와 같이 형광단-함유 폴리머라제와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오티드 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET: fluorescence resonance energy transfer) 상호작용을 통해 검출될 수 있거나, 뉴클레오티드 혼입은 예를 들어, 미국 특허 제7,315,019호(이는 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨)에 기술된 바와 같이 0-모드 도파관(zero-mode waveguide)으로, 그리고 예를 들어, 미국 특허 제7,405,281호 및 미국 특허 공개 제2008/0108082호(이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨)에 기술된 바와 같이 형광 뉴클레오티드 유사체 및 조작된 폴리머라제를 사용하여 검출될 수 있다. 조명은 형광 표지된 뉴클레오티드의 혼입이 낮은 배경으로 관찰될 수 있도록 표면- 테더링된 폴리머라제 주변의 젭토리터 규모의 부피로 제한될 수 있다(예를 들어, 문헌[Levene et al., Science, 299, 682-686, 2003]; 문헌[Lundquist et al., Opt. Lett., 33:1026-1028, 2008]; 및 문헌[Korlach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:1176-1181, 2008] 참조, 이들 각각은 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨). 이러한 방법에서 수득된 영상은 본원에 명시된 대로 저장, 처리 및 분석될 수 있다.
일부 SBS 예는 뉴클레오티드가 연장 생성물에 통합될 때 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 전기 검출기 및 Ion Torrent(코네티컷주 Guilford, Life Technologies 자회사)로부터 상업적으로 이용가능한 관련 기술 또는 미국 특허 공개 제2009/0026082호; 제2009/0127589호; 제2010/0137143호; 및 제2010/0282617호에 기술된 서열분석 방법 및 시스템을 사용할 수 있으며, 상기 특허 각각은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다. 동역학 배제를 사용하여 표적 핵산을 증폭하기 위해 본원에 기술된 방법은 양성자를 검출하는데 사용되는 기질에 쉽게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기술된 방법은 양성자를 검출하는데 사용되는 앰플리콘의 클론 집단을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
H. 데이터 분석
개시된 방법을 사용하여 수득된 서열 판독물을 분석하고 처리하기 위해 임의의 적절한 생물정보학 작업흐름이 사용될 수 있다.
일부 예에서, 동일한 긴 DNA 단편에서 유래한 판독물은 연결된-판독물 분석을 가능하게 하기 위해 동일한 바코드로 표지된다. 동일한 DNA 단편과 관련된 클러스터는 비드가 플로우 셀에 고정화된 위치에 상대적으로 근접하여 플로우 셀에 공간적으로 함께 위치하므로, 정확한 바코드 할당은 플로우 셀 상의 비드 위치(또는 "클러스터 패치")의 식별에 기초할 수 있다. 실시간 분석(RTA: real-time analysis) 영상을 직접 사용하고/하거나(예를들어 Illumina MiSeqTM 플랫폼에서 사용가능) RTA에서 보고하는 클러스터 좌표를 사용하여 비드 위치 식별이 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 작업흐름은 예를 들어 클러스터 좌표 조회를 지원하는 플랫폼에서 사용할 수 있다.
일부 예에서, 각 타일에 대한 RTA(x,y) 판독 좌표(적절한 경우 표면 및 모든 타일 스와스 모두를 고려함)가 주어지면, 밀도-기반 공간 클러스터링을 수행하여 각 타일에 대한 비드 위치가 식별될 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 틈새 공간으로 누출된 판독물에 의해 생성된 저밀도 배경과 비교하여 판독물의 고밀도 클러스터에 해당하는 것으로 가정된다. 클러스터링 절차는 알 수 없는 수의 클러스터를 검출하고(각 타일의 비드 수가 고정되어 있지 않기 때문에), 다양한 클러스터 모양 및 크기를 처리하고(비드가 일정한 크기가 아니고 용융 후 원형 모양이 아닌 경우), 틈새 판독물을 노이즈로 분류한다. DBSCAN 클러스터링 알고리즘과 같은 임의의 적절한 밀도-기반 클러스터링 알고리즘을 사용하여 클러스터를 정의할 수 있다. 몇몇 구현에서, 비드 경계는 클러스터에 할당된 포인트의 블록 껍질(convex hull)을 찾아 각각의 생성된 클러스터에서 계산된다. 클러스터링 결과를 향상시키기 위해, 클러스터링 전에 밀도-기반 판독물 필터링 절차가 적용될 수 있으며, 이는 타일에서 이웃의 희소성을 기반으로 판독물을 제거한다(예를 들어, 타일에서 주변 반경 r 내에 n개 미만의 다른 판독물이 있는 경우 판독물이 필터링되며, 여기서 n 및 r은 구성가능한 매개변수이다). 일부 예에서, 클러스터링 절차의 최종 결과를 평가하고 보정하기 위한 수동 큐레이션 단계가 구현될 수 있다.
추가 예에서, 딥 러닝을 사용하여 RTA 좌표로부터 비드 위치가 결정된다. 예를 들어 영상 세분화를 위한 U-Net 컨볼루션 신경망 아키텍처 또는 적절한 컨볼루션 신경망(CNN: convolutional neural network) 모델을 사용하여 클러스터 패치 경계 및 해당 비드 위치를 결정할 수 있다. 이러한 일부 예에서, 훈련 데이터 세트는 좌표-기반 플롯에서 수득되는 수동 주석 영상과 합성 생성 영상을 포함한다. 합성 데이터 확대는 수동으로 주석이 달린 영상에 일련의 변환을 적용하여 이루어진다; 변환은 모양 변형, 크기, 수 및 배치 변화뿐만 아니라 비드 간 및 비드 내 밀도 변화를 포함한다.
공지된 참조 게놈으로부터 DNA를 서열분석할 때, 게놈 정렬 정보는 비드 식별을 추가로 정제하고, 틈새 판독을 구제하고, 결과적인 바코드 할당을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일한 클러스터에 할당된 비드는 공간적 근접성과 함께 판독물이 맵핑된 게놈 창을 고려하여 추가로 분리될 수 있다. 대안적으로, 이웃 비드에서 동일한 게놈 창에 맵핑되는 판독물을 계산하여 비드 간 혼선을 정량화할 수 있다; 이어서 혼선이 상당히 높은 비드 쌍을 병합하여 페이징(phasing)과 같은 여러 대상 어플리케이션에서 아일랜드 인접성 및 성능을 향상시킬 수 있다. 확률적 또는 "소프트" 바코드 할당은 페이징 및 어셈블리와 같은 여러 대상 어플리케이션에서 추가적인 성능 향상을 위해 고려된다.
일부 예에서, 식별 후, 각각의 검출된 비드는 고유 바코드와 결합되고 비드 경계 내에 포함된 판독물은 이러한 바코드로 표지된다. 그 결과, 초기에 동일한 비드에 고정화된 긴 DNA 단편에서 유래한 판독물은 동일한 바코드에 할당되며 후속 분석 중에 연결될 수 있다. 특히, 인간 게놈 페이징의 경우, 바코드 판독물은 게놈 정렬 위치의 근접성을 사용하여 아일랜드(판독물이 유래한 더 긴 DNA 단편에 해당)에 연결될 수 있으며(예컨대 인간 게놈에 의해 근접하게 맵핑되는 경우 동일한 바코드의 판독물은 연결될 수 있음), 이는 훨씬 더 큰 페이즈(phase) 블록의 재구성을 가능하게 한다. 게놈 어셈블리에서, 예를 들어, 먼저 읽기를 부분적으로 조립된 콘티그(contig)에 맵핑한 다음 바코드 정보를 사용하여 콘티그를 연결함으로써, 바코드 정보를 사용하여 반복을 명확하게 하고 어셈블리 인접성을 크게 증가시킬 수 있다. 연결된-판독물 분석에 대한 모범 사례에 따라 데이터 분석 작업흐름의 후속 단계로 단계별 및 어셈블리 파이프라인이 구현되었다.
실시예
실시예 1. PCL 비드 제조 및 사용
3 μm 평균 직경의 PLC 비드를 구입할 수 있다(예를 들어 매사추세츠주 Phosphorex에서). PCL 비드를 작용화하기 위해, 활성 아미노기를 40℃에서 60분 동안 1,6-헥산디아민 중의 10%(w/w) 이소프로판올 용액에서 아미노분해에 의해 미소구체 표면에 도입하였다(문헌[Yuan et al. J. Mater. Chem. B 3:8670-83 (2015)]에 기술된 바와 같음). 그런 다음 PCL 비드 표면의 활성 아민을 (i) 스트렙타비딘의 리신 잔기 상의 아민 및 (ii) 글루타르알데히드에 의한 아민-작용화된 자기 나노입자에 접합하였다(도 1a)(문헌[Fang et al. RSC Adv 6:67875-82 (2016)] 및 문헌[Hassan et al. Nano Res 11(1):1-41 (2018)] 참조)). 비오틴-접합된 트랜스포좀을 비오틴-스트렙타비딘 결합에 의해 PCL 비드의 표면 상에 조립하였다(도 1b). 이들 비오틴-접합된 트랜스포좀은 비오틴에 접합된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그런 다음 PCL 비드는 DNA 단편화 및 라이브러리 제조 및 온-플로우 셀 공간 클러스터 클라우드 생성에 사용할 준비가 된다.
PCL 비드를 PCL 미소구체 표면에 남아 있는 스트렙타비딘이 플로우 셀 표면에 패턴화된 비오틴에 결합하고 비드를 고정시키는 플로우 셀에 도입하였다(도 2). 라이브러리 방출 및 클러스터링 후, PCL 비드는 과량의 유리 비오틴에 의해 표으로부터 방출된다. 그런 다음 PCL 비드를 60℃ 초과의 온도에서 용융한 후 세척하여 플로우 셀에서 제거하였다. 대안적으로, 고온에서 NaOH를 사용한 알칼리성 가수분해를 사용하여 PCL 비드를 분해할 수 있다(문헌[Ramirez Hernandez et al. Am J Polym Sci, 3(4):70-75 (2013)] 참조).
실시예 2. 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물의 사용
비드 및 적어도 하나의 나노입자(여기서 각각의 나노입자는 하나 이상의 트랜스포좀 복합체를 포함함)를 포함하는 조성물의 혼합물을 서열분석을 위한 라이브러리를 제조하는데 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 본원에 기술된 것 중 임의의 것일 수 있다.
도 8은 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물을 사용하여 서열분석 라이브러리를 제조하는 대표적인 방법의 요약을 제공한다. 표적 핵산(예를 들어 고분자량 게놈 DNA)을 조성물에 첨가하고 55℃에서 태깅을 수행하였다. 태깅을 5% SDS 용액으로 중지하였다. 이 시점에서, 라이브러리 단편은 나노입자에 고정화된다. 자기력을 인가하여 조성물을 고정화하고(여기서 비드는 자기 비드일 수 있음) 상등액을 제거한 다음 3회 세척하였다.
반응 용기를 80℃로 가열하여 클러스터링 나노입자 및 Tn5 트랜스포사제를 방출하였다. 자기 비드는 자기력을 사용하여 나머지 반응에서 분리될 수 있다. 이 시점에서, 라이브러리 단편은 용액에 있으며 용액에서 증폭될 수 있다. 조성물이 동일한 트랜스포좀을 포함하는 경우, 증폭 전에 두 번째 어댑터 서열을 통합하는 단계를 수행할 수 있다. 그런 다음 증폭된 단편을 서열분석을 위해 플로우 셀에 로딩할 수 있다. 라이브러리 단편은 플로우 셀에 고정화된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 상보적인 어댑터 서열을 갖도록 생성될 수 있다.
대안적으로, 비드를 포함하는 조성물은 플로우 셀에 로딩될 수 있으며 그 다음 라이브러리 단편이 방출되고 플로우 셀에 포획된다. 이러한 단편은 상이한 트랜스포좀 복합체를 사용하여 상이한 어댑터 서열을 통합하는 비대칭 태깅으로 생성될 수 있다. 그 다음 비드는 증가된 온도 또는 분해제(조성물이 본 명세서에 기재된 바와 같은 분해성 비드를 포함하는 경우)로 분해함으로써 제거될 수 있다. 고정화된 단편은 플로우 셀에서 증폭된 후 서열분석될 수 있다. 이러한 모든 방법에서, 서열분석 전 증폭도 또한 생략할 수 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물을 사용한 방법은 일반적으로 라이브러리 단편의 크기 선택에 소요되는 비용 및 시간을 피할 수 있다. 이러한 방법에서, 단일 비드에 포함되는 다수 나노입자로부터의 입체 장애는 트랜스포좀 복합체를 간격을 두어 짧은 단편의 생성을 피하는 방법을 허용한다. 따라서, 서열분석은 잘 알려진 공지된 긴 판독 서열분석 방법으로 수행될 수 있다.
등가물
전술한 서면 명세서는 당업자가 실시형태를 실시할 수 있게 하기에 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 실시예는 특정 실시형태를 상세히 설명하고 발명자에 의해 고려된 최상의 모드를 설명한다. 그러나 전술한 내용이 텍스트에서 아무리 상세하게 나타나더라도, 실시형태는 많은 방식으로 실시될 수 있고 첨부된 청구범위 및 그 균등물에 따라 해석되어야 함을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약이라는 용어는 명시적으로 표시되는지 여부에 관계없이 예를 들어 정수, 분수 및 백분율을 포함하는 숫자 값을 지칭한다. 약이라는 용어는 일반적으로 당업자가 인용된 값과 동등하다고 간주하는(예를 들어, 동일한 함수 또는 결과를 갖는) 수치 값의 범위(예를 들어, 인용된 범위의 +/-5 또는 +/-10%)를 지칭한다. 적어도 및 약과 같은 용어가 숫자 값 또는 범위 목록 앞에 있는 경우, 해당 용어는 목록에 제공된 모든 값 또는 범위를 수정한다. 경우에 따라, 약이라는 용어에는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 숫자 값을 포함할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ILLUMINA, INC. <120> BEADS AS TRANSPOSOME CARRIERS <130> 01243-0018-00PCT <150> US 63/049,172 <151> 2020-07-08 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 primer <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 Primer <400> 2 caagcagaag acggcatacg a 21

Claims (48)

  1. 표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함하는 분해성 폴리에스터 비드로서, 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하고,
    상기 폴리에스터 비드는 50℃ 내지 65℃의 융점을 갖고, 선택적으로 상기 폴리에스터 비드는 60℃의 융점을 갖고, 선택적으로 상기 폴리에스터 비드는 폴리카프로락톤을 포함하는, 분해성 폴리에스터 비드.
  2. 제1항에 있어서, 이에 고정화된 복수의 자기 나노입자를 포함하며, 선택적으로 상기 자기 나노입자가 자기 코어를 갖는 비드이고, 선택적으로 상기 자기 코어가 철, 니켈, 및/또는 코발트를 포함하는, 분해성 폴리에스터 비드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하고, 비드가 표면에 공유적으로 결합된 복수의 비드 결합 모이어티를 포함하고, 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합을 통해 비드 표면에 고정화되는, 폴리에스터 비드.
  4. 제3항에 있어서,
    a. 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 각각의 트랜스포좀 복합체의 제1 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합되거나 각각의 트랜스포좀 복합체의 제2 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합되되고/되거나;
    b. 비드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이고 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 비오틴이고/이거나;
    c. 각각의 비드 결합 모이어티가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되어 있고, 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하는, 폴리에스터 비드.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 자기 나노입자가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되어 있고, 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하는, 폴리에스터 비드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에스터 비드가 플로우 셀의 표면 상에 고정화되고, 선택적으로 폴리에스터 비드가 상기 플로우 셀의 표면 상에서 비드 결합 모이어티의 플로우 셀 결합 모이어티로의 공유 결합을 통해 상기 플로우 셀의 표면 상에 고정화되는, 폴리에스터 비드.
  7. 제6항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티 및 플로우 셀 결합 모이어티가 동일 유형의 결합 모이어티이고, 트랜스포좀 복합체가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제1 부분에 결합되고 플로우 셀 결합 모이어티가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제2 부분에 결합되는, 폴리에스터 비드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비드 상의 적어도 2개의 트랜스포좀 복합체에 각각 결합된, 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함하며, 선택적으로 대부분의 트랜스포좀 복합체가 비드의 표면 상에 고정화되는, 폴리에스터 비드.
  9. 플로우 셀의 표면 상에 고정화된 폴리에스터 비드를 포함하는 플로우 셀로서, 상기 폴리에스터 비드는 표면에 고정화된 복수의 트랜스포좀 복합체를 포함하고,
    각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하고;
    상기 폴리에스터 비드는 50℃ 내지 65℃의 융점을 갖거나, 선택적으로 상기 폴리에스터 비드는 60℃의 융점을 갖고, 선택적으로 상기 폴리에스터 비드는 폴리카프로락톤을 포함하고/하거나 이에 고정화된 복수의 고정화된 자기 나노입자를 포함하는, 플로우 셀.
  10. 제9항에 있어서, 각각의 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하고, 비드가 표면에 공유적으로 결합된 복수의 비드 결합 모이어티를 포함하고, 트랜스포좀 복합체가 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 비드 결합 모이어티로의 결합을 통해 비드 표면 상에 고정화되고 선택적으로,
    a. 각각의 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 각각의 트랜스포좀 복합체의 제1 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합되거나 각각의 트랜스포좀 복합체의 제2 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 결합되되고/되거나;
    b. 비드 결합 모이어티는 스트렙타비딘 또는 아비딘이고 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 비오틴이고/이거나;
    c. 각각의 비드 결합 모이어티가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되어 있고, 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하는, 플로우 셀.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 각각의 자기 나노입자가 링커를 통해 폴리에스터 비드에 공유적으로 결합되어 있고, 상기 링커는 선택적으로 -N=CH-(CH2)3-CH=N-, -C(O)NH-(CH2)6-N=, 또는 -C(O)NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)3CH=N-을 포함하고/하거나, 상기 자기 나노입자가 폴리에스터 비드를 플로우 셀의 표면 상에 시딩하기 위해 사용되는, 플로우 셀.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에스터 비드가 플로우 셀의 표면 상에서 비드 결합 모이어티의 플로우 셀 결합 모이어티로의 공유 결합을 통해 플로우 셀의 표면 상에 고정화되거나 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티 및 플로우 셀 결합 모이어티가 동일한 유형의 결합 모이어티이고, 트랜스포좀 복합체가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제1 부분에 결합되고 플로우 셀 결합 모이어티가 비드 상의 비드 결합 모이어티의 제2 부분에 결합되는, 플로우 셀.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 비드 상의 적어도 2개의 트랜스포좀 복합체에 각각 결합된, 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함하며, 선택적으로 대부분의 트랜스포좀 복합체가 비드 상의 표면에 고정화되는, 플로우 셀.
  14. 표적 핵산이 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되고 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 트랜스포존 말단 서열이 단편의 적어도 하나의 가닥의 5' 말단으로 전달되는 조건 하에서 표적 핵산을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리에스터 비드 또는 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 하나의 플로우 셀과 접촉함으로써, 단편의 고정화된 라이브러리를 생산하는 단계를 포함하는 표적 핵산으로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 적어도 하나의 가닥이 태그로 5'-태깅되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    a. 접촉 단계가 표적 핵산을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리에스터 비드와 접촉하는 단계를 포함하고, 방법이 단편의 고정화된 라이브러리를 포함하는 비드를 플로우 셀의 표면에 고정화하는 단계를 포함하고/하거나;
    b. 비드가 플로우 셀의 표면 상에서 비드 결합 모이어티의 플로우 셀 결합 모이어티로의 결합을 통해 플로우 셀의 표면에 고정화되고/되거나;
    c. 비드가 이에 고정화된 복수의 고정화된 자기 나노입자를 포함하며, 선택적으로 상기 자기 나노입자가 폴리에스터 비드를 플로우 셀의 표면에 시딩하기 위해 사용되고/되거나;
    d. 접촉 단계가 표적 핵산을 제6항의 폴리에스터 비드와 접촉하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    a. 고정화된 비드로부터 단편을 방출시켜 소비된 비드를 제공하는 단계 및 플로우 셀 표면 상에 방출된 단편을 포획하여 포획된 단편을 생산하는 단계로서, 선택적으로 상기 고정화된 비드로부터 단편을 방출하는 단계가 비드로부터 단편을 증폭하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 방출된 단편을 포획하는 단계가 방출된 단편을 혼성화하여 플로우 셀의 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 포획하는 단계;
    b. 플로우 셀 표면 상에서 포획된 단편을 증폭하여 고정화된, 증폭된 단편을 생산하는 단계로서, 선택적으로 포획된 단편을 증폭하는 단계가 단편의 클러스터를 생산하기 위한 브리지 증폭을 포함하는 단계;
    c. 소비된 비드를 과량의 용액-상 플로우 셀 결합 모이어티로 처리하여 플로우 셀 표면으로부터 소비된 비드를 분리하여 용액-상 소비된 비드를 제공하는 단계;
    d. 용액-상 소비된 비드를 분해제로 분해하는 단계;
    e. 분해된 비드를 플로우 셀에서 제거하는 단계를 추가로 포함하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 분해제가 (a) 50℃ 내지 65℃, 또는 60℃의 온도, 및/또는 (b) 수성 염기인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 수성 염기가 NaOH이고, 선택적으로 수성 염기가 1M 내지 5M NaOH인이고, 선택적으로 수성 염기가 1M, 2M, 3M, 4M, 또는 5M NaOH이고, 선택적으로 수성 염기가 3M NaOH인, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 고정화된, 증폭된 단편 또는 단편의 클러스터를 서열분석하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 복수의 트랜스포좀 복합체를 폴리에스터 비드에 고정화하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리에스터 비드의 제조 방법으로서, 상기 각각의 트랜스포좀 복합체는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열 및 태그를 포함하는 3' 부분을 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존 말단 서열에 상보적이고 이와 혼성화되는 5' 부분을 포함하는 방법으로서, 선택적으로 상기 방법은 복수의 자기 나노입자를 폴리에스터 비드에 고정화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물로서, 상기 비드는 상기 나노입자에 결합할 수 있는 작용기를 포함하고, 선택적으로 나노입자 또는 상기 비드는 자기(magnetic)인, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 나노입자가,
    a. 합성 수지상돌기, DNA 수지상돌기, 또는 중합체 브러쉬이고/이거나;
    b. 자기 코어를 갖는 비드이고, 선택적으로 상기 자기 코어가 철, 니켈, 및/또는 코발트를 포함하고/하거나;
    c. 50 내지 150 nm의 직경을 갖고, 선택적으로 상기 나노입자가 100 nm의 직경을 갖는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가
    a. 단일 고정화된 트랜스포좀 복합체, 또는
    b. 1개 초과의 고정화된 트랜스포좀 복합체로서, 선택적으로 상기 1개 초과의 고정화된 트랜스포좀 복합체가 나노입자 상의 각각의 트랜스포좀 복합체 간에 유사한 거리로 고정화되는, 상기 1개 초과의 고정화된 트랜스포좀 복합체를 포함하는, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 고정화된 트랜스포좀 복합체 또는 트랜스포좀 복합체가 나노입자로부터 멀리 향하는 트랜스포사제로 배향되는, 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 트랜스포좀 복합체가
    a. 비오틴, 데스티오비오틴, 또는 이중 비오틴을 포함하는 트랜스포존의 나노입자에 포함된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로의 결합에 의해, 또는
    b. 트랜스포존에 포함된 제제와 나노입자에 포함된 제제 사이의 클릭 화학 반응에 의해 나노입자에 고정화되고, 선택적으로 상기 클릭 화학 반응이 나노입자 상의 아지드와 트랜스포존 상의 디벤질사이클로옥틴(DBCO) 사이의 반응인, 조성물.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 다수 나노입자에 결합할 수 있는 담체 비드이고, 선택적으로 상기 비드가 1 μm 이상의 직경을 갖고/갖거나 비드가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 분해성 폴리에스터 비드인, 조성물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 작용기가 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머이고, 선택적으로
    a. 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머가 나노입자에 직접적으로 결합하거나;
    b. 화학적 부착 핸들 및/또는 클러스터링 프라이머가 나노입자에 간접적으로 결합하거나; 또는
    c. 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 비드에 포함된 클러스터링 프라이머 및 나노입자 둘 모두에 결합하는, 조성물.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자와 비드 사이의 상호작용이 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용이고, 선택적으로 상기 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용이 단백질-리간드 상호작용 또는 금속-킬레이터 상호작용이고, 추가로 선택적으로 상기 단백질-리간드 상호작용이 비오틴-스트렙타비딘 상호작용이거나 금속-킬레이터 상호작용이 니켈-폴리히스티딘 또는 코발트-폴리히스티딘 상호작용인, 조성물.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 클러스터링 프라이머를 포함하고 나노입자가 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 선택적으로 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 상기 클러스터링 프라이머가 서로 직접적으로 결합하거나 연결 올리고뉴클레오티드가 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 상기 클러스터링 프라이머 둘 모두에 결합할 수 있는, 조성물.
  30. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자와 비드 사이의 상호작용이 비가역적 및/또는 공유적 상호작용이고, 선택적으로 상기 공유적 상호작용이 비드와 나노입자 사이의 절단가능한 링커이고, 추가로 선택적으로 상기 절단가능한 링커가 화학적으로 또는 효소적으로 절단가능한 링커인, 조성물.
  31. 플로우 셀 시딩 방법으로서,
    a. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 비드와 나노입자를 해리하는 단계로서, 선택적으로 상기 비드와 나노입자를 해리하는 단계는 절단가능한 링커의 절단에 의해 또는 나노입자와 비드 사이의 가역적 및/또는 비-공유적 상호작용의 해리에 의한 것인 단계; 및
    b. 나노입자를 플로우 셀의 표면 상에 고정시키는 단계
    를 포함하는, 플로우 셀 시딩 방법.
  32. 제31항의 방법에 의해 제조된, 표면에 고정화된 나노입자를 포함하는 플로우 셀, 또는 플로우 셀의 표면에 고정화된 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 플로우 셀로서, 선택적으로 상기 조성물은 나노입자의 플로우 셀의 표면으로의 결합을 통해 플로우 셀에 고정화되는, 플로우 셀.
  33. 제32항에 있어서, 표적 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편을 포함하며, 각각은 나노입자 상에 고정화된 적어도 2개의 트랜스포좀 복합체에 결합되는, 플로우 셀.
  34. 반응 용액 중의 표적 핵산으로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 표적 핵산이 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되고 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 트랜스포존 말단 서열이 단편의 5' 말단에 전달되는 조건 하에서 표적 핵산을 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항의 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 각각 포함하는 조성물의 혼합물과 접촉함으로써, 고정화된 이중 가닥 표적 핵산 단편을 생산하는 단계를 포함하되, 하나의 가닥이 태그로 5'-태깅되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    a. 단편 생산 후 소듐 도데실 설페이트(SDS: sodium dodecyl sulfate) 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 SDS가 추가 단편 생산을 중단시키는 단계; 또는
    b. 단편 생산 후 또는 SDS 용액 첨가 후 트랜스포좀 복합체로부터 단편을 방출시키는 단계로서, 선택적으로 상기 방출 단계는 80℃의 온도에서 또는 증폭에 의해 수행되는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 트랜스포좀 복합체로부터 단편을 방출하는 단계가 나노입자로부터 단편을 방출하며, 선택적으로 상기 단편이 방출 후 용액 중에 있는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 단편 방출 후 반응 용액으로부터 비드를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 선택적으로,
    a. 비드는 자기이고 비드 제거가 자기장을 사용하여 수행되거나,
    b. 비드가 분해성 폴리에스터 비드이고 비드 제거가 분해제를 사용하여 수행되고, 선택적으로 상기 분해제가 (a) 50℃ 내지 65℃, 또는 60℃의 온도, 및/또는 (ii) 수성 염기인, 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 용액 중의 단편이 증폭되고, 증폭된 단편이 플로우 셀 내로 로딩되고, 포획되어, 서열분석되거나; 또는
    b. 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물에 고정화된 단편이 플로우 셀 내로 로딩되고, 단편이 방출되고/되거나 비드가 제거되고, 단편이 플로우 셀 상에 포획되고, 증폭되고, 서열분석되는 방법으로서, 선택적으로 단일 조성물로부터 방출된 단편이 플로우 셀 상에서 공간적으로 근접하여 포획되는, 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 다수 트랜스포좀 복합체에 의해 단편화되는 방법으로서, 선택적으로 모든 상기 트랜스포좀 복합체는 동일하고 단편은 이중-가닥 단편의 두 가닥 모두의 5' 말단에서 동일한 어댑터 서열로 태깅되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    a. 트랜스포좀 복합체로부터 이중-가닥 표적 핵산 단편을 방출하는 단계로서, 선택적으로 상기 단편이 이어서 고체 지지체에 고정화되는 단계,
    b. 어댑터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 제1 3' 말단 트랜스포존 서열에 대해 모두 또는 부분적으로 상보적인 서열을 혼성화하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오티드에 포함된 어댑터 서열은 트랜스포좀 복합체에 포함된 어댑터 서열과 상이한 단계,
    c. 선택적으로 이중-가닥 표적 핵산 단편의 제2 가닥을 연장하는 단계,
    d. 선택적으로 폴리뉴클레오티드 또는 연장된 폴리뉴클레오티드를 이중-가닥 표적 핵산 단편과 결찰하는 단계, 및
    e. 이중-가닥 단편을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 UMI를 포함하고 이중-가닥 표적 핵산 단편이 UMI를 포함하고, 선택적으로 상기 UMI가 표적 핵산 단편의 3' 말단에 바로 인접하여 위치하는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 생산된 이중 가닥 단편이 하나의 가닥의 5' 말단에서 제1 트랜스포존으로의 제1 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되고 다른 가닥의 5' 말단에서 폴리뉴클레오티드의 제2 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되는, 방법.
  43. 제39항에 있어서,
    a. 트랜스포좀 복합체로부터 이중-가닥 단편을 방출하는 단계로서, 선택적으로 상기 단편이 고체 지지체 상에 고정화되는 단계,
    b. 어댑터 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 단계로서, 제1 트랜스포존의 어댑터는 제1 폴리뉴클레오티드의 어댑터와 상이한 단계,
    c. 선택적으로 제1 폴리뉴클레오티드와 상보성인 영역을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 첨가하여 이중-가닥 어댑터를 생산하는 단계,
    d. 선택적으로 이중-가닥 표적 핵산 단편의 제2 가닥을 연장하는 단계,
    e. 선택적으로 이중-가닥 어댑터를 이중-가닥 표적 핵산 단편과 결찰하는 단계, 및
    f. 이중 가닥 단편을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드가 UMI를 추가로 포함하고 이중-가닥 단편이 UMI를 포함하는 방법으로서, 선택적으로 상기 UMI가 표적 핵산 단편과 제1 폴리뉴클레오티드의 어댑터 서열 사이에 위치하는, 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 생산된 이중 가닥 단편이 하나의 가닥의 5' 말단에서 제1 트랜스포존의 제1 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되고 다른 가닥의 5' 말단에서 제1 폴리뉴클레오티드의 제2 판독 서열 어댑터 서열로 태깅되는, 방법.
  46. 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물 중의 비드에 고정화된 나노입자의 평균 수가 표적 핵산 단편의 크기를 결정하는 방법으로서, 선택적으로 상기 방법은 증폭 또는 서열분석 전에 생산된 단편의 크기 선별을 필요로 하지 않는, 방법.
  47. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 비드 상에 포함된 나노입자 사이의 입체 장애가 35개 미만의 염기쌍의 단편의 생성을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 생산된 단편이 긴 판독(long read) 서열분석을 사용하여 서열분석되는, 방법.
  48. 비드 및 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 조성물의 혼합물의 제조 방법으로서,
    a. 비드 및 나노입자를 혼합하여 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 비드 및 나노입자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계로서, 선택적으로 상기 비드는 자기이고 혼합물은 자기장을 사용하여 수행되는 단계;
    b. 혼합물로부터 비드를 분리하는 단계로서, 선택적으로 상기 비드는 자기이고 비드를 분리하는 단계가 자기장을 사용하여 수행되는 단계;
    c. 각각의 비드와 결합된 나노입자의 평균 수를 평가하는 단계로서, 선택적으로 상기 평가 단계는 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단편을 제조하는 단계 및 단편 크기를 결정하는 단계에 의해 수행되는 단계; 및
    d. 원하는 평균 수의 나노입자가 조성물의 혼합물에서 각각의 비드와 결합될 때까지 이전 단계를 반복하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020227045558A 2020-07-08 2021-07-07 트랜스포좀 담체로서의 비드 KR20230038145A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063049172P 2020-07-08 2020-07-08
US63/049,172 2020-07-08
PCT/US2021/040612 WO2022010965A1 (en) 2020-07-08 2021-07-07 Beads as transposome carriers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230038145A true KR20230038145A (ko) 2023-03-17

Family

ID=77155893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227045558A KR20230038145A (ko) 2020-07-08 2021-07-07 트랜스포좀 담체로서의 비드

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230287476A1 (ko)
EP (1) EP4179109A1 (ko)
JP (1) JP2023532905A (ko)
KR (1) KR20230038145A (ko)
CN (1) CN116018412A (ko)
AU (1) AU2021306281A1 (ko)
BR (1) BR112023000073A2 (ko)
CA (1) CA3186976A1 (ko)
IL (1) IL299042A (ko)
MX (1) MX2023000345A (ko)
WO (1) WO2022010965A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747301B (zh) * 2022-08-01 2023-12-22 深圳赛陆医疗科技有限公司 一种测序文库的构建方法、构建测序文库的试剂盒及基因测序方法

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US192A (en) 1837-05-15 Machine for cutting
US8053A (en) 1851-04-22 Improvement in clogs or pattens
CA2044616A1 (en) 1989-10-26 1991-04-27 Roger Y. Tsien Dna sequencing
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
JP2002503954A (ja) 1997-04-01 2002-02-05 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸増幅法
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
JP4954415B2 (ja) 2000-02-10 2012-06-13 イルミナ インコーポレイテッド 試料のビーズをベースとした同時プロセシングのための基材としての個々のアレイのアレイおよびその製造法
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
CN100462433C (zh) 2000-07-07 2009-02-18 维西根生物技术公司 实时序列测定
WO2002044425A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
WO2004018497A2 (en) 2002-08-23 2004-03-04 Solexa Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
JP2007525571A (ja) 2004-01-07 2007-09-06 ソレクサ リミテッド 修飾分子アレイ
CN101914620B (zh) 2004-09-17 2014-02-12 加利福尼亚太平洋生命科学公司 核酸测序的方法
WO2006064199A1 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
EP1888743B1 (en) 2005-05-10 2011-08-03 Illumina Cambridge Limited Improved polymerases
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
EP2018622B1 (en) 2006-03-31 2018-04-25 Illumina, Inc. Systems for sequence by synthesis analysis
WO2008051530A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
EP2653861B1 (en) 2006-12-14 2014-08-13 Life Technologies Corporation Method for sequencing a nucleic acid using large-scale FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2010003132A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Illumina Cambridge Ltd. Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
EP2718465B1 (en) 2011-06-09 2022-04-13 Illumina, Inc. Method of making an analyte array
EP3290528B1 (en) 2011-09-23 2019-08-14 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
EP3305400A3 (en) 2011-10-28 2018-06-06 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
EP3366348B1 (en) 2012-01-16 2023-08-23 Greatbatch Ltd. Emi filtered co-connected hermetic feedthrough, feedthrough capacitor and leadwire assembly for an active implantable medical device
BR112014024789B1 (pt) 2012-04-03 2021-05-25 Illumina, Inc aparelho de detecção e método para formação de imagem de um substrato
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
US9644199B2 (en) * 2012-10-01 2017-05-09 Agilent Technologies, Inc. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
DK3431614T3 (da) 2013-07-01 2021-12-06 Illumina Inc Katalysator fri overfladefunktionalisering og polymerpodning
DK3083994T3 (da) 2013-12-20 2021-09-13 Illumina Inc Bevarelse af genomisk konnektivitetsinformation i fragmenterede genomiske DNA-prøver
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
JP6759197B2 (ja) 2014-10-31 2020-09-23 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 新規のポリマーおよびｄｎａコポリマーコーティング
CA2975739C (en) 2015-02-10 2022-12-06 Illumina, Inc. Methods and compositions for analyzing cellular components
BR112019014651A2 (pt) 2017-01-18 2020-07-21 Illumina, Inc. métodos para sequenciar moléculas de ácido nucleico e para preparar adaptadores de sequenciamento, produto de programa de computador, e, sistema de computador.
WO2018218226A1 (en) * 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3662083A4 (en) * 2017-08-01 2021-03-03 Illumina, Inc. SPATIAL INDEXING OF GENETIC MATERIAL AND LIBRARY MANUFACTURING USING HYDROGEL BEADS AND FLOW CELLS
CA3067425C (en) 2017-11-30 2023-10-31 Illumina, Inc. Validation methods and systems for sequence variant calls
EP4081657A1 (en) 2019-12-23 2022-11-02 Illumina Inc Nanoparticle with single site for template polynucleotide attachment

Also Published As

Publication number Publication date
CA3186976A1 (en) 2022-01-13
EP4179109A1 (en) 2023-05-17
AU2021306281A1 (en) 2023-01-05
CN116018412A (zh) 2023-04-25
US20230287476A1 (en) 2023-09-14
WO2022010965A1 (en) 2022-01-13
JP2023532905A (ja) 2023-08-01
IL299042A (en) 2023-02-01
BR112023000073A2 (pt) 2023-04-11
MX2023000345A (es) 2023-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11649498B2 (en) Spatial indexing of genetic material and library preparation using hydrogel beads and flow cells
KR102602143B1 (ko) 고체 지지체 상의 샘플 제조법
KR102212234B1 (ko) 샘플 처리를 위한 조성물 및 방법
US20210155985A1 (en) Surface concatemerization of templates
US9944924B2 (en) Polynucleotide modification on solid support
US20230287476A1 (en) Beads as Transposome Carriers
KR20230041725A (ko) 비드-연결된 트랜스포좀을 사용한 rna 및 dna 시퀀싱 라이브러리의 제작
CN107849598B (zh) 簇中的表面引物的增强利用
US20210171939A1 (en) Sample processing barcoded bead composition, method, manufacturing, and system