CN107835857A - 用于测序应用的聚合物片层 - Google Patents

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Abstract

本申请的实施方案涉及用于测序应用的图案化聚合物片层和制备该聚合物片层的方法。具体来说，制备了柔性微米和纳米图案化的聚合物片层并在测序反应中用作模板表面，并且描述了在纳米孔中形成分离的水凝胶塞的新的无抛光方法。

Description

用于测序应用的聚合物片层
发明领域
一般而言，本申请涉及用于多核苷酸测序应用的聚合物片层以及制备该聚合物片层的方法的领域。
发明背景
经聚合物涂覆的基底用于制备和/或分析生物分子。分子分析(如某些核酸测序方法)依赖于将核酸链附着到基底的经聚合物涂覆的表面上。然后，可以通过本领域公知的多种不同的方法来确定所附着的核酸链的序列。
流动池用于某些边合成边测试过程中。典型地，这些流动池包括惰性空隙区域内的活性表面。通常使用以下步骤制造流动池的表面：(1)最初将孔蚀刻到均一的基底中；(2)用硅烷和聚合物或水凝胶对孔和空隙区域官能化；(3)通过抛光工艺除去覆盖空隙区域的过量聚合物或水凝胶；(4)然后将单链引物DNA嫁接(graft)到孔中的聚合物或水凝胶，从而为下游测序应用提供流动池表面。在此情况中，在制作工作流程的抛光步骤中浪费了一些聚合物或水凝胶。
发明概述
本文描述的一些实施方案涉及用于核酸测序应用的聚合物片层的制备方法，其包括提供具有表面的基底；将聚合物组合物层沉积到基底的表面上，其中所述聚合物组合物包含用于嫁接寡核苷酸的官能团；将所述聚合物组合物在所述表面上形成聚合物片层；和从所述基底的表面除去过量的聚合物片层材料。在一些实施方案中，聚合物片层的形成包括对所述聚合物组合物脱水。
本文描述的一些实施方案涉及通过本文所述的方法制备的用于核酸测序应用的聚合物片层。
本文描述的一些实施方案涉及制备用于核酸测序应用的基底表面的方法，其包括提供具有第一多个官能团的聚合物片层；将所述聚合物片层与基底的表面相接触，其中所述表面包含第二多个官能团；将所述聚合物片层的所述第一多个官能团与所述表面的所述第二多个官能团共价键合。在一些实施方案中，聚合物片层是图案化的(patterned)。在一些此类实施方案中，聚合物片层包含多个微米级或纳米级图案化的通道、沟槽、柱状体(post)、孔或其组合。
本文描述的一些实施方案涉及制备用于核酸测序应用的图案化的基底表面的方法，其包括：提供具有图案化的表面的基底，其中所述表面包含多个微米级或纳米级图案化的孔；将聚合物组合物沉积到图案化的表面上以形成第一聚合物层，其中所述聚合物组合物填充所述微米级或纳米级图案化的孔；和分开所述第一聚合物层，其中所述聚合物组合物在所述图案化表面的微米级或纳米级图案化的孔中分离。在一些实施方案中，所述方法还包括在分开所述第一聚合物层之前对所述第一聚合物层脱水。在一些实施方案中，所述方法还包括在分开所述第一聚合物层后在所述图案化的表面上直接层压第二聚合物层。在一些此类实施方案中，所述方法还包括从所述图案化的表面分开第二聚合物层，其中从所述图案化表面的微米级或纳米级图案化的孔中取出聚合物组合物以在所述第二聚合物层上形成多个图案化的聚合物柱状体。在一些实施方案中，第二聚合物层是可拉伸的。
本文描述的一些实施方案涉及通过本文描述的方法制备的用于核酸测序应用的基底表面。
本文描述的一些进一步的实施方案涉及用于核酸测序应用的自动化卷对卷(roll-to-roll)方法，其包括：缠绕(spool)通过本文描述的方法制备的图案化的聚合物片层的卷；通过用测序试剂处理所述聚合物片层来制备用于测序的图案化的聚合物片层；在经处理的图案化的聚合物片层上对样品测序；和在一个测序循环完成后再缠绕(respool)所述图案化的可拉伸的聚合物片层。在一些实施方案中，所述图案化的聚合物片层是可拉伸的。
本文描述的一些额外的实施方案涉及用于核酸测序应用的自动化方法，其包括：提供带(belt)，其包含通过本文描述的方法制备的图案化的聚合物片层；通过用来自流体递送装置的测序试剂处理所述聚合物片层来制备用于测序的图案化的聚合物片层；和在经处理的图案化的聚合物片层上对样品测序，其中对于测序应用的每个循环，所述带通过流体递送装置。
尽管本公开内容在核酸测序应用的背景下举例说明了方法和组合物，应当理解其他用途和应用是可能的。示例性的应用包括但不限于基于非测序的核酸测定，如杂交或结合测定；蛋白质测定，如结合或动力学测定；用于其他生物成分的测定；用于非生物成分的测定(无论是生物活性还是生物惰性)等。因此，可用于这些测定或本领域已知的其它测定的各种分析物中的任一种可以附着至如本文对用于核酸测序应用的分析物所例示的聚合物片层和/或表面。作为进一步的应用，本文阐述的组合物的方法可以用于合成各种分析物，包括但不限于核酸、蛋白质、生物活性分子、生物惰性分子，和候选治疗剂等。
附图简述
图1A显示了制备未图案化的聚合物片层的方法的横截面图。
图1B是通过图1A所示的方法制备的PAZAM水凝胶片层的俯视图。
图1C是通过图1A所示的方法制备的PAZAM片层的俯视图，其中所述片层悬挂在塑料支架上形成独立的(free standing)聚合物膜。
图2显示了根据一个实施方案的制备图案化聚合物片层的方法的横截面图。
图3A显示了将根据图2所示的方法形成的PAZAM片层分层(delaminating)。
图3B显示了将PAZAM片层悬挂在黄色带中。
图3C显示了将PAZAM片层转移到官能化的载体基底上，例如经降冰片烯涂覆的载玻片上。
图4A和图4B显示了流动池的Typhoon荧光成像。
图5A显示了具有柱状体的图案化的水凝胶聚合物片层的横截面图。
图5B和图5C是具有多个纳米级柱状体的图案化的PAZAM片层的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图6A是含有单一聚合物纳米级柱状体的聚合物片层的扫描电子显微术(SEM)图像。所有其余的纳米级柱状体都在基底表面的纳米孔中分离。
图6B是根据本申请的一些实施方案，从图案化的基底表面快速分开水凝胶片层的横截面图，其中一些聚合物材料留在表面的凹陷(depressions)内。
图6C是根据本申请的一些实施方案，从图案化的基底表面受控分开水凝胶片层的横截面图，其中一些聚合物材料仍附着到水凝胶片层。
图7A是根据本申请的一些实施方案，在基底表面上形成水凝胶填充的纳米孔的过程的横截面图。
图7B是形成含有图案化的水凝胶的柔性片层的方法的横截面图。
图8是自动化工厂规模的测序过程的示意图，该测序过程使用图7A和图7B所示的过程制备的用于边合成边测序(SBS)应用的卷对卷柔性片层，所述卷对卷柔性片层用相容的聚合物或水凝胶图案化。
图9显示了图8中描绘的自动化的卷对卷测序过程的一部分，其中在成像过程中拉伸柔性图案化的片层并且在成像后缩回。
发明详述
本文描述的是形成聚合物片层的方法。在一些实施方案中，所述聚合物片层可用于核酸测序反应。在一些实施方案中，聚合物片层具有光滑的表面，而在其他实施方案中，聚合物片层是微米或纳米图案化的聚合物片层。本文描述的一些实施方案涉及将独立的柔性聚合物片层直接图案化并释放，所述聚合物片层任选用作核酸测序反应或其他应用中的模板表面。本文描述的一些其他实施方案涉及形成“孔中胶(gels in wells)”(指基底表面的纳米孔中分离的图案化的水凝胶)的免抛光方法。这些方法可以用于各种应用中，包括在图案化的生物相容性和可拉伸表面上的下一代核酸测序、干细胞生长、分化和增殖，和生物反应，以及柔性和/或可拉伸电子器件和用于表面等离子体学(plasmonics)的可拉伸表面上的生物反应和与生物传感器的整合。
在一些实例中，聚合物片层是自由悬挂的，并且具有用于储存食物和其他家用物品的公知塑料包裹材料的一致性和柔性，然而也提供用于核苷酸测序的典型水凝胶涂层中存在的化学反应性。例如，在用于测序的标准流动池中，活性官能团通常存在于可以参与引物嫁接的涂层上。这可以在(San Diego，CA)的边合成边测序系统中看到。因此，通过层压或转移打印工艺，这种柔性聚合物片层可以应用于包含流动池的各种测序构造。
本文描述的一些其他实施方案涉及用于工厂级测序的柔性聚合物片层的用途，例如，在类似于印刷机的卷对卷格式中，其中在每个测序循环期间重复再缠绕柔性聚合物片层，来回经过系统。类似地，柔性聚合物片层可以形成带(belt)，所述带使表面重复通过系统以用于相应的测序循环。这种方法可以使得发生低成本、高通量的测序反应。
任选地，聚合物片层可以是可拉伸的。在此类实施方案中，可拉伸聚合物片层包含高密度水凝胶阵列，该阵列然后可以使用低成本的光成像设备在用于测序的低数值孔径(NA)读取头(read-head)间拉伸或变形。这种方法将较小的流动池尺寸所提供的较低的输入量和试剂体积与低成本的光学器件结合起来。更具体地，在流体处理步骤期间，表面可以处于相对收缩的状态，以允许大量的阵列特征接触相对少量的试剂。在化学步骤之后，并且可以拉伸表面以增加阵列的间距(pitch)，从而使得能够使用低数值孔径物镜对相邻特征进行光学检测和描绘，所述低数值孔径物镜通常不能在收缩状态下解析这些特征。此外，拉伸表面以增加特征的间距减少了检测步骤期间阵列特征之间的串扰(cross-talk)，实现使用低成本光学器件的稳健(robust)成像。
在可拉伸聚合物的一些其他实施方案中，可以用金属或电介质(dielectrics)涂覆或图案化这些可拉伸聚合物片层。通过热、机械、化学或光学方式加压力，可以将在聚合物上具有图案化的金属结构的这些形状记忆聚合物片层调整为压缩(contract)，从而形成相对于非应力状态具有减小的间距的金属或电介质表面。此外，收缩过程会在金属结构中诱导较高的表面粗糙度或“皱纹”。参见Fu等人，“Tunable Nanowrinkles on Shape MemoryPolymer Sheets,”Adv.Mater.2009,21,1-5。具有图案化的金属和电介质的这些压缩聚合物材料的潜在应用是在表面等离子体学、SERS、荧光增强、电子器件等应用中。尼龙和聚烯烃是热缩聚合物的实例，所述热缩聚合物可以用聚合物涂覆以用于测序，或者用金属/电介质图案化并收缩以用于表面等离子体学、电子器件以及用于形成金属或半导体间隙连接。可用于这些应用的其它候选聚合物系列包括：聚烯烃、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氨酯、硅酮、聚酰亚胺薄膜等。
以下详细描述涉及本申请的某些具体的实施方案。在该描述中，参考附图，其中为清楚起见，全文中相同的部分或步骤可以用相似的数字指定。本说明书中提及的“一个实施方案”、“实施方案”、或“在一些实施方案中”意指结合该实施方案所描述的特定的特征、结构或特性可以包括在本发明的至少一个实施方案中。短语“一个实施方案”、“实施方案”、或“在一些实施方案中”在本说明书的不同地方的出现不必是全部提及相同的实施方案，也不是与其他实施方案互相排他的单独的或替代实施方案。此外，描述了可以通过一些实施方案表现而不通过其他实施方案表现的各种特征。类似地，描述了各种要求，其可以是一些实施方案但不是其他实施方案的要求。
本文使用的部分的标题仅为了组织的目的，而不应解释为限制所述的主题。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。除非另外说明，否则本文引用的所有专利、申请、公布的申请和其他出版物通过引用整体并入。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文中另外明确地指示，否则单数形式“一种/一个”和“该/所述”包括复数个指示物。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括/包含”以及其他形式的使用不是限制性的。如本说明书所使用，不论是在过渡词中还是在权利要求书的正文中，术语“包括/包含”应当被理解为具有开放式含义。即，术语应被理解为与短语“至少具有”或“至少包括”同义。当用于方法的上下文中时，术语“包括/包含”意指所述方法至少包括所列举的步骤，但可以包括另外的步骤。当用于化合物、组合物或装置的上下文中时，术语“包括/包含”意指所述化合物、组合物或装置至少包含所列举的特征或组件，但还可以包含其他的特征或组件。
如本文所用，常见的有机缩写定义如下：
dATP 脱氧腺苷三磷酸
dCTP 脱氧胞苷三磷酸
dGTP 脱氧鸟苷三磷酸
dTTP 脱氧胸苷三磷酸
ssDNA 单链DNA
NA 数值孔径
SBS 边合成边测序
PAZAM 任何的丙烯酰胺与Azapa(N-(5-(2-叠氮乙酰胺基)戊基)丙烯酰胺)比率的聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)
℃ 摄氏温度
μm 微米
如本文所用，术语“阵列”是指在一个或多个基底上发生，以便不同的特征可以彼此在空间上区分的不同特征的群体。在一些实施方案中，特征是基底表面上的孔、柱状体、沟槽、脊(ridges)或其他轮廓。或者/另外，特征可以各自包含一个或多个探针分子并且任选地不同的探针可以出现在每个特征上。特征也可以定义为位置，其中凝胶或其他材料的数量大于同一表面上的空隙区域。阵列可以包含不同的探针分子，其各自位于在基底上不同的可寻址的位置处。或者/另外，阵列可以包含分开的基底，其各自携带不同的探针分子，其中可以根据在与基底连接的表面上基底的位置或根据液体中基底的位置来鉴定所述不同的探针分子。在分开的基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中包括珠的那些阵列，如在美国专利号6,355,431 B1、US 2002/0102578和PCT公开号WO 00/63437号中所描述的。例如，在美国专利号6,524,793中描述了示例性形式，其可用于本申请以例如利用诸如荧光激活细胞分选仪(FACS)的微流体装置来区分液体阵列中的珠。可用于本申请的阵列的另外的实例包括但不限于，在美国专利号5,429,807；5,436,327；5,561,071；5,583,211；5,658,734；5,837,858；5,874,219；5,919,523；6,136,269；6,287,768；6,287,776；6,288,220；6,297,006；6,291,193；6,346,413；6,416,949；6,482,591；6,514,751和6,610,482；以及WO 93/17126；WO 95/11995；WO 95/35505；EP 742 287；和EP 799 897中所描述的那些阵列。
如本文所用，术语“共价附着”或“共价键合”是指以原子之间电子对的共用为特征的化学键合的形成。例如，与通过诸如粘附或静电相互作用的其他手段附着于表面相比，“共价附着的聚合物片层”当提及基底表面使用时是指与基底的官能化表面形成化学键的聚合物片层。应理解，共价附着于表面的聚合物还可以通过除了共价附着之外的其他手段键合。
如本文所用，术语“卷对卷方法”是指随着将伸长的基底从一卷转移至另一卷时对该基底的处理。示例性卷对卷方法是当表面在从一卷解缠绕并且缠绕到另一卷上的情况下移过测序装置时对图案化基底的连续测序。
如本文所用，术语“间距(pitch)”是指阵列的两个特征之间的中心到中心间距。特征的图案可以按照平均间距表征。例如，图案可以是规则的，使得平均间距附近的变异系数较小，或者图案可以是不规则的，在该情况下变异系数可以相对较大。在任何一种情况下，平均间距可以是例如至少约10nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大，由前面两个值中的任何一个定义的范围。或者/另外，平均间距例如可以是最多约100μm、约10μm、约5μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小，由前面两个值中的任何一个定义的范围。
如本文所用，术语“串扰”是指由从另一个特征产生的信号所致的、来自观察的特征的表观信号。串扰通常是不期望的，并通常被认为是一种背景形式。
如本文所用，“Ca至Cb”或“Ca-b”(其中“a”和“b”是整数)是指规定的基团中的碳原子数。也即，基团可以包含从“a”到“b”(包括端点)的碳原子。因此，例如“C1至C4烷基”或“C1-4烷基”基团是指具有1至4个碳的所有烷基，即，CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。
如本文所用，术语“卤素”或“卤代”意指元素周期表第7列的放射稳定性的原子中的任何一种，例如，氟、氯、溴或碘，优选氟和氯。
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键或三键)的直链或支链的烃链。烷基可以具有1至20个碳原子(每当其在本文中出现时，数字范围例如“1至20”是指在给定范围中的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意指烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等、直至并且包括20个碳原子组成，然而本定义还涵盖了其中没有指定数字范围的术语“烷基”的出现。烷基可以是具有1至9个碳原子的中等尺寸的烷基。烷基还可以是具有1至4个碳原子的低级烷基。烷基可以称为“C1-4烷基”或类似名称。仅举例而言，“C1-4烷基”表示在烷基链中存在一至四个碳原子，即，烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但决不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
如本文所用，“烯烃”或“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链的烃链。烯基可以具有2至20个碳原子，然而本定义还涵盖了其中没有指定数字范围的术语“烯基”的出现。烯基还可以是具有2至9个碳原子的中等尺寸的烯基。烯基还可以是具有2至4个碳原子的低级烯基。烯基可以称为“C2-4烯基”或类似名称。仅举例而言，“C2-4烯基”表示在烯基链中存在二至四个碳原子，即，烯基链选自：乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2,-二烯基以及丁-1,2-二烯-4-基。典型的烯基包括但绝不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。
如本文所用，“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链的烃链。炔基可以具有2至20个碳原子，然而本定义还涵盖了其中没有指定数字范围的术语“炔基”的出现。炔基还可以是具有2至9个碳原子的中等尺寸的炔基。炔基还可以是具有2至4个碳原子的低级炔基。炔基可以称为“C2-4炔基”或类似名称。仅举例而言，“C2-4炔基”表示在炔基链中存在二至四个碳原子，即，炔基链选自：乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基。典型的炔基包括但绝不限于：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基等。
如本文所用，“环烷基”意指完全饱和的碳环基环或环系统。实例包括环己基、环庚基、环辛基等
如本文所用，“环亚烷基(cycloalkylene)”意指过两个附着点连接到分子的剩余部分的完全饱和的碳环基环或环系统。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”意指具有至少一个双键的碳环基环或环系统，其中环系统中的环不是芳香族的。一个实例是环辛烯。另一个实例是降冰片烯或降冰片烯基。
如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指具有至少一个双键的、在环主链中具有至少一个杂原子的碳环基环或环系统，其中环体系中的环是芳香族的。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”意指具有至少一个三键的碳环基环或环系统，其中环系统中的环不是芳香族的。一个实例是环辛炔。另一个实例是二环壬炔(bicyclononyne)。
如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指在具有至少一个三建的、在环主链中具有至少一个杂原子的碳环基环或环系统，其中环系统中的环不是芳香族的。
如本文所定义，“氨基”基团是指“-NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元-10元杂芳基、以及5元-10元杂环基。非限制性实例包括游离氨基(即，-NH2)。
如本文所定义，“C-酰胺基(C-amido)”基团是指“C(＝O)NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元-10元杂芳基、以及5元-10元杂环基。
如本文所定义，“N-酰胺基”基团是指“-N(RA)C(＝O)RB”基团，其中RA和RB各自独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元-10元杂芳基、以及5元-10元杂环基。
如本文所用，本文使用的术语“羧酸”或“羧基”是指–C(O)OH。
如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指–NHNH2基团。
如本文所用，本文使用的术语“腙”或“腙基”是指基团，其中Ra和Rb各自独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元-10元杂芳基、以及5元-10元杂环基，如本文所定义的。非限制性实例包括游离氨基(即-NH2)。
如本文所用，术语“环氧基”是指
如本文所用，术语“缩水甘油醚”是指
如本文所用，术语“四嗪”或“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基。四嗪可以被任选取代。
如本文所用，术语“四挫”或“四唑基”是指包含四个氮原子的五元杂环基。四唑可以被任选取代。
如本文所用，“腈氧化物”是指“RC≡N+O-”基团，其中如本文所定义，R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元-10元杂芳基、以及5元-10元杂环基。制备腈氧化物的非限制性实例包括通过用氯胺-T(chloramide-T)处理或通过亚胺基氯化物(imidoyl chloride)[RC(Cl)＝NOH]上的碱作用从醛肟原位生成。
如本文所用，“硝酮(nitrone)”是指“RARBC＝NRc +O-”基团，其中如本文所定义，RA、RB和Rc各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元-10元杂芳基、以及5元-10元杂环基。
如本文所用，取代的基团源自未取代的母本基团，其中已经有一个或多个氢原子替换为另一种原子或基团。除非另外指示，当一个基团被认为是“取代的”时，是指该基团被独立地选自以下的一个或多个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C7碳环基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、C3-C7-碳环基-C1-C6-烷基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、5元-10元杂环基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、5元-10元杂环基-C1-C6-烷基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、芳基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、芳基(C1-C6)烷基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、5元-10元杂芳基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、5元-10元杂芳基(C1-C6)烷基(被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基任选取代)、卤素、氰基、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)、芳氧基、硫氢基(巯基)、卤代(C1-C6)烷基(例如，-CF3)、卤代(C1-C6)烷氧基(例如，-OCF3)、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基(S-sulfonamido)、N-磺酰氨基(N-sulfonamido)、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酰基、异氰酰基、硫代氰酰基、异硫代氰酰基、亚硫酰基、磺酰基、以及氧代(＝O)。每当基团被描述为“任选取代”，则基团可以被以上取代基取代。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮的杂环碱、糖、以及一个或多个磷酸基团。它们是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中糖是脱氧核糖，即，缺少存在于核糖的2’位置的羟基的糖。含氮的杂环碱可以是嘌呤碱或嘧啶碱。嘌呤碱包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)、以及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)、以及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。
如本文所用，“核苷”在结构上与核苷酸相似，但在5’位置缺少任何磷酸部分。术语“核苷”以本领域技术人员所理解的普通含义用于本文。实例包括但不限于：包含核糖部分的核糖核苷，以及包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的戊糖部分是其中氧原子被碳替代和/或碳被硫原子或氧原子替代的戊糖部分。“核苷”是可以具有经取代的碱和/或糖部分的单体。此外，核苷可以掺入较大的DNA和/或RNA聚合物和寡聚物。
如本文所用，术语“多核苷酸”通常是指核酸，包括DNA(例如，基因组DNA cDNA)、RNA(例如，mRNA)、合成寡核苷酸和合成核酸类似物。多核苷酸可以包括天然碱基或非天然碱基或其组合以及天然或非天然的主链连接(例如，硫代磷酸酯、PNA或2’-O-甲基-RNA)或其组合。
如本文所用，术语“引物”定义为具有游离3’OH基团和在5’末端处修饰以允许偶联反应的单链DNA(ssDNA)分子。引物长度可以是任何数量的碱基长度，并且可以包括各种非天然核苷酸。在一些实施方案中，“SBS引物”用作在诸如来自Illumina(San Diego,CA)的或系统的系统上的边合成边测序(SBS)反应测序的一部分。在这些反应中，一组扩增引物通常与玻璃表面结合。将要测序的一组靶DNA分子与已结合的引物杂交，并且然后通过桥式扩增技术扩增。进行测序反应，并且在本发明的实施方案中，扩增引物(和扩增子，其包含扩增步骤期间延伸以包含靶DNA拷贝的引物)然后从玻璃表面释放，使得在未来的测序反应中表面是可重复使用的。因此，可以重复以下步骤的一个或多个：将扩增引物附着到玻璃表面、将靶DNA分子与引物杂交、桥式扩增、对靶DNA测序，以及除去扩增引物和扩增子。可以执行一个或多个重复。如下详述，在一些实施方案中，SBS引物在一个实施方案中可以是P5或P7引物。P5和P7引物用于Illumina公司销售的商用流动池表面，用于在 和Genome 平台上测序。引物序列描述于美国专利公开号2011/0059865A1中，其全部内容通过引用并入本文。
P5和P7引物序列包含以下：
配对末端组：
P5：配对末端5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC
P7：配对末端5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT
单一读段组：
P5：单一读段：5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGA
P7：单一读段：5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGA
任选地，P5和P7引物中的一个或两者可以包含多聚T尾。多聚T尾一般位于上述序列的5’末端，但在某些情况下可以位于3’端。多聚T序列可以包含任何数目的T核苷酸，例如2至20个。
用于测序应用的聚合物片层的制备步骤
本文描述的一些实施方案涉及制备用于测序应用的聚合物片层的方法，其包括：提供具有表面的基底；将聚合物组合物层沉积在基底的表面上，其中所述聚合物组合物包含用于嫁接寡核苷酸的官能团；将所述聚合物组合物在所述表面上形成聚合物片层；和从所述基底的表面取出所述聚合物片层。
各种聚合物组合物可用于本文所述的方法中。聚合物组合物可以包含聚合物，其具有一个或多个能够与感兴趣的生物分子反应的官能团，例如用于嫁接的引物。在一些实施方案中，聚合物的官能团也能够与基底表面反应以形成聚合物和基底表面之间的共价键。在这些实例中，基底表面通常用功能性硅烷或硅烷衍生物处理，所述功能性硅烷或硅烷衍生物在与聚合物组合物反应的表面上提供反应性位点。在一些此类实施方案中，聚合物组合物的官能团可以包括或可以选自C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、C8-14环炔烃、8至14元杂环炔烃、炔基、乙烯基、卤素、叠氮基、氨基、酰胺基、环氧基、缩水甘油基、羧基、亚肼基、肼基、羟基、四唑基、四嗪基、氧化腈、氮宾、硝酮、氧代-氨基(oxo-amino)，或硫醇，或其任选取代的变体及组合。在本文中描述了本申请中可以使用的聚合物的非限制性实例，包括美国专利号9,012,022中所述的那些，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实例中，聚合物组合物可以部分或完全用单体组合物、预聚物组合物或聚合物前体组合物代替，其中聚合反应在形成聚合物片层的过程中原位进行。
水凝胶
在一些实施方案中，本文所述的聚合物组合物包含水凝胶。可以在本申请中使用的非限制性示例性水凝胶包括：聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、均聚物水凝胶、共聚物水凝胶、多聚合物水凝胶等。本文描述了可用于本申请的水凝胶的其他非限制性实例。WO 00/31148(通过引用并入本文)公开了聚丙烯酰胺水凝胶和基于聚丙烯酰胺水凝胶的阵列，其中优选地从丙烯酰胺和丙烯酸或包含乙烯基的丙烯酸衍生物形成所谓的聚丙烯酰胺预聚物。随后可以实施预聚物的交联。对如此产生的水凝胶以固体支持，优选在玻璃上。还可以实施对固体支持的水凝胶的官能化。
W0 01/01143(通过引用并入本文)描述了与W0 00/31148类似的技术，但不同之处在于水凝胶具有官能性，所述官能性能够参与与生物分子的[2+2]光致环加成反应，以形成此类生物分子的固定阵列。此类官能化水凝胶可以用于本公开的组合物的方法中。二甲基马来酰亚胺(DMI)是特别优选的官能性。[2+2]光致环加成反应在基于聚丙烯酰胺的微阵列技术的上下文中的用途还描述于W002/12566和W003/014392中(两者通过引用并入本文)。
美国专利公开号6,465,178(通过引用并入本文)公开了试剂组合物在提供用于制备核酸的微阵列的经活化的载玻片中的用途；试剂组合物包括丙烯酰胺共聚物。其中阐述的组合物和方法可以应用于本文阐述的方法和组合物的上下文中。
WO 00/53812(通过引用并入本文)公开了基于聚丙烯酰胺的水凝胶DNA阵列的制备和这些阵列在重复扩增中的用途，其可以在本文阐述的方法或组合物中使用。
一旦形成了水凝胶，随后生物分子就可以与它们附着以产生分子阵列(如果需要的话)。可以以不同的方式进行附着。例如，美国专利号6,372,813(通过引用并入本文)教导了具有二甲基马来酰亚胺基团的多核苷酸与产生的具有二甲基马来酰亚胺基团的水凝胶的固定，其中该固定是通过在两个二甲基马来酰亚胺基团(一个与待固定化的多核苷酸附着和一个从水凝胶中悬垂)之间进行[2+2]光致环加成步骤进行。
当在水凝胶的产生之后形成分子阵列时，可使用两种策略实现这一目的。首先，可以在水凝胶产生之后将其进行化学修饰。更常见的备选是实现用具有官能性的共聚单体的聚合，所述官能性经引发或预活化以与要排列的分子反应。
可以采用最初形成水凝胶，随后向其排列分子的替代方案，例如，其中在水凝胶产生的同时形成阵列。这可以通过例如经丙烯酰胺衍生化的多核苷酸的直接共聚合来实现。该方法的实例描述于W001/62982(通过引用并入本文)，其中将丙烯酰胺衍生化的多核苷酸与丙烯酰胺溶液混合，并且直接实现聚合。
Mosaic Technologies(Boston,Mass.,USA)生产了ACRYDITETM(一种丙烯酰胺亚磷酰胺)，其可以在所得单体与丙烯酰胺共聚合之前与多核苷酸反应。
Efimov等人(Nucleic Acids Research,1999,27(22),4416-4426,通过引用并入本文)公开了可以使用的水凝胶/阵列的同时形成的另外的实例，其中发生丙烯酰胺、反应性丙烯酸衍生物和具有5’-或3’-端丙烯酰胺基团的经修饰的多核苷酸的共聚合。
PAZAM
在一些实施方案中，聚合物组合物包含聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。在一些实施方案中，PAZAM也由式(A)或(B)表示：
其中n是1-20,000范围内的整数，并且m是1-100,000范围内的整数。
可以通过丙烯酰胺和Azapa(N-(5-(2-叠氮乙酰胺基)戊基)丙烯酰胺)以任何比率聚合来制备PAZAM。在一些实施方案中，PAZAM是线性聚合物。在一些其他的实施方案中，PAZAM是轻度交联的聚合物。在一些实施方案中，PAZAM作为水溶液应用。在一些其他的实施方案中，PAZAM作为含有一种或多种诸如乙醇的溶剂添加剂的水溶液应用。美国专利号9,012,022(其通过引用整体并入本文)中详细讨论了用于制备不同PAZAM聚合物的方法。在一些实施方案中，在制备本文所述的聚合物组合物时，PAZAM可以与一种或多种聚合物或水凝胶混合。
在一些实施方案中，在沉积聚合物组合物(或聚合物的前体)之前，用硅烷或硅烷衍生物处理基底表面。在一个实施方案中，用氟硅烷处理基底表面。在另一个实施方案中，用降冰片烯硅烷(如，[(5-二环[2.2.1]庚-2-烯酰)乙基]三甲氧基硅烷)来处理表面。可以在本申请中使用的其它合适的硅烷衍生物描述于美国公开号2015/0005447A1中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，聚合物片层的形成包括对聚合物组合物脱水。脱水步骤的一个目的是除去聚合物组合物中的任何溶剂。在一些实施方案中，脱水步骤在升高的温度(例如高于约30℃)进行，或在与聚合物或水凝胶中的官能部分相容的温度进行。在一些此类实施方案中，脱水发生在约60℃。在一些情况下，控制脱水温度以维持聚合物片层的期望化学和物理性质(如在约100℃以下)。例如当使用PAZAM时，脱水温度通常低于约90℃。脱水步骤可以在本领域普通技术人员已知的各种装置中进行，例如在热板或真空烘箱中进行。在一些实施方案中，如果要将形成的聚合物片层化学连接或键合到表面上，则可能需要在表面上孵育聚合物组合物的单独步骤。
在一些实施方案中，基底表面包含微米级或纳米级图案，如通道、沟槽、柱状体、孔或其组合。在一些此类实施方案中，将图案化表面的微米级或纳米级图案的印记转移至聚合物片层以形成图案化的聚合物片层。微米级图案例如包含具有特征的那些图案，所述特征具有约1微米至约999微米范围内的尺寸(例如平均直径或平均横截面)。纳米级图案例如包含具有特征的那些图案，所述特征具有约1纳米至约999纳米范围内的尺寸(例如平均直径或平均横截面)。
本文描述的一些实施方案涉及通过本文描述的方法制备的用于测序应用的聚合物片层，和包含通过本文描述的方法制备的用于测序应用的聚合物片层的基底。
图1A显示了根据本申请的一些实施方案的制备未图案化的聚合物片层的方法的横截面图。首先，提供了含有下层的玻璃板101和氟硅烷层102表面的基底100。然后，在氟硅烷层102上沉积水合水凝胶103层。在60℃对水凝胶脱水之后，水凝胶形成聚合物片层104，其随后通过物理力(例如带)而取出。
图1B是通过图1A所示的方法制备的PAZAM片层的俯视图。图1C是通过图1A所示的方法制备的PAZAM片层的俯视图，其中片层悬挂在支架或支持结构上，例如塑料支持架上。
图2显示了根据本申请的一些实施方案的图案化的聚合物片层的制备方法的横截面图。在这个具体实例中，将PAZAM用作选择的水凝胶，因为其支持边合成边测序(SBS)。然而，该方法也可以扩展到各种其他水凝胶和聚合物。首先提供了基底200，其含在带有图案202的下层和氟硅烷层(未示出)的图案化玻璃板201。然后，在图案化玻璃板201上沉积水合PAZAM水凝胶203层。对水凝胶脱水后，水凝胶形成含有图案205的聚合物片层204，该图案205从玻璃板201的图案202转移。然后通过物理力取出聚合物片层204。
可以将图1A的未图案化的聚合物片层和图2的图案化的聚合物片层可以在尺寸上缩放到显微镜载玻片的尺寸。增加这些聚合物片层的结构强健性的方法包括增加水凝胶聚合物链长以获得更大的物理缠结，向水凝胶添加炔烃交联剂(例如PAZAM水凝胶的炔交联剂)，或改变水凝胶的分子量，等等。
用于测序应用的基底表面的制备方法
本文描述的一些实施方案涉及制备用于测序应用的基底表面的方法，其包括：提供包含第一多个官能团的聚合物片层；将所述聚合物片层与基底的表面相接触，其中所述表面包含第二多个官能团；将所述聚合物片层的所述第一多个官能团与所述表面的所述第二多个官能团共价键合。在一些实施方案中，当与表面形成共价键合时，可以需要在表面上温育聚合物组合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过将官能化的寡核苷酸与所述聚合物片层的所述第一多个官能团反应来将寡核苷酸嫁接到所述基底表面上。
在一些实施方案中，聚合物片层是图案化的。在一些实施方案中，聚合物片层包含多个微米级或纳米级图案化的通道、沟槽、柱状体、孔或其组合。
在一些实施方案中，聚合物片层包含水凝胶。在一些此类实施方案中，在与基底表面共价键合前对水凝胶脱水。在此类实施方案中，在与官能化的寡核苷酸反应前对脱水的水凝胶再水合。
在一些实施方案中，聚合物片层的第一多个官能团包含或选自C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、C8-14环炔烃、8至14元杂环炔烃、炔基、乙烯基、卤素、叠氮基、氨基、酰氨基、环氧基、缩水甘油基、羧基、腙基、肼基、羟基、四唑基、四嗪基、氧化腈、氮宾、硝酮、氧代-氨基，或巯基，或其任选取代的变体及组合。在一些进一步的实施方案中，第一多个官能团选自叠氮基、炔基、氨基、羧基、环氧基、缩水甘油基、卤素或四嗪基，或其任选取代的变体及组合。在一个实施方案中，第一多个官能团包含叠氮基。
在一些实施方案中，聚合物片层包含聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。在一些实施方案中，在制备本文所述的聚合物组合物时，PAZAM可以与一种或多种聚合物或水凝胶混合。
在一些实施方案中，基底表面的第二多个官能团包含或选自自乙烯基、丙烯酰基、烯基、炔基、C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、氮宾、醛基、肼基、缩水甘油醚、环氧基、氨基、卡宾、异氰酸盐/酯或马来酰亚胺，或其任选取代的变体及组合。在一些进一步的实施方案中，第二多个官能团选自炔基、丙烯酰基、C8-14环烯烃、炔基、缩水甘油醚、环氧基，或其任选取代的变体及组合。在一个实施方案中，第二多个官能团任选地包含取代的降冰片烯。
图3A-3C显示了通过图2中所示的方法形成的聚合物片层并将所述聚合物片层转移到官能化的载体基底上。图3A显示了根据图2所示的方法形成的分层的PAZAM片层。图3B显示了PAZAM片层在黄色带中的悬挂。图3C显示了将PAZAM片层向官能化载体基底(例如经降冰片烯涂覆的载玻片)上的转移。官能化的载体基底可以是具有表面官能团的任何基底，所述表面官能团可与聚合物片层中的官能团反应。在这种情况下，玻璃载玻片上的降冰片烯基团可与PAZAM的叠氮基团发生反应以在PAZAM片层和基底之间形成共价键。其他载体基底也可用于转移打印工艺，例如硅烷化玻璃、塑料、金属、金属氧化物等。在图3C中，经降冰片烯硅烷涂覆的玻璃载体载玻片包含水或缓冲溶液的5个点样(spot)。为了进行随后的表面反应(例如引物嫁接)将载体基底上的水/缓冲剂用于再水合水凝胶。
图4A-4B显示了用GE Healthcare Lifesciences“Typhoon”成像仪拍摄的流动池的荧光图像。图4A示出了通过将未图案化的PAZAM片层转移到经降冰片烯涂覆的载玻片上以及随后的引物嫁接和TET荧光染料杂交而制备的流动池的Typhoon图像。图4B显示了通过将图案化的PAZAM片层转移到经降冰片烯涂覆的载玻片上并随后进行引物嫁接和TET荧光染料杂交而制备的流动池的Typhoon图像。图4A和4B表明，在转移过程之后，表面显然是官能性的，并且阵列区域显示出更高的TET强度。
图5A显示了根据图2所示的方法制备的具有柱状体的图案化水凝胶聚合物片层的横截面图。图5B和5C是使用图2所示的方法形成的纳米图案化的PAZAM片层的SEM图像。图5B显示了在约700nm的间距下在悬挂的水凝胶片层上约400nm直径的图案化的PAZAM水凝胶柱状体。图5C是图5B的放大图。
本文描述的一些实施方案涉及制备用于测序应用的图案化的基底表面的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括提供具有图案化的表面的基底，其中所述表面包含多个微米级或纳米级图案化的孔。然后可以将聚合物组合物沉积在图案化的表面上以形成第一聚合物层，其中所述聚合物组合物填充所述微米级或纳米级图案化的孔。然后从所述表面分离在表面上的第一聚合物层。这允许保留在图案化表面的微米级或纳米级图案化的孔内分离的聚合物组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括在分离所述第一聚合物层前对所述第一聚合物层脱水。在一些实施方案中，当在聚合物组合物和微米级或纳米级图案化孔的表面之间形成共价键合时，可以需要温育聚合物组合物的分开步骤。
在一些实例中，聚合物组合物可以部分或完全地由单体组合物、预聚物组合物或聚合物前体组合物代替，其中在聚合物片层形成过程中原位进行聚合反应。
在一些实施方案中，聚合物组合物包含第一多个官能团，其选自C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、C8-14环炔烃、8至14元杂环炔烃、炔基、乙烯基、卤素、叠氮基、氨基、酰氨基、环氧基、缩水甘油基、羧基、腙基、肼基、羟基、四唑基、四嗪基、氧化腈、氮宾、硝酮、氧代-氨基，或巯基，或其任选取代的变体及组合。在一些进一步的实施方案中，第一多个官能团选自叠氮基、炔基、氨基、羧基、环氧基、缩水甘油基、卤素或四嗪基，或其任选取代的变体及组合。在一个实施方案中，第一多个官能团包含叠氮基。
在一些实施方案中，聚合物组合物包含聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。在一些实施方案中，在制备本文所述的聚合物组合物时，PAZAM可以与一种或多种聚合物或水凝胶混合。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过使官能化寡核苷酸与聚合物片层的第一多个官能团反应而将寡核苷酸嫁接到基底表面上。
在一些实施方案中，聚合物组合物包含水凝胶。在一些此类实施方案中，在与寡核苷酸反应前，对聚合物组合物再水合。
图6A是含有单一聚合物纳米级柱状体的聚合物片层的SEM图像。所有剩余的纳米级柱状体都在基底表面的纳米孔中分离。
图6B是根据本申请的一些实施方案从图案化的基底表面快速分开水凝胶片层的横截面图。在具体的实施方案中，含有下层玻璃板601和具有图案化的纳米孔的表面的基底600B沉积有水凝胶组合物层。在使水凝胶组合物脱水后，从玻璃板601的表面快速分开形成的水凝胶片层603，导致基底的纳米孔中图案化的水凝胶组合物604的分离。
图6C是根据本申请的一些实施方案从图案化的基底表面受控分开水凝胶片层的横截面图。与图6B所示的实施方案类似，含有下层玻璃板601和具有图案化的纳米孔的表面的基底600C沉积有水凝胶组合物层。在使水凝胶组合物脱水之后，用受控的力将形成的水凝胶片605从玻璃板601的表面分开，导致图案化结构604从基底表面602转移到水凝胶片层605。
在一些实施方案中，步骤还包括在分开第一聚合物层之后在图案化表面上直接层压第二聚合物层。
在一些实施方案中，第二聚合物层包含第二多个官能团，其选自乙烯基、丙烯酰基、烯基、炔基、C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、C8-14环炔烃、8至14元杂环炔烃、氮宾、醛、肼基、缩水甘油醚、环氧基、氨基、卡宾、异氰酸盐/酯或马来酰亚胺，或其任选取代的变体及组合。在一些进一步的实施方案中，第二多个官能团选自炔基、丙烯酰基、C8-14环烯烃、炔基、缩水甘油醚、环氧基，或其任选取代的变体及组合。在一个实施方案中，第二多个官能团包含任选取代的降冰片烯。
在一些实施方案中，在层压之前首先用官能性硅烷或硅烷衍生物处理第二聚合物层。官能性硅烷或硅烷衍生物在第二聚合片层的表面上提供反应性位点，用于与图案化的基底表面中分离的聚合物组合物反应。在一个实施方案中，用降冰片烯硅烷(如，[(5-二环[2.2.1]庚-2-烯酰)乙基]三甲氧基硅烷)来处理表面。可以在本申请中使用的其它合适的硅烷衍生物描述于美国公开号2015/0005447 A1中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，聚合物组合物的第一多个官能团与第二聚合物层的第二多个官能团反应以形成共价键。在一些实施方案中，在与第二多个官能团反应之前再水合聚合物组合物。
在一些此类实施方案中，方法还包括在第二聚合物层和聚合物组合物的第一多个官能团之间形成共价键之后，从图案化表面分开第二聚合物层，导致从基底表面的微米级或纳米级图案化的孔中取出聚合物组合物以在第二聚合物层上形成图案化的聚合物柱状体。在一些实施方案中，在从具有第二聚合物层的基底表面的图案化孔分开之前再水合聚合物组合物。
在一些实施方案中，第二聚合物层是柔性的或可拉伸的。在一些此类实施方案中，第二聚合物层包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚氨酯、聚醚、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酰亚胺，或其组合和共聚物。
在一些实施方案中，方法还包括通过官能化寡核苷酸与聚合物片层的第一多个官能团反应来将寡核苷酸嫁接到第二聚合物层上。
图7A是根据本申请的一些实施方案，在基底表面上形成水凝胶填充的纳米孔的方法的横截面图。在具体实施方案中，包含下层玻璃板701和具有图案化的纳米孔的表面的基底700沉积有水凝胶组合物703层。将水凝胶组合物脱水后，从玻璃板701的表面快速分开形成的水凝胶片层704，导致基底的纳米孔中图案化的水凝胶组合物705的分离。
图7B是形成包含图案化的水凝胶的柔性片层的方法的横截面图。首先，基底700B与含有某些能够与水凝胶组合物705反应的官能团的柔性片层706层压，所述基底含有在根据图7A中描述的方法形成的玻璃板701的图案化的纳米孔中分离的图案化的水凝胶组合物705。在水凝胶组合物705再水合之后，通过水凝胶组合物中的官能团与柔性片层中的官能团相反应，在水凝胶组合物705和柔性片层706之间形成共价键。在水凝胶组合物705脱水之后，从玻璃板701上剥离含有共价连接的图案化水的凝胶705的新形成的柔性片层707。在一些实施方案中，柔性片层705由诸如环烯烃共聚物(COC)或塑料的聚合物材料制成。
本文描述的一些实施方案涉及通过本文所述的方法制备的用于测序应用的基底表面。
卷对卷和带方法(Roll-to-Roll and Belt Processes)
本文描述的一些其他实施方案涉及例如用于测序应用的自动化的卷对卷方法。该方法可以包括缠绕通过本文描述的方法制备的图案化的或未图案化的聚合物片层的卷。可以通过用测序试剂处理来制备用于测序反应的聚合物片层，并且然后在处理的聚合物片层上对样品测序。处理后，可以在完成一个测序循环后再缠绕聚合物片层。
在一些实施方案中，用于卷对卷方法的聚合物片层是可拉伸的。因此，自动化方法还可以包括在测序循环中的成像过程中拉伸所述聚合物片层。
在一些实施方案中，聚合物片层包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚氨酯、聚醚、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酰亚胺，或其组合和共聚物。
图8是自动化工厂规模的测序过程的示意图，该测序过程使用图7A和图7B所示的过程制备的用于边合成边测序(SBS)应用的卷对卷柔性片层，所述卷对卷柔性片层用相容的聚合物或水凝胶图案化。在每个测序循环中，卷通过系统递送到各种SBS试剂浴(reagentbath)(如序贯地掺入、冲洗、去封闭)并通过系统的另一侧的读取头部成像和再缠绕。然后，将卷以相反的方向递送到系统以开始下一个测序循环。
图9显示了图8所示的自动化卷对卷测序过程的一部分，其中柔性图案化的片层在成像过程中拉伸并且在成像后缩回。使用这些可拉伸的图案化的片层开辟了制备超高密度SBS阵列，以及然后使用低成本、低数值孔径(NA)光学器件成像的可能性。将具有较小的表面积足印(foot print)的高密度阵列图案化导致需要更低的DNA输入和试剂体积。通过拉伸该柔性片层阵列，增加了阵列间距并且降低了邻近簇之间的串扰，这使得能够使用低成本、低NA光学器件。为了减少图像失真，可以对这些表面变形以补偿像差。这种柔性、可拉伸的SBS表面也可以围绕成像透镜本身包裹。成像后，允许片层收缩并进入SBS化学的下一个循环。
本文描述的一些进一步的实施方案涉及例如用于测序应用的自动化带驱动方法。该方法可以包括驱动图案化或未图案化的通过本文描述的方法制备的聚合物片层的带。通过用测序试剂处理可以制备用于测序反应的聚合物片层，并且然后在经处理的聚合物片层上对样品测序。带可以多次通过流体递送和检测系统，使得每次通过构成一个测序循环。用于形成和使用带以用于对核酸测序的方法和可以修改以用于本文的其他应用例如阐述于美国专利申请公开号2011/0178285 A1中，其通过引用并入本文。
在任何公开的实施方案中，聚合物组合物的脱水可导致聚合物组合物的体积减少超过20倍、超过15倍、超过10倍、超过5倍或超过2倍，或由前述任何两个值限定的范围。
在柔性或可拉伸聚合物片层的任何公开的实施方案中，可将片层拉伸至其原始尺寸或长度的约20倍、约17.5倍、约15倍、约12.5倍、约10倍、约7.5倍、约5倍、约2.5倍、约2倍或约1.5倍，或由前述任何两个值定义的范围。
在任何公开的实施方案中，基底表面的微米级或纳米级图案可以包含通道、沟槽、孔、柱状体或其组合。在一些实施方案中，微米级或纳米级图案的至少一部分是孔。在一些此类实施方案中，孔具有小于约500nm的平均直径。在一些情况下，具有小于约500nm平均直径的孔称为“纳米孔”。在一些此类实施方案中，孔具有约330nm或更小的平均直径，例如包括小于约300nm、约200nm、约100nm或约50nm，或由前述两个值中的任何一个定义的范围。在一些此类实施方案中，孔具有小于约500nm的平均高度。在一些进一步实施方案中，孔具有约300nm或更小的平均高度，例如包括小于约300nm、约200nm、约100nm或约50nm，或由前述两个值中的任何一个定义的范围。作为示例性的上限的备选或除示例性的上限以外，孔的平均直径和/或平均高度可以为至多约1nm、约500μm、约100μm、约1μm、约500nm、约400nm、约300nm、约200nm或约100nm，或由前述两个值中的任何一个定义的范围。
基底
在一些实施方案中，本申请中使用的基底包括基于二氧化硅的基底，例如玻璃、熔融二氧化硅和其它含二氧化硅的材料。在一些实施方案中，基于二氧化硅的基底还可以是硅、二氧化硅、氮化硅、硅酮氢化物(silicone hydrides)。在一些实施方案中，本申请中使用的基底包括诸如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯和聚(甲基丙烯酸甲酯)的塑料材料。优选的塑料材料是聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯和环烯烃聚合物基底。在一些实施方案中，基底是基于二氧化硅的材料或塑料材料。在一个实施方案中，基底具有至少一个包含玻璃的表面。
丙烯酰胺、烯酮(enone)或丙烯酸酯也可以用作基底材料。其它基底材料可以包括但不限于砷化镓(gallium aresnide)、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物和共聚物。上述列表意图例示本申请，但不限于本申请。
在一些实施方案中，基底和/或基底表面可以是石英。在一些其他的实施方案中，基底和/或基底表面可以是半导体，即，GaAs或ITO。
基底可以包含单一材料或多种不同的材料。基底可以是复合材料或层压材料。基底可以是扁平、圆形、有纹理和图案化的。例如可以通过在非金属表面上形成特征的金属垫来形成图案，例如如美国专利号8,778,849中描述的，其通过引用并入本文。另一种有用的图案化表面是具有在表面上形成的孔特征的表面，例如如描述于美国专利申请公开号2014/0243224 A1、美国专利申请公开号2011/0172118 A1，或美国专利号7,622,294，这些中的每一篇通过引用并入本文。对于使用图案化基底的实施方案，凝胶可以选择性地附着至图案特征(例如，凝胶可以附着至金属垫或凝胶可以附着至孔的内部)或者备选地凝胶可以均匀地在图案特征和空隙区域两者之间附着。
在制备和使用分子阵列中使用基于塑料的基底的优势包括成本：通过例如注射-模塑制备合适的基于塑料的基底的成本通常低于例如通过蚀刻和粘合制备基于二氧化硅的基底。另一个优点是几乎无限种类的塑料，允许微调支持物的光学性质以适合其预期的应用或其可以置于的应用。
在金属用作基底或基底上的垫的情况下，这可以是因为期望的应用：金属的电导性可以允许调制基于DNA的传感器中的电场。以这种方式，可以增强DNA错配鉴别，固定的寡核苷酸分子的取向可以受到影响，或者可以加速DNA杂交动力学。
基底可以是基于二氧化硅的。另外，所使用的基底的形式和形状可以根据本申请实践的应用而变化。然而，通常支持材料的载玻片，例如二氧化硅，如熔融的二氧化硅在分子的制备和随后的整合中特别有用。在本申请的实践中特别使用的是以商品名SPECTRASILTM出售的熔融二氧化硅载玻片。尽管如此，对于本领域技术人员显而易见的是，本申请同样适用于基底(包括基于二氧化硅的支持物)的其它呈现(presentations)，如珠子，棒等。
在一些实施方案中，基底的表面包含经官能化分子涂覆的区域和没有涂层的惰性区两者。在一些实例中，官能化的分子涂层包括本文所述的水凝胶或聚合物片层。经官能化分子涂覆的区域可以包含反应性位点，并因此，可以用于通过化学键合或其他分子相互作用来附着分子。在一些实施方案中，可以交替官能分子涂覆区(例如反应性特征、垫、珠或孔)和惰性区(称为空隙区)以形成图案或网格。此类图案可以为一维或二维。在一些实施方案中，惰性区可以选自玻璃区域，金属区域，掩模区域(mask regions)或空隙区域。或者，这些材料可以形成反应区域。惰性或反应性将取决于基底上使用的化学和工艺。在一个实施方案中，表面包含玻璃区域。在另一个实施方案中，表面包括金属区域。在又一个实施例中，表面包括掩模区域。可用本公开的聚合物涂覆的非限制性示例性基底材料或可以以其他方式用于本文阐述的组合物或方法中的非限制性示例性基底材料描述于美国序列号13/492,661和13/661,524中，其每个通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的基底形成流动池的至少一部分或者位于流动池中。在一些此类实施方案中，流动池还包含经由官能化分子涂层(如聚合物涂层)附着于基底表面的多核苷酸。在一些实例中，聚合物涂层是本文描述的聚合物片层。在一些实施方案中，多核苷酸以多核苷酸簇的形式存在于流动池中，其中多核苷酸簇的多核苷酸经由本文所述的聚合物涂层或聚合物片层附着至流动池的表面。在此类实施方案中，认为多核苷酸所附着的流动池体的表面是基底。在其他实施方案中，将具有聚合物涂覆表面的分开的基底插入流动池的主体中。在优选的实施方案中，流动池是被分成多个泳道(lane)或多个扇区(sector)的流动室，其中在多个泳道或多个扇区中的一个或多个包含用本文所述的共价附着的聚合物片层涂覆的表面。在本文所述的流动池的一些实施方案中，在单一多核苷酸簇内附着的多核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列。在本文所述的流动池的一些实施方案中，不同的多核苷酸簇的附着的多核苷酸具有不同的或非相似的核苷酸序列。可用于本文所述的方法和组合物中的示例性流动池和用于制造该流动池的基底包括但不限于：可商购自Illumina,Inc.(San Diego,CA)或描述于US 2010/0111768A1或US2012/0270305中的那些，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本申请中使用的基底是基于二氧化硅的基底。通常，可以以某种方式对基于二氧化硅的基底表面进行化学修饰以便共价附着能够与官能化分子反应的化学反应性基团，所述官能化分子例如水凝胶，聚合物或部分形成的水凝胶(例如预聚物(PRP))。表面活化剂通常是有机硅烷化合物。在一个实施方案中，表面活化剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，称为“结合硅烷”或“交联硅烷”并可商购自Pharmacia，尽管其他基于硅的表面活化剂也是已知的，如单乙氧基二甲基甲硅烷基丁醛、3-巯丙基-三甲氧基硅烷和3-氨丙基三甲氧基硅烷(所有可获自Aldrich)。在该方式中，可将悬垂的官能团如氨基、醛基(aldehydro)或可聚合的基团(例如烯烃)附着于二氧化硅。
在本文描述的任何实施方案中，基底可以选自玻璃基底、二氧化硅基底、石英基底、塑料基底、金属基底、金属氧化物基底或其组合。在一些实施方案中，基底是玻璃基底。在一个实施方案中，基底是流动池的一部分或安置在流动池内。
核酸分析应用
多种不同的DNA扩增技术可与本文描述的流动池结合使用。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)或随机引发扩增(RPA)。在具体的实施方案中，用于扩增的一种或更多种引物可以附着至聚合物涂层。在PCR实施方案中，用于扩增的一种或两种引物可以附着至聚合物涂层。利用两种附着的引物的格式通常称为桥式扩增，因为双链扩增子形成已经被附着的模板序列侧翼的两种附着的引物之间的桥样结构。可以用于桥式扩增的示例性试剂和条件描述在例如美国专利号5,641,658、美国专利公布号2012/0055100、美国专利号7,115,400、美国专利公布号2004/0096853、美国专利公开号2004/0002090、美国专利公开号2007/0128624和美国专利公开号2008/0009420中，其中每一个通过引用被并入本文。PCR扩增也可以用附着至聚合物涂层的扩增引物之一和溶液中的第二引物来实施。使用一种附着的引物和可溶性引物的组合的示例性格式是乳液PCR，例如，Dressman等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:8817-8822(2003)、WO 05/010145,或美国专利公开号2005/0130173或2005/0064460中描述的，其中每一个通过引用并入本文。乳液PCR例示了该格式并且应当理解的是，为了本文列出的方法的目的，乳液的使用是任选的，并且事实上对于多种实施方案，不使用乳液。此外，引物不需要直接附着至如ePCR参考文献中列出的基底或固体支持物，并且而是可以附着至如本文中列出的聚合物涂层。
可以修改RCA技术以用于本公开内容的方法中。可以用于RCA反应的示例性组分以及RCA产生扩增子的原理描述在例如Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)和US2007/0099208A1中，其中每一个通过引用被并入本文。用于RCA的引物可以在溶液中或附着至聚合物涂层。
可以修改MDA技术以用于本公开内容的方法。用于MDA的一些基本原理和有用的条件描述在例如Dean等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)；Lage等人,GenomeResearch 13:294-307(2003)；Walker等人,Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995；Walker等人,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)；US 5,455,166；US 5,130,238；和US 6,214,587中，其中每一个通过引用被并入本文。用于MDA的引物可以是在溶液中被附着至聚合物涂层。
在具体的实施方案中，可以使用以上示例的扩增技术的组合。例如可以组合使用RCA和MDA，其中RCA用以在溶液中产生多联体扩增子(例如，使用溶液相引物)。然后，可以将扩增子用作用于MDA的模板，所述MDA使用附着至聚合物涂层的引物。在该实例中，在组合的RCA和MDA步骤之后产生的扩增子将附着至聚合物涂层。
在一些实施方案中，本文所述的官能化水凝胶或聚合物片层涂覆的基底可以用于测定多核苷酸的核苷酸序列。在此类实施方案中，方法可以包括以下步骤：(a)将多核苷酸聚合酶与经由本文所述的聚合物或水凝胶涂层中的任何一种附着至基底表面的多核苷酸簇相接触；(b)向聚合物涂覆的基底表面提供核苷酸，从而在多核苷酸聚合酶利用一个或多个核苷酸时生成可检测信号；(c)检测一个或多个多核苷酸簇处的信号；以及(d)重复步骤(b)和(c)，从而测定一个或多个多核苷酸簇处存在的多核苷酸的核苷酸序列。
核酸测序可用于通过本领域已知的多种方法来确定多核苷酸的核苷酸序列。在优选的方法中，采用边合成边测序(SBS)来确定经由本文描述的任一聚合物涂层与基底表面附着的多核苷酸的核苷酸序列。在此类方法中，向与多核苷酸聚合酶结合的模板多核苷酸提供一种或多种核苷酸。多核苷酸聚合酶将一种或多种核苷酸掺入至与多核苷酸模板互补的新合成的核酸链中。合成以寡核苷酸引物起始，所述寡核苷酸引物与模板多核苷酸的部分或者与同在模板多核苷酸的一端共价结合的通用部分或非可变核酸的部分互补。当针对模板多核苷酸掺入核苷酸时，生成了可检测信号，其允许确定在测序方法的各步骤期间掺入了哪种核苷酸。以这种方式，可生成与所述模板多核苷酸的至少一部分互补的核酸序列，从而允许确定模板多核苷酸的至少一部分的核苷酸序列。
流动池提供了用于容纳阵列的方便的形式，所述阵列通过本公开内容的方法生产，并且进行边合成边测序(SBS)或涉及循环中重复递送试剂的其他检测技术。例如，为了起始第一SBS循环，可将一种或多种标记的核苷酸、DNA聚合酶等流入/流过容纳有通过本文阐述的方法制成的核酸阵列的流动池。可以检测引物延伸使标记的核苷酸被掺入的阵列的那些位点。任选地，核苷酸还可包含可逆的终止特性，其在向引物添加核苷酸后，终止引物的进一步延伸。例如，可向引物添加具有可逆的终止剂部分的核苷酸类似物，从而使后续延伸不能发生，直至递送去封闭剂以去除该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可(在检测发生之前或之后)将去封闭剂递送至流动池。可在各个递送步骤之间进行洗涤。然后可重复循环n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可容易地进行调整以使用通过本公开内容的方法产生的阵列的示例性SBS方法、流体系统和检测平台在例如以下文献中有描述：Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281，和US2008/0108082，其各自通过引用并入本文。在具体的实施方案中，可以使用聚合物片层代替流动池来进行与以上对于流动池所例示的类似方法。例如可以以卷对卷或带方式提供聚合物片层以允许将试剂重复递送至聚合物片层的表面，这类似于将试剂重复递送至流动池。应该理解，在一些实施方案中，本公开内容的聚合物片层可以存在于流动池中用于全部或部分测序方法。
使用循环反应的其他测序方法可以使用聚合物片层、基底或本文阐述的其它组合物(例如焦磷酸测序)。焦磷酸测序检测将特定的核苷酸掺入新生的核酸链中时释放的无机焦磷酸盐(PPi)(Ronaghi,等人,Analytical Biochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等人Science 281(5375),363(1998)；US 6,210,891；US 6,258,568and US 6,274,320,其各自通过引用以其整体并入本文)。在焦磷酸测序中，所释放的PPi可通过ATP硫酸化酶将它立即转化成三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且可通过萤光素酶产生的光子来检测生成的ATP的水平。因此，可经发光检测系统监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源对于焦磷酸测序方法不是必需的。可用于将焦磷酸测序应用于本公开内容的阵列的有用流体系统、检测器和方法在例如以下文献中有描述：WO12/058096 A1、US 2005/0191698 A1、US 7,595,883和US 7,244,559，其各自通过引用以其整体并入本文。
边连接边测序反应也可以在本文所述的聚合物片层、基底或其他组合物上有用地进行，例如包括在以下文献中描述的那些：Shendure等人Science 309:1728-1732(2005)；US 5,599,675；和US 5,750,341，其各自通过引用以其整体并入本文。一些实施方案可包括如在例如以下文献中描述的边杂交边测序法：Bains等人,Journal of TheoreticalBiology 135(3),303-7(1988)；Drmanac等人,Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor等人,Science 251(4995),767-773(1995)；和WO 1989/10977，其各自通过引用以其整体并入本文。在边连接边测序和边杂交边测序方法中，使存在于阵列位点处的核酸经受寡核苷酸递送和检测的重复循环。可容易地调整如本文或本文所引用的参考文献中阐述的用于SBS方法的流体系统，以用于为边连接边测序法或边杂交边测序法的试剂的递送。通常，将寡核苷酸荧光标记，并且可使用与本文或本文所引用的参考文献中关于SBS方法所描述的相似的荧光检测器来检测。
采用本文阐述的组合物的一些实施方案可以利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，可通过携带荧光团的聚合酶与γ-磷酸盐标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用或者用零模波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂在例如以下文献中有描述：Levene等人Science 299,682–686(2003)；Lundquist等人Opt.Lett.33,1026–1028(2008)；Korlach等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181(2008)，其公开内容都通过引用整体并入本文。
一些SBS实施方案包括检测核苷酸掺入延伸产物后释放的质子。例如，基于检测释放的质子的测序可使用可商购自Ion Torrent(Guilford,CT,Life Technologies的一家子公司)的电子检测器和相关技术，或US 2009/0026082 A1；US 2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1中描述的测序方法和系统，其中各自通过引用以其整体并入本文。核酸可以附着到本文阐述的聚合物片层、基底或其他组合物用于在此类系统或方法中检测。
本公开组合物的另一个有用的应用是例如基因表达分析部分。可以使用RNA测序技术，诸如称为数字RNA测序的RNA测序技术检测或量化基因表达。可以使用本领域中已知的测序方法，如上文阐述的方法实施RNA测序技术。也可以使用通过直接杂交至本文阐述的聚合物片层、基底或其它组合物的杂交技术或使用其中的产物在本文阐述的聚合物片层、基底或其它组合物上检测的多重测定来检测或定量基因表达。本公开内容的组合物，例如通过本文阐述的方法制备的组合物还可用于确定来自一个或多个个体的基因组DNA样品的基因型。可在本公开内容的阵列上实施的基于阵列的表达和基因型分型分析的示例性方法在以下文献中描述：美国专利号7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美国专利公开号2005/0053980 A1；2009/0186349 A1或US 2005/0181440 A1，其各自通过引用以其整体并入本文。
上文描述的使用本文阐述的聚合物片层、基底或其他组合物的方法的一些实施方案中，在单一流动步骤期间在流动池中仅存在单一类型的核苷酸。在此类实施方案中，核苷酸可以选自下组：dATP、dCTP、dGTP、dTTP及其类似物。在上文描述的使用流动池的方法的其他实施方案中，在单一流动步骤期间所述流动池中存在多种不同类型的核苷酸。在此类方法中，核苷酸可选自dATP、dCTP、dGTP、dTTP及其类似物。
通过检测在多核苷酸模板处或其附近产生的信号，实现了一种或多种多核苷酸的每个流动步骤期间掺入的一种或多种核苷酸的测定，所述多核苷酸附着流动池中存在的基底表面上的聚合物涂层。在上文描述方法的一些实施方案中，可检测信号包括光学信号。在其他实施方案中，可检测信号包括非光学信号。在此类实施方案中，非光学信号包含位于或邻近一个或多个多核苷酸模板的pH变化。
在本文所述的测序方法的任何实施方案中，聚合物涂层可以包括本文公开的水凝胶或聚合物片层。

Claims (46)

1.制备用于测序应用的聚合物片层的方法，其包括：
提供具有表面的基底；
将聚合物组合物层沉积到所述基底的表面上，其中所述聚合物组合物包含用于嫁接寡核苷酸的官能团；
将所述聚合物组合物在所述表面上形成聚合物片层；和
从所述基底的所述表面取出所述聚合物片层。
2.权利要求1的方法，其中所述聚合物组合物包含水凝胶。
3.权利要求1或2的方法，其中所述聚合物组合物包含聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述形成聚合物片层包括对所述聚合物组合物脱水。
5.权利要求4的方法，其中在升高的温度进行所述脱水。
6.权利要求5的方法，其中在约60℃发生所述脱水。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述基底的表面包含微米级或纳米级的图案。
8.权利要求7的方法，其中所述微米级或纳米级的图案包含通道、沟槽、柱状体、孔或其组合。
9.权利要求7或8的方法，其中将图案化的表面的所述微米级或纳米级图案的印记转移至所述聚合物片层以形成图案化的聚合物片层。
10.制备用于测序应用的基底表面的方法，其包括：
提供包含第一多个官能团的聚合物片层；
将所述聚合物片层与基底的表面接触，其中所述表面包含第二多个官能团；
将所述聚合物片层的所述第一多个官能团与所述表面的所述第二多个官能团共价键合。
11.权利要求10的方法，其还包括通过将官能化的寡核苷酸与所述聚合物片层的所述第一多个官能团反应来在所述基底表面上嫁接寡核苷酸。
12.权利要求10或11的方法，其中所述聚合物片层是图案化的聚合物片层，其包含多个微米级或纳米级图案化的通道、沟槽、柱状体、孔或其组合。
13.权利要求10至12中任一项的方法，其中所述聚合物片层包含多个纳米级图案化的柱状体或孔。
14.权利要求10至13中任一项的方法，其中所述聚合物片层包含脱水的水凝胶。
15.权利要求14的方法，其中在嫁接寡核苷酸前将所述聚合物片层再水合。
16.权利要求10至15中任一项的方法，其中所述第一多个官能团选自C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、C8-14环炔烃、8至14元杂环炔烃、炔基、乙烯基、卤素、叠氮基、氨基、酰氨基、环氧基、缩水甘油基、羧基、腙基、肼基、羟基、四唑基、四嗪基、氧化腈、氮宾、硝酮、氧代-氨基，或硫醇，或其任选取代的变体及其组合。
17.权利要求16的方法，其中所述第一多个官能团选自叠氮基、炔基、氨基、羧基、环氧基、缩水甘油基、卤素或四嗪基，或其任选取代的变体及组合。
18.权利要求17的方法，其中所述第一多个官能团包含叠氮基。
19.权利要求10至18中任一项的方法，其中所述聚合物片层包含聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
20.权利要求10至16中任一项的方法，其中所述第二多个官能团选自乙烯基、丙烯酰基、烯基、炔基、C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、氮宾、醛、肼基、缩水甘油醚、环氧基、氨基、卡宾、异氰酸盐/酯或马来酰亚胺，或其任选取代的变体及组合。
21.权利要求20的方法，其中所述第二多个官能团选自炔基、丙烯酰基、C8-14环烯烃、炔基、缩水甘油醚、环氧基，或其任选取代的变体及组合。
22.权利要求21的方法，其中所述第二多个官能团包含任选取代的降冰片烯。
23.用于制备用于测序应用的图案化基底表面的方法，其包括：
提供具有图案化的表面的基底，其中所述表面包含多个微米级或纳米级图案化的孔；
将聚合物组合物沉积在所述图案化的表面上以形成第一聚合物层，其中所述聚合物组合物填充所述微米级或纳米级图案化的孔；和
分开所述第一聚合物层，其中在所述图案化表面的所述微米级或纳米级图案化的孔中分离所述聚合物组合物。
24.权利要求23的方法，其还包括在分开所述第一聚合物层前对所述第一聚合物层脱水。
25.权利要求23或24的方法，其中所述聚合物组合物包含水凝胶。
26.权利要求23至25中任一项的方法，其中所述聚合物组合物包含第一多个官能团，其选自：乙烯基、丙烯酰基、烯基、炔基、C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、C8-14环炔烃、8至14元杂环炔烃、氮宾、醛、肼基、缩水甘油基、环氧基、氨基、卡宾、异氰酸盐/酯或马来酰亚胺，或其任选取代的变体及组合。
27.权利要求26的方法，其中所述第一多个官能团选自叠氮基、炔基、氨基、羧基、环氧基、缩水甘油基、卤素或四嗪基，或其任选取代的变体及组合。
28.权利要求27的方法，其中所述第一多个官能团包含叠氮基。
29.权利要求23至28中任一项的方法，其中所述聚合物组合物包含聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
30.权利要求23至29中任一项的方法，其还包括在分开所述第一聚合物层后直接在所述图案化的表面上层压第二聚合物层。
31.权利要求30的方法，其中所述第二聚合物层包含第二多个官能团，其选自乙烯基、丙烯酰基、烯基、炔基、C8-14环烯烃、8至14元杂环烯烃、C8-14环炔烃、8至14元杂环炔烃、氮宾、醛、肼基、缩水甘油醚、环氧基、氨基、卡宾、异氰酸盐/酯或马来酰亚胺，或其任选取代的变体及组合。
32.权利要求31的方法，其中所述第二多个官能团选自炔基、丙烯酰基、C8-14环烯烃、炔基、缩水甘油醚、环氧基，或其任选取代的变体及组合。
33.权利要求32的方法，其中所述第二多个官能团包含任选取代的降冰片烯。
34.权利要求30至33中任一项的方法，其还包括将所述聚合物组合物的所述第一多个官能团与所述第二聚合物层的所述第二多个官能团共价键合。
35.权利要求24的方法，其中在与所述第二多个官能团反应前将所述聚合物组合物脱水。
36.权利要求34或35的方法，其还包括从所述图案化表面分开所述第二聚合物层，其中从所述图案化表面的所述微米级或纳米级图案化的孔中取出所述聚合物组合物以在所述第二聚合物层上形成图案化的聚合物柱状体。
37.权利要求36的方法，其中在从所述图案化表面分开所述第二聚合物层前将所述聚合物组合物脱水。
38.权利要求30至37中任一项的方法，其中所述第二聚合物层是可拉伸的。
39.权利要求38的方法，其中所述第二聚合物层包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚氨酯、聚醚、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酰亚胺，或其组合和共聚物。
40.权利要求37的方法，其还包括在所述第二聚合物层的所述微米级或纳米级图案化的聚合物柱状体上嫁接寡核苷酸。
41.用于测序应用的自动化卷对卷方法，其包括：
缠绕通过权利要求38的方法制备的图案化的聚合物片层的卷；
通过用测序试剂处理所述聚合物片层来制备用于测序的所述图案化的聚合物片层；
在经处理的图案化的聚合物片层上对样品测序；和
在一个测序循环完成后再缠绕所述图案化的聚合物片层。
42.权利要求41的自动化卷对卷方法，其还包括在所述测序循环中的成像期间拉伸所述聚合物片层。
43.权利要求41的自动化卷对卷方法，其中所述图案化的可拉伸聚合物片层包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚氨酯、聚醚、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酰亚胺，或其组合和共聚物。
44.通过权利要求1至9中任一项的方法制备的用于测序应用的聚合物片层。
45.通过权利要求10至40中任一项的方法制备的用于测序应用的基底表面。
46.用于测序应用的自动化方法，其包括：
提供带，其包含通过权利要求38的方法制备的图案化的聚合物片层；
通过用来自流体递送装置的测序试剂处理所述聚合物片层来制备用于测序的图案化的聚合物片层；和
在经处理的图案化的聚合物片层上对样品测序，其中对于测序应用的每个循环，所述带通过所述流体递送装置。
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