JP4954415B2 - 試料のビーズをベースとした同時プロセシングのための基材としての個々のアレイのアレイおよびその製造法 - Google Patents

試料のビーズをベースとした同時プロセシングのための基材としての個々のアレイのアレイおよびその製造法 Download PDF

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Description

【０００１】
本願は、２０００年２月１０日に出願した米国出願番号第60/181,631号の利益を請求する（出典明示により全内容を本明細書の記載とする）。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、多数の試料の同時プロセシングを見こむことができる個々のアレイからなる複合アレイを含むセンサー組成物に関する。さらに、本発明は、複合アレイの製造および使用方法を提供する。本発明は、顕微鏡用スライドアレイおよび顕微鏡用スライドアレイの製造方法を提供する。
【０００３】
（背景技術）
流体および気体中の特定物質の存在および／または濃度の検出のための数多くのアッセイおよびセンサーがある。これらのうちの多くは、検出メカニズムとして特定リガンド／抗リガンド反応に頼る。すなわち、物質の対（すなわち、結合対またはリガンド／抗リガンド）は、お互いに結合し合うが他の物質にはあまりまたは全く結合しないことが知られている。このことは、複合体の検出のためにこれらの結合対を用いる数多くの技法の中心であった。これらは、一般に、ある方法で複合体の一成分を標識して、例えば、放射性同位体、蛍光性および他の光学活性分子、酵素などを用いて、複合体全体を検出可能にすることによって行われる。
【０００４】
これらのセンサーにおいてルミネセンスを用いる検出メカニズムが特に有用である。最近、特に、この１０年のうちに、光ファイバーおよび光ファイバーストランドと化学分析的判定用の吸光性色素との併用が急速に発展してきた。かかる目的および技法のための光ファイバーの使用は、Milanovich et al.,“Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application”, Proceedings of the SPIE 28th Annual International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics, Volume 494, 1980；Seitz, W. R.,“Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics”in C. R. C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Vol. 19, 1988, pp. 135-173；Wolfbeis, O. S.,“Fiber Optical Fluorosensors In Analytical Chemistry”in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications (S. G. Schulman, editor), Wiley & Sons, New York (1988)；Angel, S. M., Spectroscopy 2 (4):38 (1987)；Walt, et al.,“Chemical Sensors and Microinstrumentation”, ACS Symposium Series, Vol. 403, 1989, p. 252、および Wolfbeis, O. S., Fiber Optic Chemical Sensors, Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2nd Volume に開示されている。
【０００５】
さらに最近、１束の別個の光ファイバー束と一緒に複数の色素を使用可能にする光ファイバーセンサーが構築された。Walt et al.の米国特許第5,244,636号および第5,250,264号には、束の遠位端に複数の異なる色素を付加するための系が開示されている（これらの特許の各教示内容は出典明示により本明細書の記載とする）。この開示された構成は、束の光ファイバーを分けて個々の色素と光学的にアクセスすることができる。これは、各色素が異なる分析物に対して敏感である２種類またはそれ以上の色素からのシグナルを合わせた場合に生じる各色素からの反射光中の別々のシグナルを解析するという課題を回避する；色素の発光スペクトルは有意に重複している。
【０００６】
米国出願第08/818,199号および第09/151,877号には、基材表面上、例えば、個々のファイバーが各々光学サインを含有するビーズを含む光ファイバー束の末端でマイクロスフェアまたはビーズを用いるアレイ組成物が記載されている。ビーズはランダムに衰微するので、アレイを「解読（decode）」するために固有の光学サインが必要である；すなわち、アレイを調製した後、該アレイ上の個々の部位の位置と特定部位でのビーズまたは生物活性因子とを相互に関係付けることができる。これは、アレイ上にビーズをランダムに分布できることを意味し、従来技術の in situ 合成法またはスポッティング法のいずれと比較しても迅速かつ安価な方法である。以下にさらに詳しく概説するように、該アレイにビーズを負荷するとすぐに、該アレイを解読することができるか、または、該アレイを用いて試験後に完全または部分解読を引き起こすことができる。
【０００７】
加えて、マイクロタイタープレート中に複数のプローブアレイを含むシリコーンウェハーを含む組成物が米国特許第5,545,531号に開示されている。
【０００８】
（発明の概要）
上記目的に従って、本発明は、顕微鏡用スライドの寸法にフォーマットされている、５０μｍ未満の間隔で離れている別個の部位を含む表面をもつ基材、ならびに少なくとも第１亜集団および第２亜集団を含むマイクロスフェアの集団であって、該第１亜集団が第１生物活性因子を含み、該第２亜集団が第２生物活性因子を含み、該マイクロスフェアが表面上にランダムに分布している集団を含む顕微鏡用スライド組成物を提供する。
【０００９】
加えて、本発明は、顕微鏡用スライドの寸法にフォーマットされている、別個の部位を含む表面をもつ基材、ならびに少なくとも第１亜集団および第２亜集団を含むマイクロスフェアの集団であって、該第１亜集団が生物活性因子を含み、第２亜集団が生物活性因子を含まず、該マイクロスフェアが表面上にランダムに分布している集団を含む顕微鏡用スライドを提供する。
【００１０】
加えて、本発明は、顕微鏡用スライドの寸法にフォーマットされている、ウェルを含む表面をもつ基材を準備すること；ならびに個々のウェルがマイクロスフェアを含むように基材上に、少なくとも第１亜集団および第２亜集団を含むマイクロスフェアであって、該第１亜集団が生物活性因子を含み、該第２亜集団が生物活性因子を含まないマイクロスフェアをランダムに分布させることを含む、顕微鏡用スライド組成物の製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、顕微鏡用スライドの寸法にフォーマットされている、５０μｍ未満の間隔で離れている別個の部位を含む表面をもつ基材を準備すること；ならびに少なくとも第１亜集団および第２亜集団を含むマイクロスフェアであって、第１亜集団が第１生物活性因子を含み、第２亜集団が第２生物活性因子を含むマイクロスフェアの集団をランダムに分布させることを含む、顕微鏡用スライド組成物の製造方法を提供する。
【００１２】
加えて、本発明は、少なくとも第１穴および第２穴を含む基材であって、第１穴および第２穴の直径がそれぞれ第１光ファイバー束および第２光ファイバー束の直径と等しい直径である基材を準備すること；第１光ファイバー束および第２光ファイバー束をそれぞれ第１穴および第２穴に挿入すること；ならびに第１光ファイバー束および第２光ファイバー束の横断面が基材によって囲まれるように基材を切断することを含む、顕微鏡用スライドアレイの製造方法を提供する。
【００１３】
（図面の簡単な説明）
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅは、本発明のいくつかの異なる「二成分」系の実施態様を示す図である。図１Ａにはビーズアレイが示されている。第１基材１０は、ウェル２５およびビーズ３０を有するアレイ位置２０を有する。第２基材４０は、アッセイ位置４５を有する。光学レンズまたはフィルター６０もまた示されている；当業者に理解されるように、これは、基材に対して内部にあってもよい。図１Ｂは、ビーズを用いないことを除いて類似している；アレイ位置２０は、スポッティング法、プリンティング法、写真平版法などを用いて形成できる別個の部位２１、２２、２３などを有する。図１Ｃ〜Ｆは、複数の第１基材の使用を示す。図１Ｃは、混合機能のためのさらなる使用を有する「ビーズ・オブ・ビーズ（bead of beads）」を示す。図１Ｄは、複数のビーズアレイを示し、図１Ｅは、複数の非ビーズアレイを示す。図１Ｆは、第１基材１０を第２基材４０上の位置に「向ける（target）」ための結合官能基の使用を示す；当業者によって理解されるように、これは、平らな第２基材または区分された第２基材上で行うことができる。図１Ｆは、結合リガンド対７０／７０'、７１／７１'、７２／７２'などを用いる。これらは、化学官能基または生物学的官能基のいずれであってもよく、例えば、オリゴヌクレオチドなどのようなＩＢＬ／ＤＢＬ対について記載される。
【００１４】
図２Ａおよび図２Ｂは、２つの異なる「一成分」系を示す。図２Ａは、基材がビーズ３０を含むウェル２５を有するアッセイ位置４５をもつビーズアレイを示す。図２Ｂは、非ビーズアレイを示す；各アッセイ位置４５は、別個の部位２１、２２、２３などを示す。
【００１５】
図３は、ハイパースペクトルアルファ空間におけるクラスター形成を示す（α１＝Ｉ１／ΣＩＩ、α２＝Ｉ２／ΣＩｉ、α３＝Ｉ３／ΣＩｉなど）。ファイバー束上に存在する１２８種類のビーズ１セットを、４種類の色素（Ｂｏｄｉｐｙ−４９３、Ｂｏｄｉｐｙ−Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ−ＴＸＲ、およびＢｏｄ−５６４）で標識した相補オリゴヌクレオチドのハイブリダイジングセットによって解読した（オリゴヌクレオチド１個につき色素１種類だけ）。ビーズ４０１３個を解読した４段階解読の第２段階を示す。色相クラスター域の周囲に卵形線が描かれている。
【００１６】
図４は、ＦＡＭ標識オリゴ補体またはＣｙ３標識オリゴ補体のいずれかを用いてアレイ上の異なる種類のビーズを彩色（標識）する二色解読法を示す。
【００１７】
図５は、４種類の色および４つの解読段階を用いる１２８種類のビーズの解読を示す（差し込み図は、１６種類のビーズを解読するために４種類の色素を用いる単一の解読段階を示す）。
【００１８】
図６は、１６種類のビーズのグレースケール解読を示す。（Ａ）相補的な解読オリゴについてのコンビナトリアルプールリングスキーム。（Ｂ）２つの独立した標準化画像が得られ、得られたビーズ強度を比較した。（Ｃ）（Ａ）に記載した３つの解読段階についてアルファ値（標準化画像における強度に対する所定の解読段階におけるビーズ強度の比）をプロットする。
【００１９】
図７は、蓋およびベースプレートを略図的に示す。Ａ：ハイブリダイゼーションチャンバーの蓋１０およびベースプレート６０を示す。蓋における口２０は、蓋を介して光ファイバー束３０を挿入させ、ベースプレート６０のベースキャビティ５０中のマイクロタイター４０のウェル中の試料を接触させる。Ｂ：ベースプレート６０のベースキャビティ５０を示す。
【００２０】
図８は、蓋１０およびベースプレート６０を含むハイブリダイゼーションチャンバーを略図的に示す。また、周囲シール８０、クランプ９０およびクランプレセプタクル９５、蓋を介してマイクロタイタープレート４０のウェル中に挿入された光ファイバー束３０を示す。
【００２１】
図９は、穴１０５を有するベースプレートを示す。Ａ：ベースプレートにおける穴１０５を示す。Ｂ：穴１０５を連結しているチャネル１００を示す。
【００２２】
図１０は、加圧および／または減圧によって引き起こされる膜上の可変の溶液容積および局在化を示す。Ａ：＋Ｐが加圧を示し；−Ｐが減圧を示す。全てのチャンバーおよび穴において加圧に応答して膜が上方に曲がる。Ｂ：左チャンバーに減圧を適用し、中央および右チャンバーに加圧を適用すると、流体は膜の左側に移動する。Ｃ：まず、左部分に減圧を適用すると、流体は、ウェルを満たす。次に、中央および右チャンバーに減圧を適用すると、空のウェルが形成される。Ｄ：中心に減圧を適用し、左および右チャンバーに加圧を適用すると、流体は膜の中央に移動する。Ｅ：中心における高減圧によって形成されたウェルが流体で満たされる。低減圧を適用すると、左および右にからのウェルが形成される。Ｆ：右チャンバーに減圧を適用し、左および中央チャンバーに加圧を適用すると、流体が右側に移動する。
【００２３】
図１１は、ハイブリダイゼーションチャンバーについての使用を見出す代表的なアッセイスキームのフローチャートを示す。
図１２は、顕微鏡用スライドフォーマットにおけるアレイ・オブ・アレイズを示す。
図１３は、アレイを調製するための金型を示す。
【００２４】
（発明の詳細な記載）
本発明は、数多くの試料に対する同時分析、すなわち、連続プロセシングよりもむしろ並行プロセシングを許容することができる非常に高密度なアレイの形成に関する。これは、多くの試料のプロセシングを許容するように形成されている、「アレイ・オブ・アレイズ（array of arraysＴＭ）」、すなわち、複数の個々のアレイを含む複合アレイを形成することによって行われる。例えば、個々のアレイは、各々、マイクロタイタープレートの各ウェル内に存在している。かくして、マイクロタイタープレートの大きさおよび個々のアレイの大きさに依存して非常に多数のアッセイを同時に行うことができる；例えば、２,０００種類の異なった種の個々のアレイ（高いレベルの重複性が組込まれている）および９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、１９２,０００個の実験を一度に行うことができる；３８４マイクロタイタープレート中の同一のアレイは、７６８,０００個の同時実験を行い、１５３６マイクロタイタープレートは、３,０７２,０００個の実験を行う。
【００２５】
一般的に、本発明のアレイ組成物は、いくつかの方法で形成することができる。好ましい実施態様において、以下にさらに詳しく概説するように、「一成分」系が用いられる。すなわち、マイクロタイタープレートのような、複数のアッセイ位置（本明細書において、しばしば、「アッセイウェル」と称することもある）を含む第１基材を各アッセイ位置が個々のアレイを含有するように形成する。かくして、該アッセイ位置とアレイ位置とは同じである。例えば、プラスチック材料製マイクロタイタープレートを、アッセイウェルの各底に複数の「ビーズウェル」を含有するように形成することができる。以下にさらに詳しく記載するように、次いで、生物活性因子を含有するビーズを、各アッセイ位置におけるビーズウェル中に負荷することができる。本明細書の記載は、ビーズの使用を強調しているが、本発明の実施態様の全てにおいてビーズを用いることが必要なわけではないことに注目すべきである；生物活性因子を直接アレイ位置に結合させることができる。例えば、他の種類のアレイは、よく知られており、このフォーマットにおいて用いることができる；スポットされたアレイ、プリントされたアレイまたは写真平版アレイがよく知られている；WO 95/25116；WO 95/35505；PCT US98/09163；米国特許第5,700,637号；第5,807,522号および第5,445,934号；および米国出願番号第08/851,203号、09/187,289号；ならびにその中で引用されている文献を参照のこと（これらの全ては出典明示により明らかに本明細書の記載とする）。一成分系において、ビーズを用いない場合、好ましい実施態様は、非シリコーンウェハー基材を用いる。
【００２６】
別法として、「二成分」系を用いることができる。この実施態様において、個々のアレイを第２基材の上に形成し、次いで、第１マイクロタイタープレート基材中に装着または「浸漬」させることができる。当業者によって理解されるように、種々のアレイフォーマットおよび形態を用いることができる。好ましい実施態様は、個々のアレイとして、生物活性因子を含有するビーズを光ファイバー束の端部に負荷するように一般に個々のファイバーの各々の一表面中にエッチングされた「ビーズウェル」を有する光ファイバー束を用いる。かくして、複合アレイは、マイクロタイタープレートのウェル中に適合するように形成される多数の個々のアレイを含む。別法として、二成分系において他の種類のアレイフォーマットを用いることができる。例えば、スポッティング法、プリンティング法または写真平版法によって調製されるような規則的アレイを上記で概説した第２基材上に置くことができる。さらにまた、図１Ｃ〜Ｆに示すように、ランダムまたは規則的のいずれかのアレイの「片」を第１基材として用いることができる。
【００２７】
本発明、一般に、種々の化学官能基を担持するマイクロスフェアとも称されるビーズが、個々のマイクロスフェアを結合することができる別個の部位のパターン化された表面を含む基材上に分布されている、ビーズをベースとした分析化学を含む従前の研究に基づいている。一般に、ビーズは、基材上にランダムに置かれ、かくして、該アレイを「解読（decode）」するのに数種類の方法を用いることができる。一の実施態様において、いずれかの特定のビーズ上の化学官能基を同定するために用いることができる固有の光学サイン、一般に、蛍光色素をビーズ中に取り込む。これは、アレイ上の位置から分離されるべき候補因子（すなわち、核酸および抗体のような化合物）の合成を許容する。すなわち、候補因子をビーズ上で合成し、次いで、該ビーズをパターン化された表面上にランダムに分布させる。まず、ビーズを光学サインで被覆するので、これは、後にアレイを「解読」することができることを意味する。すなわち、アレイを調製した後、アレイ上の個々の部位の位置とその特定部位でのビーズまたは候補因子とを相互に関係付けることができる。これは、ビーズをアレイ上にランダムに分布することができることを意味し、従来技術の in situ 合成法またはスポッティング法のいずれと比較しても迅速かつ安価な方法である。これらの方法は、PCT/US98/05025；PCT/US98/21193；PCT/US99/20914；PCT/US99/14387；および米国出願番号第08/818,199号；第09/315,584号；および第09/151,877号に概説されている（これらの全ては出典明示により明らかに本明細書の記載とする）。加えて、本明細書は、一般に、ビーズの使用について検討されているが、同一形態を細胞および他の粒子に対して適用することができる；例えば、PCT/US99/04473 を参照のこと。
【００２８】
これらの系において、生物活性因子の配置は一般にランダムであり、かくして、コード化／解読系は、アレイにおける各位置での生物活性因子を同定することが必要とする。これは、以下にさらに詳しく概説するように、種々の方法で行うことができ、一般に、ａ）ビーズに付着した生物活性因子またはアイデンティファイアー結合リガンド（ＩＢＬ）に結合する、一般に、直接標識されたデコーディング結合リガンド（ＤＢＬ）の使用；ｂ）以下にさらに詳しく概説するように、例えば、ビーズの位置を標的にすることによる（例えば、光活性性または光切断性成分を用いてビーズの特定位置への選択的付加を許容することによる）か、または、サブバンドルもしくは部位の選択的負荷を用いることによる位置解読；ｃ）標的と結合するこれらのビーズだけを解読する選択的解読；またはｄ）これらのいずれかの併用を包含する。以下にさらに詳しく概説するように、場合によっては、この解読が全てのビーズに対して、または、特定の標的分析物を結合するビーズだけに対して生じてもよい。同様に、これは、標的分析物の付加の前または後のいずれで生じてもよい。
【００２９】
一旦アレイ中の各マイクロスフェアの同一性（すなわち、実際の因子）および位置が決定されれば、アレイを標的分析物を含有する試料に曝露するが、上記のように、これは分析の前または間にも実施できる。標的分析物は、以下でより詳細に記載するように、生物活性因子に結合し、特定のビーズの光学的シグナルの変化を生じる。
【００３０】
本発明において、「デコーディング」には光学的シグネーチャー、デコーディング工程の間に添加されるデコーディング結合リガンド、またはこれらの方法の組合せを使用し得る。デコーディング結合リガンドは、ビーズ上に配置された異なる同定結合リガンドパートナー、または、例えばビーズが一本鎖核酸を生物活性因子として含む場合、生物活性因子自体のいずれかに結合する。デコーディング結合リガンドは直接的または間接的のいずれかで標識され、従ってデコーディングは標識の存在を検出することによって生じる。デコーディング結合リガンドのプールを逐次的に使用することによって、必要とされるデコーディング工程数を大いに最小化することが可能である。
【００３１】
従って、本発明は、複数のアッセイ位置を含む表面を有する第１の基材を少なくとも含む複合アレイ組成物を提供する。本明細書において「アレイ」は、アレイ形式の複数の候補因子を意味する；アレイのサイズはアレイの構成および最終用途に依存する。約２個から数百万個の異なる生物活性因子を含むアレイ（例えば、異なるビーズ）を作製することができ、非常に大きなアレイが可能である。一般に、アレイは、ビーズのサイズ、基材およびアレイの最終用途に依存して２個から１０億個以上までを含む。従って、超高密度、高密度、中密度、低密度および超低密度アレイを作製してもよい。超高密度アレイの好ましい範囲は約１０，０００，０００〜約２，０００，０００，０００であり（数字は全て平方ｃｍ）、約１００，０００，０００〜約１，０００，０００，０００が好ましい。高密度アレイは約１００，０００〜約１０，０００，０００の範囲であり、約１，０００，０００〜約５，０００，０００が特に好ましい。中密度アレイは好ましくは約１０，０００〜約１００，０００の範囲であり、約２０，０００〜約５０，０００が特に好ましい。低密度アレイは一般に１０，０００未満であり、約１，０００〜約５，０００が好ましい。超低密度アレイは１，０００未満であり、約１０〜約１０００が好ましく、約１００〜約５００が特に好ましい。いくつかの実施態様において、本発明の組成物はアレイ形式でなくてもよい；すなわち、いくつかの実施態様について、単一の生物活性因子を含む組成物を作製してもよい。さらに、いくつかのアレイにおいて、異なるかまたは同一の組成物のいずれかの、複数の基材を使用してもよい。従って、例えば、大きなアレイは複数のより小さな基材を含んでもよい。
【００３２】
さらに、本発明の組成物の１つの利点は、特に光ファイバー技術の使用を介して、非常に高密度のアレイを作製することができることである。従って、例えば、２００μｍ以下のビーズを使用でき（２００ｎｍのビーズが可能である）、非常に小さなファイバーが知られているので、１ｍｍ２の光ファイバーバンドル中に４０，０００〜５０，０００以上（いくつかの場合、百万）の異なるファイバーおよびビーズを有することが可能であり、０．５ｃｍ２当り１５，０００，０００（いくつかの場合２千５百万〜５千万）の個々のビーズおよびファイバーより高い密度が得られる。
【００３３】
本明細書において「複合アレイ」または「組合せアレイ」または文法上等価な語は、上記のような複数の個々のアレイを意味する。一般に、個々のアレイの数は使用するマイクロタイタープレートのサイズによって設定される；従って、９６ウェル、３８４ウェルおよび１５３６ウェルマイクロタイタープレートは９６個、３８４個および１５３６個の個々のアレイを含む複合アレイを利用するが、当業者に理解されるように、各マイクロタイターウェルが個々のアレイを含む必要はない。複合アレイが同一、類似または異なる個々のアレイを含み得ることに留意すべきである。すなわち、いくつかの実施態様において、同じ２，０００回のアッセイを９６個の異なる試料に対して実施するか；あるいは１９２，０００回の実験を同じ試料（すなわち、９６ウェルの各々中の同じ試料）に対して実施することが望ましくあり得る。あるいは、重複性／品質管理のために、複合アレイの各行または列が、同じであり得る。当業者に理解されるように、システムを配置するための種々の方法が存在する。さらに、アレイのランダムな性質は、ビーズの同じ集団を２つの異なる表面に添加し、実質的に類似するがおそらく同一ではないアレイを生じさせ得ることを意味し得る。
【００３４】
本明細書において「基材」または「固体支持体」または他の文法上等価な語は、ビーズの結合または会合に適切な分離した個々の部位を含むように修飾可能であり、少なくとも１つの検出方法に使用可能ないずれかの材料を意味する。当業者に理解されるように可能な基材の数は非常に多い。可能な基材は、限定するものではないが、ガラスおよび修飾または官能基付与ガラス、プラスティック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンＪなどを含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカベースの材料（シリコンおよび修飾シリコンを含む）、炭素、金属、無機ガラス、プラスティック、光ファイバーバンドルならびに種々のその他のポリマーを含む。一般に、基材は光学的検出を可能にし、それ自体は認識可能な蛍光を発しない。
【００３５】
好ましい実施態様において、基材は金属（限定するものではないが、アルミニウムまたはステンレススチールを包含する）、シリコン、ガラス、いずれかのポリマーベースの材料、または本明細書に記載のいずれかの基材材料から作製される。好ましい実施態様において、基材は熱硬化性または熱可塑性ポリマーから作製される。アレイは当該分野において公知のミクロファブリケーション技術によって調製される。この技術は、限定するものではないが、射出成形、ホットエンボシング、ＵＶリソグラフィ、表面ミクロマシン、光重合、エッチング、ミクロステレオリソグラフィおよび電気メッキを包含する。好ましい実施態様において、当該分野において公知のマスクを使用した写真印刷によって基材上にウェルを形成させる。広範な基材が利用可能であるが、好ましくは所望の光学的特性を有する基材が選択される。すなわち、限定するものではないが、低い自己蛍光を有すること、または不透明もしくは反射性であることを包含する特性を有する基材が選択される。さらに、いくつかの実施態様において、特定の機械的特性（例えば、剛性）が好ましい。さらに、表面の金属コーティングを用いてアレイからのシグナル収集を増強することができる。また、いくつかの実施態様において、アレイの表面を修飾してアレイの可湿性を改善する。可湿性の改善方法は、限定するものではないが、酸腐食またはイオン衝撃を包含する。好ましい実施態様において、基材は標準的な顕微鏡スライドの形態または寸法である。
【００３６】
さらに、基材上の部位またはウェルの形状をシグナルの生成を変化させるように修飾することができる。すなわち、ウェルの形状を四角、丸または多角形にすることができる。シグナルの出力および／または検出を改善するためのこれらおよびさらなる表面の修飾はＵＳＳＮ ０９／６５１，１８１（２０００年８月３０日出願）よびＰＣＴ／ＵＳ００／２３８３０（２０００年８月３０日出願）（出典明示で援用する）により詳細に記載されている。
【００３７】
一般に、基材は平ら（平面）であるが、当業者に理解されるように、基材の他の立体配置を使用してもよい；例えば、試料のビーズへの接近を可能にするプラスティックの多孔性ブロック中にビーズを包埋し、検出用に共焦点顕微鏡を使用することによって三次元立体配置を使用することができる。同様に、素通り試料分析のために、ビーズをチューブの内側表面に配置して試料容積を最小化してもよい。好ましい基材は、下記の光ファイバーバンドル、ならびに平面基材（例えば、ガラス、ポリスチレンおよび他のプラスティックおよびアクリル）を包含する。いくつかの実施態様において、シリコンウェハー基材は好ましくない。１つの実施態様において、基材は顕微鏡スライドの形状であるかまたは顕微鏡スライドである（図１２参照）。
【００３８】
すなわち、好ましい実施態様において、基材は顕微鏡スライドであるかまたは標準的な顕微鏡スライドと実質的に同じ寸法の基材である。当業者に理解されるように、顕微鏡スライドは約３”または約７．５ｃｍかける約１”または２．５ｃｍで厚さ約０．０４”または約１ｍｍであるが、異なる寸法を使用することができる。従って、好ましい実施態様において、本発明の基材は約７．５ｃｍかける２．５ｃｍかける約１ｍｍである（図１２）。このサイズの基材を使用する利点は、既存の機器、すなわち検出器を使用して基材上のシグナルを分析できることである。すなわち、既存のスキャニングベースの機器（限定するものではないが、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｍａｎｉｃｓ、Ｇｅｎｅ Ｍａｃｈｉｎｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖｙｓｉｓ、ＡｘｏｎおよびＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄによって販売されるものを包含する）を使用して本発明のアレイを分析することができる。
【００３９】
第１の基材は複数のアッセイ位置、すなわち標的分析物の検出のためのアッセイが生じる位置を含む表面を含む。アッセイ位置は一般に、例えばマイクロタイタープレート中のアッセイウェルのように互いに物理的に分離しているが、他の立体配置（疎水性／親水性など）を使用してアッセイ位置を分離することができる。
【００４０】
しかし、アッセイ位置がマイクロタイタープレートのウェルに限定される必要はない。すなわち、基材上のいずれかの分離可能な位置がアッセイ位置として作用する。分離可能な位置は、基材上の他の領域から物理的に分離した基材上の位置を意味する。物理的分離はアッセイ位置間のいずれかの境界であり得る。分離は区分であり得、あるいは分離は単に、少なくとも一方を他方から区別するために十分なアッセイ位置の間隔であり得る。各アッセイ位置において溶液を分離して維持することが望ましい場合、１つのアッセイ位置に送達された試薬が別のアッセイ位置に相互汚染しないように十分な分離が存在することのみが必要とされる。しかし、いくつかの実施態様においてはそのような物理的障害は必要ではなく、いくつかの場合では所望もされない。アッセイ位置は一方から他方を区別するために十分に分離されていることのみが必要である。区分または境界がアッセイ位置間で使用される場合、好ましい境界は、限定するものではないが以下を包含する：アッセイ位置を取り囲む疎水性領域；アッセイ位置間の試料の移動を防止するために十分な幅および高さのうねもしくはへり；またはアッセイ位置間の試料の移動を防止するために十分な幅および深さのみぞ。いくつかの実施態様において、境界は、限定するものではないが、ゴムまたはシリコンを包含するガスケットから作製される。すなわち、好ましい実施態様において、境界は、基材のウェル間の試料または試薬の漏れを防止するための密封機構を含む。当業者に理解されるように、これは種々の異なる形態を取り得る。１つの実施態様において、アレイを含む基材上にガスケットが存在する（シート、チューブまたはストリップを含む）。あるいは、ゴムまたはシリコンのストリップまたはチューブを使用してもよい。１つの実施態様において、基材は、ガスケットを合わせる刻みまたは溝を含む。さらに、ガスケットを基材に結合させるために接着剤を使用することができる。アッセイ位置を取り囲むために疎水性領域を使用する場合、疎水性領域は有効に溶液を含むかまたは溶液を疎水性領域によって取り囲まれた領域内に含まれる部位に局在化させる。いくつかの実施態様において、境界または区分は、限定するものではないがゲルを包含する印刷可能材料から作製される。
【００４１】
また、いくつかの実施態様において、ウェル間の液体の流動のために溝を提供することが望ましい。この実施態様において、溝は本明細書に記載のように基材にエッチングできる。別の実施態様において、所望の液体誘導経路を作製するために印刷技術を使用する；すなわち、印刷材料のパターンによって、方向付けられた液体輸送を可能にすることができる。従って、「インク」の集結によって流動溝を規定することができる。さらに、異なる「インク」または「ペースト」の使用によって経路の異なる位置が異なる流動特性を有するようにすることができる。液体誘導経路中の試薬の保持時間を改変することが所望される場合、多材料液体誘導経路を使用することができる。さらに、試薬を「インク」中に含めることによって、または次の印刷工程によって、印刷した液体誘導経路も試薬物質を含有する領域を提供することができる。例えば、米国特許第５，７９５，４５３号（出典明示で援用する）を参照のこと。
【００４２】
１つの実施態様において、アッセイ位置は基材中のくぼんだ領域である。本明細書に記載のように、くぼんだ領域またはアッセイ位置は分離した部位またはウェルを含む。
【００４３】
好ましい実施態様において、基材上のアッセイ位置は光ファイバーバンドルである。すなわち、光ファイバーバンドルを、以下でより詳細に記載するように、基材に結合するかまたは基材に挿入し、分離したアッセイ位置を形成する。全ての実施態様において必要とされるわけではないが、いくつかの実施態様において、光ファイバーバンドルは、限定するものではないが、上記のもの（例えば、疎水性領域、うねまたはみぞ）を包含する区分によって互いに物理的に分離している。あるいは、各ファイバーバンドルは一方から他方を区別するために十分な距離によって分離されている。
【００４４】
好ましい実施態様において、第２の基材は光ファイバーバンドルまたはアレイであり、これはＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４４，８５０および０８／５１９，０６２、ＰＣＴ ＵＳ９８／０５０２５およびＰＣＴ ＵＳ９８／０９１６３（出典明示で援用する）に一般的に記載されている。好ましい実施態様は事前形成ユニタリー光ファイバーアレイを利用する。本明細書において、「事前形成ユニタリー光ファイバーアレイ」は、同軸配置され、その長さに沿って連結された分離した個々の光ファイバーストランドのアレイを意味する。一般にファイバーストランドは個々に被覆されている。しかし、事前形成ユニタリーアレイと他の光ファイバー形式を区別する１つの事項は、ファイバーが個々に物理的に操作可能でないことである；すなわち、１つのストランドは一般にその長さに沿ったいかなる点においても別のファイバーストランドから物理的に分離できない。
【００４５】
しかし、いくつかの「２成分」の実施態様において、第２の基材は光ファイバーアレイではない。
【００４６】
好ましい実施態様において、アッセイ位置（「１成分システム」の）またはアレイ位置（「２成分システム」の）は複数の分離した部位を含む。従って、前者の場合、上記のように、アッセイ位置はアレイ位置と同じである。後者の場合、アレイ位置をアッセイ位置に別個に適合させる。これらの実施態様において、基材の少なくとも１つの表面は、後のマイクロスフェアの会合のために（または、マイクロスフェアを使用しない場合は生物活性因子の結合のために）、分離した個々の部位を含むように修飾される。これらの部位は、物理的に変化した部位、すなわち物理的立体配置、例えばマイクロスフェアがウェル中に留まることができるようにビーズを保持できる基材中のウェルまたは小さなくぼみ、または他の力（磁気力もしくは圧縮力）の使用、または化学的に変化したもしくは活性な部位、例えば化学的官能基付与部位、静電的に変化した部位、疎水性／親水性官能基付与部位、接着剤のスポットなどを含んでもよい。
【００４７】
部位はパターン、すなわち規則正しいデザインもしくは立体配置であってもよく、またはランダムに分布していてもよい。好ましい実施態様は、部位にＸ−Ｙ座標平面においてアドレスし得るように、規則正しい部位のパターンを利用する。この意味での「パターン」は、繰り返し単位セル、好ましくは基材上でのビーズの高密度を可能にするものを含む。しかし、これらの部位が分離した部位でなくてもよいことに留意すべきである。すなわち、例えば、いずれかの位置でのビーズの結合を可能にする接着剤または化学官能基の均質な表面を使用することが可能である。すなわち、基材の表面は、個々の部位における（これらの部位が他の部位と連続的であっても不連続であっても）マイクロスフェアの結合を可能にするように修飾される。従って、基材の表面は、単一の会合したビーズのみを有することができる分離した部位が形成されるように修飾されていてもよく、あるいは基材の表面は修飾され、ビーズはどこにでも下るが、最後に分離した部位に至る。
【００４８】
好ましい実施態様において、基材の表面は、基材の表面中にウェル、すなわちくぼみを含むように修飾される。これは当該分野において一般に知られるように種々の技術を使用して実施し得る。この技術は、限定するものではないが、写真印刷、打抜技術、成形技術およびミクロエッチング技術を含む。当業者に理解されるように、使用する技術は基材の組成および形状に依存する。第１の基材がアッセイ位置および個々のアレイの両方を含む場合、好ましい方法は、マイクロタイタープレート中のアッセイウェルの底にビーズウェルを形成する成形技術を利用する。同様に、好ましい実施態様は、アレイ形式で各フィンガーがビーズウェルを含む「フィンガー」または突起を含む成形された第２の基材を利用する。
【００４９】
好ましい実施態様において、部位またはウェルは互いに間隔をもって分離される。当業者に理解されるように、ビーズの間隔は、中心間の距離を算出することによって決定される。部位の間隔を変動させることによって高密度、中密度または低密度のアレイが形成される。高密度アレイは、約５〜１５μｍ未満分離した部位を有することによって特徴付けられる。中密度アレイは、約１５〜３０μｍ分離した部位を有し、低密度アレイは３０μｍより大きく分離した部位を有する。一般に、部位は１００μｍ未満、好ましくは５０μｍ未満、最も好ましくは１５〜２０μｍ未満分離している。ウェルの間隔をあけることの利点は特に市販のスキャナーを使用してアレイを分析できることにある。すなわち、スキャナーの解像度は変動し、高いまたは低い解像度のスキャナーでの検出を可能にするアレイを形成することができる。高密度アレイには高解像度のスキャナー（＜５μｍ）を用いることができる。これらのスキャナーは特性（すなわちビーズ）の間隔が近い（＜１５μｍ）アレイを有効に分析する。より低解像度（＞５μｍ）のスキャナーには、より大きなビーズ間隔（すなわち、＞１０μｍ）を利用することができ、１５〜２０μｍが好ましい。両方の場合において、限定するものではないがＡＸＯＮ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＧＥＮＥＰＩＸソフトウェアパッケージまたは従来の蛍光顕微鏡スキャニング装置とともに提供される他のもののような種々のソフトウェアパッケージを使用する。好ましい実施態様において、ソフトウェアは、ビーズを分解しシグナル強度情報を引き出すためにコントラストに基くかまたはその他の画像処理アルゴリズムを用いる（ＵＳＳＮ ０９／６５１，１８１（２０００年８月３０日出願）よびＰＣＴ／ＵＳ００／２３８３０（２０００年８月３０日出願）（出典明示で援用する）も参照のこと）。
【００５０】
上記の実施態様においては特性の間隔は機材上の部位の間隔を物理的に変化させることによって達成されるが、別の実施態様において、ビーズウェル中のビーズがアレイを形成する場合、生物活性因子を含むビーズ集団に、生物活性因子を含まないビーズ集団を添加することによって密度を調節する。すなわち、生物活性因子を有しない（いくつかの実施態様においては検出可能なシグナルまたは標識を有しない）ビーズ集団を、生物活性因子を含む少なくとも１つのビーズ集団に添加する。生物活性因子を欠いたビーズ、すなわち「ブランクビーズ」は生物活性因子を有するビーズの濃度を希釈する。基材上に適用または分布すると、これによって生物活性因子を有するビーズの間隔が増加する。すなわち、ブランクビーズが存在しないと生物活性因子を有するビーズは１ウェル当りビーズ１個以下の平均密度で基材上の実質的に全てのウェルを満たす。ウェルの間隔が近接している場合、高解像度スキャナーのみがアレイを有効に分析する。しかし、ブランクビーズ集団を添加すると、ブランクビーズは生物活性因子を有するビーズとともに分布し、それによって生物活性因子を有するビーズ間の距離が増加する。従って、好ましい実施態様において、生物活性因子を有するビーズの中心間の距離は少なくとも５μｍ；より好ましくは１０〜５０μｍ；最も好ましくは１５〜２５μｍである。
【００５１】
１つの実施態様において、生物活性因子を有するビーズとブランクビーズとの間の比率を、アレイ上の生物活性因子を有するビーズの適正な密度を達成するように調整する。比率は所望されるビーズの間隔に依存する。すなわち、生物活性因子を有するビーズをビーズｎ個分離れるようにすることが所望される場合、生物活性因子を有するビーズのブランクビーズに対する比率はｎ２である。すなわち、生物活性因子を有するビーズをブランクビーズ６個分分離させることが所望される場合、生物活性因子を有するビーズのブランクビーズに対する比率は１；６２または１：３６である。いくつかの実施態様においては少数のブランクビーズを含めることのみが必要である（すなわち、比率が約１０：１以上である）かもしれないが、好ましい実施態様においては、比率は少なくとも１：３６以上、特に好ましくは１：１００である。
【００５２】
別の実施態様において、アレイは第１の生物活性因子を有する第１のビーズ集団および第２の生物活性因子の集団を有する第２のビーズ集団を含む。従来のスキャナーを使用できるようにアレイ上のビーズの間隔を調節する場合、この実施態様において各ビーズ集団について異なるタグで標識するかまたはタグ付加することが有用である。タグは好ましくは異なるチャネルにおいて検出可能である。一度に１つのビーズ集団のみが分析される。従って、分析されないビーズはスペーサービーズとして作用するが、それらは生物活性因子を含み、異なるチャネルにおいて分析することができる。各集団由来のビーズの間隔は分析のために適切にあけられ、分析すべきビーズの数はブランクビーズを使用する上記のアッセイに比較して増加する。すなわち、第１のチャネル（これは第２のビーズ集団を検出しない）において第１のビーズ集団を分析する場合、第２のビーズ集団はスペーシングビーズまたはブランクビーズとして作用する。第２のビーズ集団は第１のビーズ集団の間隔を増加させるように作用する。次に第２のチャネルにおいて第２のビーズ集団を分析する場合、第１のビーズ集団は、第２のビーズ集団を分離するスペーシングまたは「ブランク」ビーズとして作用する。
【００５３】
従って、本発明は、上記のようなアレイおよび検出器も含む。好ましい実施態様において、アレイは検出器中に存在する。特に好ましい実施態様において、基材は顕微鏡スライドであり、光ファイバーバンドルはアレイ位置およびアッセイ位置を形成し、このアレイは検出器中に存在する。
【００５４】
好ましい実施態様において、基材の表面において物理的変化を作製して、部位を生じさせる。好ましい実施態様において、例えば第２の基材が光ファイバーバンドルである場合、０８／８１８，１９９および０９／１５１，８７７（出典明示で援用する）に一般的に記載されるように、基材の表面はファイバーバンドルの末端である。この実施態様において、個々のファイバーを含む光ファイバーバンドルの末端または遠位端においてウェルを作製する。この実施態様において、小さなウェルまたはくぼみがファイバーの一方の末端において形成されるように、被覆に関して、個々のファイバーのコアをエッチングする。必要なウェルの深さはウェルに添加しようとするビーズのサイズに依存する。
【００５５】
この実施態様において一般に、マイクロスフェアはウェルに非共有的に会合しているが、以下で一般的に記載するように、ウェルをさらに化学的に官能基付与してもよく、架橋剤を使用してもよく、または物理的障害、すなわちビーズをおおうフィルムまたはメンブレンを使用してもよい。
【００５６】
好ましい実施態様において、本発明のマイクロスフェアを基材上の分離した部位または位置に結合（共有または非共有のいずれか）させるために使用できる修飾部位、特に化学的修飾部位を含むように基材の表面を修飾する。この関連での「化学的修飾部位」は、限定するものではないが、以下を含む：一般に対応する反応性官能基もまた含む、マイクロスフェアを共有結合させるために使用できる化学官能基（アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基を含む）のパターンの付加；マイクロスフェアを結合させるために使用できる接着剤のパターンの付加（接着剤の付加のための従来の化学官能基付与または接着剤の直接的付加による）；マイクロスフェアの静電結合のための（すなわち、マイクロスフェアが部位と反対の荷電基を含む場合）荷電基（化学官能基に類似）のパターンの付加；部位を差次的に疎水性または親水性にする化学官能基のパターンの付加（その結果、同様に疎水性または親水性のマイクロスフェアを適切な実験条件下で添加するとマイクロスフェアがハイドロアフィニティに基いて部位に会合する）。例えば、水性系中で疎水性部位を疎水性ビーズとともに使用すると、ビーズは優先的に部位に会合させられる。
【００５７】
さらに、生物学的に修飾した部位を使用してビーズを基材に結合させてもよい。例えば、本明細書に一般的に記載するような結合リガンド対を使用してもよい；一方のパートナーはビーズ上に存在し、他方は基材上に存在する。この実施態様において特に好ましいのは、相補的核酸鎖および抗原／抗体対である。
【００５８】
さらに、この方法での生物学的部分の使用は、複合アレイの作製も可能する。これは、基材１０を欠く以外は図１Ｆに記載のシステムに類似している。この実施態様において、ビーズの集団は単一の結合パートナーを含み、この集団の亜集団は異なる生物学的因子を有する。異なる結合パートナーを有する異なる集団および空間的に分離した結合パートナーを有する異なるアッセイもしくはアレイ位置を含む基材を使用することによって、複合アレイを生成することができる。複合アレイの各々の分離したアレイが同じコードを使用し得るので、この実施態様はまた以下で一般的に記載するコードの再使用である。
【００５９】
上記のように、この意味での「パターン」は、ビーズの分離した部位への結合を可能にする均質な表面処理、ならびに分離した部位を生じる表面処理の使用を包含する。当業者に理解されるように、これは種々の方法によって達成され得る。
【００６０】
上記のように、本発明のアレイおよび特に１成分システムのアレイは、基材の表面を、分離した部位またはウェルを含むように変化させることによって形成される。好ましくは、本明細書に記載のように、ウェルは、１個以下のマイクロスフェアを含むように形成される。本明細書に記載のように、１成分システムにおいて、好ましい実施態様において、アッセイ位置（これは１成分システムにおいてアレイ位置も形成する）は光ファイバーバンドルである。別の実施態様において、本発明はアレイ上の少なくとも１つの分離した部位に光ファイバーバンドルのセグメントを含むアレイの改善した作製方法を提供する。
【００６１】
一般に、この実施態様において、少なくとも１つの、しかし一般的には複数の光ファイバーバンドルを平面基材に結合させるかまたは挿入して平面基材上のアレイのアレイを形成させる。光ファイバーバンドルを基材に結合させる場合、方法は長さＬの光ファイバーバンドルを提供すること（ここでＬは理論的にはいずれもの長さであり得る）、およびバンドルを、限定するものではないがダイヤモンドソーまたはウォータージェットの使用のような当該分野において公知の方法によって切断して複数の小さな光ファイバーバンドルセグメントを形成させることを包含する。次いでセグメントを、限定するものではないが、接着剤で結合したバンドルセグメントを収容する大きさの事前に形成されたウェル中にセグメントを配置すること、または光ファイバーバンドルが基材中に包埋されるように基材を融解することを包含する方法によってアレイに結合させる。
【００６２】
別の実施態様において、方法は、少なくとも１つの光ファイバーバンドルを基材材料（例えばプラスティックまたはセラミック）のブロックに挿入すること、次いでバンドルを含む基材を所望の厚さに切断することを包含する（図１３参照）。ファイバーバンドルの断面部分は基材材料によって縁どられる。一般に、少なくとも第１および第２のバンドルが基材材料に挿入される。一般に、バンドルは、本明細書に記載のようにアレイ形式である。当業者に理解されるように、この方法は多数の均質なアレイのアレイの生産を著しく容易にする。すなわち、理論的には、ファイバーバンドルの長さまたは厚さに上限はない。非常に長いバンドルを非常に厚い基材ブロック（すなわち、１メーターまでまたはより厚い）に挿入することができる。例えば、アレイの基材の代表的な厚さが約０．５ｃｍ未満であると考えれば、１ｍのブロック（１ｍのバンドルを挿入可能）によって少なくとも約２００個の均質なアレイのアレイが形成される。
【００６３】
該方法において、ファイバー束を基体中に、ブロック表面の水平面に対して実質的に垂直に挿入する。一般に、束を挿入されるオリフィスを作成するために、基体に穴を開けるかまたは機械加工する。いくつかの具体例において、オリフィスは束の周囲にあるシーラントまたはガスケットでライニングされる。別法では、ブロックを切断して複数の基体を形成させた後、シーラントまたはエポキシ樹脂を束の周囲の基体に塗布する。いくつかの具体例において、シーラントは束の周囲の基体からの幾分かのアッセイ溶液またはビーズの漏出を防ぎうるだけでなく、シーラントは他の束から１の束を単離する束の周囲の境界を形成するので、このことは有益である。すなわち、いったんアレイが形成されると、少なくとも第１の光ファイバー束の周囲の基体の表面に物質をアプライし；物質は適所にファイバー束を固定するだけでなく、異なるファイバー束を分離する仕切りも形成する。いくつかの具体例において、物質、すなわち、エポキシ樹脂は仕切りを形成するのではなく、適所にファイバー束を保持する。
【００６４】
別の具体例において、光ファイバー束を基体である物質の液体または溶融溶液中に置く。すなわち、該具体例において、基体は溶融可能な材料、例えば、限定するものではないが、プラスチックまたはワックスから形成される。好ましい具体例において、基体は熱硬化性または熱可塑性ポリマーから形成される。1の具体例において、少なくとも１個の光ファイバー束をホルダーによって一端に保持し、溶融した基体溶液中に浸漬する。
【００６５】
溶融した基体の使用は、アレイの基体の形成においていくらか有用である。一度堅くなった基体中に組み込まれるであろう溶融溶液に物質を加えることができることが特に有益である。すなわち、物質を加えて、基体を反射性または不透明にするなどの基体の特性を修飾することができる。特に好ましい具体例において、カーボンブラックを液体基体物質に加える。カーボンブラックの添加は、得られる基体を不透明にする。
【００６６】
容器はいずれの形状をとってもよく、加熱メカニズムは種々の様式で実行され得ることが理解される。しかしながら、束のアレイの少なくとも仮のホルダーから突き出ている部分が浸漬または浸水されうる溶融した基体の浴槽を作成および保持することが容器および加熱メカニズムの機能である。好ましい具体例において、容器は顕微鏡スライドと同じ寸法であり、その結果、得られる基体は顕微鏡スライドと同じサイズである。
【００６７】
溶融した基体は、個々の束間の空間を埋めるであろう。熱源を切り、基体を硬化させ、仮のホルダーを除去する。束の長さＬの少なくとも何分の一でも、束を基体内に埋め込む。次いで、基体を上記のように切断して、ファイバー束を含有する複数の基体を形成させる。
【００６８】
いくつかの具体例において、束の露出した末端を、典型的にはラッピングおよび磨くことによって機械加工または加工処理して、末端表面を平面化（planarize）する。本明細書に記載のように、凹状ウェル領域を各ストランドの曝露された末端の表面に形成させてもよく、ビーズが各ウェルまたは実質的な数のウェル中に沈殿する。
【００６９】
凝固した基体によって個々の束が互いにきっちりした位置合わせにおいて保持されることに注目する。各束の縦軸は、実質的に互いに平行なままであり、基体の上表面の平面に対して実質的に垂直なままであろう。
【００７０】
１の具体例において、基体の利点は、必要に応じて個々の束を除去および置き換えることができることである。例えば、１以上の束が損傷するかもしれない。アレイ全体を捨てるよりもむしろ、ワックスのような溶融可能な基体を用いる場合、損傷した束の周囲の基体を加熱することによって当該束を除去することができる。例えば、その内径が除去すべき束の外径Ｄを上回る薄い壁の中空管を加熱し、ワックスプローブ中を押し進め、当該束の周囲に置くことができる。この局所的な加熱は損傷した束を除去し、新しいまたは異なる束で置き換えることを可能にし、次いで、その周囲に溶融したワックスを挿入して基体内に置換した束を保持することができる。
【００７１】
好ましい具体例において、本発明はまた基体ホルダーを包含する。基体ホルダーはその中に基体を据える装置である。ホルダーはアレイの容易な取り扱いを可能にする。さらに、ホルダーは剛性を提供し、基体／アレイのゆがみを防ぐ。ホルダーはいずれの剛体物質からも形成できるが、好ましい具体例においてホルダーは金属である。
【００７２】
好ましい具体例において、ホルダーは、基体の各エッジの周囲にある金属枠組、すなわち、顕微鏡スライドアレイを含む。いくつかの具体例において、ホルダーは、ふたの開閉を可能にするための蝶番を包含していてもよいふたを含む。蝶番式のふた自体は、ホルダーからのアレイの挿入および除去を容易にする。ふたはいずれの材料からも作成できるが、アレイからのシグナルの検出を可能にする半透明材料が好ましい。
【００７３】
別の具体例において、ホルダーはさらに、枠組を結合させるベースを含む。ベースはいずれの剛体材料であってもよいが、好ましい具体例においてそれは半透明である。別法では、ベースは金属である。重要なことには、ホルダーは剛性のままであり、基体がゆがむのを防ぐ。
【００７４】
当業者に明らかなように、一般に図面に示すように、いくつかの可能な配置の系がある。本明細書に記載の標準的な形式のほかに、種々の他の形式を使用してもよい。例えば、図１Ｃ−１Ｆに示すように、基体の「ピース」を使用してもよく、それは互いに連結していない。さらに、これらは、同じアレイであっても異なるアレイであってもよい。これらのピースを個々に作成してもよく、またはそれらを単一基体上の巨大な単位として作成し、次いで、基体を異なる個々の基体に切断または分離してもよい。したがって、例えば、図１Ｃおよび１Ｄは、第２の基体のウェルに加えられる複数のビーズアレイを示し；図１Ｃは、混合を最大化するために形成される「ビーズのビーズ」である。図１Ｄは、複数の二次元の第１の基体を使用し；当業者に明らかなように、これらは第２の基体に結合していてもしていなくてもよい。１の具体例において、特別の結合手段を用いず；別法では、種々の結合技術を用いる。例えば、基体へのビーズの結合に関して概説されるように、接着、化学、疎水性／親水性相互作用などを包含する共有または非共有結合力を用いてもよい。さらに、基体は磁性であってもよく、また、適所に（および混合してもよい）磁性的に保持されうる。したがって、例えば、図１Ｆに示されるように、結合部分を使用でき；これらは共有結合または非共有結合であることができる。それらは単に結合のために使用してもよく、または第１の基体アレイを第２の基体の特定の位置に向けるために使用してもよい。したがって、例えば、異なるオリゴヌクレオチドを用いて、第１の基体を第２の基体に向け、結合させてもよい。
【００７５】
好ましい具体例において、画像化のために使用される基体中に確立された光学的特性が存在する。したがって、例えば、「映像に撮る（lensing）」能力は、１成分または２成分系のいずれかにおける基体中に確立されてもよい。例えば、１成分系において、１以上のアッセイ位置の底面は独特または特別の光学成分、例えば、レンズ、フィルター等を有していてもよい。
【００７６】
さらに、好ましい具体例は、アッセイ反応の混合を容易にする配置を利用する。例えば、好ましい具体例は、混合を可能にする２成分系を利用する。すなわち、いくつかの具体例において、アレイはブロックから突出し、アッセイ成分の良好な混合、反応速度の増加などを促進するために反応物を攪拌する「スティック」として使用できる。当業者に明らかなように、これは、種々の方法で達成されうる。好ましい具体例において、第１および第２の基体を、それらが互いにＸ−Ｙ座表面、Ｘ−Ｚ座表面、Ｙ−Ｚ座表面または３次元（Ｘ−Ｙ−Ｚ）のいずれかにおいて相対的に移動できるように配置する。好ましい具体例は、ブロックをプレートの平面またはそれに直交する面のいずれかにおいて自由に移動させるブロックジグを利用する。これは特に、反応容量が小さい場合に、標準的な混合条件はしばしばこれらの状況下でよく機能しないので、有用である。
【００７７】
このほか、またはその代わり、系の一部としての付加的な混合成分が存在し得る。例えば、加えられた外来性混合粒子が存在していてもよく；例えば、１の具体例は、混合を強いるために移動させる磁石と共に磁性粒子を利用し；例えば、小さい磁石混合棒および磁石攪拌プレートを用いてもよい。
【００７８】
別法では、１または２成分系のいずれかにおける混合は、系をシールし、標準的な技術を用いて、所望により混合粒子を用いて、それを振盪することによって達成できる。
【００７９】
好ましい具体例において、系は蒸発を減らし、小さい試料サイズおよび取り扱いを容易にするように配置する。すなわち、所定の空間を封じることによって系を閉じるかまたはシールして、少量の試料の調節を維持する。この点に関して、本発明は、アレイおよび／または試料を含むかまたは封入するハイブリダイゼーションチャンバーを提供する。より詳細に下記するように、好ましい具体例は、２成分系において特に有用であるが、１成分系においても有用であるベースプレートおよびアラインメント部分を含むハイブリダイゼーションチャンバーを利用する。
【００８０】
封入した系の１の利点は、振動を減少または低下させることである。すなわち、少量の試料なので、アレイは、例えば、台振盪、モーター振盪または空気循環による振動によって引き起こされる乱れに影響されやすい。アレイを封入すること、およびアレイをベースプレート上に置くことによって、ベースプレートが振動を低下させるので、試料およびアレイは振動によって引き起こされる乱れにあまり影響されなくなる。
【００８１】
本発明の該態様の付加的な利点は、封入したアレイが益々少量の使用を可能にすることである。開いたアレイ形式において、少量の試料は蒸発して、試料の変形、溶液中の溶質濃度の変化および不一致を包含する種々の問題を引き起こしうる。例えば、少量の試料が異なるアッセイ位置に存在する場合、溶液の特異な蒸発により、著しく変化した溶質濃度がもたらされ得る。かかる差異は、ハイブリダイゼーション速度を変化し、例えば、かかる開いたアレイから得られる結果を解釈および比較することが困難になる。しかしながら、例えば、本明細書に概説されるハイブリダイゼーションチャンバーにおいて、アレイを封入することにより、かかる試料変量を最小限にし、それにより、封入したアレイから得られるデータをより信頼できるものとする。したがって、本明細書に記載の方法のいずれも、ハイブリダイゼーションチャンバーと共に用いて有用である。
【００８２】
また、封入したアレイは、開いたアレイにおけるインキュベーション時間と比べて延長したアッセイ／インキュベーション時間を可能にする。さらに、シールまたは封入したアレイは試料の蒸発を防ぎ、延長したインキュベーション期間を可能にする。
【００８３】
さらに、封入したアレイは必要ならば、試料の混合を促進する。一般に、少量の試料を用いる場合、試料の十分な混合を達成することは困難である。しかしながら、より詳細に下記するように、１の具体例において、ハイブリダイゼーションチャンバーは、柔軟な膜を真空および／または加圧を提供する空気式装置と共に使用する場合、混合を促進する。
【００８４】
「２成分」系を用いる場合、ハイブリダイゼーションチャンバーを用いてもよい。すなわち、成分のどちらも、すなわち、複数のアッセイ位置を含む基体および複数のアレイ位置を含む基体をハイブリダイゼーションチャンバー内に封入する。好ましい具体例において、これらの成分は限定するものではないが、ハイブリダイゼーションチャンバー中に封入されている光ファイバーアレイおよびマルチウェルミクロタイタープレートを包含する。
【００８５】
好ましい具体例において、ハイブリダイゼーションチャンバーは、その上またはその中に成分の１つが置かれているベースプレートを含有する。「ベースプレート」なる語により、その上にアレイ成分の１つが置かれているいずれかの台またはホルダーを意味する。ベースプレートは、プラスチック、ガラスまたは金属あるいは基体に関して本明細書中に記載されたいずれかの材料を包含するいずれかの材料より作成されうる。ベースプレートが金属である場合、好ましくはアルミニウムにより作成される。アルミニウムは、軽量で、さらに耐久性のあるベースプレートを提供する。さらに、アルミニウムは、チャンバーに対して効率のよいおよび／または迅速な熱移動を可能とする。しかしながら、ベースプレートがプラスチックまたはガラスにより作成される場合、成分は直接、ベースプレートと接触する。別法では、金属薄板または鋳型をベースプレート中に挿入するか、またはベースプレート上に置いてもよい。金属薄板または鋳型は、種々の成分サイズおよび／または形状を適応させるために、種々の形状のいずれかを保持するように設計することができる。以前に記載されたように、金属は迅速で効率のよい熱伝導体であるという利点を提供する。
【００８６】
１の具体例において、ベースプレートは、その中にアレイ成分が置かれる少なくとも１つの陥没またはベースキャビティー（base cavity）を含有する。すなわち、ミクロタイタープレートが成分である場合、例えば、陥没またはベースキャビティーは、ミクロタイタープレートが直接その中に置かれ、好ましくは、余分な振動を避け、有効な熱移動を可能にするためにぴったりと嵌るように形成される。陥没はベースプレート中に成形してもよい。さらに、ベースプレートは複数の陥没またはキャビティーを含有していてもよく、その結果、複数の分離したアレイ成分が単一のベースプレート上に置かれる。別法では、ベースプレートは平面であってもよく、好ましくは、アレイを適所に維持するためにフックまたは他の結合部分を含む。
【００８７】
さらに好ましい具体例において、ハイブリダイゼーションチャンバーと共にふたを利用する。ふたはいずれの材料からも作成できるが（また、本明細書中の基体に関して列挙したとおり）、ガラス、プラスチックまたは金属が好ましい。ふたは好ましくは、ふたがベースプレート上に置かれる場合、閉じたチャンバーが形成されるようにベースプレートに適合している。
【００８８】
別の具体例において、ふたは、少なくとも１つの成分配置ポートを含む。「成分配置ポート」なる語により、それに対して成分が固定されるふた中の部位を意味する。すなわち、配置ポートは成分の１つをふたへ結合させる。好ましい具体例において、ポートは、それにより成分が挿入されるふた中の穴である。例えば、光ファイバー束が成分である場合、ポートを介して束を挿入する。該具体例において、ポートは付加的に、結合部位の周囲のシーラントを含み、その結果、成分、すなわち、光ファイバー束の遠位末端とふたの間に気密なシールが形成される。該シーラントは、下記するように、シリコーン、ゴム、プラスチックなどを包含するいずれの材料であってもよい。別法では、シールは石油ゼリーのようなゲルベースの物質、またはＰＡＲＡＦＩＬＭのようなフィルムベースの物質であってもよい。
【００８９】
付加的な具体例において、ふたは、ふた中の複数のポートを含む。すなわち、複数の成分が使用される場合、各成分につき別々のポートが必要である。例えば、複数の光ファイバー束を使用する場合、各光ファイバー束を別々のポートに置く。しかしながら、各光ファイバー束を１のポート中に一度に挿入することが可能であるが、同じ光ファイバー束を異なるポート中に連続的に挿入することも可能である。すなわち、成分を連続的に挿入するポートの数に限りはない。例えば、図７Ａに示されるように、ふた１０は、その中に光ファイバー束３０を置く複数のポート２０を含有する。次いで、ふたをベースプレート６０のベースキャビティー５０中のミクロタイタープレート４０上に置く。ベースプレート６０は図７ｂに示され、ベースプレート６０およびベースキャビティー５０を示す。
【００９０】
好ましい具体例において、ポートシールは溶液の汚染を減少または防ぐ。すなわち、個々のポート／成分の周囲のシールは、ベースプレートまたはアレイ成分に対してシールを形成し、その結果、特定のポート／成分に対応する試料由来の溶液が他の成分から分離またはシールされる。
【００９１】
別の具体例において、全てのポートがいつも成分でも満たされているわけではない。ポートの最大充填量未満が適当または所望される場合、プラグを成分を含有しないポート中に挿入することができる。この方法において、成分を含有しないポートの存在にもかかわらず、ふたは依然としてベースプレートと気密なシールを形成する。プラグはゴム製ストッパー、ガスケット、フィルム、ゲルなどの形態であることができる。
【００９２】
好ましい具体例において、ふたとベースプレートとの間のチャンバーの周囲にシーラントが存在する。シーラントは、ふたとベースプレートとの間に形成される気密なシールをもたらすいずれの材料であってもよい。好ましい具体例において、シーラントはゴム、例えば、ゴムまたはシリコーンガスケットまたはＯ−リング８０により形成される（図８参照）。シーラントは、ふたまたはベースプレートのいずれに固定されてもよい。このため、シーラントはふたまたはベースプレートに永久に貼付されていてもよい。別法では、シーラントはふたまたはベースプレートのいずれかにおける溝中に嵌っていてもよい。それにより、シーラントはふたまたはベースプレートに固定されるが、固定化は必ずしも永久ではない。別法では、シーラントは、石油ゼリーのような液体シーラントから、またはＰＡＲＡＦＩＬＭのような柔軟なフィルム材料または他のワックスから形成されうる。
【００９３】
好ましい具体例において、２成分系を用いる場合、ハイブリダイゼーションチャンバーはさらにアラインメント部分を含む。「アラインメント部分」なる語により、ふたとベースプレートとのアライントメントを促進するチャンバーの特徴を意味する。アラインメント部分の重要性は単一のふたおよびベースプレートのアラインメントにあるだけでなく、複数のふたおよび基材プレートの再生可能なアラインメントにもある。すなわち、アラインメント部分は、いずれかのアレイ成分といずれかのマルチプルウェルミクロタイタープレートの配置間の物理的アラインメントを促進する。ふたにおける光ファイバー束とベースプレート上のミクロタイタープレートとを整列させる場合、アラインメント部分は、ファイバー束の垂直中心軸と対応するウェル中心軸とのアラインメントを可能にする。好ましい具体例において、全てのファイバー束がウェルの内壁を触れずに通り抜ける、すなわち、接触しないようなアラインメントである。該アラインメントは続いて起こる画像化に重要であり得る。
【００９４】
１の具体例において、アラインメント部分は相補的な雄／雌型嵌合部（fitting）である。雄型嵌合部はふたまたはベースプレートに貼付されてもよいが、永久に貼付される必要なない。雄型嵌合部がアラインメント部分としてベースプレートまたはチャンバーのふたのいずれかにおいて使用される場合、反対のチャンバーピースは雄型嵌合部が挿入される溝穴または穴（雌型嵌合部）を含有することが好ましい。通常の当業者には、本発明と共に用いて有用な雄／雌型嵌合部のバリエーションが明らかである。この点に関して、特徴は１のチャンバーピース上のインデクサー（indexer）ピンまたは出っ張りおよび他のピース上の穴または相補的な溝であってもよい。
【００９５】
好ましい具体例において、基準を用いる；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１１９，３２３および０９／５００，５５５およびＰＣＴ／ＵＳ００／０３３７５を参照のこと（出典明示により全体として本明細書の一部とする）。
【００９６】
別の具体例において、チャンバーはまた、ふたとベースプレートとの間の安全な接触を維持するためのクランプ特徴を含有していてもよい。クランプで締める利点は、チャンバー中の一様な負荷を妨害して一様なシール圧を達成することにある。「クランプ特徴」または「クランプ」なる語により、ふたとベースプレートとの間の増加した圧力またはシールの適用および維持を可能にするいずれかの特徴を意味する。１の具体例において、クランプ特徴は回転鋲／レセプタクル（receptacle）メカニズムを包含する。すなわち、鋲９０をレセプタクル９５中に挿入し、回転させてふたおよびベースプレートを一緒に押し下げる（図８参照）。別法では、該メカニズムは、フックおよび掛け金メカニズムを包含する。通常の当業者には、本発明と共に用いて有用ないくつかのクランプで締めるメカニズムが明らかである。さらに、通常の当業者には、クランプで締める方法が手動に限定されないことが明らかである。したがって、それは自動化されうる。
【００９７】
別の具体例において、チャンバーはチャンバーを取り扱うための周囲の特徴を包含する。好ましい具体例において、該特徴は、使用者の指が手動でチャンバー／アレイを取り扱うことを可能にするのに十分に幅広な溝穴である。別の具体例において、該特徴は溝穴、溝、ハンドルなどであり、チャンバーの自動またはロボット運転において特に有用である。これらの付加的な特徴はまた、ロボット操縦を容易にするために非対称に配置されうる。
【００９８】
上記のように、ハイブリダイゼーションチャンバーの利点は、試料溶液を喪失することなく少量の試料を使用できることである。さらなる具体例において、チャンバーは、付加的な溶液を保持するための１以上の貯蔵器を含有しうる。それにより、ハイブリダイゼーションチャンバーはまた、湿気チャンバーとして機能する。付加的な溶液の貯蔵器中への包含はさらに試料の蒸発を防ぐ。
【００９９】
別の具体例において、例えば、ミクロタイタープレートを用いない場合、試料をベースプレートの表面にある膜に加えてもよい。膜を用いることの利点には、各使用後の膜の浄化または処理の容易さがあり、柔軟な膜は、試料ウェルの底面とチップとの接触に起因してピペットチップまたは光ファイバーチップを損傷することはないであろう。
【０１００】
該具体例において、ベースプレートは、例えば、ミクロプレート形式において、一連の小さな開口部１０５を含有する（図９Ａ参照）。したがって、膜は分離したアッセイ位置を形成している開口部中に押し下げられる。種々の膜が本発明で有用である。重要なことは、膜が柔軟であることである。いくつかの具体例において、化学的に不活性な膜を有することが望ましいが、いくつかの具体例において、アッセイ成分が相互作用する膜、例えば、ナイロン、ニトロセルロース膜などを有することが望ましい。
【０１０１】
好ましい具体例において、チャンネルは開口部の各々に連結している（図９Ｂ）。チャンネル１００は真空および／または圧力を生じる空気式装置に連結してもよい。したがって、真空が適用される場合、膜は開口部１０５中に変形して小さいポケットまたはウェルを形成する。次いで、試料をポケットに加えることができる。異なる量の真空を開口部を通じて膜に適用することにより、変形した膜によって形成されるウェルの容積および流体高度を変化することができる。さらにまた、断続する真空をチャンネルを通じて膜に適用することにより、ウェル中の液体を攪拌または混合することができる。かかる混合法は、系全体を振動する必要がなく、攪拌バーまたはタンブラーが必要ないので有益である。さらに、開口部のサブセットを異なるチャンネルに連結し、異なるサブセットを同じベースプレートにおいて独立して混合することができる。
【０１０２】
正圧を加える場合、圧力の大きさ、膜の上面における負荷の有無ならびに開口部のサイズおよび形状に依存して、膜は上に変形するか、または平面に止まる。このことは、チャンバーの洗浄または浄化において特に有意な利点を有する。
【０１０３】
圧力および真空をある特定の順序で異なるポートに加える場合、少量の溶液を膜の異なる部分に移動させることができる。すなわち、図１０Ａ−Ｆに示されるように、圧力および真空の異なる適用により、いくつかの場所で持ち上げられ、他の場所で押し下げられる膜を生じる。したがって、膜に加えられる溶液は膜のより低いセクションに移動するであろう。これは、膜上での試料のインキュベーションを正確な時間進行させるという利点を有する。これは、特定の時間後、真空を解除し、もし必要ならば、溶液を除去するように圧力を加えることができる。これは、小さいセクションにおけるインキュベーションがアレイを横切って第１と最後のウェルとの間の一様なインキュベーション時間を達成することを可能とするであろう。
【０１０４】
真空または圧力の適用によって試料容量を調節する利点は、ハイブリダイゼーション溶液のような試薬の消費量の減少；少量試料の混合の容易さの増強および膜の浄化の容易さの増強を包含する。
【０１０５】
好ましい具体例において、チャンネルは共通の流体ハンドリング装置に連結して、ハイブリダイゼーション混合物のような試料溶液または洗浄液をポンプで汲み上げるかまたは吸い上げる。さらに、１の具体例において、全ての開口部を単一のチャンネルに連結する。それにより、全てのウェルを同じ溶液で処理する。別法では、開口部のサブ集団を異なるチャンネルに連結し、サブ集団への溶液の特異な適用を可能にする。
【０１０６】
チャンネルを流体ハンドリング装置に連結する場合、試料由来の液体の適用および除去のための特徴を包含しなけれならないであろう。すなわち、ベースプレート中の開口部を通じて加えられ、除去されるべき液体について、流体を移動させるために膜は浸透性でなければならない。この点に関して、例えば、針は、流体を適用および除去するために膜を貫くのに有用である。針を使用する場合、再度のシールが可能な膜を使用すること、または溶液の望ましくない漏出を防ぐために穿刺箇所にシーラントを適用することが必要かもしれない。
【０１０７】
いくつかの具体例において、チャンバーは熱移動特徴を包含する。すなわち、高温が必要または所望される場合、チャンバーは、高温を維持するように設計される。１の具体例において、これはチャンバーへの断熱材の適用を包含する。次いで、予め温めた溶液をチャンバー中に導入する場合、高温が維持される。すなわち、溶液は、チャンバー中にポンプで汲み上げられる前に、チャンバーの外側で容易に加熱できる。単純なチャンバージオメトリーは、異なるウェル中の液体間での等温の維持を容易にするであろう。
【０１０８】
別の具体例において、チャンバーは、チャンバー中で高温を維持するための加熱メカニズムを包含する。１の具体例において、加熱装置によってチャンバーを均一に加熱する。別の具体例において、加熱装置はチャンバーの異なるセクションを独立して加熱する。
【０１０９】
上記のように、金属は熱の高速で効率のよい伝導体なので、ベースプレート上のアルミニウムのような金属の使用は熱移動を促進する。
【０１１０】
「１成分」系を使用する場合、ふたおよびシーリングメカニズムを用いることができる。すなわち、上記のように、ふたはベースプレートと気密なシールを形成する。したがって、上記のふたのように、「１成分」系のふたも、ふたとベースプレートとの間にシーラントを含む。１の具体例において、ふたとベースプレートはまた、「２成分」系に関して上記されるようなアラインメント部分を含む。別法では、１の具体例において、１成分系のチャンバーはアラインメント部分を含まない。これに関して、ふたおよびベースプレートの１成分系におけるストリンジェントなアラインメントの必然性は２成分系におけるよりも低い。すなわち、１成分系はベースプレート上のアレイ位置と共に整列されるべきふたにおけるアレイ成分を有さないので、アラインメントはストリンジェントではない。しかしながら、アラインメントは依然として画像化に重要である。
【０１１１】
さらに、上記のように、１成分系におけるチャンバーのふたはガラス、プラスチックまたは金属で作成できる。さらに、金属は高速で効率のよい熱伝導体であるので、金属の使用は、温度の維持を容易にする。
【０１１２】
加えて、系は同様に付加的な元素を含みうる。これらはプローブまたは光ファイバー束に関するホルダーまたはホルダー（複数）を含む。このようなホルダーは１９９９年５月２０日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ６０／１３５，０８９および２０００年５月１９日に出願された０９／５７４，９６２ならびに２０００年５月１９日に出願されたＰＣＴ ＵＳ００／１３７７２により完全に記載されている。加えて、系はＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．ｓ０９／０３３，４６２および０９／２６０，９６３ならびにＰＣＴ／ＵＳ９９／０４４７３に記載のように細胞を含んでいてもよい。加えて、系はＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．ｓ６０／１１９，３２３および０９／５００，５５５ならびにＰＣＴ／ＵＳ００／０３３７５に記載のように起線を含んでいてもよく、こらら全ての刊行物は出典明示し本明細書に組み入れる。
好ましい具体例において、本発明の方法および組成物はロボット系を含む。多くの系は、当業者に明らかであるように、一般に９６（またはそれ以上）のウェルマイクロタイタープレートの使用に関するが、多くの異なるプレートまたは構造を使用することができる。加えて、本発明記載のいずれかのまたは全ての工程は自動化されていてもよく；したがって、例えば系は完全または部分的に自動化されていてもよい。
【０１１３】
当業者に明らかなように、使用できる多くの構成要素があり、限定するものではないが、１つまたはそれ以上のロボットアーム；マイクロプレートの位置決めのためのプレートハンドル；非交差汚染プレート上のウェルのふたを除去および交換するための自動ふたハンドル；使い捨てチップを有する試料分布に関するチップアセンブリ；試料分布に関する洗浄可能チップアセンブリ；９６ウェル装填ブロック；冷却試薬棚；マイクロタイタープレートピペット位置（冷却されていてもよい）；プレートおよびチップに関するスタッキングタワー；およびコンピュータ系を含む。
完全なロボット系はスクリーニング適用の全ての工程を行うための高処理能力ピペッティングを含む自動液体−および粒子−ハンディングを含む。これは液体および粒子操作、例えば吸引、分配、混合、希釈、洗浄、正確な容量移動；ピペットチップの回収および破棄；および単試料吸引から多く誘導される同一の容量の反復ピペッティングを含む。これらの操作は交差汚染物質自由液体および粒子移動である。
【０１１４】
好ましい具体例において、化学誘導粒子、プレート、チューブ、磁気粒子、またはリガンドまたは変異胃蛋白に対して特異性を有する他の固相マトリックスが使用される。マイクロプレート、チューブまたはいずれの固相マトリックスの結合表面は非極性表面、高極性表面、共有結合を促進させる修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合蛋白またはペプチドを結合させる結合性媒体、表面固定蛋白、例えば組み換え蛋白ＡまたはＧ、ヌクレオチド樹脂またはコーティングを含み、他の結合性マトリックスは本発明において有用である。
好ましい具体例において、マルチウェルプレート用の基盤、マルチチューブ、小型のチューブ、深いウェルプレート、マイクロフュージ（microfuge）、低温バイアル、四角ウェルプレート、フィルター、チップ、光ファイバー、ビーズおよび種々の容量を有する他の固相マトリックスまたは基盤は、付加的な能力のために機能向上できるモジュラー基盤上に適応する。このモジュラー基盤は可変速度環状シェーカーおよび源試料に関する多位作用デッキ、試料および試薬希釈、分析プレート、試料および試薬貯蔵所、ピペットチップ、および活性洗浄ステーションを含む。
好ましい具体例において、熱循環および熱調節系は熱交換器、例えば制御ブロックまたは基盤の温度を安定させるため使用され、４〜１００℃でインキュベートする試料の正確な温度制御を提供する。
【０１１５】
好ましい具体例において、単または多磁気プローブ、結合性プローブを有する相互交換できるピペットヘッド（単または多チャンネル）またはピペットは液体および粒子をロボット操作する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気分離装置または基盤は担体を単または多試料フォーマットにおいて液体および粒子操作する。
いくらかの好ましい具体例において、計測器はデータを保存および変換し、定量化フォーマットにイメージするために、ＣＣＤカメラ；およびコンピュータワークステーションを含むだろう。これらはデータ解析できるだろう。
柔軟なハードウェアおよびソフトウェアは、様々な適用に適応する機器である。ソフトウェアプログラムモジュールは方法の創造、修飾および運転を行える。システム診断モジュールは、機器配列、適性接続およびモーター操作を行える。改造された器具、実験器具および液体ならびに粒子移動型は、異なる適用であり、実行することができる。データベースは方法およびパラメーター記憶装置である。ロボットおよびコンピュータインタフェースは機器間の通信を行う。
好ましい具体例において、ロボットワークステーションは、１つまたはそれ以上の加熱または冷却する構成部を含む。反応および試薬に応じて、冷却または過熱のいずれかが必要でありえ、これらはペルチェ系を含む多数の公知の加熱および冷却系を使用して行うことができる。
【０１１６】
好ましい具体例において、ロボット機構は中央演算処理装置を含み、これはメモリと入力／出力デバイスの組（例えば、キーボード、マウス、モニタ、プリンター等）をバスで接続する。中央演算処理装置、メモリ、入力／出力デバイスおよびバスの間の一般的な相互作用は当該分野において公知のものである。したがって、行われる実験に依存する多種の異なる方法はＣＰＵメモリに保存されている。
好ましい具体例において、本発明の組成物は、さらに、マイクロスフェアの母集団を含む。本明細書の「母集団」なる用語は、アレイに関する上記の概要のように複数のビーズを意味する。母集団が亜集団に分割される場合、１つのマイクロスフェアまたは多数の同一のマイクロスフェアであってもよい。いくらかの具体例において、これは、以下のより完全に概要されるように、アレイは各々の生物活性剤に対して１つのビーズだけを含んでいてもよく、好ましい具体例は複数の各々の型のビーズに有用である。
【０１１７】
本明細書の「マイクロスフェア」または「ビーズ」または「粒子」または文法上同義語は小さい別個の粒子を意味する。ビーズの構成は、生物活性剤および合成法に応じて変化するだろう。適当なビーズ構成は、限定するものではないが、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリル重合体、常磁性物質、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタニウム、ラテックスまたは架橋デキストランを含み、例えばセファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびテフロンが全て使用でき、ペプチド、核酸および有機基合成に使用されるものを含む。Bangs Laboratoriesの「マイクロスフェア検出ガイド（Microsphere Detection Guide）」は有用なガイドである。
ビーズは球形である必要はなく；不揃いの粒子を使用してもよい。加えて、ビーズは多孔性であってもよく、したがって、ビーズの表面積が増加し、生物活性剤付着またはＩＢＬ付着のいずれかに利用できる。ビーズ粒径の範囲は、ナノメーター、すなわち１００ｎｍ〜ミリメーター、すなわち１ｍｍであり、約０．２ミクロン〜約２００ミクロンであるビーズが好ましく、約０．５〜５ミクロンが特に好ましいが、いくらかの具体例において、より小さいビーズを使用してもよい。
本発明の主要な構成は、基材の表面の別個の部位でビーズの結合または付着を可能にし、ビーズがアレイの経過の間動かないようにする基材／ビーズ組の使用であることが示されるべきである。
【０１１８】
いくらかの具体例において、各々のマイクロスフェアは生物活性剤を含むが、当業者に明らかなように、合成法に応じて生物活性剤を含まないいくらかのマイクロスフェアが存在してもよい。別法として、本明細書に記載のように、いくらかの具体例において、マイクロスフェアの母集団は生物活性剤を含まないことが望ましい。本明細書の「候補生物活性剤」または「生物活性剤」または「化学的機能」または「結合リガンド」は、本明細書に記載のいずれの分子、例えば、蛋白、オリゴペプチド、小さい有機分子、相関複合体、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド等を意味し、これらは本発明のマイクロスフェアに付着できる。本発明の組成物は、１つの主要な使用を有することは理解できるだろう。好ましい具体例において、以下により完全に概要されるように、組成物は特別な標的検体の存在；例えば、特別なヌクレオチド配列または特別な蛋白、例えば酵素、抗体または抗原の存在または非存在を検出するために使用される。別の好ましい具体例において、組成物は、特別な標的検体に結合するための生物活性剤、すなわち薬物候補をスクリーンするために使用される。
【０１１９】
生物活性剤は、多数の化学物質群を含むが、典型的には、有機分子、好ましくは１００ドルトンより大きく、約２５００ドルトンより小さい分子量を有する小さい有機化合物を含む。生物活性剤は、蛋白、特に水素結合で構造的相互作用を必要とする官能基を含み、典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。生物活性剤は、しばしば、１つまたはそれ以上の上記官能基で置換されていてもよい環状炭素またはヘテロサイクリック構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含む。また、生物活性剤は、ペプチド、核酸、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造アナログまたは組み合わせを含む生体分子で見出される。核酸および蛋白が特に好ましい。
生物活性剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む広範囲の源から得ることができる。例えば、多くの方法はランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む種々の有機化合物および生体分子のランダムおよび直接合成のために利用できる。別法として、細菌、カビ、植物および動物抽出物の形態である天然化合物のライブラリーは入手できるか、または容易に生成される。加えて、天然または合成生成ライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的方法により容易に修飾できる。公知の薬剤は直接またはランダム化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化および／またはアミド化に付すことができ、構造アナログを生成することができる。
【０１２０】
好ましい具体例において、生物活性剤は蛋白である。本明細書の「蛋白」は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、これは蛋白、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。この蛋白は天然に生じるアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造により生成することができる。したがって、本明細書で使用される「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に生じるおよび合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的に関してアミノ酸と考えられる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置のどちらであってもよい。好ましい具体例において、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ−配置である。非天然に生じる側鎖が使用できる場合、非アミノ酸置換基が使用でき、例えばインビボで分解を防止するかまたは遅らせる。
好ましい具体例において、生物活性剤は、天然に生じる蛋白または天然に生じる蛋白のフラグメントである。したがって、例えば蛋白を含む細胞抽出物または蛋白様細胞抽出物のランダムもしくは直接消化物が使用できる。この点において、原核および真核蛋白のライブラリーは、本明細書に記載された系においてスクリーニングできる。特に好ましいこの具体例において、細菌、カビ、ウイルスおよび哺乳類の蛋白のライブラリーが好ましく、ヒト蛋白が特に好ましい。
好ましい具体例において、生物活性剤は約５〜約３０のアミノ酸からのペプチドであり、約５〜約２０のアミノ酸からのペプチドがより好ましく、約７〜約１５からのペプチドが特に好ましい。ペプチドは、上記のような天然に生じる蛋白の消化物、ランダムペプチドまたは「偏った（biased）」ランダムペプチドであってもよい。本明細書の「ランダム化」または文法上同義語は、各々の核酸およびペプチドが各々本質的にランダムヌクレオチドおよびアミノ酸から成ることを意味する。一般にこれらのランダムペプチド（または以下に議論する核酸）が化学的に合成されるので、これらはいずれかの位置でいずれかのヌクレオチドまたはアミノ酸を含みうる。合成過程は、ランダム化蛋白または核酸を生じるように設計でき、配列の長さを超える全てまたはほどんどの可能な組み合わせが発生し、したがって、ランダム化生物活性蛋白様薬剤のライブラリーが形成される。
【０１２１】
好ましい具体例において、生物活性剤のライブラリーが使用される。ライブラリーは生物活性剤の十分に構造的に多様化した母集団を提供し、標的検体への結合の確率的に十分な範囲に効果がある。したがって、相互作用ライブラリーは、その各員の少なくとも１つが標的検体に対する結合性を与える構造を有するために十分に大きくなくてはならない。相互作用ライブラリーの必要とされる絶対的な大きさを測定することは難しいが、自然が免疫応答で手掛かりを与えており：１０７〜１０８の異なる抗体の多様性は、十分な結合性で少なくとも１つの組み合わせを提供し、生物に面した最も可能性ある抗原に相互作用する。インビトロにおける公開された選択法もまた、１０７〜１０８のライブラリーの大きさが標的の結合性を有する構造を見出すために十分であることを示している。したがって、好ましい具体例において、少なくとも１０６、好ましくは少なくとも１０７、より好ましくは少なくとも１０８および最も好ましくは少なくとも１０９の異なる生物活性剤は、対象法で同時に分析される。好ましい方法は、ライブラリーの大きさおよび多様性を最大にする。
好ましい具体例において、ライブラリーは完全にランダム化され、いずれかの位置で配列優先性または恒常性がない。好ましい具体例において、ライブラリーは偏っている。これは、配列のいくつかの位置が恒常性を保持しているか、または限られた数の可能性から選択される。例えば、好ましい具体例において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は所定の群、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインに関するプロリン、リン酸化部位に関するセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン等の創製に、またはプリン等に立体的に偏った（小型または大型）残基の群内でランダム化される。
【０１２２】
好ましい具体例において、生物活性剤は核酸（本明細書において、一般に「プローブ核酸」または「候補プローブ」と称する）である。本明細書において、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法上同義語は、共に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般に、リン酸ジエステル結合を含むが、いくつかの場合、以下に示すように、例えばリン酸アミド（Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) およびそれらの引用文献; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzlら Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsingerら Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawaiら Chem. Lett., 805 (1984), Letsingerら J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); および Pauwelsら Chemica Scripta, 26:141 (1986))、ホスホロチオエート (Magら Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート (Briuら J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)), O-メチルホスホロアミド連結 ( Eckstein、オリゴヌクレオチドおよびアナログ： A Practical Approach, Oxford University Press参照)、およびペプチド核酸骨格および連結 ( Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meierら Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlssonら Nature, 380:207 (1996)参照、これらは出典明示により本明細書に組み入れる）を含む、別の骨格を有していてもよい核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸は、陽性骨格（Denpcyら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)); 非イオン性骨格 (米国特許第5,386,023号; 第5,637,684号; 第5,602,240号; 第5,216,141号; および 第4,469,863号; Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsingerら J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsingerら、Nucleosides & Nucleotides, 13:1597 (1994); 第２章および第３章、 ＡＳＣシンポジウム・シリーズ５８０、「アンチセンスリサーチにおける炭水化物修飾」、Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook編; Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffsら、 J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996))および米国特許第 5,235,033号 および 第5,034,506号、ならびに第６章および第７章、ＡＳＣシンポジウム・シリーズ５８０、「アンチセンスリサーチにおける炭水化物修飾」、Y.S. Sanghui および P. Dan Cook編に記載の非リボース骨格を有する核酸を含む。１つまたはそれ以上のカルボサイクリック糖を含む核酸もまた核酸の定義内に含まれる(Jenkinsら Chem. Soc. Rev., (1995) 169-176頁参照）。いくつかの核酸アナログはRawls, C & E News、１９９７年６月２日３５頁に記載されている。全てのこれら引用文献は出典明示し本明細書に組み入れる。リボース−リン酸骨格においてこれらの修飾を行い、標識のような付加的な部の付加を容易にし、あるいは生理学的環境においてこのような分子の安定性および半減期を増加でき、例えばＰＮＡが特に好ましい。加えて、天然に生じる核酸およびアナログの混合物を調製できる。別法として、異なる核酸アナログの混合物、および天然に生じる核酸およびアナログの混合物を調製できる。核酸は特記されていれば単ストランドまたは二重ストランドのいずれであってもよく、または二重ストランドまたは単ストランド両方の配列の部を含んでいてもよい。核酸はＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく；核酸はデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドのいずれの組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサントニン、ハイポキサントニン、イソシトシン、イソグアニンおよび塩基アナログ、例えばニトロピロールおよびニトロインドール等を含む、塩基のいずれの組み合わせを含んでいてもよい。
【０１２３】
好ましい具体例において、生物活性剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、クローン核酸のライブラリーである。この具体例において、各々の核酸は、一般に慣用的方法（限定するものではないが、プラスミドまたはファージベクターにおける増殖、ＰＣＲ等を含む増幅法を含む）を使用して調製される。核酸は、好ましくはいくらかのフォーマット、例えばマイクロタイタープレートフォーマット、およびライブラリーの付着のために添加されるビーズにアレイされる。
クローンライブラリー（または本明細書に記載のいずれかの核酸）の付着は、当業者に明らかであるだろう種々の方法、限定するものではないが、化学的または結合性捕捉（例えば、AminoLinkまたはビオチン化ヌクレオチドのような誘導ヌクレオチドを含み、これらは表面に核酸を付着させるために使用され、ならびにハイブリダイゼーションによる結合性捕捉を含む）、架橋および静電結合等で行うことができる。
好ましい具体例において、結合性捕捉はビーズにクローン核酸を付着させるために使用される。例えば、クローン核酸を、例えば結合対の１員で誘導でき、およびビーズを結合対の他の員で誘導できる。適当な結合対は、本明細書に記載のＩＢＬ／ＤＢＬ対である。例えばクローン核酸を、ビオチン化できる（例えば、ビオチンの光学活性化架橋連結により、ビオチン化ヌクレオチドの酵素の組み込みを使用して）。ついで、ビオチン化核酸を、当該分野で公知のように、ストレプトアビジンコート化ビーズに捕捉できる。同様に、例えばジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン抗体のような他のハプテン−受容体組み合わせが使用できる。別法として、化学基は誘導体ヌクレオチドの形態に付加することができ、表面に核酸を付加するために使用される。
【０１２４】
好ましい付着は共有結合であるが、各々の核酸あたりの複数の付着部位が存在する場合、相対的に弱い相互作用（例えば非共有結合）でさえも表面に核酸を付着させるために十分である。したがって、例えば、静電気相互作用は、例えば生物活性剤と反対の電荷を有するビーズを使用することにより付着できる。
同様に、ハイブリダイゼーションに利用する結合性捕捉は、ビーズにクローン核酸を付着させるために使用できる。例えば、当該分野で公知のように、ポリＡ＋ＲＮＡは、日常的に、オリゴ−ｄＴビーズへのハイブリダイゼーションにより捕捉でき、これはオリゴ−ｄＴ捕捉、ついで架橋工程、例えばソラレン架橋を含む。目的の核酸がポリＡ領域を含まない場合、当該分野で公知の末端転移酵素での重合により、またはオリゴＡリンカーのライゲーションを介して付着できる。
別法として、化学架橋連結は、例えば当該分野で公知のように、チミジンの活性基への光活性架橋することにより行うことができる。
一般に、特別な方法がクローンアレイをデコードするために必要とされ、これは以下により完全に説明する。
【０１２５】
一般に蛋白に関して上記のように、核酸生物活性剤は、天然に生じる核酸、ランダム核酸、または「偏った」ランダム核酸であってもよい。例えば、蛋白に関して上で説明したように、原核生物または真核生物のゲノムの消化物を使用できる。
一般に、本発明のプローブは、標的配列（本明細書に記載のように、試料の標的検体配列または他のプローブ配列のいずれか）に対し相補的に設計され、標的と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが起こるようにする。この相補性は完全に必要ではなく；いくつかの塩基対の不一致は存在してもよく、標的配列および本発明の単ストランド核酸間のハイブリダイゼーションを妨害する。しかしながら、ハイブリダイゼーションが最小のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でさえも起こらないほど変異体の数が非常に多い場合、配列は相補的な標的配列ではない。したがって、本明細書の「実質的に相補的」なる用語は、プローブが標的配列に対して十分に相補的であり、選択された反応条件下でハイブリダイゼーションすることを意味する。高いストリンジェンシー条件は当該分野では公知であり、例えば、Maniatisらの Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, およびAusubelらのShort Protocols in Molecular Biology, ed.を参照されたい。これら両方の引用文献は出典明示し本明細書に組み入れる。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる環境において異なるであろう。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイゼーションされる。核酸のハイブリダイゼーションに対するさらなるガイドはTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見られる。一般に、イオン強度ｐＨで特異的な配列に対して融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低く定義したストリンジェント条件が選択される。Ｔｍは標的配列に対して相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイゼーションする温度である（一定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が占めている）。ストリンジェント条件は塩濃度が少なくとも７．０〜８．３のｐＨで、約１．０Ｍのナトリウムイオン、典型的には約０．０４〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）より小さいものであり、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）関して少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）に関して少なくとも約６０℃であろう。また、ストリンジェント条件はホルムアミドのような不安定化剤の添加でも達成できる。他の具体例において、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が使用され；例えば、中程度または低いストｒンジェンシー条件が使用され、これは当該分野で公知であり、ManiatisおよびAusubel,の上掲文献およびTijssenの上掲文献を参照されたい。
【０１２６】
本明細書の「標的配列」または文法上同義語は、核酸の単ストランドの核酸配列を意味する。標的配列は遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むＲＮＡ、または他のものの一部であってもよい。これはいずれの長さであってもよく、より長い配列はより特異的であることが理解できる。当業者に明らかなように、相補的な標的的配列は多くの形態であってもよい。例えば、これは長い核酸配列、すなわち遺伝子またはｍＲＮＡの全てまたは一部、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメント、他のもの中に含まれていてもよい。以下により完全に説明するように、プローブは試料中の標的配列の存在または非存在を決定する標的配列にハイブリダイゼーションするために作成される。一般的に言えば、この用語は当業者に明らかだろう。
好ましい具体例において、生物活性剤は有機化学基であり、これらは広範囲にわたって文献により利用できる。
【０１２７】
好ましい具体例において、各々のビーズは単一型の生物活性剤を含むが、各々の生物活性剤の多くは、好ましくは各々のビーズに付着できる。同様に、好ましい具体例は、独特の生物活性剤を含む１つ以上のマイクロスフェアに有用であり、これらはマイクロスフェアの亜集団の使用により系中に重複して構築され、亜集団中の同じ生物活性剤を含むものである。当業者に明らかなように、生物活性剤はビーズ上に直接合成するか、または作成でき、ついで合成後に付着させることもできる。好ましい具体例において、リンカーはビーズに生物活性剤を付着させるために使用され、両方を良好に付着させ、十分に固定し、標的分子と良好に相互作用し、望ましくない結合反応を防ぐ。
好ましい具体例において、生物活性剤はビーズ上に直接合成する。当該分野で公知のように、化学化合物の多くの群はビーズ、例えばペプチド、有機基および核酸を含む固体担体上で容易に合成される。
好ましい具体例において、生物活性剤を最初に合成し、ついでビーズに共有結合させる。当業者に明らかなように、これは生物活性剤およびビーズの組成に依存して行われるだろう。固体担体表面、例えばある種のポリマーを化学活性基、例えばチオール、アミン、カルボキシル等で機能化することは、一般に当該分野で公知のものである。したがって、「ブランク（blank）」マイクロスフェアが使用でき、これは使用者により望ましい官能基の付着を促進する表面化学を有する。ブランクマイクロスフェアに関するこれらの表面化学のいくらかの例示は、限定するものではないが、脂肪族および芳香族アミンを含むアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジン、ヒドロキシル基、スルホラートおよびスルフェートを含む。
【０１２８】
これらの官能基は、一般に公知の化学的方法を使用して、ビーズにいくらかの異なる候補物質を付加させるために使用できる。例えば、炭化水素を含む候補物質は、標準的な方法を使用して作成され、ついでアルデヒドを表面のアミノ基と反応させる。別の具体例において、スルフヒドリルリンカーが使用できる。当該分野で公知の多くのスルフヒドリル活性リンカー、例えばＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチルおよびピリジルジスルフィド（例えば、1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, 155-200頁参照、これは出典明示し本明細書に組み入れる）があり、これらは担体にシステイン含有蛋白様物質を付着させるために使用できる。別法として、候補物質上のアミノ基が、表面上のアミノ基への付着のために使用できる。例えば、多くの安定な二官能基は当該分野でよく知られており、ホモ二官能基およびヘテロ二官能基リンカー（Pierceのカタログおよびハンドブック、155-200頁参照）を含む。付加的な具体例において、カルボキシル基（表面または候補物質由来のもの）は、よく知られたリンカー（ pierceのカタログ参照）を使用して誘導できる。例えば、カルボジイミドは、良好な求核剤、例えばアミンによる攻撃に対してカルボキシル基を活性化する（Torchilinらの Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4):275-308 (1991）参照、本明細書に完全に組み入れる）。また、蛋白様候補物質は、当該分野で公知の他の方法、例えば重合体への抗体の付着のための方法を使用して付着できる（Slinkin らの Bioconj. Chem. 2:342-348 (1991); Torchilin らの上掲文献; Trubetskoy らの Bioconj. Chem. 3:323-327 (1992); Kingらの, Cancer Res. 54:6176-6185 (1994); および Wilbur らのBioconjugate Chem. 5:220-235 (1994)参照、これら全ては出典明示し本明細書に組み入れる）。候補物質は、上記のものを含む種々の方法で付着できることが理解できるだろう。好ましくは、付着方法は候補物質の機能性を有意には変化させず；候補物質は標的との相互作用を可能にする柔軟な方法で付着されるべきである。加えて、化学的または物理的機能の型がアレイを付着させるために使用でき、図１Ｆに記載のように、各々のビーズの位置または組を分析できる。
【０１２９】
酵素を微小球上に固定する具体的な方法は当該分野にて公知である。一の場合において、ＮＨ２面の化学微小球を用いる。表面活性化は、ｐＨを６．９とするリン酸緩衝化セイライン（１０ｍＭ）（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）中２．５％グルタルアルデヒドでなされる。これを室温で約２時間攪拌床上で攪拌する。その微小球を０．０１％−０．０２％ツゥーン２０（界面活性剤）を加えた超精製水で洗い流し、再び０．０１％ツゥーン２０を加えたｐＨ７．７のＰＢＳで洗い流す。最後に、好ましくは０．４５μｍのアミコン微小孔のフィルターを用いて予備濾過した後に、酵素を溶液に加える。
ある具体例においては、微小球は付加的に特定の解読システムに用いるためのアイデンティファイアー結合リガンドを含んでいてもよい。本明細書中の「アイデンティファイアー結合リガンド」または「ＩＢＬ」とは、対応する解読結合リガンド（ＤＢＬ）と特異的に結合し、ビーズに付着する生物活性体の同一性の解明を促進するであろう化合物を意味する。すなわち、ＩＢＬと対応するＤＢＬは結合パートナーのペアを形成する。本明細書中の「特異的に結合する」とは、ＩＢＬが対応するＤＢＬと他のＤＢＬ（すなわち、他のＩＢＬについてのＤＢＬ）または該システムの他の成分もしくは汚染物の間の差異を認めるのに十分な特異性をもってその対応するＤＢＬと結合することを意味する。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄工程を含む、解読工程の条件下で結合状態を維持するのに十分でなければならない。ある具体例において、例えば、ＩＢＬおよび対応するＤＢＬが蛋白または核酸である場合、ＩＢＬのそのＤＢＬに対する解離定数は約１０−４−１０−６Ｍ−１未満であり、約１０−５ないし１０−９Ｍ−１未満が好ましく、約１０−７−１０−９Ｍ−１未満が特に好ましい。
【０１３０】
ＩＢＬ−ＤＢＬ結合ペアは既知であるか、あるいは公知技法を用いて容易に見出すことができる。例えば、ＩＢＬが蛋白である場合、ＤＢＬは蛋白（特に、抗体またはそのフラグメント（ＦＡｂなど）または小分子を包含し、あるいはその逆（ＩＢＬが抗体で、ＤＢＬが蛋白である）である。金属イオン−金属イオンリガンドまたはキレーターペアもまた有用である。抗原−抗体ペア、酵素および基質または阻害剤、他の蛋白−蛋白相互作用性ペア、受容体−リガンド、相補的核酸（三重螺旋を形成する核酸分子を含む）および炭水化物およびその結合パートナーもまた、適当な結合ペアである。一本鎖または二本鎖核酸結合蛋白、および小分子核酸結合体を含む、核酸−核酸結合蛋白ペアもまた有用である。同様に、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５２７０１６３号、第５４７５０９６号、第５５６７５８８号、第５５９５８７７号、第５６３７４５９号、第５６８３８６７号、第５７０５３３７号および関連する特許に記載されるように、核酸「アプタマー」を実質的にいずれかの標的に結合させるために開発することもできる；そのようなアプタマー−標的ペアをＩＢＬ−ＤＢＬペアとして用いることができる。同様に、コンビナトリアルケミストリー方法に基づいて結合ペアの開発に関連するワイドボディーの文献もある。
【０１３１】
好ましい具体例において、ＩＢＬは選択的に結合するＤＢＬの存在下で色相または発光特性が変化する分子である。
一の具体例において、ＤＢＬをビーズ、すなわち、フルオロフォアなどの標識を有していてもよい「デコーダービーズ」に付着させることができる。
好ましい具体例において、ＩＢＬ−ＤＢＬペアは実質的に相補的な一本鎖核酸を含む。この具体例において、結合リガンドを「アイデンティファイアープローブ」および「デコーダープローブ」ということができる。一般に、アイデンティファイアーおよびデコーダープローブは、長さが約４個の塩基対から約１０００個の範囲であり、約６個ないし約１００個が好ましく、約８個ないし約４０個が特に好ましい。重要なことは、特異的であるのに、すなわち、異なるＩＢＬ−ＤＢＬペアの間を区別するのにプローブが十分に長く、しかも、ａ）必要に応じて、適当な実験条件下での解離、およびｂ）効果的なハイブリダイゼーションを可能とするのに十分に短いことである。
【０１３２】
好ましい具体例において、以下にさらに詳しく記載するように、ＩＢＬはＤＢＬと結合しない。むしろ、ＩＢＬは、例えば、質量分光器の使用を介して、直接同定されるアイデンティファイアー部分（ＩＭ）として用いられる。
別法として、好ましい具体例において、ＩＢＬと生体活性体とは同一部分である；かくして、例えば、本明細書において記載するように、特に、光学的特徴を用いない場合、生体活性体はアイデンティファイアーおよびその活性体の両方として用いることができる。例えば、核酸の場合、ビーズ結合プローブ（生体活性体として役立つ）もまたデコーダープローブと結合し、ビーズ上にあるプローブの配列を同定することができる。かくして、この具体例において、ＤＢＬは生体活性体と結合する。このことは、この具体例が解読に加えてアレイまたはアッセイについての情報を付与することができるため、特に有用である。例えば、以下により詳細に記載されるように、ＤＢＬの使用はアレイキャリブレイションおよびアッセイ開発を可能とする。このことは仮にＤＢＬその物が例えば非ランダムアレイにて用いられないとしても行うことができ、これらプローブセットの使用は、たとえ解読が要求されないとしても、アレイキャリブレイションおよびアッセイ開発が可能である。
【０１３３】
好ましい具体例において、微小球は光学的特徴を含まない。すなわち、米国出願番号０８／８１８１９９および０９／１５１８７７に記載されているように、これまでの研究では、各部分集団が独特な光学的特徴または光学タグを含む微小球を有し、それを微小球の部分集団の独特な生物活性体を同定するために用いる；すなわち、解読はビーズの光学特性を利用するものであり、独特な光学的特徴を含むビーズを異なる光学的特徴を有する他の位置にあるビーズから区別するものである。かくして、これまでの研究は、生体活性体を含む微小球が該特徴に基づいて同定可能であるような独特な光学的特徴を各生体活性体に帰属させた。これらの光学的特徴は、ビーズ自体にトラップされるかまたは付着される染料、通常、クロモフォアまたはフルオロフォアを含んだ。光学的特徴の多様性において、種々の蛍光色素、種々の割合の蛍光色素混合物、および種々の濃度（強度）の蛍光色素を用いた。
【０１３４】
かくして、本発明は、アレイを解読するために、ある場合には光学特性に依存するとしても、それだけに依存する必要はない。しかしながら、当業者にとって明らかなように、ある具体例において、このシステムと協同して、さらなるコード化方法として光学的特徴を用いることが可能である。かくして、例えば、以下にさらに詳しく記載するように、アレイの大きさは、いくつかの方法で一セットの解読部分を用いて効果的に増大されることができ、その方法のうちの一は、一のビーズ上の光学的特徴と組み合わせて用いるものである。かくして、例えば、一「セット」の解読分子を用いて、光学的特徴を有するものと光学的特徴を有していないものとの２つのビーズ集団の使用は、アレイの大きさを効果的に倍にすることができる。同様に、複数の光学的特徴の使用はアレイの大きさの可能性を増大させる。
【０１３５】
好ましい具体例において、ビーズの各部分集団は、複数の異なるＩＢＬを含む。各生体活性体をコードするために複数の異なるＩＢＬを用いることによって、可能となる独特なコードの数を実質的に増加する。すなわち、生体活性体につき１個の独特なＩＢＬを用いることによって、アレイの大きさは、（以下に記載するように、「再使用」が生じないと仮定すると）独特なＩＢＬの数となるであろう。しかしながら、各ＩＢＬの有無を指標として用いた場合、ビーズ１個につき複数の異なるＩＢＬ ｎ個を用いることによって、アレイの大きさを２ｎに増大させることができる。例えば、ビーズ１個につき１０個のＩＢＬの帰属させると、１０ビット二進法コードが得られる（ここで、各ビットは「１」（ＩＢＬが存在する）または「０」（ＩＢＬが存在しない）で表すことができる）。１０ビット二進法コードは可能となる２１０種の変数を有する。しかしながら、以下にさらに詳しく検討するように、アレイの大きさは、濃度または強度のような別のパラメーターが含まれる場合にはさらに増大させることができる；かくして、例えば、２種類の異なる濃度のＩＢＬを用いる場合、アレイの大きさは３ｎに増大する。かくして、この具体例において、アレイにおける個々の生体活性体は、各々、ＩＢＬの組み合わせに帰属させられ、そのＩＢＬは生体活性体を付加する前、生体活性体の合成の後、または生体活性体の合成の間、すなわち、ＩＢＬと生体活性体成分の同時付加の間にビーズに付加することができるＩＢＬの組合せを付与される。
【０１３６】
別法として、生体活性体がポリマーまたは異なる残基である場合、すなわち、生体活性体が蛋白または核酸である場合、種々のＩＢＬの組み合わせを用いて蛋白または核酸の配列を解明することができる。
かくして、例えば、２つの異なるＩＢＬ（ＩＢＬ１およびＩＢＬ２）を用いて、核酸の第１の位置を解明することができる；例えば、アデノシンはＩＢＬ１およびＩＢＬ２の両方が存在することによって表すことができ；チミジンはＩＢＬ１が存在するが、ＩＢＬ２が存在しないことによって表すことができ；シトシンはＩＢＬ２が存在するが、ＩＢＬ１が存在しないことによって表すことができ、グアノシンは両方が存在しないことによって表すことができる。核酸の第２の位置は、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４を用いて同様に行うことができ；かくして、ＩＢＬ１、ＩＢＬ２、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４の存在はＡＡの配列を示し；ＩＢＬ１、ＩＢＬ２およびＩＢＬ３の存在は配列ＡＴを示し；ＩＢＬ１、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４の存在は配列ＴＡを示すなどである。第３の位置は、ＩＢＬ５およびＩＢＬ６を用いるなどである。このようにして、２０個の異なるアイデンティファイアーを用いて、全ての可能となる１０量体についての独特なコードを得ることができる。
【０１３７】
このシステムは蛋白と同様であるが、各位置にある許容される多様性に応じて、各位置を同定するのにより多くの数の異なるＩＢＬを必要とする。かくして、例えば、すべてのアミノ酸がすべての位置で許容されるならば、各位置について５個の異なるＩＢＬが必要とされる。しかしながら、上述したように、例えば、生体活性体としてランダムペプチドを用いると、該システムの中に構築される傾向があるかもしれず；すべてのアミノ酸がすべての位置に存在するものではなく、ある位置は予めセットされていてもよい；したがって、各アミノ酸について４つの異なるＩＢＬを利用することが可能である。
このようにして、各配列についての「バーコード」の分類を構築することができる；別個の各々のＩＢＬの有無は各生体活性体の同定を可能とするであろう。
【０１３８】
加えて、種々の濃度または密度のＩＢＬを使用することで分類の「再使用」を可能とする。例えば、第１の物質を含むビーズが１倍濃度のＩＢＬを有しており、第２の物質を含む第２のビーズが１０倍濃度のＩＢＬを有する場合、対応する標識された飽和濃度のＤＢＬを用いることでユーザーに２つのビーズを区別させることができる。
候補物質および独特なＩＢＬを含む微小球が生成されたならば、それらを基材に付加してアレイを形成させる。本明細書に記載された方法のほとんどは、アッセイ前にビーズを基材に付加するが、アレイの調製、使用および解読の順序を変えることができる。例えば、アレイを調製し、解読し、次いで、アッセイを行うことができる。また、アレイを調製し、アッセイにおいて使用し、次いで、解読することができる；これは、ほんのわずかなビーズを解読する必要がある場合に特に有用であることが分る。また、基材にビーズを付加する前に、アッセイ混合物、すなわち、標的とする分析物を含有する試料にビーズを付加することができる；付加およびアッセイの後にアレイを解読してもよい。これは、ビーズを含む試料を撹拌または混合した場合に特に好ましい；この操作は単位時間あたりにビーズに結合した標的分析物の量を増加させることができ、かくして、（核酸アッセイの場合に）ハイブリダイゼーション速度を増大させることができる。これは、試料中の標的分析物の濃度が低い場合に特に有用であることが分る；一般に、低濃度の場合、結合時間を長くしなければならない。
【０１３９】
加えて、ビーズをアッセイ混合物に添加することにより、分類または選択を行うことができる。例えば、ラージライブラリーのビーズを試料に加え、そして試料に結合するビーズだけを基材中に添加することができる。例えば、標的分析物が蛍光標識（直接的に（例えば、標識を核酸増幅反応中に組み入れることにより）あるいは間接的に（例えば、サンドウィッチアッセイを用いることにより））されているならば、標的分析物が結合した結果として蛍光を発するビーズを蛍光活性化細胞分類操作（Fluorescence Activated Cell Sorting）（ＦＡＣＳ）を介して分類することができ、これらビーズだけをアレイに加え、つづいて解読することができる。同様に、アフィニティー技法；標的分析物を含むアフィニティーカラムを製造し、結合するビーズだけを該アレイに用いる、技法を介して分類を行うことができる。同様に、２つのビーズシステム；例えば、標的分析物を含む磁気ビーズを用いて標的に結合するであろうビーズを「プルアウト」し、つづいてその後、（例えば、昇温させることで）磁気ビーズを放出させ、アレイに付加する、システムを用いることができる。
【０１４０】
一般に、アレイの調製方法およびアレイの解読方法は、独特にコードされ得る種々の候補物質の数を最大にするように行われる。本発明の組成物は、種々の方法で調製される。一般に、アレイは、ビーズの付着のための部位を含有する表面にビーズを含む溶液またはスラリーを添加することによって調製される。これは、水性溶媒および有機溶媒を包含する種々のバッファーおよび混合物において行われる。溶媒を蒸発させ、過剰のビーズを除去することができる。
【０１４１】
好ましい具体例において、非共有方法を用いてビーズをアレイに結合させる場合、ビーズをアレイに負荷させる新規方法が用いられる。この方法はアレイを粒子（微小球および細胞を包含する）の溶液に曝し、次いで、エネルギーを加え、例えば、該混合物を撹拌または振動させることを含む。これにより、弱く結合したビーズを外す（ウェルの場合には、落とす）のに十分なエネルギーを用いて撹拌が行われた場合には、より固く結合した粒子を含むアレイが得られる。ついで、これらの部位は異なるビーズを結合するのに利用可能である。このようにして、部位に対して高いアフィニティーを示すビーズを選択する。このようにして調製したアレイは、より安定した負荷と比較して２つの主要な利点を有している：その一つは、この部位を高いパーセンテージで容易に充填することができ、二つ目は、このようにして負荷されたアレイは、アッセイの間のビーズの損失が実質的に低下することを示す。すなわち、好ましい具体例において、これらの方法を用いて、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、特に好ましくは、少なくとも約９０％の充填部位を有するアレイが得られる。同様に、このようにして得られたアレイは、好ましくは、アッセイの間にビーズの約２０％未満、好ましくは、約１０％未満、特に好ましくは、約５％未満を損失する。
【０１４２】
この具体例において、別個の部位を有する表面を含む基材を、粒子（ビーズ、細胞など）を含む溶液中に浸漬する。表面は、本明細書に記載するように、ウェル、または、該部位に対して示差アフィニティーがあるようなパターン化された表面上の他の型の部位を含んでもよい。この示差アフィニティーにより競合工程に至り、その結果、さらに強固に結合する粒子が選択される。好ましくは、ビーズで「負荷」されるべき全表面は溶液と流動接触している。この溶液は、一般に、ビーズ：溶液（ｖｏｌ：ｖｏｌ）が約１０,０００：１ないし１：１の範囲にあるスラリーである。一般に、該溶液は、水性バッファー、有機溶媒、塩、他の試薬成分などを包含するかなり多数の試薬を含むことができる。加えて、該溶液は、好ましくは、過剰のビーズを含む；すなわち、アレイ上の部位よりも多くのビーズがある。好ましい具体例は２倍ないし１０億倍過剰量のビーズを用いる。
【０１４３】
浸漬はアッセイ条件を模倣することができる；例えば、アレイが上から試料を含むマイクロタイタープレート中に「浸漬される」ものである場合、負荷に対するこの配置を繰り返し、重力により落下する可能性のあるビーズを最小にすることができる。
表面が浸漬されれば、基材、溶液またはその両方を競合工程に付し、それにより、低いアフィニティーの粒子を基材から解離させ、その部位に対して高いアフィニティーを示す粒子と置き換えることができる。この競合工程は、溶液もしくは基材またはその両方を、加熱、音波処理、撹拌もしくは混合、振動またはかき回す、形態のエネルギーの導入によって行われる。
好ましい具体例は撹拌または振動を用いる。一般に、基材の操作の量を最小限にしてアレイに対する損傷を妨げる；かくして、好ましい具体例はアレイよりもむしろ溶液の撹拌を用いるが、いずれも有効に作用するであろう。当業者に明らかなように、この撹拌はかなり多くの形態をとることができ、好ましい具体例としては、マイクロタイタープレート振盪器を用いて撹拌されるビーズ溶液を含むマイクロタイタープレートを用いることである。
【０１４４】
攪拌をアレイが所望の量で満たされるのに十分な時間行う。ビーズの大きさおよび濃度ならびにアレイの大きさに応じて、この時間は約１秒から数日の範囲とすることが可能であり、約１分から約２４時間が好ましい。
アレイの部位のすべてがすべてビーズを含むものではないこと、すなわち、基材表面に空の部位があってもよいことに留意すべきである。加えて、好ましいわけではないが、１個よりも多くのビーズを含有する部位があってもよい。
ある場合において、例えば、化学的付着を行う場合、ビーズをランダムではなく、または秩序立てて付着させることが可能である。例えば、光活性化可能な付着性リンカーまたは光活性化可能な付着物質またはマスクを用い、ビーズの一定の集団に播種するように、アレイ上の選択された部位を連続的に付着に適するようにすることができる。
【０１４５】
候補物質の同一性についての情報がアレイの中に組み込まれるように本発明のアレイを構築する。その結果、ファイバーウェル中のビーズのランダムな堆積が「解読」され、あらゆる位置での候補物質を同定することができる。このことは、アレイを使用する前、間、または後のいずれであっても、標的とする分子を検出するための種々の方法にて行うことができる。
かくして、アレイを作製した後に、基材表面上にある、１またはそれ以上の生体活性体、すなわち、ビーズの各部分集団の位置を同定するためにそのアレイを「解読」する。図１１は、限定されるものではないが、本発明のアレイおよびハイブリダイゼーションチャンバーを用いて行うことができるアッセイのフローチャートを示す。
【０１４６】
好ましい具体例においては、選択的解読システムを使用する。この場合、標的分析物の結合の結果として光シグナルの変化を示す微小球だけが解読される。この操作は、一般に、「ヒット」の数、すなわち、解読される部位の数が一般に少ない場合に行われる。すなわち、標的分析物の不存在の下にある実験的条件下でまずアレイをスキャンする。標的分析物を含有する試料を加え、光シグナルの変化を示す位置だけを解読する。例えば、ビーズの正または負のシグナル位置を選択的にタグ化またはアレイから放出させ（例えば、光切断可能なリンカーを用いて）、その後、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）にて分類または豊富化させる。すなわち、すべての負のビーズを放出させ、ついで正のビーズを放出させるかもしくはインサイチュにて分析するか、あるいはまたすべての正のビーズを放出させて分析する。別法として、標識はハロゲン化芳香族化合物を含んでいてもよく、その標識の検出を、例えば、ガスクロマトグラフィー、化学タグ、アイソトープタグ、マススペクトルタグを用いて行う。
【０１４７】
当業者に明らかなように、このことはまた、アレイが解読されていない；すなわち、今までにビーズの組成と位置とを相関付ける必要もなかった、システムにて行うこともできる。この具体例においては、ビーズをアレイ上に負荷させて、アッセイを行う。ついで、「正」の、すなわち、以下により詳細に示すように光シグナルの変化を示すそれらのビーズを、「負」のビーズと区別または分離するように「マーク」を付す。この操作は、数種の方法、好ましくは光ファイバーアレイを用いて行うことができる。好ましい具体例において、各ビーズは蛍光染料を含有する。アッセイを行い、「正」または「活性ビーズ」を同定した後、一般に、光活性化試薬（典型的には、溶存酸素）の存在下で、正のファイバーだけに、または負のファイバーだけに光を照らす。前者の場合、活性ビーズはすべて光漂白される。かくして、すべてのビーズを、例えば、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）装置を用いるその後の分類操作で非選択的放出に付した後、非蛍光的な活性ビーズを蛍光的な負のビーズから分類することができる。また、負のファイバーに光を照らすと、負はすべて非蛍光的であり、正は蛍光的であり、分類を進めることができる。付着した生体活性体の特徴化を、例えば、質量分光器を用いて直接行うこともできる。
【０１４８】
また、同一化が、ＩＢＬに類似するが、必ずしもＤＢＬに結合する必要のない、アイデンティファイアー部分（「ＩＭ」）の使用を介して起こるかもしれない。すなわち、生体活性体の構造を直接解明するよりもむしろ、ＩＭの組成物をアイデンティファイアーとして供することができる。かくして、例えば、ＩＭの特異的な組み合わせをビーズをコードするのに供し、それをビーズからの放出でビーズ上にある物質を同定し、つづいてその後の、例えば、ガスクロマトグラフィーまたは質量分光器を用いる、分析に用いることができる。
別法として、各ビーズは、蛍光染料を含有するというよりもむしろ、蛍光染料の非蛍光前駆体を含む。例えば、蛍光分子上の特定のオルトニトロベンジル基などの光切断可能な保護基を用い、蛍光色素の光活性化を行うことができる。アッセイを行った後、再び「正」または「負」のファイバーのいずれかに光を照射し、これらの集団を区別する。ついで、そのイルミネートされた先駆体を化学的に蛍光染料に変える。ついで、すべてのビーズを分類操作に付しながら、アレイから放出させ、蛍光および非蛍光ビーズ（正および負あるいはその逆）の集団を形成させる。
【０１４９】
別の好ましい具体例において、ビーズ（例えば、ウェル）の付着部位が光重合可能な試薬を含むか、あるいは光重合可能な試薬が集合アレイに付加されている。試験アッセイを行った後、光を再び「正」または「負」のファイバーのいずれかに照射し、これらの集団を区別する。その照射の結果として、すべての正またはすべての負が重合して、その部位にトラップまたは結合され、他のビーズの集団を該アレイから放出させることができる。
好ましい具体例において、あらゆる生体活性体の位置を解読結合リガンド（ＤＢＬ）を用いて測定する。上述したように、ＤＢＬは、存するとすればアイデンティファイアー結合リガンドに、あるいは、好ましくは生体活性体が核酸または蛋白である場合の、生体活性体それ自身に結合するはずの結合リガンドである。
好ましい具体例において、ＤＢＬは、上述したように、ＩＢＬに結合する。
【０１５０】
好ましい具体例において、生体活性体は一本鎖核酸であり、ＤＢＬは、本明細書中、デコーダープローブと称される、生体活性体に結合（ハイブリッド形成）する実質的に相補的な一本鎖核酸である。候補プローブの各々に実質的に相補的なデコーダープローブを製造し、アレイを解読するのに使用する。この具体例において、候補プローブおよびデコーダープローブは特異性を付与するのに十分な長さ（解読工程は適当な条件下で行う）でなければならず；すなわち、候補プローブは各々、各候補プローブの区別を可能とするのに十分に特異的に、その対応するデコーダープローブに結合しなければならない。
好ましい具体例において、ＤＢＬは直接的または間接的のいずれかで標識されている。本明細書中の「標識されている」とは、一の化合物が化合物の検出を可能とするように結合した少なくとも１個の因子、アイソトープまたは化合物を有することを意味する。一般に、標識は３つのクラス：ａ）アイソトープ標識であり、放射活性または重アイソトープとすることができる；ｂ）磁気、電気、熱；およびｃ）着色または発光染料に分けられるが、標識は酵素および磁気粒子などの粒子を包含する。好ましい具体例においては、ＤＢＬを直接標識し、すなわち、ＤＢＬは標識を含む。もう一つ別の具体例において、ＤＢＬを間接的に標識する；すなわち、ＤＢＬに結合するであろう標識化結合リガンド（ＬＢＬ）を使用する。この具体例において、標識化結合リガンド−ＤＢＬペアをＩＢＬ−ＤＢＬペアについて上述したものとすることができる。適当な標識は、限定されるものではないが、ユーロピウムとテルビウム、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラサイト・グリーン、スチルベン、ルシファー・イエロー、カスケード・ブルー（登録商標）、テキサス・レッド、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ｃｙ３、ｃｙ５およびリチャード・ピー・ホーグランドによるモレキュラー・プローブ・ハンドブックの第６版に記載されている別の化合物の複合体を含む、蛍光性ランタニド複合体を包含する。
【０１５１】
一の具体例において、標識は、局所的環境の変化により、ＩＢＬの存在下にある着色または発光特性が変化する分子である。例えば、標識は：（１）ｐＨと共に発光強度が変化する蛍光性ｐＨインジケーター；（２）イオン濃度と共に発光特性が変化する蛍光性イオンインジケーター；または（３）疎水性環境下で蛍光強度が増加するエチジウム塩などの蛍光性分子である。
したがって、個々のビーズ（またはビーズの部分集団）の位置の同定を、標識化ＤＢＬとＩＢＬまたは生体活性体の間の結合（すなわち、候補プローブと、生体活性体が核酸である場合のデコーダープローブとの間のハイブリダイゼーション）を含む１またはそれ以上の解読工程を用いて行う。解読した後、ＤＢＬを除去し、そのアレイを用いることができる；しかし、ある環境下、例えば、ＤＢＬが生体活性体ではなく、ＩＢＬに結合する場合、（ある環境下では望ましいかもしれないが）ＤＢＬの除去は不要である。加えて、本明細書中で述べたように、アレイをアッセイに使用する前、アッセイの間、またはアッセイの後のいずれにおいても解読を行うことができる。
【０１５２】
一の具体例において、単一の解読工程を行う。この具体例において、ＤＢＬの各々を独特標識で標識化する。そのために、独特標識の数は生体活性体の数に等しいか、またはそれより多い（ただし、ある場合には、本明細書中に記載されるように、独特標識を「再利用」することもできる；同様に、候補プローブの少数の変種が別の次元にて、すなわち、ビーズの大きさまたは標識にてコード化されているならば、そのような変種は同じデコーダーを共有することができる）。生体活性体またはＩＢＬの各々の場合、それと特異的に結合し、独特標識、例えば１またはそれ以上の蛍光色素を含有するＤＢＬを調製する。かくして、各ＤＢＬの同一性、その組成（すなわち、核酸である場合のその配列）およびその標識は共に知られている。ついで、ＤＢＬと生体活性体またはＩＢＬのいずれかの間の複合体（成分が核酸である場合にハイブリダイゼーション複合体と称される）の形成を可能とする条件下、ＤＢＬを生体活性体を含有するアレイに付加することにより、各ＤＢＬの位置を解明することができる。このことにより、各生体活性体の位置を同定することができ；ランダムアレイが解読される。ついで、必要ならば、ＤＢＬを取りだし、標的とする試料を適用することができる。
【０１５３】
好ましい具体例において、独特標識の数を独特な生体活性体の数よりも少なくし、そうして一連の解読工程を使用する。話を簡単にするために、この具体例は核酸について説明するが、他の型の生体活性体およびＤＢＬを同様に有用である。この具体例において、デコーダープローブを解読操作のためにｎ個のセットに分ける。セットの数は独特タグの数に対応する。各デコーダープローブをｎ個の別々のタグを有するｎ個の別々の反応にて標識化する。デコーダープローブはすべて同じｎ個のタグを共有する。各プールのデコーダーが各デコーダーのｎ個のタグのバージョンの１個だけを含有し、２つのデコーダープローブがすべてのプールを通して同じ配列のタグを有することがない。これを正当化するために必要なプールの数は、デコーダープローブの数およびｎの数により決定される。各プールをアレイにハイブリダイゼーションすると、ＩＢＬを含む処理毎にシグナルを発生する。各プールを、順次、連続的にハイブリダイゼーションすると、各候補プローブにつき独特な配列特異的コードが得られる。これにより各処理のアレイにおける候補プローブを同定する。例えば、４個のタグを用いる場合、４ｘｎ回の連続したハイブリダイゼーションで、理想的には４ｎ個の配列を区別することができるが、ある場合には、さらなる工程を必要とするかもしれない。各プールをハイブリダイゼーションに付した後、ハイブリッドは変性され、デコーダープローブは除去されているため、次のハイブリダイゼーションに備えて、プローブを一本鎖にする（ただし、利用可能なプローブが飽和状態とならないように、標的の数を限定してハイブリダイズすることも可能である。逐次的ハイブリダイゼーションは前のハイブリダイゼーションから前に存在するシグナルを減ずることにより行い、分析することができる）。
【０１５４】
当該分野の専門家には認識されるように、ハイブリダイゼーションまたはインキュベーションの時間は異なる。一般に、ハイブリダイゼーションまたはインキュベーションの時間は秒から分まで続き、または時間もしくは日もしくはそれ以上まで続く。本明細書に開示されるハイブリダイゼーションチャンバーを用いる場合、ハイブリダイゼーションまたはインキュベーション時間は該ハイブリダイゼーションチャンバーを用いないインキュベーション時間よりも増すことができる。
【０１５５】
例を示す。１６のプローブ核酸(番号１-１６)のアレイおよび４のユニークなタグ(４の異なる粉体(flour)、例えば、標識Ａ-Ｄ)を想定する。ビーズ上のプローブに対応するデコーダープローブ１-１６を作成する。第一ステップは、デコーダープローブ１-４をタグＡで、デコーダープローブ５-８をタグＢで、デコーダープローブ９-１２をタグＣで、およびデコーダープローブ１３-１６をタグＤで標識することである。プローブを混合し、次いで該プールを結合候補プローブを有するビーズを含むアレイと接触させる。各タグの位置(および次いで各デコーダーおよび候補プローブ対)を次いで決定する。デコーダープローブの第一のセットを次いで除去する。第二のセットを添加するが、このとき、デコーダープローブ１、５、９および１３をタグＡで標識し、デコーダープローブ２、６、１０および１４をタグＢで標識し、デコーダープローブ３、７、１１および１５をタグＣで標識し、次いでデコーダープローブ４、８、１２および１６をタグＤで標識する。即ち、両デコーディング段階でタグＡを含むこれらのビーズは候補プローブ１を含み、第一デコーディング工程でタグＡを、第二デコーディング工程でタグＢを含むビーズは候補プローブ２を含み、第一デコーディング工程でタグＡを、および第二工程でタグＣを含むビーズは候補プローブ３を含む。当該分野の専門家に認識されるように、デコーダープローブはいかなる順序で作成してもよく、およびいかなる順序で添加してもよい。
【０１５６】
一の具体例では、デコーダープローブはインサイチュで標識し、すなわち、それらはデコーディング反応の前に標識する必要はない。この具体例では、インカミングデコーダープローブは、候補プローブよりも短く、デコーディングプローブ上に５’「突出」を作成している。標識されたｄｄＮＴＰ(それぞれユニークなタグで標識されている)およびポリメラーゼの添加により、配列特異的な方法でタグを添加することが可能となり、こうしてシグナルの配列特異的パターンが作成される。同様に、ライゲーションなどを含む他の変更を行うことができる。
【０１５７】
加えて、アレイのサイズはユニークなデコーディング結合リガンドの数により指定されるので、もっと多数の試験部位を許容するために、ユニークなＤＢＬのセットを「再利用」することが可能である。これは、いくつかの方法；例えば、光学特性を含むいくつかのサブポピュレーションを用いることにより行われてよい。同様に、アレイ内におけるポジショナルコーディングスキームの使用；異なるサブバンドルがＤＢＬのセットを再利用してもよい。同様に、一の具体例はコーディングモダリティとしてビーズサイズを利用し、こうして、各ビーズサイズに関してユニークなＤＢＬのセットの再利用が可能となる。別法として、アレイに連続的にビーズを部分ローディングすることにより、ＤＢＬを再利用することも可能となる。さらに、「コードシェアリング」が同様に生じ得る。
【０１５８】
好ましい具体例では、ビーズのいくつかのサブポピュレーションに光学特性を含ませることによりＤＢＬを再利用してもよい。好ましい具体例では、光学特性は一般にレポーター色素、好ましくは蛍光の混合物である。混合物の組成(即ち、一の色素対他の色素の比率)および色素の濃度(シグナル強度の違いを導く)の両方を変化させることにより、ユニークな光学特性のマトリックスを作成してよい。これは、色素をビーズ表面に共有結合させることにより、またば別法として、色素をビーズ内にエントラップすることにより行われてよい。色素は発色団またはリン光体であってよいが、好ましくは蛍光色素であり、これは、その強いシグナルにより、デコーディングのための良好なシグナル対ノイズ比が提供される。本発明における使用に適した色素には、前記のＤＢＬを標識することに関して記載したものが含まれる。
【０１５９】
好ましい具体例では、エンコーディングは、少なくとも２の色素の比率において達成することができるが、例えばより多くのエンコーディングディメンションをビーズのサイズに加えてもよい。加えて、標識は互いに識別可能であり、すなわち、２の異なる標識には異なる分子(即ち２の異なる粉体)が含まれてよく、または別法として、２の異なる濃度または強度の１の標識が含まれてよい。
【０１６０】
好ましい具体例では、色素をビーズの表面に共有結合する。これは、ビーズの表面上の官能基を用いて、生物活性剤の結合に関して概説されるように行ってよい。当該分野の専門家により認識されるように、これらの結合は、色素の影響を最少にするべく行う。
好ましい具体例では、色素をビーズに、一般的にはビーズ上の孔中に色素をエントラップすることにより、非共有結合する。
【０１６１】
加えて、２またはそれ以上の色素の比率におけるエンコーディングが、単一の色素濃度よりもむしろ好ましいが、これは、それにより、レポーター色素の特性を調べるのに用いられる光の強度およびディテクターの感受性に対してインセンシティビティが提供されるからである。
【０１６２】
好ましい具体例では、空間的または位置的コーディングシステムを行う。この具体例では、サブバンドルまたはサブアレイ(即ち、全アレイの部分)を用いる。テレフォンシステムとの類似により、各サブアレイは他のサブアレイの同じ標識(即ち、テレフォンナンバー)を有することができる、サブアレイの位置により識別される「領域コード」である。すなわち、例えば、同じユニークな標識をバンドルからバンドルへと再利用することができる。つまり、５０のユニークな標識を１００の異なるサブアレイと組み合わせて用いて、５０００の異なる生物活性剤のアレイを作成することができる。この具体例では、１のバンドルを他から分けることができることが重要となり、一般に、これは手動またはマーカービーズの使用によるかのいずれかで行われ、これらは、各サブアレイのためのユニークなタグを含むビーズ、または種々の量の同じマーカービーズの使用、または異なる比率での２またはそれ以上のマーカービーズの使用であり得る。
【０１６３】
別の具体例では、さらなるエンコーディングパラメータ、ミクロスフィアサイズなどを追加することができる。例えば、異なるサイズのビーズの使用により、ＤＢＬのセットの再利用も可能となり、すなわち、ミクロスフィアのエンコーディングディメンションを拡張する異なるサイズのミクロスフィアの使用が可能となる。光学ファイバーアレイは、それぞれ異なるファイバー直径または断面を有するピクセルを含ませて作成することができ、別法として、それぞれが個々のファイバーの異なる断面を有する２またはそれ以上のファイバー光バンドルを追加して、より大きなバンドルを形成することができる；または、同じサイズの断面のファイバーを有するファイバー光学バンドルは、異なるサイズのビーズと共にのみ用いることができる。異なる倍率を用いて、最大のウェルは最大のミクロスフィアで満たし、ついでより小さなウェル中のより小さなミクロスフィアへと、全サイズのウェルが満たされるまで除々に移動することができる。この方法で同じ色素の比率を用いて異なるサイズのミクロスフィアをコードし、それにより、アレイ中に存在する異なるオリゴヌクレオチド配列の数または化学的官能基の数を拡張することができる。ファイバー光学物質に関して概説されているが、本方法ならびに本明細書に概説される他の方法を、他の物質および他の結合モダリティを用いて用いることができる。
【０１６４】
好ましい具体例では、コーディングおよびデコーディングは、ミクロスフィアをアレイに連続ローディングすることにより行われる。本具体例において空間的コーディングに関して前に概説されているように、光学特性は「再利用する」ことができる。この具体例では、それぞれ異なる生物活性剤を含むミクロスフィアのライブラリー(またはそれぞれ異なる生物活性剤を含むサブポピュレーション)を、例えば、所望のアレイのサイズおよびユニークなタグの数により複数のサブライブラリーに分け、それぞれ全ライブラリーのおよそ１０％を含む１０のサブライブラリーを形成してよく、それぞれのサブライブラリーは、同じユニークなタグを概して含む。次いで、第一のサブライブラリーを、ウェルを含むファイバー光学バンドルに添加し、各生物活性剤の位置を、一般にＤＢＬの使用により決定する。第二のサブライブラリーを次いで添加し、各生物活性剤の位置を再び決定する。この場合のシグナルは、「第一」ＤＢＬおよび「第二」ＤＢＬのシグナル形態を含み、２のマトリックスを比較することにより、各サブライブラリー中の各ビーズの位置を決定することができる。同様に第三、第四などを添加して、サブライブラリーにより連続的に、アレイが満たされる。
【０１６５】
好ましい具体例では、コードはいくつかの方法で「共有される」ことができる。第一の具体例では、単一のコード(即ち、ＩＢＬ／ＤＢＬ対)を、標的分析物のその結合強度が十分に異なる場合に２またはそれ以上の物質に対して割り当てることができる。例えば、ｍＲＮＡ定量アッセイに用いられる２の核酸プローブは、そのハイブリダイゼーションシグナル強度の範囲がオーバーラップしない場合、同じコードを共有することができる。これは、例えば、標的配列の一つが他のものよりもより常に高濃度で存在する場合にのみおこり得る。別法として、２の標的配列は常に同程度の濃度で存在してよいが、ハイブリダイゼーション効率は異なっていてよい。
【０１６６】
別法として、物質が機能的に等価である場合、単一のコードを複数の物質に対して割り当てることができる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブのセットを、特定の遺伝子の存在を検出するという共通の目的をもって割り当てる場合、プローブは、それらが配列を異にする可能性があっても、機能的に等価である。同様に、分析物のクラスまたは「ファミリー」が所望される場合、キナーゼまたはＧ-タンパク結合レセプターなどの、クラスの異なるメンバーに関する全プローブはコードを共有することができる。同様に、このタイプのアレイを用いて公知遺伝子のホモログを検出することができた。この具体例において、各遺伝子は、遺伝子の異なる領域にハイブリダイズしている(すなわち配列が異なる)プローブの異種セットにより表される。プローブのセットは共通のコードを共有する。ホモログが存在する場合、それは、プローブの全てにはハイブリダイズしないがいくらかにはハイブリダイズする可能性がある。ホモロジーのレベルはハイブリダイズしているプローブのフラクションならびに平均ハイブリダイゼーション強度により示すことができる。同様に同じタンパク質に対する複数の抗体は全て同じコードを共有する。
【０１６７】
好ましい具体例では、自己集合したランダムアレイのデコーディングを、ｐＨ滴定に基づき行う。この具体例では、生物活性剤に加えて、ビーズは光学特性を含み、ここで、光学特性はフルオロフォアなどのｐＨ反応性色素(ときに、「ｐＨ色素」と本明細書中呼ばれる)の使用により作成する。具体例はＰＣＴＵＳ９８／０５０５２およびＵ．Ｓ．Ｓ.Ｎ０９／１５１,８７７に概説されているものと同じであり、この両方を、本発明に用いられる色素が、溶液ｐＨをｐＫａ未満からｐＫａ以上(またはその逆)に調整する場合に蛍光強度(または他の特性)の変化を示すことを除き、引用により明らかに組み込む。好ましい具体例では、好ましくは少なくとも０．５ｐＨユニットにより分けられる異なるｐＫａをそれぞれ有するｐＨ色素のセットを用いる。好ましい具体例では、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１および１１．５のｐＫａのｐＨ色素セットを利用する。各ビーズは、ｐＨ色素のあらゆるサブセットを含むことができ、この方法により、生物活性剤に関してユニークなコードを作成する。つまり、アレイのデコーディングは、ｐＨ１からｐＨ１３までアレイを滴定し、次いで各ビーズからの蛍光シグナルを溶液ｐＨの関数として測定することにより達成する。
【０１６８】
好ましい具体例では、ユニークまたは別個のタグの数を増すさらなる方法が存在する。各ビーズ上の別個の属性を用いて、コードの数を増すことができる。加えて、連続デコーディングにより、新たな方法でコードを再利用することが可能となる。これらの特質は互いに独立であり、従って、デコーディング工程の数および属性の数の関数としてコードの数を指数的に増すことが可能となる。しかし、単一のデコーディングステップにおいて得られるデコーディング情報の量を増すことにより、デコーディングステップの数は明らかに減る。別法として、別個のコードの数は明らかに増える。デコーディングステップ当たりの属性の数を増すことにより、所定の数のコードに関して必要とされるデコーディングステップがより少なくなる。つまり、好ましい具体例では、様々な方法を用いてアレイをデコーディングする方法に用いるための多くのコードが作成するが、必要なデコーディングステップは少なくなる。例えば、様々な異なるコーディング法を組み合わせることができる。つまり異なる「色」、色の組み合わせ(「ｈｕｅｓ」)、異なる強度の色もしくはｈｕｅｓまたはその両方を全て組み合わすことができる。
【０１６９】
好ましい具体例では、ＤＢＬは、ビーズに物理的属性の定量的セットまたは別個のセットを添加または包埋すること、即ち、ビーズを標識することによる。ビーズの好ましい物理的属性には、制限されるものではないが、表面の「滑らかさ」または「粗さ」、色(蛍光およびその他)、色の強度、サイズ、検出可能な化学部分、化学反応性、磁性、ｐＨ強度、存在する色素間のエネルギー輸送効率、疎水性、親水性、吸収性、電荷、ｐＨ感受性などが含まれる。
【０１７０】
ビーズデコーディングスキームには、単一の定量可能な属性を各ビーズタイプに割り当てること／染み込ませることが含まれ、ここで、各ビーズのタイプはその属性の定量値が異なる。例えば、所定の数のフルオロフォアをビーズに結合し、次いでデコーディングプロセスにおいて結合されたフルオロフォアの数を定量することができる。しかし、実際、「所定の量」の属性をビーズに結合すること、および属性を正確に測定することは問題を含む可能性がある。一般に、目的は、変動率(ＣＶ)を減じることである。変動率とは、連続標識にてビーズを標識することにおける変動を意味する。このＣＶは、多くの試験において、ビーズを規定された所定の数の標識で標識すること、ついでビーズにより放射される生じるシグナルを測定することにより決定されることができる。大きなＣＶはあらゆる所定の属性に関して利用可能な、および解析可能な「レベル」数を制限する。
【０１７１】
より確実なデコーディングスキームは、定量的な属性をコードにセグメント化するのに、絶対的な測定よりもむしろラショメトリックな測定を用いる。ラショメトリックなデコーディングは、ラベルの比率(即ち、１：１０、１：１および１０：１)でもってビーズを標識することを意味する。理論においては、該比率間のシグナルの違いが検出できる限りは、あらゆる数の比率を用いることができる。このプロセスによりＣＶは小さくなり、所定の動的範囲内でより多い属性のセグメント化が可能となる。つまり、好ましい具体例では、ラショメトリックなデコーディングの使用により変動係数が減る。
【０１７２】
加えて、当該分野の専門家により認識されるように、ラショメトリックなデコーディングは、種々の方法で行うことができる。この具体例では、第一デコーディング反応において第一色素(または色素の組み合わせ)強度を所定の数のＤＢＬに付加し、連続第二デコーディング反応において第二色素強度を第二の数に付加するよりもむしろ、このラショメトリックな分析は、標識：非標識ＤＢＬの比率を用いることにより行ってよい。すなわち例えば１００,０００ＤＢＬ／反応に関してセットに飽和濃度のデコーディングビーズを与える場合、第一強度デコーディングステップは、１００,０００標識ＤＢＬを付加することにより行ってよく、次いで、第二ステップは、１０,０００標識ＤＢＬおよび９０,０００非標識ＤＢＬを付加することにより行うことができる。平衡は、第二ステップが１０分の一のシグナル強度を与えることを示す。
【０１７３】
定量的に測定された属性値の値の幅のために、別個のコードの数は実質上１２未満にまたはそのようなコードに制限される。しかし、ビーズを異なる属性値で連続的に「ペイントすること」(即ち、属性レベルをビーズに一時的に結合すること)および「取り除くこと」(属性レベルを除去すること)により、可能なコードの数が、デコーディングプロセスにおける連続ステージの数と共に指数関数的に増す。
【０１７４】
例を示す。例えば、９の異なるビーズタイプおよび３の識別可能な属性の分布(表１)。２の異なるステージにおいて、組み合わせとして異なったパターンの異なる属性値を有するビーズを「ペインティングすること」(標識すること)により、各ビーズタイプに関してユニークなコードが生じる、すなわち、９の別個のコードが生じる。つまり、好ましい具体例において、ビーズを複数のステージにおいて異なる属性を用いて組み合わせとして異なるパターンで標識する。これにより、各ビーズタイプに関してユニークなコードが生じる。異なる属性の例は前に開示する。ビーズの別個の属性での標識は、当該分野で公知の方法により行う。
【０１７５】
【表１】
Figure 0004954415
表１ 連続デコードにより、少数の属性レベルを用いてユニークなコードが生じる。
【０１７６】
蛍光色は、デコーディングスキームに使用するための特に便利な属性である。ＩＢＬを認識するあらゆる物質に蛍光色を結合して、標識されたＤＢＬを作成することができる。ＤＢＬとしてのオリゴヌクレオチド(核酸アナログを含む)に対して考察を指向する。蛍光標識はビーズのあらゆる所望のサブセットを特定の色で、(即ち、相補的な配列を有するＤＢＬに対して)単にハイブリダイゼーションおよび脱ハイブリダイゼーションのプロセスにより特異的および可逆的に「ペイント」(標識)することができるので、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、特に有用なＤＢＬである。さらに、蛍光は、常套の光学ハードウェアおよびソフトウェアを用いて容易に画像処理され、および定量される。所定のビーズタイプを特定色で「ペイント」するために、ビーズのタイプをユニークなハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列(ＩＢＬ)で標識しなければならず、デコーディング溶液は、色で標識されたその配列の成分を含まなければならない。
【０１７７】
デコーディングスキームを実行するのに考慮すべきことは、集められる画像の数を最少にすることである。色に基づくスキームにおいて、集められる画像の数は色の数およびステージの数の産物である。画像の数は、ビーズを多くの色で、各所定のステージに関して「ペインティングすること」により減じることができる。複数の色をビーズに割り当てることにより、有効なコードの数が増す。例として、２４ビットの３色スキーム(例えば、赤、緑、青)において、コンピューターにより用いられる着色プロセスにおいて、２５６＊２５６＊２５６＝１６７０万の異なる「ｈｕｅｓ」のトータルを単に３つの色(赤、緑、青)から作成することができる。
【０１７８】
つまり、好ましい具体例において、ＤＢＬは着色されたフルオロフォアの組み合わせを用いて標識する。このように、この方法は、少数の異なる色素(色)のみを用いてＤＢＬを標識するために利用できるコードの数を増すことに使用できる。各デコーディングステップに利用できるコードの数を増すことにより、所定のデコーディングプロセスに必要とされるデコーディングステップの数が大幅に減る。
【０１７９】
一の具体例では、単一のＤＢＬをコードしているオリゴヌクレオチドのポピュレーションを、着色されたフルオロフォアの組み合わせから作成される特徴的な「ｈｕｅ」に基づきＤＢＬが結合する各ビーズが同定されるように、色の規定された比率を用いて標識する。好ましい具体例では、２の別個の色を用いる。好ましい具体例では、３またはそれ以上の別個の色素(色)が使用できる。この場合、単一ＤＢＬをコードしているオリゴヌクレオチドのポピュレーションをいずれかの所定の色で標識することにより作成される識別可能なコードの数は３である。しかし、色および色のレベルの組み合わせを標識において許容することにより、より多くのコードが作成される。
【０１８０】
ハイブリダイゼーションによるデコーディングに関して、識別可能な色の明暗のより好ましい数は２〜２０００であり、識別可能な色の明暗のより好ましい数は２〜２００であり、および識別可能な色の明暗の最も好ましい数は２〜２０である。３の異なる色の明暗(強度)および３色を用いて、異なるｈｕｅの数は３４＝８１である。ｈｕｅを連続デコーディングと組み合わせることにより、明らかに無制限の数のコードが作成される。
【０１８１】
前記のように、ＤＢＬはＩＢＬに結合する物質であり得る。好ましい具体例では、単一のＤＢＬを予め決定された比率の色で標識する。この比率は各ＤＢＬで変化し、こうして、そのように標識された各ＤＢＬに関してユニークな「ｈｕｅ」が可能となる。ビーズのＤＢＬを用いた処理の後、ビーズを分析して、各ビーズに結合された「ｈｕｅ」を決定し、それによりその結合された生物活性剤を用いてビーズを同定する。
【０１８２】
例えば、４の主要色および２の強度レベル(色は存在または不在)を用いて、１５の異なるｈｕｅｓ/ステージが可能である。４の色素および３の別個の強度レベルを用いる場合(不在、半分存在、完全に存在)、７３の異なるｈｕｅ／ステージが可能である。この場合、７３の異なるコーディングｈｕｅに関する情報を得るのに、わずか４色の画像を獲得するので十分である。
【０１８３】
好ましい具体例では、本発明により、別個の部位を含む表面を有する第一基質を含むアレイ組成物が提供される。好ましい具体例は部位に分散したミクロスフィアのポピュレーションを利用し、そのポピュレーションは少なくとも第一および第二サブポピュレーションを含む。各サブポピュレーションは生物活性剤を含み、および加えて、所定のｐＫａを持つ少なくとも一の光学色素を含む。異なる光学色素のｐＫａは異なる。
【０１８４】
好ましい具体例では、例えばアレイがクローン化された核酸を含む場合、アレイをデコードするのに用いることができるいくつかの方法がある。好ましい具体例では、クローン化された核酸についてのいくつかの配列情報が公知である場合、特異的デコーディングプローブを、本明細書に概説されるように作成することができる。
【０１８５】
好ましい具体例では、「ランダム」でコーディングプローブを作成することができる。連続ハイブリダイゼーションまたは複数の標識を用いることにより、前記のように、ユニークなハイブリダイゼーションパターンを、各センサーエレメントに関して作成することができる。これにより、所定のクローンを表している全ビーズを同じグループに属するとして同定することが可能となる。該して、これは、配列依存的だが、高度に配列特異的な方法ではないランダムまたは部分的に変性したデコーディングプローブを用いることにより行う。プロセスは、何度も反復することができ、各場合に異なる標識体を用いて、quesi-特異的相互作用に基づく異なるシグナルパターンを作成することができる。この方法で、ユニークな光沢特性を各センサーエレメントに関して最終的に作成する。パターン認識またはクラスタリングアルゴリズムを光学特性に当てはめることにより、ビーズを同じ特性を有する(すなわち、同じプローブを持つ)セットにグループ分けすることができる。
【０１８６】
クローンそのものの実際の配列を同定するために、さらなる操作が必要であり、例えば、直接配列決定を行うことができる。クローンを含む順序付けられたアレイ、例えばスポットされたｃＤＮＡアレイなどを用いることにより、セットにおけるその位置が公知である特異的クローンに対してハイブリダイゼーションパターンを関連付ける「鍵」を作成することができる。この方法において、クローンを回収し、次いでさらに特徴付けることができる。
【０１８７】
別法として、クローンのアレイは、ベクタータグを用いるバイナリーデコーディングを用いてデコードすることができる。例えば、部分的にランダム化されたオリゴを核酸ベクター(例えば、プラスミド、ファージなど)にクローン化する。各オリゴヌクレオチド配列は、制限されたセットの配列のサブセットからなる。例えば、制限セットが１０の配列を含む場合、各オリゴヌクレオチドはいくつかのサブセット(または１０の全て)の配列を有してよい。従って、１０の配列のそれぞれはオリゴヌクレオチドが存在しても存在しなくてもよい。それゆえ、２１０または１，０２４の可能な組み合わせが存在する。配列はオーバーラップしていてよく、可能な組み合わせの数を増すために、少数の変種が表されることもできる(例えば、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧ置換)。核酸ライブラリーを、ランダムコード配列を含むベクターにクローン化する。別法として、ＰＣＲなどの他の方法を用いてタグを付加することができる。この方法において、クローンのアレイをデコードするための少数のオリゴデコーディングプローブを用いることができる。
【０１８８】
好ましい具体例では、識別分析およびクラスターアルゴリズムおよびコンピューター装置を用いて、本発明のアレイからデコーディングデータを分析する。複合ステップデコーディングプロセスにフルオロフォアの異なる強度および「ｈｕｅｓ」の使用と組み合わせて、本発明に利用される非常に多数のコードは、データの良好に分類することが必要となる。データ、特に強度データは、各段階で異なる色または色の混合物を用いてビーズを可逆的に標識する(例えば、ビーズ上のＩＢＬプローブに対して色素標識された相補的デコーディングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによる、または非核酸ＩＢＬ-ＤＢＬ対に関する結合リガンド対の形成による)複合ステッププロセスにおいて獲得する。問題は、各段階でペイントする色に関して、ビーズを迅速に分類することである。(光学画像処理システムにより決定されるように)標識が互いにより密接に関連するほど、分類はより困難となる。
【０１８９】
画像処理システムにより認められる色素の近接は、デコーディング色素のスペクトル特性および画像処理システムのスペクトルチャンネル分離により決定する。より良好な色の分離を、狭い発光スペクトルを有する蛍光色素を用いることにより、および「ピークにある」色素を励起するよう、および「ピークにある」その発光を測定するべく設計される狭いバンドパス励起および発光フィルターを有する光学システムを用いることにより達成する。ビーズ上の色素を光学画像処理する方法は、我々の脳が、我々の目の中の３の異なる円錐体タイプにおける興奮の比率を測定することにより色を見る、ヒトの視覚プロセスと同様である。しかし、光学画像処理システムを用いて、実際の色のチャンネルの数は、ヒトの目に存在する３よりも大きい。目の円錐体は５００-６００ｎｍの可視スペクトルに変わるが、画像処理システムに基づくＣＣＤは３５０ｎｍから８５０ｎｍまでの色を「見る」ことができる。
【０１９０】
ビーズアレイをデコーディングする問題は、識別分析分類の問題である。つまり、好ましい具体例において、超スペクトルα空間における変動の分析は、ビーズ色またはｈｕｅの公知のセットにおいて行う。αスペース中のビーズクラスターの中心は、クラスターの重心と名づけられ、クラスター内のポイントの散乱はクラスターの広がりを決定する。確実な分類スキームには、異なるビーズクラス(ｈｕｅｓ)の重心間の距離が、いずれのクラスタークラスの広がりよりも大きいことが必要である。さらに、重心の位置はファイバー間で、および実験間で一定であるべきである。
【０１９１】
つまり、好ましい具体例では、ｈｕｅ「ゾーン」は、ｈｕｅ重心を囲み、クラスターの分布半径から広がっているαスペース中の領域として規定する。ｈｕｅ重心の引用セットおよび拡張半径が与えられる場合、経験的に決定されるように、データの新規なセットの分類は、所定のビーズポイントがｈｕｅクラスターの「ゾーン」へ、または「ゾーン」内に落ちるかどうかを調べることにより行うことができる。これは、異なるｈｕｅクラスの重心からのビーズポイントのMahalanobis距離(この場合、単純にユークリッド距離メートルである)を算定することにより行う。図３に示すデータに関して、重心の位置および互いのその距離を、表２に示す。
【表２】
Figure 0004954415
【０１９２】
異なるビーズを個々の色相で分類するために、０．３のユークリッドのディスタンスカットオフ（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｃｕｔｏｆｆ）を選択した。０．３のユークリッドまたはマハラノビスの距離を用いる場合、最も近い２つの重心であるＢｏｄ−Ｒ６ＧおよびＢｏｄ−５６４（距離＝０．５５）はそれらの解読範囲において少しの重複を有する。分類の改善はこの距離を減少させることにより、および異なる座標軸に適当に重みをつけることにより行うことができる。
【０１９３】
加えて、本発明はビーズの色を分析し分類するための計算方法を提供する。ビーズの色の分類をハイパースペクトル「アルファ」空間（ａ１＝Ｉ１／ＳＩｉ、ａ２＝Ｉ２／ＳＩｉ、ａ３＝Ｉ３／ＳＩｉ、など）においてビーズを調べることにより行い、各々の座標軸は与える画像チャンネル内でのフラクションのビーズの強度を意味する。例えば、４つの画像チャンネルを用いてビーズを映した場合、ビーズの色または色相を３次元のアルファ空間の点によりあらわすことができる（４次元は必ずしもＳａｉ＝１からではない）。ビーズを標識化することにより一連の異なる本来の色素を与えると、色素を割合を変化させたり、組み合わせの傾向を変えて、組み合わすことができるため、これらの色素から生じることができる色相の数は限定されない。実用的な色相の数を、ハイパースペクトルアルファ空間における異なる色相クラスターの分類により実験的に判断する。
【０１９４】
図３は４つの別々のイメージングチャンネルで描かれている４つの異なる色相で標識されているビーズのハイパースペクトルアルファプロットを示す。ビーズは４つの区別可能なクラスターを形成することを示す。これらの４つのクラスターがはっきりと分離されているという事実により、強固な解読分類スキームを行うことができる。
【０１９５】
好ましい具体例において、解読操作の品質管理分析を行う。このことは、各々の解読段階のためにアルファ空間のクラスター分析を行うことにより達成する。判断されたクラスターの数を予測された色相の数により確定する。クラスターの重心の位置をモニターし、予測位置からの偏差に着目する。
すなわち、本発明は本発明のアレイを解読するための装置を提供する。本明細書中で概説されている組成物に加えて、装置には母線を介するメモリーおよび一連の入力／出力装置（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）で通信する中央演算処理装置を包含する。中央演算処理装置、メモリー、入力／出力装置および母線の間の一般的な相互作用は当該分野で周知である。本発明の１つの態様は、メモリーに記録されているハイパースペクトル「アルファ」空間分類系統に指向される。
【０１９６】
該分類システムプログラムは、光学式読取装置または共焦点顕微鏡（または別のイメージングシステム）からデータを受け取るデータ収集モジュールを包含する。一般的には、分類プログラムは、ハイパースペクトルアルファ空間における変動の分析、クラスラーの重心の計算、クラスターの散乱（広がり）の計算および色相の範囲およびディスタンスカットオフを定義することができる分析モジュールを包含する。さらに一般的には、該分析モジュールはマハラノビスの距離を計算することによりデータポイントが色相の範囲内に含まれるかどうかを判断する。
最終的には、該分析モジュールはビーズの位置に生物活性剤を最終的に帰属させるために異なる逐次的な解読情報を分析する。
【０１９７】
このように、各々の段階でアレイ中の各々のビーズを各々の段階で色相のクラスターに帰属させるための判別分析計算を利用して、逐次的な解読段階を実行する。逐次的な解読情報のビルドアップによりビーズの位置と化学反応とを相互に関連付ける。
【０１９８】
いったん作成し、本発明の組成物の多数の適用した用途をみいだす。好ましい具体例において、該組成物を標的検体（存在する定量化した標的検体量を包含する）の存在または不在の試料溶液を調査するために使用する。「標的検体」または「検体」または本明細書中の文法的相当語句は、結合相手を検出するか、または評価するかのどちらかを行う原子、分子、イオン、分子イオン、化合物または微粒子を意味する。当業者に認識されているように、多数の検体を本発明に用いてもよく、基本的には、生物活性剤との結合または結合パートナーを探すいかなる標的検体を用いることができる.

【０１９９】
適当な検体は、生体高分子を含む、有機および無機分子を包含する。標的検体の検出を行う場合、適当な標的検体は環境汚染物質（除草剤、殺虫剤、毒などを含む）、化学物質（溶媒、ポリマー、有機物質などを含む）、治療分子（治療および覚せい剤、抗体などを含む）、生体高分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜抗原および受容体（神経の、ホルモンの、栄養素および細胞表面受容体）またはそれらのリガンドなどを含む）、全細胞（原核生物（例えば、病原菌）および真核生物細胞を含む、哺乳動物の腫瘍細胞を含む）、ウィルス（レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、レンチウィルスなど）および胞子を包含するが、限定するものではない。特に好ましい検体は核酸およびタンパク質である。
【０２００】
好ましい具体例において、標的検体はタンパク質である。当業者に認識されているように、本発明を用いて結合パートナーを検出または評価しうる可能なタンパク質性標的検体が多数存在する。適当なタンパク質標的検体は（１）免疫グロブリン、（２）酵素（および別のタンパク質）、（３）ホルモンおよびサイトカイン（細胞受容体用リガンドとして供する多くのもの）および（４）別のタンパク質を包含するが、限定するものではない。
【０２０１】
好ましい具体例において、標的検体は核酸である。一般的に、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．ｓ６０／１６００２７、６０／１６１１４８、０９／４２５６３３および６０／１６０９１７（出典明示により本明細書の一部とする）で概説されているように、これらのアッセイは広範囲の適用における用途を見出されている。
【０２０２】
好ましい具体例において、該プローブを遺伝子診断に用いる。例えば、プローブを本明細書記載の手法を用いて作成し、標的配列、例えば、非腺腫性大腸癌の遺伝子、ＢＲＣＡ１乳癌遺伝子、種々の癌に関連する遺伝子であるＰ５３、アルツハイマー疾患の大きな危険性を有するＡｐｏＥ４遺伝子、患者の発病前の容易なスクリーニング、嚢胞性線維症遺伝子における変異、チトクロムＰ４５０ｓまたは当業者に周知の別のいかなる物を検出することができる。
【０２０３】
さらなる具体例において、ウィルスおよびバクテリアの検出を本発明の複合体を用いて行う。この具体例において、プローブを設計し、種々のバクテリアおよびウィルスから標的配列を検出する。例えば、現在の血液スクリーニング法は抗ＨＩＶ抗体の検出をもちにしている。本明細書中に開示されている方法は臨床的な試料の直接スクリーニングを可能にし、ＨＩＶ核酸配列、特に、極めて保存されているＨＩＶ配列を検出する。加えて、抗ウィルス治療の効果の評価の改良方法として、患者内の環状ウィルスの直接的なモニタリングを可能にする。同様に、白血病に関連するウィルスである、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩをこの方法で検出してもよい。また、バクテリアの感染、例えば、結核、クラミジアおよび別の性感染症を検出してもよい。
【０２０４】
好ましい具体例において、本発明の核酸は水および食物試料のスクリーニングでの有毒なバクテリアのためのプローブとしての用途を見出した。例えば、試料は核酸を放出するバクテリアを溶解させるための処置をし、次いで、プローブは菌種（限定するものではないが、例えば、病原株としては、サルモネラ菌、カンピロバクター菌、コレラ菌、リーシュマニア、大腸菌の腸毒素株およびレジオネラ症バクテリアを包含する）の見分けがつくように設計した。
【０２０５】
さらなる具体例において、該プローブは犯行現場のＤＮＡと被害者および被疑者から採取した試料を照合する「ＤＮＡ指紋採取」に使用する。
さらなる具体例において、アレイでの該プローブはハイブリダイゼーションによる配列決定に使用する。
【０２０６】
また、本発明は標的核酸配列における変異またはミスマッチの検出法としての使用を見出す。例えば、現在の焦点は、多型ＤＮＡマーカーの使用による遺伝的変異と発現型との関係の分析にある。以前の研究では、多型ポジショナルマーカーとしての短い縦列反復（ＳＴＲｓ）を利用したが、現在の焦点は、ヒト遺伝的ＤＮＡにおいて１キロベースあたり平均して１回以上の頻度で起こる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）である。特に、コード配列の中および周囲でのＳＮＰｓは治療的に関連した表現型変種の直接的原因である可能性が高い。周知の多型の多くは臨床的に重要な表現型に起因し、例えば、ａｐｏＥ２／３／４変種はアルツハイマーおよび別の疾患のさまざまな相対危険度を伴う（Cordorら, Science 261 (1993)）。オリゴヌクレオチドアレイへの次のハイブリダイゼーションでのＳＮＰ座の多重ＰＣＲ増幅は、少なくとも何百ものＳＮＰｓを同時に遺伝子型を特定する正確で、確実な方法であることを示す（Wangら、Science, 280:1077(1998)を参照；また、Schaferら, Nature Biotechnology 16:33-39(1998)を参照）。本発明の合成は先の技術のアレイを代用していてもよく、特に、一塩基伸長（ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）およびピロシークエンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法は本発明の組成物に有用である。
【０２０７】
好ましい具体例において、本発明の組成物を生物活性剤を選別するために用い、標的分子と結合し、好ましくはその機能を変化させる物質を見出す。前記したように、多種多様の異なるアッセイ形式を、当該分野で周知のように実行してもよい。一般的には、望ましい結合パートナーのための標的検体を標識し、生物活性剤による標的検体の結合により、次の検出で結果として標識したビーズの補充を行う。
【０２０８】
好ましい具体例において、生物活性剤および標的検体の結合は特異的であり、すなわち、生物活性剤は標的検体に特異的に結合する。本明細書における「特異的結合」とは、検体と別の構成要素または試験試料の汚染物質とを見分けるのに十分な特異性で、該剤が検体に結合することを意味する。しかしながら、当業者に認識されているように、格別特異的でない結合を用いて検体を検出することは可能であり、該システムは異なる結合リガンド、例えば、異なるリガンドのアレイを用いてもよく、個々の検体の検出は「エレクトロニック・ノース（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｎｏｓｅｓ）」研究での操作に類似する結合リガンドのパネルに結合する「特徴」による。これは化学的検体の検出において特に有用である。結合は、非特異的結合を排除するための洗浄段階を包含するアッセイ条件下で結合したままであるのに十分なものであるべきであるが、ある具体例において、低い親和性の結合パートナーを検出するためには洗浄段階は望ましくない。いくつかの具体例において、対の解離定数は約１０−４〜１０−６Ｍ−１未満であり、約１０−５〜１０−９Ｍ−１未満が好ましく、約１０−７〜１０−９Ｍ−１未満が特に好ましい。
【０２０９】
一般的には、標的検体が少なくとも１つの生物活性剤と結合するために適当な条件、すなわち、一般に、生理学的条件下で、標的検体を含む試料（標的検体の検出用か、または標的検体の結合パートナーのスクリーニング用）をアレイに加える。次いで、標的検体の存在または不在を検出する。当業者に認識されているように、これは種々の方法で行われ、一般に、光信号における変化の使用を用いて行われる。この変化は多くの異なる機構を介して起こりうる。ある具体例は、色素標識検体とビーズの結合、ビーズ上または近くの色素種の生成、存在する色素種の破壊、ビーズ上の色素と相互作用する検体に対する光学的特徴の変化、または別の光学的応答を包含する。
【０２１０】
好ましい具体例において、光信号の変化は、検出可能な標識、好ましくは光学的標識（例えば、蛍光色素）で直接的または非直接的に標識されている標的検体の結合の結果として起こる。すなわち、一例を挙げると、タンパク質性標的検体を使用した場合、直接または非直接的に、例えば、標識されている抗体の使用を介して蛍光で標識してもよい。
【０２１１】
同様に、核酸を、例えば、当該分野で周知のＰＣＲ増幅の間に蛍光で容易に標識してもよい。代わりに、標的配列の結合に際してハイブリダイゼーションインジケーターを標識として用いてもよい。ハイブリダイゼーションインジケーターは、たいてい可逆的に優先的に２本鎖の核酸に伴う。ハイブリダイゼーションインジケーターはインカレーターおよび副および／または主溝結合部分を包含する。好ましい具体例において、インカレーターを用いていてもよく、インカレーターは一般的に２本鎖の核酸の存在下でのみ起こるため、標的ハイブリダイゼーションの存在だけでは標識は発光するであろう。すなわち、標的検体と生物活性剤との結合に際して、その部位で生じる光信号があり、次いで検出される。
【０２１２】
代わりに、ある場合において、前記したように標的検体、例えば、酵素は直接的または非直接的な光学的に検出可能な種を生じる。
【０２１３】
さらに、ある具体例において、光学的特徴の変化は光信号の基盤であるとしてもよい。例えば、ある化学的な標的検体とビーズ上のある蛍光色素との相互作用は光学的特徴を変え、すなわち異なる光信号を生じる。
【０２１４】
当業者に認識されているように、ある具体例において、標的検体の存在または不在を別の光学または非光学信号の変化を用いて行ってもよい（表面増強ラマン分光、放射能などを包含するが、限定するものではない）。
【０２１５】
当業者に認識されているように、該アッセイを種々の実験条件下で行ってもよい。反応はアッセイに含まれうる様々な他の試薬を包含しうる。これらとしては、塩、緩衝液、中性タンパク(例えば、アルブミン)、界面活性剤などの試薬が挙げられる。これらは最適なタンパク質・タンパク質結合および検出を容易にし、および/または非特異的なもしくはバックグラウンドの相互作用を減少させるのに用いうる。また、試料の調製方法および標的に純度に依存して、それ以外にアッセイの効率を向上させる試薬(例えば、プロテアーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ阻害薬、抗菌薬など)を用いてもよい。必須の結合を提供する、組成物の混合物を任意の順序で加えてもよい。種々の遮断および洗浄段階を当該分野で周知のように利用してもよい。
【０２１６】
好ましい具体例において、二色の（ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ）競合ハイブリダイゼーションアッセイを行う。これらのアッセイは慣用的なサンドイッチアッセイに基づいて行うことができる。該ビーズは標識配列を捕獲するＳＮＰの片方（上流または下流）に位置する捕獲配列を含有する。異なる蛍光物質で各々標識されている２つのＳＮＰ対立遺伝子特異的プローブを標識配列にハイブリダイズする。一般的によりよい結合を示す正しい配列とともに、遺伝子型を２つの信号比から得ることができる。これは標的配列自身を標識する必要がないという利点を有する。加えて、該プローブは競合しているため、このことは結合条件を最適化する必要がないことを意味する。ミスマッチなプローブを安定に結合させる条件下で、マッチしたプローブはそれにとって変わることができる。それゆえ、該競合アッセイはそれらの条件下でよりよい識別を提供することができる。多くのアッセイは並列して行うため、条件を同時に全てのプローブのために最適化することはできない。それゆえ、ミスマッチな識別にとって最適でない条件を補うように競合アッセイシステムを使用することができる。
【０２１７】
好ましい具体例において、ジデオキシヌクレオチド・チェーンターミネーター配列決定を本発明の組成物を用いて行う。この具体例において、ＤＮＡポリメラーゼを蛍光標識したｄｄＮＴＰｓを用いたプライマーの伸長のために用いる。プライマーの３’末端はＳＮＰ部位に隣接して位置している。このように、単一塩基伸長はＳＮＰ部位の配列に相補的である。各々の塩基につき一つで、４つの異なる蛍光物質を用いることにより、ＳＮＰ配列を４つの塩基特異的な信号を比較することにより推論することができる。これは種々の方法で行ってもよい。第一の具体例において、捕獲プローブを伸長することができ、このアプローチにおいて、該プローブをビーズ上の５’から３’に向かって合成、または５’末に取り付け、ポリメラーゼ伸長用の遊離の３’末を得る必要がある。代わりに、サンドイッチ型アッセイを用いることができ、この具体例において、該標的をプローブによりビーズ上で捕獲し、ついで、プライマーをアニールし、伸長させる。後者の場合において、該標的配列を標識する必要はない。加えて、サンドイッチ型アッセイは２つの特異的な相互作用を必要としているため、複合体試料の分析に特に適しているさらなるストリンジェンシーを提供する。
加えて、標的検体および該ＤＢＬのどちらもが該薬剤と結合する場合、競合の解読を介して標識していない標的検体の検出を行うことができる。
【０２１８】
好ましい具体例において、本発明の方法はアレイ品質管理に有用である。本発明前に、いかなる方法にも全てのアレイ上の全てのプローブの性能のポジティブ試験を提供することは記載されていない。アレイ解読はこの試験を提供するだけでなく、過程自身を解読する間に生じるデータを利用することにより行われる。それゆえ、付加実験は必要でない。本発明はソフトウェアで解読できる一連のデータの分析アルゴリズムを必要とする。
【０２１９】
品質管理操作はアレイにおける幅広いシステマティックなランダムな問題を同定することができる。例えば、塵または別の混入物のランダムな一片はある検出器に不適当な信号を与える原因となり、これは解読中に検出することができる。複合的なアレイからの１つ以上の薬剤の欠如を検出することができる。この品質管理操作の利点はアッセイの直前に行うことができることにあり、各々の検出器の真の機能試験といえるところである。それゆえ、アレイの組み立てと実用性の間に起こるに違いない、いかなる問題もみつけることができる。高レベルの信頼性が必要であり、および／または検出器故障の深刻な見込みがある適用において、解読および品質管理を実際の試料分析の前後で行うことができる。
【０２２０】
好ましい具体例において、該アレイを試薬の品質管理を行うために用いることができる。多くの場合において、生体高分子を試薬として用い、品質を管理しなくてはいけない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブの多くを試薬として提供してもよい。多数の異なる生体高分子の品質管理を行うことは典型的に難しい。本明細書記載のアプローチを用いて、アレイの代わりの変数として試薬（ＤＢＬｓとして処方）を処理することにより行うことができる。
【０２２１】
好ましい具体例において、本明細書中に概説した方法をアレイキャリブレーションに用いる。多くの適用、例えば、ｍＲＮＡの定量のために、標的検体の濃度に対して直線的な応答である信号を有することが望ましく、または、もし非直線的であれば、濃度と信号の関係を調べ、標的検体の濃度を推定することができる。したがって、本発明はアレイにおける複合的なビーズのための並列したキャリブレイションな曲線を作る方法を提供する。キャリブレーションな曲線を分析するのに複雑な試料をシミュレートする条件下で作ることができる。同時のアレイ用の別の曲線を除いて、各々の曲線を他のものと無関係に構築することができる（例えば、異なる範囲の濃度）。すなわち、この具体例において、異なる蛍光物質よりむしろコード「標識」として用いて、逐次的な解読スキームを異なる濃度で行う。このように、濃度経の応答のような信号を各々のビーズで測定することができる。このキャリブレーションを直前のアレイを用いて行うことができ、全てのアレイ上の全てのプローブを必要に応じて個々にキャリブレートする。
【０２２２】
好ましい具体例において、本発明の方法をさらなるアッセイ開発に用いることができる。すなわち、例えば、該方法はプローブよし悪しの同定ができ、当業者に認識されているように、あるプローブはうまくハイブリダイズしないためか、または１つ以上の配列と架橋ハイブリダイズするためうまく機能しない。これらの問題を解読の間に容易に見つける。プローブの能力を速やかに見積もる能力は、アッセイ開発の時間および費用を大きく減少させる可能性を有する。
【０２２３】
同様に、好ましい具体例において、本発明の方法はアッセイ開発における定量に有用である。多くのアッセイの主な難問は、関連した検体の複合的な混合物の存在下で、試料と検体との濃度の違いを見分ける能力、これらの違いを定量および検体の確かな濃度を測定する能力である。この問題の例は全細胞のｍＲＮＡ存在下での特異的ｍＲＮＡの定量である。ｍＲＮＡ定量の基準として構築されている１つのアプローチは複合的なマッチおよびミスマッチなプローブ対を利用することである（Lockhartら、1996（出典明示により全てを本明細書の一部とする））。このアプローチは単純であるが、比較的多くのプローブを必要とする。このアプローチにおいて、濃度に対する定量的な反応を所定の遺伝子または配列への一連の異なるプローブからの信号を平均することにより得る。あるプローブだけが定量的に反応するため、これらのプローブを確実に予測することは不可能である。予備的知識の欠如において、適当に選択して集めたプローブの平均的反応は定量的である。しかしながら、本発明において、これは一般的に別のアッセイと同様なアッセイに基づく核酸に適用することができる。本質的には、該アプローチは、別のプローブでそれらを平均するよりむしろ、個々のアッセイにおける定量的に反応するプローブを同定することである。このことは前記したキャリブレーションアレイスキームを用いて行い、濃度に基づくコードを用いる。このアプローチの利点は、少しのプローブしか必要としないこと、測定の精度が使用したプローブにあまり依存しないこと、および各々および全ての配列が効率的な操作で試験できるため、検出器の感度が確実に高レベルであると知られていることを包含する。実験的にうまく選択され、予測したプローブ能力、特に、複合体配列混合物中での問題および不確定さを回避するプローブをを言及することは重要である。その一方で、順序づいたアレイでのデータを記載した実験において、比較的少数の配列を、周知のｍＲＮＡを混合物に加えて、定量的なスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）実験を行うことにより確認する。
【０２２４】
好ましい具体例において、ｃＤＮＡアレイはＲＮＡ発現解析に最適である。この具体例において、個々のｃＤＮＡクローンを宿主ベクター系で増殖させたｃＤＮＡライブラリーから増幅させる（例えば、ＰＣＲを用いて）。各々の増幅させたＤＮＡをビーズの集団に付着させる。異なる集団をともに混合し、ｃＤＮＡライブラリーに相当するビーズの集団を作成する。該ビーズをアレイし、前記したように解読し、アッセイに用いる（本明細書中で概説したように、解読は十分なアッセイの後に起こりうる）。該アッセイを摘出し、必要に応じて標識し、さらにアレイにハイブリダイズされているＲＮＡ試料（全細胞またはｍＲＮＡ）を用いて行う。比較分析は個々のＲＮＡｓ発現レベルにおける検出の相違を考慮する。適切なキャリブレーション基準の比較はＲＮＡの絶対量を定量化させる。
【０２２５】
また、ｃＤＮＡアレイをマッピング、例えば、遺伝子中、例えば、腫瘍または別の組織試料から欠如/挿入または複写の数の変化をマップすることで代用することができる。このことはゲノムのＤＮＡをハイブリダイズすることにより行うことができる。ｃＤＮＡｓ（またはＥＳＴｓなど）の代わりに、ランダムゲノムフラグメント（ｒａｎｄｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を包含する別のＳＴＳ（配列標識部位）をこの方法でアレイすることができる。
本明細書に引用されている全ての言及は出典明示により全体を本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅは、本発明のいくつかの異なる「二成分」系の実施態様を示す図であり、図１Ｃ〜Ｆは、複数の第１基材の使用を示す図である。
【図２】 図２Ａおよび図２Ｂは、２つの異なる「一成分」系を示す図である。
【図３】 図３は、ハイパースペクトルアルファ空間における集落形成を示す図である。
【図４】 図４は、ＦＡＭ標識オリゴ補体またはＣｙ３標識オリゴ補体のいずれかを用いてアレイ上の異なる種類のビーズを彩色（標識）する二色解読法を示す図である。
【図５】 図５は、４種類の色および４つの解読段階を用いる１２８種類のビーズの解読を示す図である。
【図６】 図６は、１６種類のビーズのグレースケール解読を示す図である。
【図７】 図７は、蓋およびベースプレートの略図である。
【図８】 図８は、蓋１０およびベースプレート６０を含むハイブリダイゼーションチャンバーの略図である。
【図９】 図９は、穴１０５を有するベースプレートを示す図である。
【図１０】 図１０は、加圧および／または減圧によって引き起こされる膜上の可変の溶液容積および局在化を示す図である。
【図１１】 図１１は、ハイブリダイゼーションチャンバーについての使用を見出す代表的なアッセイスキームのフローチャートである。
【図１２】 図１２は、顕微鏡用スライドフォーマットにおけるアレイ・オブ・アレイズを示す図である。
【図１３】 図１３は、アレイを調製するための金型を示す図である。

Claims (32)

  1. ａ）シーラントによって互いに分離された第１および第２のアッセイ位置を含む表面をもつ基材であって、該アッセイ位置が１つのマイクロスフェアを保持するように形成された別個の部位を含む基材；および
    ｂ）少なくとも第１亜集団および第２亜集団を含むマイクロスフェアの集団であって、該第１亜集団が第１生物活性因子を含み、該第２亜集団が第２生物活性因子を含み、該マイクロスフェアが表面上の別個の部位にランダムに分布している集団
    を含む、アレイ組成物。
  2. 別個の部位が２５μｍ未満の間隔で離れている請求項１記載の組成物。
  3. 別個の部位が１５μｍ未満の間隔で離れている請求項１記載の組成物。
  4. 別個の部位が少なくとも約５μｍの間隔で離れている請求項１ 記載の組成物。
  5. 別個の部位がウェルである請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
  6. ウェルが光ファイバーバンドルの末端に分布している請求項５記載の組成物。
  7. シーラントがゴム、シリコンおよびゲルからなる群から選択される材料を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
  8. シーラントがガスケットである請求項７記載の組成物。
  9. ガスケットが接着剤で基材に結合されている請求項８記載の組成物。
  10. 第１生物活性因子が核酸を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
  11. 基材が顕微鏡スライドを含む請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
  12. 基材がハイブリダイゼーションチャンバー内に封入されている請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
  13. マイクロスフェアの第１亜集団が検出可能なシグナルを含む請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
  14. 第２亜集団が検出可能なシグナルを含む請求項１３記載の組成物。
  15. 第２亜集団が検出可能なシグナルを含まない請求項１３記載の組成物。
  16. ａ）検出器；および
    ｂ）該検出器中にある請求項１〜１５のいずれか１項記載の組成物
    を含む装置。
  17. ａ）１つのマイクロスフェアを保持するように形成された別個の部位を含む表面をもつ基材を準備すること；ならびに
    ｂ）少なくとも第１亜集団および第２亜集団を含むマイクロスフェアの集団であって、第１亜集団が第１生物活性因子を含み、第２亜集団が第２生物活性因子を含むマイクロスフェアの集団を、該別個の部位にランダムに分布させること
    を含む、アレイ組成物の製造方法。
  18. 別個の部位が２５μｍ未満の間隔で離れている請求項１７記載の方法。
  19. 別個の部位が１５μｍ未満の間隔で離れている請求項１７記載の方法。
  20. 第１亜集団と第２亜集団との比率が少なくとも１：３６である請求項１７記載の方法。
  21. 第１亜集団と第２亜集団との比率が少なくとも１：１００である請求項１７記載の方法。
  22. 別個の部位がウェルである請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
  23. ウェルが光ファイバーバンドルの末端に分布する請求項２２記載の方法。
  24. シーラントがゴム、シリコンおよびゲルからなる群から選択される材料を含む請求項１７から２１のいずれか１項記載の方法。
  25. シーラントがガスケットである請求項２４記載の方法。
  26. ガスケットが接着剤で基材に結合される請求項２５記載の方法。
  27. 第１生物活性因子が核酸を含む請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
  28. 基材が顕微鏡スライドを含む請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
  29. さらに基材をハイブリダイゼーションチャンバー内に封入する請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
  30. マイクロスフェアの第１亜集団が検出可能なシグナルを含む請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
  31. 第２亜集団が検出可能なシグナルを含む請求項３０記載の方法。
  32. 第２亜集団が検出可能なシグナルを含まない請求項３０記載の方法。
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