JPH09507121A - 生物学的チップ上の核酸プローブアレー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、固定化プローブのチップ、及び既知の配列の対照ポリヌクレオチド配列を、その対照配列と実質的類似性を示すが、例えば突然変異の存在で異なる標的配列と対比させるためのこのチップの利用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的チップ上の核酸プローブアレー 関連出願のクロスリファレンス 本願は、1993年10月26日出願の米国出願08／143,312の一部継続出願である199 4年８月２日出願の米国出願08／284,064号の一部継続出願であり、それぞれは全 ての目的のためにその全内容を引用することで本明細書に組入れる。本発明に至 る研究はNIH承認番号IROIHG00813−01により一部援助され、従って政府は本発明 について一定の権利を有しうる。 発明の背景 発明の分野 本発明は課題の生物学的分子相互作用を分析するための、シリカチップ上にマ イクロ加工化パターンで固定化されたオリゴヌクレオチドプローブアレーを供す る。従って、本発明は、化学、生物学、医学及び医学診断学を含む、分子相互作 用の本質により影響を受ける様々な分野に関連する。 関連技術の詳細 オリゴヌクレオチドプローブは課題の核酸（「標的」核酸）の相補性核酸配列 を検出するのに長い間利用されている。あるアッセイ方式においては、オリゴヌ クレオチドプローブは固相支持体に連結、即ち共有結合されており、そして固相 支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーが標的核酸の中の 特定の核酸配列を検出するのに利用されている。例えばPCT特許公開No．WO89／ 10977及び89／11548を参照のこと。その他は、標的核酸の完全な核酸配列を供す るるに大量のオリゴヌクレオチドプローブを利用することを提唱しているが、し かしこの目的のために固相化プローブのアレーを利用できる方法の提供はなしえ ていない。米国特許第5,202,231及び5,002,867号並びにPCT特許公開No．WO93／1 7126号参照のこと。 VLSIPS（商標）技術の開発は、ごく少ないアレーの中に非常に大量のオリゴヌ クレオチドプローブアレーを作るための方法を提供している。米国特許第5,143, 854号並びにPCT公開No．WO90／15070 92／10092を参照のこと。それぞれは引用 することで本明細書に組入れる。1993年６月25日出願の米国特許出願第082／937 号には、標的核酸の完全配列を提供する及び特定のヌクレオチド配列を含む核酸 の存在を検出するのに用いることのできうるオリゴヌクレオチドプローブアレー を作る方法が述べられている。 大量のオリゴヌクレオチドプローブのマイクロ加工アレー、通称「DNAチップ 」は多種多様な用途にとっての多大なる希望を供する。この希望を実現するのに 新たる方法及び試薬が必要とされ、そして本発明はこの必要性を満足せしめるの に役立つ。 発明の概要 本発明は既知の配列である対照配列を、この対照配列と実質的な類似性を示す が、例えば突然変異の存在において異なる標的配列と対比させるための固定化プ ローブアレーを採用するいくつかの手法を提供する。第１の態様において、本発 明は少なくとも２セットのプローブを含んで成る固定化オリゴヌクレオチドプロ ーブアレーを採用するタイル貼り手法(tiling stragety)を提供する。第１プロ ーブは複数のプローブを含んで成り、各プローブは対照配列のサブ 配列にまさに相補性な少なくとも３個のヌクレオチドのセグメントを含んで成り 、このセグメントは対照配列の中の対応のヌクレオチドに対して相補性な少なく とも１個の疑問(interrogation)位を含む。第２プローブセットは第１プローブ セットにおける各プローブに対する対応プローブを含んで成り、この第２プロー ブセットの中の対応のプローブは、第１プローブセット由来の対応のプローブを 含んで成る配列又は少なくとも１個の疑問位を含むその少なくとも３個のヌクレ オチドのサブ配列と同一であるが、ただしこの少なくとも１個の疑問位はこの第 １及び第２プローブセット由来の２つの対応プローブそれぞれにおいて異なるヌ クレオチドにより占拠されている。この第１プローブセットにおけるプローブは 、対照配列の中の２つの連続ヌクレオチドに対応する少なくとも２つの疑問位を 有する。一の疑問位は連続ヌクレオチドの一方に対応し、そして他方の疑問位は 他方に対応する。 第２の態様において、本発明は４組のプローブセットを含んで成るアレーを採 用するタイル貼り手法を提供する。第１プローブセットは複数のプローブを含ん で成り、各プローブは対照配列のサブ配列にまさに相補性の少なくとも３個のヌ クレオチドのセグメントを含んで成り、このセグメントは対照配列の中の対応の ヌクレオチドに相補性な少なくとも１個の疑問位を含む。第２、第３及び第４の プローブセットはそれぞれ第１プローブセットの中の各プローブに対する対応プ ローブを含んで成る。この第２、第３及び第４プローブセットの中のプローブは 、第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又は少なくとも１個 の疑問位を含むその少なくとも３個のヌクレオチドのサブ配列と同一であり、た だしこの少なくとも１個の疑問位はこの４つのプローブセット由来の４つの対応 プローブそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されてい る。この第１プローブセットは往々にして、対応配列の中の100個の連続ヌクレ オチドに対応する少なくとも100個の疑問位を有する。時折り、この第１プロー ブセットは対照配列の中の全てのヌクレオチドに対応する疑問位を有する。この プローブセット内の相補性セグメントは通常約９〜21ヌクレオチドである。プロ ーブはこの９〜21配列に加えて先行又は後続配列を含みうるが、多くのプローブ は９〜21セグメントの相補性のみより成る。 第３の態様において、本発明は多重対照配列のためにタイル貼りされた固定化 プローブアレーを提供する。一のかかるアレーは少なくとも１組の第１及び第２ プローブグループを含んで成り、各グループは第１の態様において定義した第１ 及び第２セットプローブを含んで成る。第１グループ由来の第１プローブセット における各プローブは第１対照配列のサブ配列にまさに相補性であり、そして第 ２グループ由来の第１プローブセットにおける各プローブは第２対照配列のサブ 配列にまさに相補性である。それ故、この第１グループのプローブは第１対照配 列との関係でタイル貼りし、そして第２グループのプローブは第２対照配列との 関係でタイル貼りする。各グループのプローブは第２の態様において定義した通 りの第３及び第４セットのプローブをも含みうる。このタイプの一部のアレーに おいて、この第２対照配列は第１対照配列の突然変異体である。 第４の態様において、本発明はブロックタイル貼り（block tiling）について のアレーを提供する。ブロックタイル貼りは上記の一般的なタイル貼り手法の一 種である。ブロックタイル貼りアレーの通常の単位は、野生型プローブ、３の突 然変異プローブの第１セット及び３つの突然変異プローブの第２セットを含んで 成るプローブのグループである。この野生型プローブは対照配列のサブ配列にま さに相補性の少なくとも３個のヌクレオチドのセグメントを含んで 成る。このセグメントは対照配列における第１及び第２ヌクレオチドに対応する 少なくとも第１及び第２疑問位を有する。３つの突然変異プローブの第１セット におけるプローブはそれぞれ、野生型プローブを含んで成る配列又は第１及び第 ２疑問位を含むその少なくとも３個のヌクレオチドのサブ配列と同一であるが、 ただし第１疑問位においては、それは３つの突然変異プローブ及び野生型プロー ブにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている。この３つの突然変異プロ ーブの第２セットにおけるプローブは、野生型プローブを含んで成る配列又は第 １及び第２疑問位を含むその少なくとも３つのヌクレオチドのサブ配列と同一で あるが、ただしその第２疑問位においては、それは３つの突然変異プローブ及び 野生型プローブにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている。 第５の態様において、本発明は固定化したプールプローブアレーを用いて標的 配列と対照配列とを対比させる方法を提供する。これらの方法において採用する アレーは上記の一般的なアレータイル貼りの更なる種類である。これらの方法に おいては、少なくとも１個のヌクレオチドにおいて対照配列と異なる対照配列変 異体を同定し、そしてそれぞれに特定の表示を割り当てる。プールプローブのア レーを提供し、ここで各プールは別々のアレーのセルを占める。各プールは、特 定の表示を割り当てた各変異配列にまさに相補性のセグメントを含んで成るプロ ーブを含んで成る。次いでこのアレーを対照配列の変異体を含んで成る標的配列 と接触させる。標的配列に対するこのアレーの中のプールの相対ハイブリダイゼ ーション強度を決定する。標的配列の同一性はハイブリダイゼーション強度のパ ターンから推定する。往々にして、各変異体には、少なくとも１個のアラビア数 字及びそのアラビア数字に関する少なくとも１つの値を有する表示を割り当てて おく。本ケースにおいては、各プールは 、特定のアラビア数字における特定の値を割り当てた各変異配列にまさに相補性 のセグメントを含んで成るプロープを含んで成る。変異体に、ｎ個のアラビア数 字を有する基数ｍの番号系の連続番号を割り当てる場合、各変異体に表示を割り 当てるのにｎ×（ｍ−１）個のプールプローブが利用されたこととなる。 第６の態様において、本発明は格子タイル貼り（trellis tiling）のためのプ ールプローブを提供し、これは一般的なタイル貼り手法の更なる種類である。格 子タイル貼りにおいては、標的配列のヌクレオチドの同一性は３つのプールした 格子プローブのハイブリダイゼーション強度の対比から決定する。プールした格 子プローブは、プールヌクレオチドＮにより占拠された第１疑問位、（１）Ｍ又 はＫ，（２）Ｒ又はＹ及び（３）Ｓ又はＷより成る３つのグループから選ばれる プールヌクレオチドにより占拠された第２疑問位、並びにこのグループから選ば れる第２プールヌクレオチドにより占拠された第３疑問位を除き、対照配列のサ ブ配列とまさに相補性なセグメントを含んで成る。第２疑問位を占拠するプール ヌクレオチドは、第２プールプローブ及び対照配列を最大限に整合させたときに 対照配列由来の対照ヌクレオチドと相補性であるヌクレオチドを含んで成り、そ してこの第３疑問位を占拠するプールヌクレオチドは第３プールプローブ及び対 照配列を最大限に整合させたときに対照配列由来の対応ヌクレオチドと相補性で あるヌクレオチドを含んで成る。プールヌクレオチドを記述するのに標準のIUPA C命名法を利用する。 格子タイル貼りにおいて、アレーはそれぞれが第１、第２及び第３プールプロ ーブにより占拠された少なくとも第１、第２及び第３セルを含んで成り、それぞ れは上記の一般的な説明に従っている。しかしながら、相補性のセグメント、疑 問位の位置、及び各疑問位 にあるプールヌクレオチドの選別は以下の拘束を条件として３つのプールプロー ブ間で異なっていても異ならなくてもよい。各３プールプローブにおける３つの 疑問位の１つは、対照配列の中の同じ対応ヌクレオチドと整合しなくてはならな い。この疑問位はプールプローブのうちの１つにおいてＮにより占拠されていな くてはならず、そして残りの２つのプールプローブそれぞれにおいては異なるプ ールヌクレオチドにより占拠されていなくてはならない。 第７の態様において、本発明はブリッジタイル貼り（bridge tiling）のため のアレーの提供にある。ブリッジタイル貼りは上記の一般的なタイル貼りの種類 であり、それにおいては第１プローブセット由来のプローブは複数の相補性セグ メントを含む。ブリッジタイル貼りにおいては、対照配列におけるヌクレオチド は通常４つのプローブの対比より決定する。第１プローブは少なくとも第１及び 第２セグメントを含んで成り、それぞれは少なくとも３個のヌクレオチドより成 り、そしてそれぞれは対照配列の第１及び第２サブ配列にまさに相補性である。 これらのセグメントは対照配列の中のヌクレオチドに対応する少なくとも１の疑 問位を含む。（１）第１及び第２サブ配列は対照配列の中で不連続であるか、又 は（２）第１及び第２サブ配列は連続し、且つその第１及び第２セグメントは第 １及び第２サブ配列に対して反転している。このアレーは更に第２、第３及び第 ４プローブを含んで成り、これらは第１プローブを含んで成る配列又は第１及び 第２セグメントのそれぞれに由来の少なくとも３個のヌクレオチドを含んで成る そのサブ配列と同一であるが、ただし少なくとも１の疑問位においては、各プロ ーブにおいて異なっている。ブリッジタイル貼りの種類のうち、欠失タイル貼り （deletion tiling）と呼ぶものにおいては、第１及び第２サブ配列は対照配列 の１又は２個のヌクレオチドにより隔てられている。 第８の態様において、本発明は多重タイル貼り（multiplex tiling）のための プローブアレーを提供する。多重タイル貼りは一の手法であり、それにおいては 標的配列における２個のヌクレオチドの同一性を、それぞれが２つの疑問位を有 する４つのプローブのハイブリダイゼーション強度の対比より決定する。各プロ ーブは対照配列由来のサブ配列にまさに相補性である少なくとも７個のヌクレオ チドのセグメントを含んで成るが、そのセグメントは２つの疑問位においてまさ に相補性であっても、そうでなくてもよい。疑問位を占拠するヌクレオチドは以 下の規則に従って選定される：（１）第１疑問位は４つのプローブそれぞれにお いて別のヌクレオチドにより占拠されている。（２）第２疑問位は４つのプロー ブそれぞれにおいて、別のヌクレオチドにより占拠されている。（３）第１及び 第２プローブにおいて、このセグメントは、１の疑問位を除き、そのサブ配列と まさに相補性である。（４）第３及び第４プローブにおいて、このセグメントは 、両疑問位を除き、そのサブ配列とまさに相補性である。 第９の態様において、本発明はヘルパー突然変異を含む固定化プローブアレー を提供する。ヘルパー突然変異は例えば反転したリピートを有するプローブの自 己アニーリングを防ぐのに有用である。この手法においては、標的配列のヌクレ オチドの同一性は通常４つのプローブの対比から決定する。第１プローブは１又 は２箇所の位置を除き対照配列のサブ配列とまさに相補性の少なくとも７個のヌ クレオチドのセグメントを含んで成り、このセグメントはその１又は２箇所の位 置にない疑問位を含んでいる。この１又は２箇所の位置はヘルパー突然変異によ り占拠されている。第２、第３及び第４突然変異プローブはそれぞれ、野生型プ ローブを含んで成る配列又は疑問位及び前記の１又は複数の位置を含むそのサブ 配列と同一で あるが、ただしこの４つのプローブそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより 占拠されている疑問位を除く。 第10の態様において、本発明は、少なくとも２組のプローブセットを含んで成 るが、対照配列と完璧に対合するプローブを含んで成るプローブセットを欠くプ ローブアレーを提供する。かかるアレーは通常対照及び標的配列を共にこのアレ ーにハイブリダイズさせる方法を利用する。この第１プローブセットは複数のプ ローブを含んで成り、各プローブは、疑問位を除き対照配列の少なくとも３個の ヌクレオチドのサブ配列にまさに相補性のセグメントを含んで成る。この第２プ ローブセットは第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを 含んで成り、この第２プローブセットの対応プローブはこの第１プローブセット 由来の対応プローブを含んで成る配列又は疑問位を含むその少なくとも３個のヌ クレオチドのサブ配列と同一であるか、ただしその疑問位が２つの対応プローブ それぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されていること、及び対照配列 に対する相補性を除く。 第11の態様において、本発明は、上記の任意のアレーを利用して、標的配列を 、所定のヌクレオチド配列を含んで成る対照配列と対比させる方法を提供する。 この方法は、標的核酸配列をアレーにハイブリダイズさせ、そしてそのアレーの うちのどのプローブが、互い同志と比べ、標的核酸配列に特異的に結合するかを 決定することを含んで成る。これらのプローブの相対特異的結合能は、標的配列 が対照配列と同一又は異なることを示唆する。かかる方法の一部において、標的 配列は少なくとも１の未知の位置において対照配列に比して置換されたヌクレオ チドを有し、そしてこのプローブの相対特異的結合能は標的配列の中のその位置 の位置決め及びその位置を占拠しているヌクレオチドを示唆する。ある方法にお いては、第２ 標的核酸はアレーともハイブリダイズする。従って、このプローブの相対特異的 結合能は、標的配列が対照配列と同一であるか異なるかを、及び第２標的配列が 対照配列と同一であるか異なるかの両方を示唆する。ある方法においては、その アレーが第１及び第２対照配列それぞれのためにタイル貼りした２グループのプ ローブを含んで成るとき、第１グループにおけるプローブの相対特異的結合能は 、標的配列が第１対照配列と同一であるか異なるかを示唆する。第２グループに おけるプローブの相対特異的結合能は、標的配列が第２対照配列と同一又は異な るかを示唆する。かかる方法は遺伝子の異種アレルを分析するのに特に有用であ る。ある方法は、対照配列及び標的配列を共に上記の任意のプローブアレーにハ イブリダイズさせることを含む。対照及び標的配列に対するプローブの相対特異 的結合能の対比は、標的配列が対照配列と同一又は異なるかを示唆する。 第12の態様において、本発明は固定化プローブアレーを提供し、それにおいて はプローブはヒト免疫不全ウィルス由来の対照配列をタイル貼りするようにデザ インされている。HIVの逆転写酵素遺伝子又はプロテアーゼ遺伝子のいづれかに 由来する対照配列が特に注目される。一部のチップは更に、病理性微生物由来の 16S RNA又は16S RNAをコードするDNA由来の対照配列をタイル貼りしたプローブ アレーを含んで成る。本発明は更に、HIV標的配列を分析するうえでのかかるア レーを利用する方法を提供する。これらの方法は標的配列が少なくとも１の位置 において対照配列に比して置換されたヌクレオチドを有し、その置換がHIVウィ ルスで感染した患者を処置するのに利用する薬剤に対する耐性を授けるときに極 めて有用である。この方法は置換化ヌクレオチドの存在を示す。この方法は様々 なHIV変異体由来の第１及び第２標的配列の未知の割合の混合物 を分析するのに極めて有用でもある。プローブの相対特異的結合能は第１及び第 ２標的配列の割合を示唆する。 第13の態様において、本発明はCFTR遺伝子由来の対照配列を基礎にタイル貼り したプローブアレーを提供する。好適なアレーは、少なくとも、野生型プローブ 及び５セットの３つの突然変異プローブを含んで成るプローブのグループを含ん で成る。この野生型プローブは襄胞性線維症由来の対照配列のサブ配列にまさに 相補性であり、そのセグメントは対照配列における５個の連続ヌクレオチドに対 応する少なくとも５個の疑問位を有する。これら３つの突然変異プローブの第１ セットにおけるプローブはそれぞれ、５個の疑問位の最初であって３つの突然変 異プローブ及び野生型プローブそれぞれにおいて異なるものにより占拠されてい る位置を除き、野生型プローブと同一である。３つの突然変異プローブの第２セ ットにおけるプローブはそれぞれ野生型プローブと同一であるが、ただし３つの 突然変異プローブ及び野生型プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドに より占拠されている５つの疑問位の２番目を除く。３つの突然変異プローブの第 ３セットにおけるプローブはそれぞれ野生型プローブと同一であるが、ただし３ つの突然変異プローブ及び野生型プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチ ドにより占拠されている５つの疑問位の３番目を除く。３つの突然変異プローブ の第４セットにおけるプローブはそれぞれ野生型プローブと同一であるが、ただ し３つの突然変異プローブ及び野生型プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレ オチドにより占拠されている５つの疑問位の４番目を除く。３つの突然変異プロ ーブの第５セットにおけるプローブはそれぞれ野生型プローブと同一であるか、 ただし３つの突然変異プローブ及び野生型プローブのそれぞれにおいて異なるヌ クレオチドにより占拠されている５つの疑問位の５番目を除く。好 ましくは、チップは２つのかかるプローブグループを含んで成る。この第１グル ープは第１対照配列にまさに相補性の野生型プローブを含んで成り、そして第２ グループは第１対照配列の突然変異体である第２対照配列にまさに相補性の野生 型プローブを含んで成る。 本発明は更にCFTR遺伝子から標的配列を分析するための本発明のアレーを利用 する方法を提供する。この方法はCFTR遺伝子のヘテロ接合アレルを示す第１及び 第２標的配列の同時分析が可能である。 第14の態様において、本発明はｐ53遺伝子、hMLH１遺伝子及びMSH２遺伝子由 来の対照配列をタイル貼りしたプローブアレーを提供する。本発明は更にこれら の遺伝子を分析するために上記のアレーを利用する方法を提供する。本方法は例 えは癌の発症し易い患者を診断するのに有用である。 第15の態様において、本発明はミトコンドリアゲノムからの対照配列をタイル 貼りするプローブアレーを提供する。この対照配列はＤループ領域の一部もしく は全体、又はミトコンドリアゲノムの全体もしくは実質的に全体を含んで成りう る。本発明は更にミトコンドリアゲノム由来の標的配列を分析するために上記の アレーを利用する方法を提供する。この方法は患者に係る突然変異の同定、法医 学、疫学及び進化の研究にとって有用である。 図面の簡単な説明 図１：基礎的タイル貼り手法。本図は、疑問位（Ｉ）と対照配列における対応 ヌクレオチド（ｎ）間の関係、及び第１プローブセット由来のプローブと第２、 第３及び第４プローブセット由来の対応プローブとの関係を示す。 図２：第１プローブセット由来のプローブにおける相補性のセグメント。 図３：基礎的タイル貼り手法におけるプローブのずれ系列。この図は４組のプ ローブセットを示し、それぞれは３つのプローブを有している。各プローブは同 セットの中の先行プローブと５′ヌクレオチドの獲得及び３′ヌクレオチドの欠 失、並びに疑問位を占拠しているヌクレオチドにおいて異なる。 図４：チップ上のレーンの典型的な整列。このチップは４組のプローブセット を示し、それぞれは５つのプローブを有し、そしてそれぞれは、プローブ当り１ の割合で、全部で５つ疑問位を有している。 図５：レーンに置いたプローブを有するチップのハイブリダイゼーションパタ ーン。暗色区画はハイブリダイゼーションを示す。この図面の下のプローブは、 プローブの長さが15そして疑問位が７のとき、矢印で表示しているアレーの行に 見い出させる。 図６：欠失及び挿入突然変異を検出するための手法。かっこ内の塩基は存在し てもしていなくてもよい。 図７：ブロックタイル貼り手法。第１プローブセット由来のプローブは３つの 疑問位を有する。他のプローブセット由来のプローブはこれらの疑問位のうちの １つのみを有する。 図８：多重タイル貼り手法。各プローブは２つの疑問位を有する。 図９：ヘルパー突然変異手法。相補性のセグメントは対照配列の相補体とは、 ヘルパー突然変異及び疑問位において異なる。 図10：HV 407チップ上のプローブのレイアウト。この図は、それぞれ４本のレ ーンに副分割した連続配列の列を示す。４本のレーンはチップ上のＡ−，Ｃ−， Ｇ−及びＴ−レーンに相当する。各プローブはその疑問位を占拠するヌクレオチ ドにより表している。文字「Ｎ」はコントロールプローブ又は空の行を示す。サ イズの異なる プローブは平行で並べている。即ち、上から下にかけて、13量体の列の次に15量 体の列が続き、それに17量体の列が続き、それに19量体の列が続く。 図11：チップの対照配列と同一の標的配列（pPo119）にハイブリダイズしたHV 407の蛍光パターン。 図12：pPoL19及び4MUT18にハイブリダイズさせたHV 407チップから解読した配 列（別々の実験）。この対照配列を「野生型」と呼ぶ。対照配列の下にはpPoL19 標的にハイブリダイズしたチップから解読した４列の配列があり、第１列は13量 体から、第２列は15量体から、第３列は17量体から、そして第４列は19量体から 解読したものである。これらの配列の下には、HBX2標的にハイブリダイズさせた チップから解読した４つの更なる配列の列がある。連続している列は13量体、15 量体、17量体及び19量体から解読したものである。例の中の各ヌクレオチドは、 Ａ−，Ｃ−，Ｇ−及びＴ−レーンにおけるプローブの相対蛍光強度から判定され たものである。チップから解読した不明瞭な配列の領域を目立たさせた。HBX2配 列と、適正に検出された対照配列との間での株相違は（★）で表示し、そして判 定できなかったものは（○）で表示した。（417位にあるヌクレオチドは、何回 かの実験においては正しく解読された。）チップの解読可能な領域において見い 出させる薬剤耐性に係ることで知られる一部の突然変異の位置は「野生型」と表 示した配列の上（コドン番号）及び下（突然変異ヌクレオチド）に示す。標的配 列を増幅させるのに用いたプライマーの位置は矢印で示す。 図13：混合標的配列の検出。突然変異標的は野生型とは、逆転写酵素遺伝子の コドン67における単独突然変異により相違する。それぞれのサイズの異なるプロ ーブグループは突然変異が認められるヌクレオチドを解読する４つのプローブの 行を有する。行を占拠して いる４つのプローブは図の中の単独プローブにより表され、記号（○）は疑問位 を表し、それは各プローブにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている。 図14：様々な割合の突然変異体及び野生型標的についての13量体及び15量体に 結合した標的の蛍光強度。蛍光強度は、突然変異体及び野生型標的が異なり合う ヌクレオチドを解読するための疑問位を有するプローブに由来している。 図15：ddI＞による処置の前後での４種の臨床サンプル由来のプロテアーゼチ ップから解読した配列。 図16：CFTR点突然変異を分析するためのプローブアレーのブロックタイル貼り 。各プローブは事実上４つのプローブを示し、１のプローブは疑問位Ｎにおいて Ａ，Ｃ，Ｇ又はＴのそれぞれを有する。示している順で、左側に示す第１プロー ブは野生型対照配列からタイル貼りしたものであり、第２プローブは突然変異配 列からタイル貼りしたものであり、交互でそれが続く。プローブは全て同一であ るが、ただし疑問位は除かれ、それは同一の対照配列からタイル貼りした連続プ ローブ間の一の位置（例えば左側の欄の第１、第３及び第５プローブ）をシフト させる。格子は、このアレーが対照配列とハイブリダイズしたときのハイブリダ イゼーション強度を示す。 図17：ヘテロ接合標的についてのハイブリダイゼーションパターン。この図は 先の図面のアレーを突然変異体及び野生型対照配列の混合物とハイブリダイズさ せたときのハイブリダイゼーションパターンを示す。 図18：パネルＡ，Ｂ及びＣにおいて、CFTRエクソン10プローブを含むDNAチッ プの領域より作ったイメージを示す；パネルＡにおいて、このチップは野生型標 的にハイブリダイズさせている；パネルＣにおいて、このチップは突然変異ΔF5 08標的にハイブリダイズさ せている；そしてパネルＢにおいて、このチップは野生型及び突然変異標的の混 合物にハイブリダイズさせている。 図19：図18のパネルＡ，Ｂ及びＣに対応するシート１〜３において、蛍光強度 、対、タイル貼り位置のグラフを示す。水平軸上のラベルは、対応のプローブに おける置換位置に対応する野生型配列における塩基を示す。プロットしているの は野生型プローブを含む特徴（又は合成部位）、最も標的に結合する置換プロー ブを含む特徴（「判定」）、及び置換プローブ全体のうちで２番目に強い強度で 標的に結合する置換プローブを含む特徴（「２番目」）から観察された強度であ る。 図20：パネルＡ，Ｂ及びＣにおいて、CFTRエクソン10プローブを含む、DNAチ ップの領域から作ったイメージを示す。パネルＡにおいて、このチップはwt標的 にハイブリダイズさせている；パネルＣにおいて、このチップはmu480標的にハ イブリダイズさせている；そしてパネルＢにおいて、このチップは野生型及び突 然変異標的にハイブリダイズさせている。 図21：図20のパネルＡ，Ｂ及びＣに対応するシート１〜３において、蛍光強度 、対、タイル貼り位置のグラフを示す。水平軸上のラベルは、対応のプローブに おける置換位置に対応する野生型配列における塩基を示す。プロットしているの は野生型プローブを含む特徴（又は合成部位）、最も標的に結合する置換プロー ブを含む特徴（「判定」）、及び置換プローブ全体のうちで２番目に強い強度で 結合する置換プローブを含む特徴（「２番目」）から観察された強度である。 図22：パネルＡ及びＢにおいて、CFTRエクソン10プローブを含むDNAチップの 領域から作ったイメージを示す。パネルＡにおいて、このチップは野生型ΔF508 配列を有する個体のゲノムDNA由来の核 酸配列にハイブリダイズさせている；パネルＢにおいて、この標的核酸はヘテロ 接合個体（ΔFD508突然変異との関係で）に由来する。 図23：図22のパネルＡ及びＢに対応するシート１及び２において、蛍光強度、 対、タイル貼り位置のグラフを示す。水平軸上のラベルは、対応のプローブにお ける置換の位置に対応する野生型配列の中の塩基を示す。プロットしているのは 、野生型プローブを含む特徴（又は合成部位）、標的に最も結合する置換プロー ブを含む特徴（「判定」）、及び置換プローブ全体のうちで２番目に強い強度を もって標的に結合する置換プローブを含む特徴（「２番目」）から観察された強 度である。 図24：CFTR遺伝子におけるG551D及びQ552X突然変異を検出するようにデサイン されたブロックタイル貼りアレーに対するCFTR遺伝子のエクソン11由来のホモ接 合野生型（Ａ）及びヘテロ接合（Ｂ）標的配列のハイブリダイゼーション。 図25：突然変異、ΔF508，Δ1507及びF508Cを検出するようにデザインされた ブロックタイル貼りアレーに対するCFTRのエクソン10由来のホモ接合野生型（Ａ ）及びΔF508突然変異（Ｂ）標的配列のハイブリダイゼーション。 図26：図25のアレーに対する、ヘテロ接合突然変異標的配列ΔF508／F508Cの ハイブリダイゼーション。 図27：12量体のモデルの標的核酸との、p53 DNAチップ上の一部のプローブの 整合を示す。 図28：p53エクソン６ DNAチップについての10量体プローブのセットを示す。 図29：p53 DNAチップと、異なる１塩基置換を有する標的とのハイブリダイゼ ーションの後に非常に異なるパターンが観察されるこ とを示す。図29の最初のイメージにおいて、野生型標的は第１列にある（最上列 ）。単一塩基不対合を有する12量体は第２、第３及び第４列にあり、そしてはる かに低いシグナルを発している。 図30：グラフ２，３及び４においては、図29のデーターをグラフ的に描写する 。各グラフ上で、Ｘ軸はチップ上のその列の中のプローブの位置でしり、そして Ｙ軸はハイブリダイゼーション後のそのプローブ位にあるシグナルである。 図31：p53 DNAチップに対してWT及び突然変異p53遺伝子の混合標的集団をハイ ブリダイズさせた結果を示す。 図32：グラフ１〜４において、12量体プローブアレーと比べた10量体プローブ アレーのハイブリダイゼーション効率を示す（同様に図30参照のこと）。 図33：標的DNAにハイブリダイズさせたp53 DNAチップのイメージを示す。 図34：実際の配列を図33に示すチップからどのようにして解読するかを示す。 WT列の中の文字の配列の中のギャップはコントロールプローブ又は部位に相当す る。塩基が誤まって判定された位置は、WT塩基が別の塩基により置換されたプロ ーブに対応する格子の中でイタリック体で表している。 図35：ヒトミトコンドリアゲノムを示す；「Ｏ_H」はＨ鎖複製起点であり、そ して矢印はクローニングされた陰なし配列を示す。 図36：DNAチップ上のミトコンドリアDNA誘導型核酸（mt４サンプル由来）のサ ンプルの適用から観察されたイメージを示す。 図37：図36に似ているが、mt５サンプルから観察されたイメージを示す。 図38：２つのサンプルと対照配列との間での誤対合に基づくDNAチップ上のmt ４及びmt５サンプルの間での推定の異なるイメージを 示す。。 図39：mt４及びmt５サンプルについて観察された実際の異なるイメージを示す 。 図40：シート１及び２において、アレーのうちの列10及び11にわたる標準化強 度のプロット、並びに検出された突然変異の表を示す。 図41：チップで得られた野生型及び突然変異ハイブリド間の区別を示す。各プ ローブの６標準化ハイブリダイゼーション評点の中央値を採用した；このグラフ は、標準化ハイブリダイゼーション評点に対する中央値評点の比、対、平均カウ ント数をプロットしている。1.6の比及び50以上の平均カウント数は偽陽性をも たらさない。 図42：塩基不対合の同一性がどのようにして、オリゴヌクレオチドプローブ内 の誤対合の位置よりも、突然変異体と野生型配列とを区別する能力に影響を及ぼ しうるかを示す。この誤対合位置は３′末端からのプローブ長さの％として表わ す。塩基変化はグラフ上に示す。 図43：チップ上のプローブに対応する一の標的を挙げている、５′から３′に 至る配列を提供する。標的において相違している（即ち、表示の位置においてプ ローブと誤対合する）位置を大文字とする。 図44：サンプルにハイブリダイズさせたときの図17記載のチップのスキャニン グにより得られる蛍光イメージを示す。 図45：図44のチップ上の野生型プローブに対する標的配列の中の４つのトラン ジションの検出を示す。 図46：オリゴヌクレオチドの光誘導型合成に適用したVLSIPS（商標）技術。光 （hv）をマスク（Ｍ₁）を介して照射し、保護基（Ｘ）の除去により表層上の官 能基（−OH）を活性化させる。光除去性 保護基（Ｔ−Ｘ，Ｃ−Ｘ）で保護されたヌクレオチド構成単位を活性化領域にカ ップリングさせる。照射とカップリング工程を繰り返すことにより、非常に簡単 なオリゴヌクレオチドのアレーが調製できる。 図47：２量体、３量体、そして４量体を生成するための、４種のヌクレオチド を全てカップリングさせることにより合成した「ヌクレオチド順列組合せ」又は オリゴヌクレオチドを調製するVLSIPS（商標）プロセスの利用。 図48：固相DNA合成法の脱保護、カップリング及び酸化工程。 図49：VLSIPS（商標）法に用いるヌクレオシド構成単位についての代表的な合 成ルート。 図50：好適な光除去性保護基MeNPOC及びその活性形態の基の調製。 図51：DNAチップをスキャニングするための検出系。 発明の詳細な説明 本発明は既知の配列（対照配列）をその配列を変異体（標的配列）と対比させ るためのいくつかの手法を提供する。この対比は全ゲノム、染色体、遺伝子、エ クソンもしくはイントロンのレベルで行ってよく、又は個々の突然変異部位及び すぐ隣りの塩基を焦点としてよい。この手法は、標的配列中の変化、例えば突然 変異又は多形性の検出を可能とし、これも特定の変異が事前に特性決定されてい ようと関係ない。この手法は変異の種類特定し、且つ標的配列の中のその位置を 同定する。 この手法は固相支持体に固定化したオリゴヌクレオチドプローブのアレーを採 用する。標的配列を、そのアレーの特定のプローブでのハイブリダイゼーション の程度を決定することにより分析する。 プローブの選択におけるこの手法は、完璧に対合したプローブと、単独塩基又は その他の度合いの誤対合を示すプローブとの区別を助長する。この手法は通常、 標的配列の中の注目の各ヌクレオチドを数回サンプリングすることを含み、これ によりその同一性における高度の信頼性を達成せしめる。この信頼性のレベルは 、注目のヌクレオチドに対する標的配列の中の隣接ヌクレオチドのサンプリング により更に高まる。チップ上のプローブの数はかなり多くてよい（例えば10⁵〜1 0⁶）。しかしながら、通常、一定の長さのプローブの総数のうちのごくわずかし か意味をなさない。一定の長さの全ての可能性のあるプローブのごくわずかしか 使用しないいくつかの利点には：（ｉ）アレーの中の各値置が、ハイブリゼーシ ョンが起ころうと起きまいと、高度の情報性となる；（ii）非特異的なハイブリ ダイゼーションが最少限となる；（iii）ハイブリダイゼーション相違を配列相 違と相関させることが、特に既知の標準品のハイブリダイゼーションパターンを 参酌したとき、簡単である；及び（iv）高解像度ホトリトグラフィーを使用した ときの合成の際に個別に各プローブをアドレスする能力が、アレーを任意の配列 のためにデザイン及び最適化することを可能にする；ことが含まれる。例えば、 任意のプローブの長さは他と独立して変更することができる。 本タイル貼り手法は、配列情報における高度な信頼性をもって、ルーチンの大 量スケール実施に適する配列決定及び対比方法をもたらす。 Ｉ．一般的なタイル貼り手法 Ａ．対照配列の選択 チップは、配列のわかっている１又は複種の選定対照配列に対する相補性を示 すプローブを含むようにデザインされている。これらのチップは対照配列自体又 はその配列の変異体を含んで成る標的配 列を解読するのに用いられる。標的配列は対照配列とは１又は複数の位置におい て相違してよいか、しかし対照配列と総合的には高度の配列同一性を示すものと する（例えば少なくとも75，90，95，99，99.9又は99.99％）。既知の配列の任 意のポリヌクレオチドを対照配列として選んでよい。注目の対照配列には、ヒト 患者の臨床的意義を有する表現型変化の伴う突然変異又は多形性を含むことのわ かっている配列が含まれる。例えば、ヒトのCFTR遺伝子及びｐ53遺伝子では、い くつかの突然変異の存在がそれぞれ襄胞性線維症又は癌をもたらすことが同定さ れている。注目のその他の対照配列には、病理性微生物の同定を担うもの及び／ 又はかかる微生物に薬剤耐性を与える突然変異部位（例えばHIV逆転写酵素遺伝 子）であるものが含まれる。注目のその他の対照配列には、多形性変異を起こす ことで知られている領域が含まれる（例えば、ミトコンドリアDNAのＤ−ループ 領域）。これらの対照配列は法医学又は疫学的研究の用途を有する。注目のその 他の対照配列には、ｐ34（ｐ53と近縁）、ｐ65（乳、前立腺及び肝臓癌に関連） 、並びにチトクロームP450をコードするDNAセグメントが含まれる(Meyerら、Pha rmac．Ther．46，349-355(1990))。注目のその他の対照配列には、病理ウィルス 、例えば肝炎（Ａ，Ｂ又はＣ）、ヘルペスウィルス（例えばV2V，HSV-１，HAV- ６，HSV−II及びCMW、アプステイン・バー・ウィルス）、アデノウィルス、イン フレンザウィルス、フラビウィルス、エコウィルス、リノウィルス、コックサッ キーウィルス、コルノウィルス、呼吸シンシチアウィルス、流行性耳下腺炎ウィ ルス、ロタウィルス、麻疹ウィルス、風疹ウィルス、パルボウィルス、ワクシニ アウィルス、HTLVウィルス、デング熱ウィルス、パピロマウィルス、伝染性軟属 腫ウィルス、ポリオウィルス、狂犬病ウィルス、JCウィルス及びアルボウィルス 性脳炎ウィルスのゲノム由来のも のが含まれる。注目のその他の対照配列は、病理性細菌のゲノム又はエピソーム 、特に薬剤耐性を授けるか、又は宿主の系統発生的特徴を担う領域である（例え は16S RNA又は対応のDNA）。例えば、かかる細菌にはクラミジア(chlamydia)、 リッケッチャ(rickettsial)細菌、ミコバクテリア（mycobacteria）、スタフィ ロコッカス(staphylococci)、トレプトッカス(treptocci)、ニューモノッカス(p neumonococci)、メニンゴコッカス（meningococci）及びコノコッカス(conococc i)、クレブシーラ（klebsiella）、プロテウス(proteus)、セラチア（serratia ）、シュードモナス(pseudomonas)、レギオネラ（legionella）、ジフテリア（d iphtheria）、サルモネラ（salmonella）、バチルス(bacilli)、コレラ(cholere )、破傷風、ボツリズム（botulism）、アントラックス(anthrax)、プラーグ（pl ague）、レプトスピロシス(leptospirosis)及びライム(lymes)病細菌が含まれる 。その他の注目の対照配列には、その突然変異が下記の常染色体退縮性病をもた らすものか含まれる：鎖状赤血球貧血、β−サラセミア、フェニルケトン尿症、 ガラクトース血症、Wilson病、ヘモクロマト−シス、重症な合併免疫不全、アル ファ−１−アンチトリプシン欠乏症、白皮症、アルカプトン尿症、リソゾーム貯 蔵障害及びEhlers-Danlos症候群。注目のその他の対照配列には、その突然変異 が下記のＸ−連結型退縮性障害をもたらすものが含まれる：血友病、グルコース −６−リン酸デヒドロゲナーゼ、無ガンマグロビン血症、尿崩症、Lesch-Nyhan 症候群、筋ジストロフィー、Wiskott-Aldrich症候群、Fabry病及びぜい弱Ｘ症候 群。その他の注目の対照配列には、その突然変異が下記の常染色体支配障害をも たらすものが含まれる：家族性高コレステロール症、多襄性腎障害、Huntingdon 病、遺伝性球状赤血球症、Marfan症候群、von Willebrand病、神経線維腫症、結 節硬化症、遺伝性出血性 毛細管拡張症、家族性腸ポリポーシス症、Ehlers-Danlos症候群、筋緊張性ジス トロフィー、筋ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポリフィリン症及び von Hippel-Lindua病。 対照配列の長さは全長ゲノムから個々の染色体、エピソーム、遺伝子、遺伝子 の構成要素、例えばエクソン、イントロン又は調節配列、更には数ヌクレオチド に至るまで幅広く変えてよい。約２，５，10，20，50，100，500，1,000，5,000 もしくは10,000，20,000又は100,000ヌクレオチドの間の対照配列が一般的であ る。時折り、配列の特定領域（例えば遺伝子のエクソン）のみが注目される。か かる状況においては、任意の選択に応じて、この特定領域は独立の対照配列と考 えるか、又は単独対照配列の構成成分と考えてよい。 対照配列はヌクレオチド、RNAの又はDNAの、任意の天然、突然変異、共通又は 純粋な仮説配列であってよい。例えば、配列はコンピューターデーターベース、 出版物から獲得したものであるか、又は新たに決定又は認識されたものであって よい。通常、対照配列は着想の標的配列に対して高度の配列同一性を示すように 選定する。往々にして、特に有意義な相違の度合いが標的配列間で期待される場 合、複数の対照配列を選定する。野生型及び突然変異対照配列の組合せを本タイ ル貼り手法のいく通りかの用途に利用する。 Ｂ．チップデザイン １．基礎的なタイル貼り手法 この基礎的なタイル貼り手法は、１又は複数種の選定対照配列に対して高度の 配列同一性を示す標的配列の分析のための固定化プローブのアレーを提供する。 この手法はまず、４組のプローブセットに副分割したアレーについて例示するか 、ある状況においては、２組のプローブセットのみから満足たる結果が得られる ことが期待されるであろう。第１プローブセットは選定の対照配列と完璧な相補 性を示す複数のプローブを含んで成る。この完璧な相補性は通常プローブ全長に わたっている。しかしながら、完璧な相補性の１又は複数のセグメントであって 、対照配列に対する相補性を欠く先行又は後続配列が隣接しているものも利用し てよい。相補性のセグメント内では、この第１プローブの各プローブは対照配列 の中のヌクレオチドに対応する少なくとも１個の疑問位を有している。即ち、プ ローブと対照配列間の相補性を最大限とするようにこの両者を整合させたとき、 この疑問位は対照配列の対応ヌクレオチドと整合する。プローブが複数の疑問位 を有するなら、それぞれ対照配列の中の対応のヌクレオチドと対応する。第１プ ローブの特定プローブにおける疑問位及び対応ヌクレオチドの同定は単に第１セ ットのプローブの視察により決定できない。明らかとなる通り、疑問位及び対応 ヌクレオチドは、第１プローブセットにおけるプローブの構造を、別のプローブ セット由来の対応のプローブと対比させることにより特定する。 原理的には、プローブは対照配列に相補性のセグメントの各位置において疑問 位を有しうる。時折り、疑問位は、相補性セグメントの先端から遠く離れている とき、より正確なデーターを供する。即ち、一般に、長さＸの相補性のセグメン トを有するプローブはＸ−２より多くの疑問位を含まない。プローブは一般に９ 〜21ヌクレオチドであるため、そして通常全てのプローブが相補性であるため、 プローブは一般に１〜19の疑問位を有する。往々にして、プローブは、プローブ の中心に又はその付近に単独の疑問位を含む。 第１セットの各プローブに関し、本例示の目的で、３つの別のプローブセット 由来の３つの対応プローブがある。図１参照のこと。即ち、対照配列の中の注目 の各ヌクレオチドに対応する４つのプローブがある。この４つの対応プローブそ れぞれは、注目のヌクレオ チドに整合する疑問位を有する。通常、３組の別のプローブセット由来のプロー ブは、一の例外をもって、第１プローブセット由来の対応プローブと同一である 。この例外は、４組のプローブセット由来の４つの対応のプローブそれぞれにお いて同一の位置にある少なくとも１の（そして往々にして１のみ）疑問位が、４ 組のプローブセットにおいて別々のヌクレオチドにより占拠されていることにあ る。例えば、対照配列のＡヌクレオチドに関し、第１プローブセット由来の対応 プローブはその疑問位がＴにより占拠され、そして別の３組のプローブセット由 来の対応プローブはその対応疑問位が、各プローブにおいて別々のヌクレオチド でＡ，Ｃ，又はＧにより占拠されている。むろん、第１プローブセット由来のプ ローブが対照配列に対する相補性を欠く後続又は隣接配列を含んで成るとき（図 ２参照）、これらの配列は３組の別のセット由来の対応プローブに存在している 必要はない。同様に、３組の別のセット由来の対応プローブは、第１プローブセ ット由来の対応プローブにない、相補性セグメントの外側に先行又は後続配列を 含んでよい。時折り、別の３組のプローブセット由来のプローブは、第１プロー ブセット由来の対応プローブの完全相補性セグメントの連続サブ配列と同一であ ってよい（疑問位を除いて）。この場合、このサブ配列は疑問位を含み、そして 通常全長プローブとは、相補性セグメントの末端からの一方又は双方の末端ヌク レオチドの省略においてのみ異なる。即ち、第１プローブセット由来のプローブ が長さｎの相補性セグメントを有するとき、他のセット由来の対応プローブは通 常少なくとも長さｎ−２のセグメントのサブ配列を含むであろう。即ち、このサ ブ配列は通常少なくとも３，４，７，９，15，21又は25ヌクレオチドの長さであ り、最も一般的には９〜21ヌクレオチドの範囲内である。このサブ配列は、プロ ーブが、対照配列に対するよりも、疑問 位において突然変異した対照配列の変異体に対して検出できるほどに一層強くハ イブリダイズすることを可能にするに足りる長さであるべきである。 これらのプローブは相補性塩基対合により標的配列とハイブリダイズできるオ リゴデオキシリボヌクレオチドもしくはオリゴリボヌクレオチドであるか、又は これらのポリマーの任意の改変体であってよい。相補性塩基対合は配列特異的塩 基対合を意味し、これは例えばWatson-Crick塩基対合、及びその他の塩基対合形 態、例えばHoogsteen塩基対合が含まれる。改変体には２′−０−メチルオリゴ リボヌクレオチド及びいわゆるPNAが含まれ、それにおいてはオリゴデオキシリ ボヌクレオチドはホスホジエスル結合ではなく、ペプチド結合を介して連結され ている。これらのプローブは支持体に任意の結合を介して付加されていてよい（ 例えば３′，５′、又は塩基を介して）。３′付加がより一般的であり、なぜな らこの配向はオリゴヌクレオチドの固相合成のための好適な化薬品と適合性であ るからである。 第１プローブセットの中のプローブの数（及びその結果としての別プローブセ ットの中のプローブの数）は、対照配列の長さ、対照配列の注目のヌクレオチド の数、及びプローブ当りの疑問位の数に依存する。一般に、対照配列の中の注目 の各ヌクレオチドには４組のプローブセットにおいて同一の疑問位を必要とする 。例えば、100ヌクレオチドの対照配列があり、そのうちの50が注目され、そし て各プローブが単独の疑問位を有することを考える。この状況においては、第１ プローブセットは50プローブを必要とし、それぞれは対照配列において注目のヌ クレオチドに対応する１の疑問位を有する。第２、第３及び第４プローブセット はそれぞれ第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを有し 、そしてそれ ぞれも全部で50のプローブを含む。対照配列における注目の各ヌクレオチドの同 一性は、４組のプローブセット由来のヌクレオチドに対応する疑問位を有する４ つのプローブでの相対ハイブリダイゼーションシグナルを対比させることにより 決定する。 ある対照配列においては、全てのヌクレオチドが注目される。他の対照配列に おいては、変異体（例えば突然変異又は多形性）が集中している一定の領域のみ が注目される。他の対照配列においては、特定の突然変異又は多形性及びそのす ぐ隣りのヌクレオチドのみが注目される。通常、この第１プローブセットは少な くとも１のヌクレオチド（例えば点突然変異を表わす）及び１の隣接ヌクレオチ ドに対応するように選定する。通常、第１セットにおけるプローブは少なくとも ３，10，50，100，1,000又は20,000連続ヌクレオチドに対応する疑問位を有する 。これらのプローブは通常、対照配列のヌクレオチドのうち少なくとも５，10， 30，50，75，90，99又は時折り100％に対応する疑問位を有する。しばしば、第 １プローブセットのプローブは対照配列全体に完璧に及び、そして対照配列に対 し互いと重複し合っている。例えば、一の一般的な配備において、第１プローブ セットの中の各プローブはそのセットの中の別のプローブと、対照配列に対して 相補性の３′塩基の省略及び対照配列に対して相補性の５′塩基の獲得により、 相違する。図３参照のこと。 便宜上、セットの中のプローブは通常チップにわたるレーンの中で配列の順に 並べる。レーンは一連の重複プローブを含み、それは選定の対照配列を占める又 はタイル貼りしている（図３参照）。４組のプローブの成分は通常４本の平行な レーンに置かれ、水平方向における列及び鉛直方向における一式の４員行より集 約的に構成されている。４組のプローブセット由来の対応プローブ（即ち、対照 配列の同一のサブ配列に相補性）が行を占めている。レーンの中の各プローブは 通常、そのレーンの先行のものとは、図３に示す通り、一端での塩基の欠落及び 他端での追加の塩基の組込みにより、異なる。しかしながら、プローブのこの順 序立った進行は、アレーの所定の行におけるコントロールプローブの組込み又は プローブの省略により妨げられうる。かかる行はチップを配向する又はバックグ ランドを評価するためのコントロールを担う。（バックグランドは、チップに非 特異的に結合した標的配列が含まれうる）。 プローブセットは通常、疑問位がＡにより占拠されている全プローブがＡ−レ ーンを形成し、疑問位がＣにより占拠されている全プローブがＣ−レーンを形成 し、疑問位がＧにより占拠されている全プローブがＧ−レーンを形成し、そして 疑問位がＴにより占拠されている全プローブがＴ−レーン（又はＵ−レーン）を 形成しているように、レーンにおいて並べる。この配備においてプローブセット とレーンとの間に固有の対応がないことに注目する。即ち、第１プローブセット 由来のプローブを、図４における５本の行について、Ａ−レーン、Ｃ−レーン、 Ａ−レーン、Ａ−レーン及びＴ−レーンで並べる。プローブの行の上の疑問位は 、その同一性がその行の中のプローブに対するハイブリダイゼーションの分析か ら決定された標的配列における位置に対応する。即ち、Ｉ₁〜Ｉ₅はそれぞれ図４ のＮ₁〜Ｎ₅に対応する。その疑問位はプローブのどこにあってもよいが、通常は 完全対合と単一塩基誤対合とでの示差ハイブリダイゼーションシグナルを最大と するよう、プローブの中央位置又はその付近とする。例えば、11量体プローブに 関し、中央位置は６ヌクレオチドである。 プローブのアレーは通常、上記の通り行と列で並べるか、かかるチップ上のプ ローブの物理的な配備は必須ではない。アレーの中の 各プローブの間隔位置がわかっていることを条件に、プローブ由来のデーターを 集め、そして処理して、チップ上のプローブの物理的配備と無関係に標的の配列 を作り出す。データーの処理において、対応のプローブ由来のハイブリダイゼー ションシグナルは、チップ上のプローブの物理的配備がどのようであろうと、事 後のデーターの削減のために所望される任意の概念的なアレーに並べ換えてよい 。 一連の長さのプローブをチップに利用してよい。前述の通り、プローブは相補 性セグメントより成っていてよく、又はセグメントを隣接、後続及び／もしくは 介在させることにより並べ換えた／もしくは複数の相補性セグメントを有してよ い。後者の場合、相補性セグメントの全長の方がプローブの長さより重要である 。機能的な観点において、第１プローブセットの相補性セグメントは、そのプロ ーブが、プローブの疑問位に対応するヌクレオチドにおいて単一の塩基突然変異 を含むその対照の変異体と比べ、対照配列に対して検出できるほどに一層強くハ イブリダイズするよう、十分な長さであるべきである。同様に、別のプローブセ ット由来の対応プローブの相補性セグメントは、そのプローブが、対照配列と比 べ、疑問位に単一ヌクレオチド置換を有する対照配列の変異体に対して検出でき るほどに一層強くハイブリダイズするほどに十分な長さであるべきである。プロ ーブは通常、対照配列に対して完璧な相補性（プローブセットに依存し、疑問位 において可能性があるというのではなく）を示す少なくとも５，６，７，８，９ ，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25又は30塩 基の長さを有する一本の相補性セグメントを有する。ブリッジング手法において は、１より多くの相補性セグメントがあるとき、各セグメントは対照配列に対す る少なくとも３相補性ヌクレオチドを供し、そして組 合せセグメントは３又は全部で６の相補性ヌクレオチドの少なくとも２セグメン トを供する。他の手法と同様に、相補性セグメントの結合長さは一般に６〜30ヌ クレオチド、そして好ましくは約９〜21ヌクレオチドである。この２つのセグメ ントは往々にしてほぼ同じ長さである。往々にして、これらのプローブ（又はプ ローブ内の相補性セグメント）は奇数個の塩基を有し、これにより疑問位はプロ ーブのまさに中央にあることができる。 一部のチップにおいては、プローブは全て同じ長さである。他のチップは異な るプローブセットのグループを利用し、それにおいてはプローブはグループ内で 同一のサイズであるか、別のグループ間では相違する。例えば、一部のチップは プローブが全て11量体である上記の４組のプローブセットを含んで成る第一のグ ループを、プローブが全て13量体である４組のプローブセットを含んで成る第二 のグループと共に有する。むろん、更なるプローブグループを追加してよい。即 ち、一部のチップは、例えば11量体、13量体、15量体及び17量体のサイズを有す る４グループのプローブを含む。他のチップは同一グループの４組のプローブセ ット内で異なり合うサイズのプローブを有する。これらのチップにおいては、第 １セットのプローブは互いと独立して長さを変えてよい。他のセットにおけるプ ローブは通常、第１セット由来の同一の行を占拠するプローブと同じ長さである 。しかしながら、往々にして４本のレーンにおける同一の行の位置に長さの異な るプローブを含ませることができる。様々な長さのプローブを、Ａ−Ｔ又はＣ− Ｇ結合が疑問位に形成されるかに関係なく、プローブ由来のハイブリダイゼーシ ョンシグナルを均一化するために含ませる。 プローブの長さは、標的配列に完璧に対合したプローブと、単一塩誤対合を示 すプローブとを区分するうえで重要でありうる。この 区別力は通常プローブが短いほど強くなる。短いプローブは通常、二次構造の形 成もしにくい。しかしながら、結合した標的配列の絶対量、それ故シグナルの絶 対量はプローブが大きいほど高い。このような競合する所見を最適に妥協させる プローブの長さは、とりわけ標的DNA配列の特定領域のGC含有量、二次構造、合 成効率及び交差ハイブリダイゼーションに依存しうる。標的の一部の領域おいて は、ハイブリダイゼーション条件に依存して、短いプローブ（例えば11量体）は より長いプローブ（例えば19量体）からはアクセスできない情報を提供でき、ま たその逆も真成りである。最大の配列情報は前述の通り、チップ上の様々なサイ ズのプローブのいくつかのグループを含ませることにより解読できる。しかしな がら、標的配列の多数の領域のため、かかる手法は、同じ配列が別のプローブの グループから何回も解読されるという冗長な情報を提供してしまう。均等な情報 は、様々なサイズのプローブの単一のグループから得られ、それにおいてはサイ ズは標的配列の特定領域にある解読可能な配列を最大限にするように選ぶ。標的 配列の様々な領域においてプローブの適切なサイズは、例えば図12から決定でき 、それは標的の様々な領域における様々なサイズのプローブの解読力を対比させ ている。一グループのプローブセット内のプローブの長さを調整する手法は、特 定の標的配列を解読するのに必要なプローブの総数を最少限にする。これは、チ ップがその他の配列に対するプローブを含むことの余裕のキャパシティーを残す 。 本発明は、対照配列における特定のヌクレオチドを分析するためのプローブの 選別の最適化する、プローブの長さ及び疑問位の系列的な変更を可能とする最適 化ブロックを提供する。このブロックは、野生型標的に相補性なプローブと特定 の突然変異に相補性のプローブとの交互の行を含んで成る。疑問位は行間で様々 であり、そし てプローブの長さは行内で様々である。対照配列又は対照配列の突然変異形態に 対するチップのハイブリダイゼーションは、最大の示差ハイブリダイゼーション シグナルを供するプローブの長さ及び疑問位を同定せしめる。 プローブは対照配列のいづれかの鎖（例えばコード又は非コード）に対して相 補性となるようにデザインする。一部のチップは、一方はコード鎖に相補性、他 方は非コード鎖に相補性である別々のプローブグループを含む。コード及び非コ ード鎖の個別の分析は非常に冗長な情報を供する。ところで、コード鎖の解読の うえであいまいな領域は非コード鎖の解読におけるものと常に同じでない。即ち 、コード及び非コード鎖由来の情報の組合せは配列決定の全体的な精度を高める 。 一部のチップは、第二の対照配列に相補性となるようにデザインされた追加の プローブ又はプローブグループを含む。この第二対照配列は往々にして、１又は 複数の一般的に見い出せる突然変異又は株間変異を抱える第一対照配列のサブ配 列とする。第２プローブグループグループは前記と同じ原理によりデザインする か、ただしそのプローブは第二対照配列に相補性を示すようにする。第２グルー プの組込みは、多数の突然変異がプローブの長さにつり合う短い距離内で見い出 せることが予測される（即ち、９〜21塩基内で２個以上の突然変異）第一対照配 列の短いサブ配列を分析するのに極めて有用である。むろん、同じ原理はいくつ かの対照配列のためのプローブのグループを含むチップを供することに及びうる 。他方、このチップは、前述の如くタイル貼りしたアレーの一部を構成しないが 、慣用のリバース・ドット・ブロットのためのプローブを担う更なるプローブを 含みうる。例えば、突然変異の存在は、突然変異を抱える単一オリゴマープロー ブへの標的配列の結合から検出できる。 好ましくは、野生型配列の同等領域を含む追加のプローブをコントロールとして 含ませる。 これらのチップはアレーの中のプローブに対して結合したラベル化標的の強度 を対比させることにより解読される。特に、対比は、各行の位置（物理的又は概 念的）にある各プローブのレーン（例えばＡ，Ｃ，Ｇ及びＴレーン）間で行う。 特定の行位置に関し、最大のハイブリダイゼーションシグナルを示すレーンが判 定され、なぜならそのヌクレオチドは、プローブにおける疑問位に対応する標的 配列の位置に存在しているからである。図５参照のこと。標的配列における対応 の位置は、プローブ及び標的を相補性が最大限となるように整合させたとき、対 応のプローブにおける疑問位と整合する。行の中の４つのプローブのうち、１プ ローブのみが標的配列と完璧な対合を示すことができ、一方、その他は通常少な くとも１の塩基対誤対合を示す。完璧な対合を示すプローブは通常、その行の中 の他の３つのプローブよりも実質的に強いハイブリダイゼーションシグナルを生 成し、それ故簡単に同定される。しかしながら、標的配列の中の一部の領域にお いては、完璧な対合と一塩基誤対合との区別はあまりはっきりしない。従って、 プローブから解読すべき特定の標的位置について超えねばならない、最良にハイ ブリダイズするプローブ、対、２番目にハイブリダイズするプローブの比を規定 する判定率を設定する。高い判定率は、あるにしてもわずかなエラーしか標的ヌ クレオチドの判定においてなされないことを保障するが、いくつかのヌクレオチ ドがあいまいに評価されることをもたらすことがあり、それらは事実上正確に解 読し得ない。低い判定率は少なめのあいまいな判定をもたらすが、より多くの誤 まった判定をもたらしうる。1.2の判定率において事実上全ての判定が正確であ ることがわかった。しかしながら、少ないが有意義な数の塩基（例 えば約10％に至るまで）があいまいに評価されうる。 標的配列のうちの小さな領域は時折りあいまいとなりうるが、これらの領域は 通常、異なる標的配列の同一又は類似のセグメントにおいて見い出せる。即ち、 予め特性決定した突然変異に関し、その突然変異は明瞭に決定できる配列の領域 内にある傾向にあることが先に知られている。 プローブのアレーは、対照配列であって、それよりプローブをデザインするも の、及びその対照配列との実質的な配列類似性を示すその配列の変異体（例えば 、対照配列上にあるいくつかの単独塩基突然変異体）を分析するのに最も有用で ある。アレーを、対照配列であってそれよりそれがデザインされたものを正確に 分析するのに用いるとき、１のプローブは対照配列に対する完璧な対合を示し、 そして同じ行の中の他の３つのプローブは単独塩基誤対合を示す。即ち、ハイブ リダイゼーションシグナル間の区別力は通常高度であり、そして正確な配列が得 られる。高精度は、アレーを、対照配列に比して単一の突然変異を有する、又は 対照配列に比して複数の幅広く広がった突然変異を有する対照配列変異体を含ん で成る標的配列を分析するために用いる。別の突然変異遺伝子座において、１の プローブは標的に対して完璧な対合を示し、そして同一の行を占拠する他の３つ のプローブは単一塩基誤対合を示し、その相違は（対照配列の分析に関する）完 璧な対合が起こるレーンである。 対照株とは高度の相違を示す標的配列、又は対照株とはいくつかの近隣の突然 変異を含むことで異なる標的配列に関しては、単独のプローブグループ（即ち、 単独の対照配列に関して）が、この配列の高度変異領域の正確な配列を常に供す るわけではない。一部の特定の行位置においては、標的に対する完璧な相補性を 示すプローブはないことがあり、そして任意の対比は４つのプローブ間の誤対合 の様々な度合いを基礎とせねばならない。かかる対比は、常に標的ヌクレオチド が判定すべき行の位置に対応することを可能にしない。標的配列における欠失は 、この欠失により囲まれた疑問位を有するプローブからのシグナルの消失により 検出されうる。しかしながら、シグナルは、解読できない標的配列の一部の領域 をもたらしてしまうような、欠失に近位する疑問位を有するプローブからも失わ れてしまう。挿入を有する標的配列も、通常解読されない挿入を含む及びそれに 近位する短い領域も示すであろう。 近位した突然変異、挿入又は欠失を理由に解読困難な標的の短い領域の存在は 、標的の残りの配列の決定の妨げとはならず、その理由は標的配列の種々の領域 は独立して決定されるからである。更に、単独のプローブグループによる様々な 変異体の分析に由来しうるかかる本明瞭さは、チップ上に複数のプローブグルー プを含ませることにより回避されうる。例えば、１グループのプローブは、全長 対照配列を基礎にデザインでき、そして他のグループは、しばしば見い出させる 突然変異又は株変異を含む対照配列のサブ配列を基礎にできる。 本配列決定手法の、慣用の配列決定法に勝る特定の利点は、複数の標的配列の 検出及び比率の定量を同時に行う能力にある。かかる能力は、例えば遺伝子に関 してヘテロ接合している患者又は通常複数の多形性体で存在しているHIVの如く のウィルスで感染された者の診断のために有用である。かかる能力は腫瘍細胞の 生検及びその周辺組織由来の標的を分析するのにも有用である。複数の標的配列 の存在は、相違の認められる標的ヌクレオチドは対応するアレー行においての４ つのプローブの相対シグナルから検出される。検査下にある混合物についての４ つのプローブにおいての相対シグナルを、相同の対照配列由来の対応シグナルと 対比させる。対照配列との 関係で誤対合したプローブ由来のシグナルの上昇及び対照配列と対合したプロー ブ由来のシグナルの対応の低下は、混合物中の突然変異株の存在を知らせる。プ ローブのハイブリダイゼーションシグナルにおけるシフトの程度は混合物中の標 的配列の割合に関連する。相対ハイブリダイゼーションシグナルのシフトは、付 加した突然変異体及び対照配列の混合物によるチップ事前較正により、対照及び 突然変異配列の割合に対して定量的に換算させることができる。このことは、チ ップを、株の混合物の１，５，20又は25％ほどの少なさを構成する変異体又は突 然変異株を検出するのに用いることができる。 似たような原理は、複数の標的配列の同時分析を、たとえどれも対照配列と同 一でなくても、可能にする。例えば、第１及び第２突然変異を有する２種の標的 配列の混合物により、対照配列によるハイブリダイゼーションパターンに比して の、第１及び第２突然変異体に対応する疑問位を有するプローブのハイブリダイ ゼーションプローブにおける変異があるであろう。各位置において、対照配列と の関係で誤対合した疑問位を有するプローブのうちの１つはハイブリダイゼーシ ョンシグナルの上昇を示し、そして対照配列との関係で対合した疑問位を有する プローブはハイブリダイゼーションシグナルの低下を示すであろう。好ましくは 対照配列のハイブリダイゼーションパターンとの対比における、突然変異標的配 列の混合物のハイブリダイゼーションパターンの分析は、２つの突然変異標的配 列の存在、各株における突然変異の位置及び種類、並びに各株の比率を示唆する 。 上記の方法の変法において、標的配列の混合物中の様々な成分を、アレーに適 用する前に別々にラベルしておく。例えば、様々な波長で様々な蛍光ラベルを発 光するものが有用である。示差的なラベ ルの利用はアレーに同時に結合した種々の標的の個々の分析を可能とする。例え ば、この方法は種々の疾患段階にある患者から獲得した標的配列の対比を可能と する。 ２．プローブの省略 上記に概略した一般手法は標的配列の中の注目の各ヌクレオチドを解読するた めに４つのプローブを採用している。１つのプローブ（第１プローブセット由来 ）は対照配列と完璧な対合を示し、そして他の３つのプローブ（第２，３及び４ プローブセット由来）は対照配列との誤対合を示し、且つ注目のヌクレオチドに 突然変異を抱える標的配列と完璧なる対合を示す。第２、第３及び第４プローブ セット由来の３プローブの提供は、任意の注目のヌクレオチドの３つの可能なヌ クレオチド置換のそれぞれの検出を可能にする。しかしながら、ある対照配列又 は対照配列の領域においては、一定の突然変異しか起こらない傾向にあることが 事前にわかっている。従って例えば、一部位において、対照配列におけるＡヌク レオチドはある標的配列においてＴ突然変異として存在しうるか、しかしＣ又は Ｇ突然変異としては存在していない傾向にある場合があることがわかることがあ る。従って、この対照配列のこの領域の分析のためには、第１プローブセットは 対照配列に対して完璧な相補性を示す、そして第２プローブセットは不変のＡ残 基により占拠された疑問位を有する（Ｔ突然変異の検出のため）。他の状況にお いては、対照配列における野生型ヌクレオチド及び標的配列のその２つの突然変 異の検出のための第１、第２及び第３プローブセット（第４はない）を含みうる 。あるチップにおいては、サイレント突然変異（即ち、アミノ酸配列に影響を及 ぼさないもの）を省略してよい。あるチップにおいては、対照配列の一部又は全 ての位置に対応する第１プローブ由来のプローブを省略する。かかるチップは少 なくとも２組 のプローブセットを含んで成る。第１プローブセットは複数のプローブを有する 。各プローブは、少なくとも１の疑問位を除き、対照配列のサブ配列に対してま さに相補性のセグメントを含んで成る。第２プローブセットは第１プローブセッ トの中の各プローブセットに対する対応プローブを有する。第２プローブセット の対応プローブは、第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又 は少なくとも１の疑問位（通常は１個）を含むそのサブ配列と同一であるか、た だしその少なくとも１の疑問位が、第１及び第２プローブセット由来の２つの対 応プローブそれぞれにおいて別のヌクレオチドにより占拠されていることを除く 。あるとしたならば、第３プローブセットは、第１プロープセットの各プローブ に対する対応プローブも含んで成るが、ただしそれらの対応プローブは、この少 なくとも１の疑問位において、３組のセット由来の対応プローブにおいて異なっ ている。対照配列に対する完璧な相補性を示すセグメントを有するプローブの省 略はコントロール情報、即ち、対照配列のヌクレオチドと同じ標的配列のヌクレ オチドの検出を失わせてしまう。しかしながら、第１プローブセット由来のプロ ーブを欠くチップを標的及び対照配列の両者をハイブリダイズさせることによっ て類似の情報を得ることができる。このハイブリダイゼーションは連続的に行っ てよく、又はもし標的及び対照を異なるようにラベルするなら、同時に行うこと ができる。この状況においては、突然変異の存在は、第１セット由来のプローブ と、第２，３及び４セット由来の対応プローブとのハイブリダイゼーション強度 の対比によるのではなく、対照配列のバックグランドバイブリダイゼーション強 度の、標的配列の完璧対合型ハイブリダイゼーションシグナルに至るシフトによ り検出される。 ３．野生型プローブレーン チップが前述の通り４組のプローブセットを含んで成り、そしてプローブセッ トを４本のレーン、即ちＡレーン、Ｃレーン、Ｇレーン及びＴ又はＵレーンで並 べたとき、対照配列に対する完璧な相補性を示すセグメントを有するプローブは 、４本のレーン間で行同志で異なる。これはチップ由来のデーターのコンピュー ター分析における任意の有意義な困難性を提供しない。しかしながら、チップの ハイブリダイゼーションパターンの目視検査は時折り追加のプローブレーンの提 供により助長され、それにおいては各プローブは対照配列に対する完璧な相補性 を示すセグメントを有する。図４参照のこと。このセグメントは他の４本のレー ンのプローブの１つ由来のセグメントと同一である（そのレーンは行位置に依存 する）。追加のプローブレーン（野生型レーンと呼ぶ）は全てのヌクレオチド位 置において標的配列とハイブリダイズするが、ただし対照配列からの変異が生じ た箇所を除く。野生型レーンのハイブリダイゼーションパターンは突然変異の簡 単な目視指標を提供する。 ４．欠失、挿入及び多重突然変異プローブ あるチップは、欠失突然を分析するために特別にデザインされた追加のプロー ブセットを供する。この追加のプローブセットは、上記の通り第１プローブセッ トの各プローブに対応するプローブを含んで成る。しかしながら、追加のプロー ブセット由来のプローブは第１プローブセットの対応プローブとは、疑問位を占 拠しているヌクレオチドが追加のプローブセット由来のプローブにおいて欠失し ている点で相違する。図６参照のこと。任意的に、この追加のプローブセット由 来のプローブは、第１プローブセット由来の対応プローブに対するその片方の末 端において追加のヌクレオチドをもつ。この追加のプローブセット由来のプロー ブは、第１プローブセット由来の対応プローブよりも強く、疑問位に対応するヌ クレオチドに おいて単一塩基欠失を有する標的配列に対してハイブリダイズするであろう。疑 問位のみならず、隣接ヌクレオチドもが欠失している追加のプローブセットを供 する。 同様にして、その他のチップは挿入を分析するための追加のプローブセットを 供する。例えば、１の追加のプローブセットは上記の通り第１プローブセットの 各プローブに対応するプローブを有する。しかしながら、追加のプローブセット のプローブは疑問位に隣接して挿入された追加のＴヌクレオチドを有する。図６ 参照のこと。任意的に、このプローブは、第１プローブセット由来の対応プロー ブに対するその片方の末端において１個少ないヌクレオチドを有している。この 追加のプローブセットのプローブは、第１プローブセット由来の対応プローブよ りも強く、疑問位に対応する位置の隣りにＡヌクレオチドの挿入されている標的 配列に対してハイブリダイズする。類似の疑問位の隣りにＣ，Ｇ又はＴ／Ｕヌク レオチドの挿入された追加のプローブセットを構築する。通常４組のかかるプロ ーブセット（各ヌクレオチド当り１組）を組合せて用いる。 その他のチップは、複数の近接した突然変異を有する標的配列を分析するため の追加のプローブ（多重突然変異プローブ）を供する。多重突然変異プローブは 通常上記の第１セット由来の対応プローブと同一であるが、ただし疑問位を占拠 する塩基、及び置換が対照配列において認められうるヌクレオチドに対応する１ 又は複数の追加位置を除く。多重突然変異プローブにおける１又は複数の追加の 位置は、可能な置換が起きているとき、対照配列の対応の位置を占拠するヌクレ オチドに相補性のヌクレオチドにより占拠されている。 ５．ブロックタイル貼り 一般のタイル貼り手法の説明において述べた通り、第１プローブ セットにおけるプローブは時折り複数の疑問位を有する。この状況においては、 第１プローブセットのプローブは時折り少なくとも１組、そして通常は３組の追 加のプローブセットの多重グループと対合する。図７参照のこと。３組の追加の プローブセットを任意の１つの位置において３つの可能なヌクレオチド置換の検 出を可能とするように利用する。一定のタイプの置換のみが起こる傾向にある場 合（例えばトランジション）、１又は２組の追加のプローブセットのみが必要と される（基礎的なタイル貼り手法におけるプロープの利用と類似）。グループが ３組の追加のプローブセットを含んで成る状況を例示するには、第１のかかるグ ループは第２、第３及び第４プローブセットを含んで成り、それぞれは第１プロ ーブセットの各プローブに対応するプローブを有する。第２、第３及び第４プロ ーブセット由来の対応プローブは第１セットの対応プローブとは、最初の疑問位 において相違する。即ち、第１、第２、第３及び第４プローブセット由来の対応 プローブからの相対ハイブリダイゼーションシグナルは、標的配列の中の第１疑 問位に対応するヌクレオチドの同一性を示唆する。第２グループの３組のプロー ブセット（第５、第６及び第７プローブセットと呼ぶ）もそれぞれ、第１プロー ブセットの各プローブに対応するプローブを有する。これらの対応プローブは第 １プローブセットにおけるものとは第２疑問位において相違する。第１、第５、 第６及び第７プローブセット由来の対応プローブからの相対ハイブリダイゼーシ ョンシグナルは、標的配列における第２疑問位に対応するヌクレオチドの同一性 を示唆する。前述の通り、第１プローブセットのプローブは往々にして７個以上 の疑問位を有する。７つの疑問位があるとき、７グループの３組の追加のプロー ブセットがあり、３組のプローブセットの各グループは７つの疑問位の１つに対 応するヌクレオチドの同定を担う。 プローブの各ブロックは短い標的配列領域の解読を可能とする。例えば、７つ の疑問位をもつプローブのブロックについては、標的配列の７個のヌクレオチド を解読できる。むろん、チップは、標的のどれぐらいの数のヌクレオチドを注目 するかに応じて、任意の数のブロックを含みうる。各ブロックについてのハイブ リダイゼーションシグナルは任意の他のブロックと独立して分析できる。このブ ロックタイル貼り手法はその他のタイル貼り手段とも組合せてよく、この場合同 一の対照配列の異なる部分を異なる手法によりタイル貼りしてよい。 ブロックタイル貼り手法は、第１セットの各プローブが単一の疑問位をもつ基 礎的な手法よりも２点の利点を供する。第１の利点は、同一の配列情報がより少 ない数のプローブから獲得できることにある。第２の利点は、ブロックを構成す る各プローブ（即ち、第１プローブセット由来のプローブ及びその他のプローブ セットのそれぞれに由来する対応プローブ）が同じ３′及び５′配列を有し、そ の変異が疑問位を含む中央セグメントに限定されることにある。種々のプローブ 間での３′配列の同一性は、チップ上でのプローブの固相合成のための手法を簡 単にし、そしてチップ上の種々のプローブの一層均等な付着をもたらし、これに より、換言すれば、チップ上の種々の領域についてのシグナル、対、ノイズ比の 均一性が高まる。第３の利点は、ブロック内で一層多大なシグナル均一質が達せ られることにある。 ６．多重タイル貼り 上記のブロックタイル貼り手法において、標的又は対照配列の１つのヌクレオ チドの同一性は、完璧な対合を示すセグメントを有する１のプローブのハイブリ ダイゼーションパターンを、単一塩基誤対合を示すその他のプローブ（通常は３ つの他のプローブ）のそれ との対比により決定する。多重タイル貼りにおいては、対照又は標的配列の少な くとも２つのヌクレオチドの同一性は、４つのプローブのハイブリダイゼーショ ンシグナル強度の対比により決定し、そのうちの２つは対照配列に対して完璧な 相補性又は単一塩基誤対合を示すセグメントを有し、そしてそのうちの２つはセ グメントに対して完璧な相補性又は二重塩基誤対合を示すセグメントを有する。 ハイブリダイゼーションパターンを対比させ合う４つのプローブはそれぞれ、２ つの疑問位を除いて対照配列にまさに相補性であるセグメントを有し、そのセグ メントは対照配列と相補性であってもなくてもよい。疑問位は対照又は標的配列 のヌクレオチドに対応し、それらは強度の対比により決定される。４つのプロー ブの疑問位を占拠するヌクレオチドは以下の規則に従って選ぶ。第１疑問位は、 ４つのプローブそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠される。この第 ２疑問位も４つのプローブそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠され る。４つのプローブのうちの第１及び第２プローブと呼ぶ２つにおいて、そのセ グメントは２つの疑問位の多くて片方を除き、対照配列とまさに相補性である。 換言すれば、疑問位の１つは、対照配列由来の対応ヌクレオチドに相補性のヌク レオチドにより占拠され、そして他方の疑問位はそのように占拠されていてもい なくてもよい。４つのプローブのうちの第３及び第４プローブと呼ぶ他の２つに おいては、このセグメントは対照配列とまさに相補性であるか、ただし両方の疑 問位が、対照配列の関連の対応ヌクレオチドに相補性でないヌクレオチドにより 占拠されていることを除く。 これらの条件を満たすのに、２つの疑問位に対応する対照配列の２つのヌクレ オチドが同一であるか異なるかに依存して、様々な方法がある。もしこれら２つ のヌクレオチドが対照配列において異な るなら（３／４の可能性）、その条件は、２つの疑問位がそれぞれ任意の所定の プローブにおいて同一のヌクレオチドにより占拠されていることにより満たされ る。例えば、第１プローブにおいて、２つの疑問位が共にＡであり、第２プロー ブにおいて共にＣであり、第３プローブにおいてそれぞれＧであり、そして第４ プローブにおいてそれぞれＴ又はＵであってよい。２つの疑問位に対応する対照 配列の２つのヌクレオチドが異なるなら、上記の条件は、４つのプローブのどれ かの疑問位それぞれが相補性ヌクレオチドにより占拠されていることにより満た される。例えば、第１プローブにおいて、疑問位はＡ及びＴにより占拠され、第 ２プローブにおいてＣ及びＧ、第３プローブにおいてＧ及びＣ、そして第４プロ ーブにおいてＴ及びＡにより占拠されていてよい。図８参照のこと。 ４つのプローブを、対照配列と同一であるか、又は対照配列とは疑問位の１（ 両方でない）において相違する標的にハイブリダイズさせたとき、４つのプロー ブのうちの２つは標的と二重誤対合を示し、そして２つのプローブは単一誤対合 を示す。このような異なる度合いの誤対合を示すプローブの同一性は様々なハイ ブリダイゼーションシグナルより決定できる。様々な度合いの誤対合を示すプロ ーブの同一性から、標的配列の疑問位双方を占拠するヌクレオチドが推定できる 。 便宜上、多重手法は、対照配列の中に２つの注目ヌクレオチドがあり、そして アレーの中に４つのプローブのみがある状況で最初に説明した。むろん、この手 法は、追加のプローブを利用することによって標的配列の中の任意の数のヌクレ オチドを分析することに及びうる。一の変異法において、各疑問位の組は固有の ４つのプローブグループから解読する。ブロック変法において、４つのプローブ の個々のグループは対照配列に相補性の同一のセグメントを示すが 、疑問位はブロック内で移動する。このブロック及び標準タイル貼り変法はむろ ん対照配列の様々な領域のために組合せて用いてよい。一方又は双方の変法を、 任意の記載のその他のタイル貼り手法と組合せし用いてもよい。 ７．ヘルパー突然変異 しばしば対照配列の小さな領域はプローブのアニーリングの結果低いハイブリ ダイゼーションシグナルを供する。自己アニーリングは標的に対するハイブリダ イゼーションに効率的に有効な量のプローブを少なくしてしまう。かかる標的領 域は一般に小さく、そしてハイブリダイゼーションシグナルの低下は通常この領 域の配列を実質的に妨害するほどではないが、この概念はヘルパー突然変異を組 込んだプローブの利用により回避されうる。ヘルパー突然変異はプローブ内の内 部相補性領域の崩壊を担い、それ故アニーニングを防ぐ。通常、１又は２つのヘ ルパー突然変異がこの目的にとってかなり十分である。ヘルパー突然変異の組込 みは上記の任意のタイル貼り手法に有利でありうる。一般に、特定の疑問位を有 する各プローブは同一のヘルパー突然変異を有する。即ち、かかるプローブは、 対照配列と完璧な相補性を示す共通のセグメントを有するが、ただしこのセグメ ントは少なくとも１のヘルパー突然変異を有し（各プローブにおいて同一）、そ して少なくとも１の疑問位を有する（全てのプローブで異なる）。例えば、基礎 的タイル貼り手法において、第１プローブセット由来のプローブは、疑問位を含 み、且つ１又は２つのヘルパー突然変異を除いて対照配列と完璧な相補性を示す セグメントを含んで成る。第２、第３及び第４でプローブセット由来の対応プロ ーブは通常、疑問位を占拠している塩基がプローブ毎に異なることを除き、同じ セグメント（又は時折り、ヘルパー突然変異及び疑問位を含むそのサブ配列）を 含んで成る。 通常、ヘルパー突然変異タイル貼り手法は上記のタイル貼り手法のいづれかと 一緒に利用する。ヘルパー突然変異を含むプローブは、それがなければ低いハイ ブリダイゼーションシグナルを供する（自己相補性のため）対照配列の領域をタ イル貼りするのに用い、そして他のタイル貼り手法は介在領域をタイル貼りする のに用いる。 ８．プール手法 プール手法も固定化プローブのアレーを採用する。プローブをアレーのセルに 固定化し、そして各セルのハイブリダイゼーションシグナルを任意のその他のセ ルと独立に決定することができる。特定のセルはプローブの混合プールにより占 拠されうる。この混合物中の各プローブの同一性はわかっているが、プールの中 の個々のプロールは個別にアドレス可能でない。即ち、セル由来のハイブリダイ ゼーションシグナルは、セルを占拠する種々のプローブのそれの総合である。一 般に、セルは、このセルを占拠する少なくとも１のプローブが標的配列に対する 完璧な相補性を示すセグメントを含んで成るなら、標的配列に対してハイブリダ イズすると評価する。 標準のタイル貼りに勝るプール化手法の強められた力を示す簡単な手法は、単 一のプール化位置を有するプールプローブをそれぞれが含む３つのセルを作り上 げることであり、ここでのこのプール位置はプールプローブそれぞれにおいて同 一である。プール位置において、２つの可能なヌクレオチドがあり、プールプロ ーブが２つの標的配列にハイブリダイズすることを可能にする。タイル貼りの用 語において、各プールのプール位置は疑問位に相当する。明らかとなる通り、３ つのセル由来のプールプローブのハイブリダイゼーション強度の対比は、疑問位 に対応する標的配列におけるヌクレオチドの同一性を示す（即ち、標的配列とプ ールプローブとを相補性について最大限に整合させたときに疑問位と対合するヌ クレオチド） 。 これら３つのセルは、プール位置を除き標的に完璧に相補性である指定のプロ ーブのプールであり、その位置は各プローブにおいて、以下の通り、異なるプー ルヌクレオチドにより占拠されている： ３つのプールにより、４通りの可能な単一塩基対状態（野生型及び３つの突然 変異）全てが検出される。プールは、そのプール内に含まれている一部のプロー ブが標的に対して相補性であるなら、その標的にハイブリダイズする。 オリゴヌクレオチドのペアー（１又は複数）を含むセルは、セルの中の任意の オリゴヌクレオチドに相補性の標的が存在しているとき、ライトアップする。単 独の手法を利用すると、４つの可能な標的（野生型及び突然変異体）のそれぞれ は３つのセルで固有のハイブリダイゼーションパターンを生み出す。 プローブのプール疑問位に対応する標的配列においてそれぞれ可能なヌクレオ チドについて種々のハイブリダイゼーションプールパターンが得られるため、ヌ クレオチドの同一性はプールのハイブリダイゼーションパターンから決定できる 。標準のタイル貼り手法は一の位置での可能な単一塩基置換を検出及び同定する ために４のセルを必要とするのに対し、この簡単なプール手法は３つのセルのみ を必要とする。 配列分析のためのより効率的なプール手法は「格子」手法である。この手法に おいては、各プールプローブは、３つのプール位置を除き、対照配列と完璧に相 補性のセグメントを有する。１のプール位置はＮプールである。３つのプール位 置はプローブにおいて連続していてもしていなくてもよい。他の２つのプール位 置は（１）Ｍ又はＫ，（２）Ｒ又はＹ及び（３）Ｗ又はＳより成る３つのプール グループから選ばれ、ここでこの１文字はIUPAC標準不明瞭コードである。プー ルプローブの配列はそれ故、形態XXXN［（Ｍ／Ｋ）又は（Ｒ／Ｙ）又は（Ｗ／Ｓ ）］［（Ｍ／Ｋ）又は（Ｒ／Ｙ）又は（Ｗ／Ｓ）］XXXXXであり、ここでXXXは対 照配列に対して相補性の塩基を示す。この３つのプール位置は任意の順序であっ てよく、そして連続しているか、又は介在ヌクレオチドにより分割されていてよ い。［（Ｍ／Ｋ）又は（Ｒ／Ｙ）又は（Ｗ／Ｓ）］により占拠されている２つの 位置に関し、２通りの選択をせねばならない。第１に、以下の３対のプールヌク レオチドの１つの選択せねばならない：（１）Ｍ／Ｋ，（２）Ｒ／Ｙ及び（３） Ｗ／Ｓ。選定した３つのプールヌクレオチドの１つは同一であるか、又は２つの プール位置において異なっていてよい。第２に、例えば１の位置においてＭ／Ｋ を選定したとすると、Ｍ又はＫの間で選定せねばならない。この選定はプローブ と対照配列とを最大限に整合させたとき、対照配列 の対応ヌクレオチドを相補するヌクレオチドを含んで成るプールヌクレオチドの 選定をもたらすべきである。同じ原理がＲとＹ、及びＷとＳの選定を支配する。 格子プールプローブは４通りの可能性を有する１のプール位置、及びそれぞれが ２通りの可能性を有する２のプール位置を有する。即ち、格子プールプローブは 16（４×２×２）プローブの混合物を含んで成る。各プール位置は対照配列由来 の対応ヌクレオチドを相補する１のヌクレオチドを含むため、これら16のプロー ブの１つは対照配列のまさに相補体であるセグメントを有する。対照配列と同一 の標的配列（即ち野生型標的）は各プローブセルに対するハイブリダイゼーショ ンシグナルを供する。ここで、他のタイル貼り法と同じように、相補性のセグメ ントは、対照配列の変異体との関係での対照配列に対するプールプローブの特異 的なハイブリダイゼーションを可能とするに足りる長さであるべきである。一般 に、相補性のセグメントは約９〜21ヌクレオチドである。 標的配列は、それぞれが上記の構造を有している３つのプールプローブでのハ イブリダイゼーション強度を対比させることにより分析する。この３つのプール プローブに存在する対照配列に対して相補性のセグメントは多少の重複を示す。 時折り、このセグメントは同一である（疑問位以外で）。しかしながら、これは 必須ではない。例えば、これらのセグメントは１のヌクレオチドづつずらして対 照配列にわたってタイル貼りしてよい（即ち、１のプールプローブは隣りとは、 ５′末端での１のヌクレオチドの獲得及び３′末端でのヌクレオチドの欠落によ り相違する）、この３つの疑問位は各プールプローブ内（即ち、プローブの末端 から離れて）の同一の相対位置にあってもなくてもよい。必要なことは、３つの プールプローブのそれぞれに由来する３つの疑問位の１つが対照配列の同一のヌ クレオチドと整合すること、及びこの疑問位が３つのプローブそれぞれにおいて 異なるプールヌクレオチドにより占拠されていることである。３のプローブの１ つにおいて、疑問位はＮにより占拠されている。他の２つのプールプローブにお いては、その疑問位は（Ｍ／Ｋ）又は（Ｒ／Ｙ）又は（Ｗ／Ｓ）のいづれかによ り占拠されている。 格子手法の最も簡単な方式においては、対照配列の単一のヌクレオチドを分析 するのに３つのプールプローブを使用する。より多くのプールプローブをアレー に含ませたとき、プローブのはるかに大きい経済性が達成される。例えば、上記 の一般構造をそれぞれが有する５つのプールプローブのアレーを考える。これら のプールプローブのうちの３つは対照配列の同一のヌクレオチドと整合する疑問 位を有し、従ってこのヌクレオチドを解読するのに用いる。３つのプローブの別 の組合せは、対照配列の異なるヌクレオチドと整合する疑問位を有する。これら の３つのプローブの強度の対比はその次のヌクレオチドの分析を可能にする。５ つのセット由来の３つのプールプローブの更なる他の組合せは、対照配列の３つ のヌクレオチドと整合する疑問位を有し、従ってこのヌクレオチドを分析するの に用いる。即ち、対照配列の３つのヌクレオチドはわずか５つのプールプローブ から完全に分析される。対比により、基礎的タイル貼り手法は類似の分析のため に12のプローブを必要とする。 例えば、格子手法による標的配列の分析のためのプールプローブを以下に示す ： このプールプローブは事実上16の個別のプローブを含んで成る： この格子手法は少なくとも３つのセルを有するプローブのアレーを採用し、そ れぞれは上記のプールプローブにより占拠されている。 １の位置が対照配列に対する任意の単一塩基置換を含みうる標的配列を分析す るために３つのかかるプールプローブを利用することを考える（即ち、区別する のに４通りの可能性のある標的配列がある）。３つのセルは、標的配列の可能な 置換の位置に対応するプール疑問位を有するプールプローブにより占拠される（ １のセルは「Ｎ」、１のセルは「Ｍ」又は「Ｋ」のいづれか、そして１のセルは 「Ｒ」又は「Ｙ」）。疑問位はヌクレオチドとは、プローブと標的配列とを相補 性を最大限とするように整合させたときにその疑問位がそのヌクレオチドの隣り と整合するとき、対応する。各プールプローブのそれぞれは２つの他のプール位 置を有するか、これらの位置は本例示とは関係ないことに注目すべきである。こ れらの位置は標的配列の複数の位置が解読されるときにのみ関連し、後に考慮す べき状況である。本目的のため、疑問位に「Ｎ」を有するセルは野生型配列と標 的配列の３つの単一塩基置換のいづれかとをライトアップする。疑問位にＭ／Ｋ を有するセルは野生型配列と１番目の単 一塩基置換とをライトアップする。疑問位にＲ／Ｙを有するセルは、野生型配列 と２番目の単一塩基置換をライトアップする。即ち、４つの可能な標的配列は４ 通りの異なるパターンで３つのプローブプールとハイブリダイズし、そして４通 りの可能な標的配列が区別されうる。 更なる説明のため、４通りの可能な標的配列（単一の位置で異なる）及び３つ のプール位置Ｎ，Ｋ及びＹを有するプールプローブ（ここでＹ位が疑問位）（即 ち、標的配列の可変位と整合）を考慮する： ４通りの可能な標的配列にハイブリダイズするプールプローブの16種の個別の 構成要素プローブは下記の通りである： プールプローブはその構成要素プローブの凝集に従ってハイブリダイズする： 即ち、前述の通り、疑問位においてｙを有するプールプローブは野生型標的及 び突然変異体のいづれかとハイブリダイズすることがわかる。類似の表を、疑問 位にその他のプールヌクレオチドを有するプローブプールのハイブリダイゼーシ ョンパターンを例示するために記す。 標的配列の単一塩基を分析するのにプールプローブを用いる上記の手法は任意 の数の塩基を分析するのに容易に広げることができる。この点で、各プローブ内 に３つのプローブ位置を含ませる目的が明らかとなろう。以上の実施例において 、10のプローブプール（それぞれ３つのプールプローブ位置を含む）を、標的配 列の８つのヌクレオチドの連続配列のそれぞれを分析するのに用いてよい。 本実施例において、種々のプールプローブを対照配列に沿ってタイル貼りし、 各プールプローブは１個のヌクレオチドのずれにより隣りのものと相違する。対 照配列の解読可能ヌクレオチドのそれぞれについて、解読可能なヌクレオチドと 整合したプール疑問位を有する３つのプローブプールがある。例えば、対照配列 の左側から12 番目のヌクレオチドは、プールプローブ８，９及び10のプール疑問位と整合する 。３つのプールプローブのハイブリダイゼーション強度の対比は、標的配列の12 位を占拠するヌクレオチドの同一性を示す。 実施例の強度： 従って、例えば、プール８，９及び10が全てライトアップすると、標的配列が 野生型であることがわかる。もしプール９及び10がライトアップすると、標的配 列は12位にＣ突然変異を有することとなる。プール８及び10がライトアップする と、標的配列は12位にＧ突然変異を有することとなる。プール10のみがライトア ップすると、標的配列は12位にｔ突然変異を有することとなる。 標的配列のその他のヌクレオチドの同一性は他の３つのプールプローブセット の対比により決定される。例えば、標的配列の13番目のヌクレオチドの同一性は 、９，10及び11と表示してプローブプールのハイブリダイゼーションパターンを 対比させることにより決定する。同様に、標的配列の14番目のヌクレオチドの同 一性は、10，11及び12と表示したプローブプールのハイブリダイゼーションパタ ーンを対比させることにより決定する。 上記の実施例において、逐次プローブ１個のヌクレオチドのずれにおいて対照 配列に沿ってタイル貼りされ、そして各プローブはプローブの末端に対して各プ ローブにおける同一の位置を占拠する３つの疑問位を有する（即ち、３′末端に 対して７，８及び 番目の位置）。しかしながら、格子手法は、プローブを１つ ずつずらしてタイル貼りすること、又は疑問位が各プローブの同一の位置にある ことを必要としない。「ループ」タイル貼りと呼ぶ格子タイル貼りの変法におい ては、標的配列の注目のヌクレオチドはプールプローブの対比により解読され、 それぞれは注目のヌクレオチドに対応するプール疑問位を有するが、しかしそれ においてはプローブの疑問位の間隔はプローブ間で異なる。ブロックタイル貼り 手法に類似して、これは疑問位を除き同一であるプローブの回収より標的配列か ら複数のヌクレオチドを解読することを可能にする。プローブの配列同一性、特 にその３′末端での同一性は、アレーの合成を簡単にし、そしてセル当りのより 均質なプローブ密度をもたらす。 ループ手法を例示するため、（３′末端から）４，５，６，７及び８番目のヌ クレオチドを解読すべき対照配列を考える。これらの位置それぞれにおいて４通 りの可能なヌクレオチドは全て５つのプールプローブのハイブリダイゼーション 強度の対比から解読できる。プローブのプール位置は異なることに注目すべきで ある（例えばプローブ55において、プール位置は４，５，及び６であり、そして プローブ56においては、５，６，及び７である）。 対照配列の注目の各位置は、対照配列の注目のヌクレオチドと整 合する疑問位を有する３つのプローブプールのハイブリダイゼーション強度を対 比することにより解読される。例えば、対照配列の４番目のヌクレオチドを解読 するため、プローブ55，58及び59は４番目の位置においてのプールを供する。同 様に、対照配列の５番目のヌクレオチドを解読するため、プローブ55，56及び59 は５番目の位置においてのプールを供する。上記の格子手法と同様に、対比する ３つのプローブのうちの１つはプール位置にＮを有し、そして他の２つはＭ又は Ｋ、及び（２）Ｒ又はＹ、及び（３）Ｗ又はＳを有する。 対照配列の５つの位置にある各可能性のあるヌクレオチド置換を示す標的配列 に対する５つのプールプローブのハイブリダイゼーションパターンを以下に示す 。各可能性のある置換は３つのプールプローブにおいて固有のハイブリダイゼー ションパターンをもたらし、そしてその位置のヌクレオチドの同一性はハイブリ ダイゼーションパターンから推定できる。 ループ及び格子タイル貼りにおいて多くの変更を施すことができる。必要なの は、配列の各位置が、「Ｎ」を有するプローブ、Ｒ／Ｙ，Ｍ／Ｋ又はＷ／Ｓのい づれかを含むプローブ、並びにそのセットとは異なるプールを含み、その位置に おいて野生型標的に相補性のプローブ、及びその位置にプールを全くもたない少 なくとも１つのプローブを有さねばならないことである。この組合せはその位置 の全ての突然変異が固有に検出及び同定されることを可能にする。 プールプローブを含む更なるクラスの手法はコード手法と呼ぶ。この手法は、 いくつかの番号のセットから対照配列の変異体にコード文字を割り当てる。変異 体の任意の番号がコード化されうる。この変異体は複数の近接置換、欠失又は挿 入を含みうる。各変異体に割り当てる表示文字又はその他の記号は任意の順序の あらゆる任意の番号セットであってよい。例えば、往々にして二進法コードを利 用するが、その他の基数のコードが全体的に可能である。番号は往々にて、各変 異体が、少なくとも１つのアラビア数字及びそのアラビア数字について少なくと も１つの０以外の値を有する表示をもつように割り当てる。例えば、二進法にお いて、101の番号を割り当てられた変異体は、３つのアラビア数字と、各アラビ ア数字についての０以外の２つの可能な値を表示をもつ。 変異体の表示は、変異体に割り当てられた番号における各アラビア数字の０以 外の値それぞれのプールプローブを含んで成るプールプローブアレーへとコード する。例えば、変異体に基数ｍの番号系の連続番号が割り当てられ、そして変異 体に割り当てた最も大きい数字がｎのアラビア数字であるとき、そのアレーは約 ｎ×（ｍ−１）のプールプローブを有するであろう。一般にlogm（３Ｎ＋１）の プローブが、それぞれ３通りの可能な突然変異置換を有する対照配列のＮ位の変 異体全てを分析するのに必要とされる。例えば、10塩 基対の配列は二進法コード系を用いることで５つのみのプールプローブにより分 析できうる。各プールプローブは、プールする所定の位置を除き、対照配列にま さに相補性のセグメントを有する。このセグメントは対照配列の突然変異体と比 べ、対照配列に対するプールプローブの特異的なハイブリダイゼーションを可能 とするに足りる長さを有すべきである。その他のタイル貼り手法においては、９ 〜21ヌクレオチドの長さのセグメントが一般的である。往々にして、このプロー ブは９〜21ヌクレオチドのセグメント以外にヌクレオチドをもたない。このプー ル位置は、プールプローブが、特定のアラビア数字における特定の０でない値が 割り当てられた全ての変異体にハイブリダイズすることを可能とする。通常、プ ール位置は、対照配列にプールプローブがハイブリダイズすることを可能にする ヌクレオチドを更に含んで成る。即ち、野生型標的（又は対照配列）は、ライト アップしたプールプローブ全てから直ちに認識される。 標的をプールにハイブリダイスさせたとき、標的にまさに相補性であるセグメ ントを有する構成プローブを含んで成るプローブのみがライトアップする。標的 の同一性はハイブリダイズするプールのパターンが推定される。ライトアップす る各プールと特定のアラビア数字の特定の値に相関させる。即ち、各ライトアッ プするプールの総合ハイブリダイゼーションパターンは、アレーにハイブリダイ ズした標的の同一性を規定するコードにおいて各アラビア数字の値を表わす。 例えば、それぞれが３通りの可能性の突然変異により占拠された４つの位置を 有する対照配列を考える。即ち、総合すると、４×３通りの可能性のある変異体 が対照配列を構成する。各変異体には、二進法番号0001−11100が割り当てられ 、そして野生型対照配列に は二進法番号1111が割り当てられている。 第１プールプローブは、第１のアラビア数字において１を有する変異体それぞ れにまさに相補性のプローブを含ませることによりデザインする。 次いで第２、第３及び第４プローブを、第２、第３及び第４のアラビア数字に おいて１を有する変異体それぞれにハイブリダイズする構成プローブを含ませる ことによりそれぞれデザインした。 プールプローブは以下の変異標的とハイブルダイズする： ハイブリダイゼーションパターン 変異（即ち突然変異）標的の同一性はプールプローブのハイブリダイゼーショ ンパターンから直接解読される。例えば、番号0001の割り当てられた突然変異体 は、プローブ４，３，２及び１との関係でそれぞれNNNYのハイブリダイゼーショ ンパターンを示す。 上記の例において、変異体は番号系において連続番号を割り当てている。他の 態様において、番号のセットはその特性により選定してよい。もしコード文字を エラーコントロールコードから選ぶなら、そのコードの特性は配列分析を引き入 れる。エラーコードは番号系であって、一部の表示は変異体に割り当てられ、そ して他の表示がハイブリダイゼーション工程において起こりうるエラーを示すこ とを担う系である。例えば、もし全てのコード文字が０でない奇数のアラビア数 字（二進法コード＋エラー検出）を有するなら、ハイブリダイゼーションにおけ る任意の単一のエラーは偶数のプールがライトアップすることにより検出される であろう。 第５のプローブを追加して、任意の単一突然変異にハイブリダイズするプール の数を奇数にすることができる。 標的に対するプールプローブのハイブリダイゼーション ９．ブリッジング手法 標的配列の２種の独立（即ち、不連続）サブ配列に部分的に対合するプローブ は時折りこの標的配列に強力にハイブリダイズする。一定の状況において、かか るプローブは標的配列に完璧に対合する同一の長さのプローブより強いシグナル を発する。この観察は、単独の標的配列と２種以上のプローブとの同時の相互作 用に由来するものと信じられている。本発明はこの観察を、対照配列の第１及び 第２サブ配列のそれぞれに相補性である少なくとも第１及び第２セグメントを有 するプローブのアレーを提供することに利用する。任 意的に、これらのプローブは第３又はそれより多くの相補性セグメントを有しう る。これらのプローブは上記の任意の手法において採用してよい。かかるプロー ブの２つのセグメントは対照配列又は連続サブ配列のばらばらのサブ配列に対し て相補性でありうる。後者の場合、プローブの２つのセグメントは、対照配列の 相補の順序に対して逆となっている。対照配列の２つのサブ配列はそれぞれ一般 に約３〜30連続ヌクレオチドを含んで成る。対照配列のサブ配列は時折り０，１ ，２又は３塩基により隔てられている。往々にして、これらの配列は隣接し合い 、そして重複していない。 例えば、野生型プローブは、対照配列の２つのセクション（下付字及び上付字 により表示）を補い、そしてその順序を反転させることにより作り上ける。疑問 位を表示し（★）、そしてそれは野生型プローブと３つの突然変異プローブの構 造の対比から明らかとする。対照配列の対応ヌクレオチドは上付字セグメントの 「ａ」である。 予測されるハイブリダイゼーションは下記の通りである： ブリッジタイル貼りは、２つの構成セグメントの長さ及び疑問位の相対位置を 供する表記を用いて説明する。表示ｎ／ｍは、ｎ個の 塩基にわたって広がり、５′末端からｍ番目の塩基に疑問位がくるように位置し ている対照配列の領域に相補性のセグメントを表示する。もしｍがｎより大きい なら、このことは、セグメント全体が疑問位の５′側寄りにあることを示唆する 。ｍが負なら、疑問位が、セグメントの第一塩基の５′側のｍ個の塩基の絶対値 であることを示唆する（ｍは０とはならない）。多重セグメントを含んで成るプ ローブ、例えばｎ／ｍ＋ａ／ｂ＋…は、プローブの３′側に第１セグメントを、 そしてこの第１セグメントに対して５′側に付加された追加のセグメントを含ん で成る。例えば、４／８タイル貼りは（プローブの３′末端から）、４塩基相補 性セグメント、疑問位の５′側の出発７塩基、それに続く６塩基領域を有し、そ れにおいては疑問位は３番目の塩基に位置する。これら２つのセグメントの間で 、対照配列の１の塩基が省かれている。この表記により、上記のセットは５／３ ＋５／８タイル貼りである。数多くの様々なタイル貼り法がこの方法により可能 であり、なぜなら両セグメントの長さ、並びにその相対位置（それらはいづれか の順序であってよく、そしてその間にギャップがあってもよい）及び疑問位に対 するその位置を変えてよいからである。 例えば、16量体オリゴ標的を長さ10の全部で４¹⁰プローブを含むチップにハイ ブリダイズさせた。このチップは標準及びブリッジ型の双方の短いタイル貼りを 含む。標準10／５タイル貼り由来のデーターを５／３＋５／８ブリッジタイル貼 り由来のデーターと対比させる（表１参照）。プローブ強度（平均カウント／ピ クセル）を、識別比（適正プローブ強度／最大不適正プローブ強度）と共に表示 す。誤強度値は50カウント数未満とする。表示した各塩基について、ブリッジタ イル貼りは高めの識別値を有することが注目される。 ブリッジング手法は以下の利点を供する： （１）対合及び誤対合プローブ間での高い識別力； （２）ブリッジングタイル貼りにおけるより長めのプローブの利用の可能性、 それ故識別力を損うことなく、ハイブリダイゼーションの特異性を高める； （３）疑問位が標的相補性領域に対して非常に中心から外れているプローブの 利用。これは、例えば、標的の一の領域に集中するプローブが低ハイブリダイゼ ーションシグナルを供するとき、特に有利である。この低シグナルは、より高め のハイブリダイゼーションシグナルを供するような連結領域に集中するプローブ を用いることによって解決される。 （４）一定のプローブのアニーリングをもたらしうる二次構造の崩壊（先のヘ ルパー突然変異の説明を参照のこと）。 10．欠失タイル貼り 欠失タイル貼りは上記のブリッジング及びヘルパー突然変異手法の双方に関連 する。欠失手法においては、対比は、共通の欠失を共有はするが、その欠失の外 側に位置する疑問位において互いと異な り合うプローブ間で行う。例えば、第１プローブは、対照配列の関連の第１及び 第２サブ配列にそれぞれまさに相補性の第１及び第２セグメントを含んで成り、 ここでこの対照配列の第１及び第２サブ配列は短い距離（例えは１又は２ヌクレ オチド）で離れている。プローブの中の第１及び第２セグメントの順序は通常、 対照配列の中の第１及び第２サブ配列に相補性のそれと同じである。疑問位は通 常離れている。この対比は、３つのその他のプローブと行い、それらは第１プロ ーブとは疑問位を除き同一であり、その位置は各プローブで異なる： かかるタイル貼りは時折り、標的及びその他のプローブに対して相補性な疑問 位を有するプローブ間でのハイブリダイゼーション強度における優れた識別力を 供する。熱動力学的に、上記に示すプローブに対して対合及び誤対合した標的に 対するハイブリダイゼーション間の相違は、単一塩基突出及び大型の非対称性ル ープ（例えば標的のうちの２個の塩基、プローブの１つ）間での相違である。こ れは往々にして、基礎的手法において単一塩基誤対合を示すプローブとの完璧対 合プローブの対比よりも、安定性における大きな相違をもたらす。 欠失タイル貼りにより供される優れた識別力を表２により例示し、これは対照 配列の標準10／５タイル貼りと（４／８＋６／３）欠失タイル貼り由来のハイブ リダイゼーションデーターとを対比させている（分子はセグメントの長さを示し 、そして分母はセグメントの末端からの欠失の距離を示す）。プローブ強度（平 均カウント／ピクセル）は、識別比（適正プローブ強度／最大不適正プローブ強 度）と共に表示する。表示された各塩基について、タイル貼りは、 示しているいづれの標準タイル貼りよりも高い識別値を有することに注目する。 欠失又はブリッジプローブの利用はかなり一般的である。これらのプローブは 本発明のタイル貼り手法のいづれにも利用できる。優れた識別力を供するだけで なく、欠失又はブリッジング手法は自己ハイブリダイゼーションを回遊するため に一定のプローブにとって有利である（１のプローブ内でも、又は同一配列の２ つのプローブ間でも）。 Ｃ．標的サンプルの調製 配列を決定すべき標的ポリヌクレオチドは通常は組織サンプルから単離される 。標的がゲノムなら、サンプルは任意の組織に由来しうる（赤血球を除く）。例 えば、全血、末梢血液リンパ球又はPBMC、皮膚、毛髪又は精液が臨床サンプルの 好都合な起源である。血液 及びその他の体液もウィルス性核酸を単離するための好都合な起源である。標的 がmRNAなら、サンプルはmRNAが発現される組織から獲得する。サンプル中のポリ ヌクレオチドがRNAであるなら、それは通常DNAに逆転写しておく。逆転写に由来 するDNAサンプル又はcDNAは通常、例えばPCRにより増幅させる。プライマー及び 増幅用酵素の選定に依存して、増幅生成物はRNAでもDNAでもよい。ペアープライ マーは注目の標的ポリヌクレオチドの境界に隣接するように選ぶ。多重のペアー プライマーを用いる多重PCRにより複数の標的を同時に増幅させることができる 。標的は増幅中又は後に１又は複数種のヌクレオチドでラベルしてよい。一定の 標的ポリヌクレオチド（サンプルのサイズに依存して）例えばエピソームDNAに とっては、増幅工程で消費されるに足りるDNAが組織サンプルの中に存在する。 標的RNAの調製におけるように標的鎖を一本鎖形態で調製するとき、鎖のセン スはむろんチップ上のプローブのそれと相補性であるべきである。このことは、 プライマーの適切な選定により成し遂げられる。この標的は好ましくはチップへ の適用の前に断片化しておき、標的の二次構造の形成を抑制又は排除しておく。 ハイブリダイゼーションを経た標的セグメントの平均サイズは通常チップ上のプ ローブのサイズより大きい。 II．例示チップ Ａ．HIVチップ HIVは大人数に感染しており、高額な医療費をもたらしている。HIVはその感染 症を処置するのに用いられる薬剤に対して迅ちに耐性となり、主にヘテロダイマ ータンパク質(51kDa及び66kDa)HIV逆転写酵素（RT）の作用に基づいており、そ の両サブユニットは1.7kbのpoL遺伝子によりコードされる。RTタンパク質の高率 エラー（ １回当り５〜10）はHIVの超変異能に原因すると信じられている。HIV感染症の処 置のために用いられるヌクレオシド類似体、即ち、AZT，ddI，ddC及びd47は、感 染細胞の細胞質内での逐次的なリン酸化によりヌクレオチド類似体に変換され、 そこではこの類似体のウィルスDNAへの合体はウィルス複製の終結をもたらし、 その理由は５′→３′ホスホジエマテル連結が完成されなくなるためである。し かしながら、処置の約６ヶ月から１年後、又はそれより短い間で、HIVは一般にR T遺伝子を突然変異させ、類似体の合体ができなくなるようにし、そして処置に 対して耐性となるようにしてしまう。薬剤耐性に関与することで知られるいくつ かの突然変異を以下の表に示す。突然変異を介して薬剤耐性を有するウィルスが 優勢となった後、その患者は劇的に増大したウィルス負荷、悪化した症状（一般 により高頻度、且つ処置困難な感染症）及び究極的な死に悩まされるようになる 。ウィルスが耐性突然変異したら直ちに別の治療法に換えることは、患者の寿命 を延命し、生存中の病的状態を緩和する患者処置において重要な工程でありうる 。 Ｎ．Ｂ． 他の突然変異は他の薬剤に対する耐性を供与。 アンチ−HIV薬に対する第２の重要な治療剤は、HIVゲノムによりコードされる アスパルチルプロテアーゼ酵素であり、その機能は感染子孫の形成にとって必須 である。Robbins & Plattner，J．Acquired Immune Deficiency Syndromes 6，1 62-170(1993); Kozal ら、Curr．Op．Infect．Dis．7: 72-81(1994)。このプロテアーゼは、ウィルス 前駆体ポリペプチドをその活性形態にプロセシングするのに機能する。この酵素 に対して標的化した薬剤は内性ヒトプロテアーゼを損傷しなく、それ故高度の選 択毒性を達成せしめる。更に、このプロテアーゼはライフサイクルにおいて逆転 写酵素よりも後に発現され、それ故ライフサイクルでの２期でのHIVに対する組 合せ攻撃の可能性を授ける。逆転写酵素に対して標的化した薬剤と同様、プロテ アーゼへの薬剤の投与は、プロテアーゼの突然変異を介する薬剤耐性の獲得をも たらしてしまいうる。患者由来のプロテアーゼ遺伝子のモニターにより、突然変 異の発生の検出が可能となり、それ故投与する薬剤の適正な調整ができるように なる。 HIVで感染する他に、AIDS患者は往々にして一連の合併症をもたらす多種多様 なその他の感染性因子によっても感染される。往々にして、診断及び処置は困難 であり、その理由は多くの病原（いくつかは生命に脅威なものであり、その他は 日常的なものである）が類似の症状をもたらすからである。このような感染症の 一部、いわゆる日和見感染症は、通常体の中に少量で存在しているが、免疫系に より抑制されている細菌、菌類、寄生虫又はウィルス病原体により生ずる。AIDS 患者の免疫系が不良となるとき、このような通常潜伏的な病原体は増殖し、そし て猛烈な感染症を発生せしめる。かかる患者の処置において、様々な最も致死的 な一般の感染症の有無を診断する、HIVウィルスに対する最も有効な治療法を決 定する、及び患者の感染症の総合的な状態をモニターするのを同時に行うことが 所望されるであろう。 本発明は、種々の治療に対する耐性に関与するHIV遺伝子の多重突然変異を検 査するためのDNAチップを提供する。これらのDNAチップは、医師が経時的に突然 変異をモニターすること、及び耐性が 生じたときに治療を換えることを可能にする。一部のチップはAIDS患者において 一般的に認められる病原性微生物の診断のためのプローブも提供する。 対照配列として選定された配列はHIVゲノムのどこにあってもよいが、しかし 好ましくは薬剤耐性に関与する突然変異が生ずることのわかっているHIVゲノム の領域をカバーしていることが好ましい。対照配列は通常長さ約５，10，20，50 ，100，500，1,000，5,000又は10,000塩基であり、そして好ましくは長さ約100 〜1,700塩基である。一部の対照配列は、poL遺伝子によりコードされる逆転写酵 素配列の少なくとも一部を包括する。好ましくは、この対照配は逆転写酵素遺伝 子全体又はその実質的に全て（即ち、約75又は90％）を包括する。逆転写酵素は いくつかの薬剤の標的であり、そして上記の通り、そのコード配列は薬剤耐性に 係る数多く突然変異部位に該当する。あるチップにおいては、この対照配列は逆 転写酵素をコードする全領域(850bp)を含み、そして別のチップにおいては、そ のサブフラグメントを含む。あるチップにおいては、この対照配列はHIVプロテ アーゼ又はエンドヌクレアーゼをコードするpoL遺伝子のその他のサブフラグメ ントを、逆転写酵素をコードするセグメントの代わりに、又はそれと共に含む。 あるチップにおいては、この対照配列はその他のHIV遺伝子、例えばenv又はgag を、逆転写酵素遺伝子と共に、又はその代わりに含んでることもある。gag及びe nv遺伝子の一定の領域は比較的よく保存されており、そしてその検出は患者に感 染したHIVウィルスの量を同定及び定量するための手段を提供する。あるチップ においては、対照配列はHIVゲノム全体を含んで成る。 どのHIV株から対照配列が獲得されるかは重要でない。HIV株はHIV−Ｉ，HIV− II又はHIV−IIIに分類され、そしてこれらの一般 グループ分けにおいて、複数種の株及びそれぞれの多形性変異体がある。BRU，S F２，HXB2，HXB2RはHIV−Ｉ株の例であり、その配列はGenBankより入手できる。 BRU及びSF２株の逆転写酵素遺伝子は23ヌクレオチドで異なる。HXB２及びHXB2R 株は同一の逆転写酵素遺伝子配列を有しており、それはBRU株のそれとは４個の ヌクレオチドで、そしてSF２のそれとは27個のヌクレオチドで異なる。あるチッ プにおいては、この対照配列は株の野生型バージョンにおいて逆転写酵素配列と まさに対応する。その他のチップにおいては、対照配列はいくつかのHIV株の共 通配列に対応する。あるチップにおいては、対照配列はHIV株の突然変異形態に 対応する。 チップは上記のタイル貼り手法に従ってデザインする。これらのプローブはHI V対照配列のコード又は非コード鎖のいづれかに対して相補性である。もし一方 の鎖のみを解読するなら、コード鎖を解読するのが好適合である。非コード鎖に 比べてのこの鎖のＡ残基の高い率は一般により少ないあいまい配列の領域をもた らす。 一部のチップは第２対照配列に対して相補性となるようにデザインされた追加 のプローブ又はプローブグループを含む。この第２対照配列は往々にして１もし くは複数の一般に生ずるHIV突然変異又は株間変動を有する（例えば逆転写酵素 遺伝子のコドン67，70，215又は219内で）第１対照配列のサブ配列である。第２ グループの組込みは特に第１配列の短いサブ配列を分析するのに有用であり、そ れにおいては複数の突然変異がプローブの長さにつり合って短い距離内で認めら れるものと予測される（即ち、９〜21塩基内で２以上の突然変異）。 チップ上のプローブの総数はタイル貼り手法、対照配列の長さ、並びに複数の プローブ長の組込みに関連して選定した選択肢及び共通の突然変異の存在の確証 に供する第２プローブグループに依存す る。HIV逆転写酵素遺伝子のほぼ全てを解読するため(BRU株については857bp)、 基礎的な手法によりタイル貼りしたチップは少なくとも857×４＝3428プローブ を含む。 配列を決定すべき標的HIVポリヌクレオチドは通常RNAの形態で血液サンプル（ 末梢血液リンパ球又はPBMC）から単離する。このRNAはDNAへと逆転写され、そし てそのDNA生成物を増幅する。プライマー及び増幅用酵素の選定に依存して、増 幅生成物はRNAでもDNAでもよい。標的の増幅のために適当なプライマーを以下の 表に示す。 本発明の別の観点において、HIV及び一般にAIDS患者に寄生する微生物（例え ばサイトメガロウィルス(CMV)、ニューモノシスティス・カリニ（Pneunocystis carini(PCP)）、菌類(カンジダ・アルビカンス(candida albicans))、ミコバク テリア(mycobacteria))の同時検査のためのチップを提供する。非HIVウィルス病 原体を検査し、そしてその薬剤耐性をHIVと類似の手法を利用して決定する。即 ち、プローブのグループは、薬剤耐性の獲得に係ることで知られる非ウィルス性 病原のゲノムの領域由来の標的配列に対する相補性を示すようにデザインする。 例えば、往々にしてAIDS患者に同時に寄生するCMV及びHSVウィルスは、アシクロ ビルに対する耐性を獲得する突然変異を受ける。 非ウィルス病原の検査のため、これらのチップは病原体のリボソームRNA又は 対応ゲノムDNAの完全配列決定を可能にするプローブのアレーを含む。上記の同 じ原理で異なるプローブをデザインするか、ただし標的配列は病原微生物の16Ｓ RNA(又は対応のDNA)由来の可変領域とする。他方、この標的配列は複数の生成 物由来の可変16Ｓ rRNA領域の共通配列であってよい。16ＳリボソームDNA及びRN Aは全ての生物（ウィルスを除く）に存在し、そしてこのDNA又はRNAの配列は任 意の２種間の進化的遺伝距離に密接に関連している。従って、タイプがかなり近 縁な生物（例えば全てのミコバクテリア）は共通の16Ｓ DNAを共有しており、そ してこの16Ｓ rDNA以外の領域（可変領域）で相違する。これらの相違は種々の サブタイプの株の同定を可能とするように利用できる。チップから解読した16Ｓ リボソームRNA又はDNAの完全配列を、数千の公知の病原の配列のデーターベース と対比させ、AIDS患者に感染するほとんどの非ウィルス性病原を大まかにタイプ 分けする。 更なる態様において、本発明は抗生物質耐性を供する細菌遺伝子 の検査のためのプローブを含むチップを提供する。抗生物質耐性遺伝子はリバー ス・ドット・ブロット方式において採用した単一プローブへのハイブリダイゼー ションにより検査されうる。他方、プローブのグループは、抗生物質耐性遺伝子 をコードするDNA配列の全体又は一部を解読するために上記と同じ原理に従って デザインしてよい。類似のプローブグループを、その他の抗生物質耐性遺伝子配 列を解読するためにデザインする。抗生物質耐性は往々にして、AIDS患者に寄生 する以下の遺伝子のいづれかにある：rpo B(RNAポリメラーゼをコード)、kat G( カタラーゼペルオキシダーゼをコード)並びにDNAジャイレースＡ及びＢ。 単一チップ上での検査の組合せのためのプローブの組込みは、あらゆる可能性 のある病原により生じうる一定の症侯群の表示に基づいて医師が追尾する臨床診 断系統樹を刺激する。かかるチップは患者におけるHIVの存在及び力価の同定、H IV株及び薬剤耐性の同定、日和見病原の同定、並びにかかる病原の薬剤耐性の同 定を可能とする。即ち、医師は、患者に感染する病原の全スペクトル及びその最 も有効な処置が同時にわかる。典型的なHIVチップ （ａ）HV 273 HV 273チップはヌクレオチド2090と2946（HIVBRU株番号付け）の間に857塩基 のHIVアンプリコンの分析のためのオリゴヌクレオチドプローブのアレーを含む 。このチップは４グループのプローブを含む：11量体、13量体、15量体及び17量 体。上から下にかけて、HV 273チップは11量体の列、それに続く13量体の列、そ れに続く15量体の列、それに続く17量体の列により占拠されている。疑問位は、 種々のサイズのチップにおいてそれぞれヌクレオチド６，７，８及び９である。 この種々のサイズのプローブのこの配備は「系列」と なっていると呼ぶ。各サイズのグループにおいて、Ａ−レーン、Ｃ−レーン、Ｇ −レーン及びＴ−レーンのそれぞれにおいて４組のプローブセットが並んでいる 。各レーンは、2090-2946 HIV逆転写酵素対照配列において各ヌクレオチド当り １のプローブで、重複する一式のプローブを含む（即ち、レーン当り８５７プロ ーブ）。このレーンは、空であるか又はコントロールプローブにより占拠された 数行の位置も含む。これらの位置は、チップを配向する、バックグランド蛍光を 決定する及び標的内の種々のサブ配列を区切るのを担う。このチップは1.28×1. 28cmの面積を有し、その中でプローブは１30×135の行列を構成している（全部 で17,550セル）。各プローブにより占拠される面積（即ち、プローブセル）は約 98×95ミクロンである。 このチップを、HIV株SF２由来の逆転写酵素フラグメントを配列するその能力 について調べた。HIV逆転写酵素コード配列のほとんどに及んでいる831bpのRNA フラグメント（pPoL19を表示）を、Ｔ３及びＴ７プロモーター配列で標識したプ ライマーを用い、PCRにより増幅した。RT#1-73及び89-391T7と表示したプライマ ーを表４に示す；Gingerasら、J．Inf．Dis．164，1066-1074(1991)（全図のた めに全体を引用することで本明細書に組入れる）も参照のこと。RNAを蛍光ヌク レオチドの合体によりラベルした。RNAを加熱により断片化し、そして30℃で40 分かけてチップにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションシグナルを蛍 光イメージングにより定量した。 標的配列の各位置での４組のプローブセットからの最良のデーターを採用し、 821塩基のうち715が正しく解読された（87％）。（対比は、pPoL19の配列に基づ き、慣用のジデオキシ法によりSF２と同一と決定された）。一般に、より長めの サイズのプローブは、短 いプローブよりも多くの配列を生み出した。SF２及びBRU株が標的内で異なる21 の位置のうち19が適正に解読された。 標的内の多くの短いあいまいな領域は、SF２及びBRU配列が相違し合う点に隣 接している標的セグメントの中にあった。これらのあいまいさは、これらの領域 内では、ハイブリダイゼーションシグナルの対比が完璧対合及び単一塩基誤対合 との間では引き出されないが、単一誤対合プローブと２つの誤対合を有する３つ のプローブとの間では引き出されることを理由に、生じる。SF２を解読するうえ でのこれらのあいまいさは、BRU配列を単独で、又はSF２標的配列と合わせて解 読するチップの能力を損うことはない。 上記の手順の変法において、pPoL19標的をプローブにハイブリダイゼーション させた後にチップをRNaseで処理する。RNaseの添加は誤対合した標的を消化し、 それ故シグナル、対、ノイズの比を高める。RNase処理は適正に解読される塩基 の数を743／821又は90％にまで高める（４グループのプローブ由来のデーターを 組合せて）。 更なる変法において、RNA標的を、HIVゲノムの同一セグメントを含むDNA標的 と置き換える。DNAプローブは、Taqポリメラーゼ、RT#1-T3プライマー及びフル オレセインd-UTPラベルを用いて線形増幅させることにより調製する。DNAプロー ブをウラシルDNAグリコシラーゼ及び加熱処理により断片化した。アレーでのハ イブリダイゼーションパターン及び解読可能な配列の率はRNA標的を用いて得ら れたのと類似であった。しかしながら、DNA標的から解読できなかったRNA標的よ り解読できないいくつかの領域及びその逆があった。 （ｂ）HV 407チップ 407チップはHV 273チップと同じ原理に従ってデザインされてい るが、しかしいくつかの観点で異なる。第１に、このチップ上のオリゴヌクレオ チドプローブは、HIV株SF２に対する完璧な配列同一性（各プローブ上の疑問位 を除き）を示すようにデザインする（HV 273チップのケースのようにBRU株とで はなく）。第２に、この407チップは、HV 273チップ上の11量体、13量体、15量 体及び17量体ではなく13量体、15量体、17量体及び19量体（ヌクレオチド７，８ ，９及び10のそれぞれでの疑問位を除き）を含む。第３に、様々なサイズのオリ ゴマーグループを、HV 273チップ上の系統配備の代わりに、平行に並べた。この 平行配備において、このチップは上から下にかけて、13量体の列、15量体の列、 17量体の列、19量体の列、更にそれに続く13量体の列、15量体の列、17量体の列 、19量体の列、それに続く13量体の列、等々を含む。各列は４本のプローブ列、 即ちＡレーン、Ｃレーン、Ｇレーン及びＴレーンを上記の通り含む。各レーンの プローブを対照配列に沿ってタイル貼りする。HV 407チップ上のプローブのレー アウトを図10に示す。 407チップを、２つの標的pPoL19 RNA及び4MUT18 RNAを配列決定する能力につ いて個別に試べた。pPoL19はSF２逆転写酵素由来の831bpのフラグメントを含み 、これは407bp上のプローブに対する完璧な相補性を示す（むろん、各行の３つ のプローブの疑問位を除き）。4MUT18は対照配列とは標的内の31箇所の位置にお いて異なり、それには薬剤耐性の獲得に係るコドン67，70，215及び219における ５箇所の位置が含まれる。上記の通りにして標的RNAを調製し、ラベルし、そし て断片化し、そしてHV 407チップにハイブリダイズさせる。pPoL19標的のハイブ リダイゼーションパターンを図11に示す。 pPoL19及び4MUT18についてチップから解読した配列を共に図12に示す（ただし ２つの配列は別々の実験で決定した）。図の中で野生 型とラベルした配列を対照配列である。対照配列の真下の４レーンの配列はpPoL 19標的に対する４通りのサイズのプローブグループから解読した関連配列である （上から下にかけて、13量体、15量体、17量体及び19量体）。次の４レーンの配 列は4MUT18標的に対する４通りのサイズのプローブグループから解読した配列で ある（上から下にかけて、同じ順序）。普通のタイプで示している配列の領域は 、チップからあいまいに解読されうるものである。配列が正確に解読できない領 域はハイライト（強調）している。１のサイズのプローブセットから解読できな い配列の一部の領域は他のものからは解読できた。 各行位置での４通りのサイズのプローブグループからの最良の結果を採用して 、pPoL19配列の約97％の塩基及び4MUT18配列の約90％の塩基が正確に解読できた 。4MUT18と対照配列間での31のヌクレオチド相違のうち、27は適正に解読でき、 それには薬剤耐性の獲得に係る３つのヌクレオチド変化が含まれる。4MUT18配列 決定におけるあいまい領域のうち、ほとんどが4MUT18と対照配列との間での相違 点に隣接する4MUT18セグメント内に認められた。明らかに、薬剤耐性に係るHIV 逆転写酵素における共通突然変異のほとんどが、チップから解読できる配列位置 にあった（表３参照のこと）。即ち、一般に生ずる突然変異のほとんどが、単一 の対照配列に基づくプローブのアレーを含むチップにより検査できうる。 種々のサイズのプローブの配列解読の対比は、標的の種々の領域のために利用 する最適なサイズのプローブを決定するうえで有用である。単一のプローブセッ トグループ内のプローブの長さを調節する手法は、特定の標的配列を解読するの に必要な総プローブ数を最少限とする。これは以下に説明の通り、他の対照配列 (例えば病原微生物の16S RNA)に対するプローブを含ませることについてチップ に余裕のキャピシティーを残す。 HV 407チップを、種々のHIV株の混合物を検出するその能力についても試験し た。この混合物は様々な比率の２種の標的配列を含んで成る；一方は野生型SF２ 株由来の逆転写酵素遺伝子のセグメント、他方はコドン67突然変異を有するSF２ 株由来の対応セグメント。図13参照のこと。この図は突然変異が生ずるヌクレオ チドを解読するための疑問位を有するチップ上のプローブを示している。この図 の単一プローブは、疑問位を表示している記号（○）のついたチップ上の４種の プローブであり、それらは４つのプローブそれぞれにおいて異なっている。図14 は、突然変異が生ずる標的配列のヌクレオチドを解読するため、疑問位を有する ４種の13量体及び４種の15量体についての蛍光強度を示す。突然変異標的の比率 が上昇すると、野生型標的に対して完璧な相補性を示すプローブの蛍光強度は下 がり、そして突然変異配列に対して完璧な相補性を示すプローブの強度は下がる 。その他の２つのプローブの強度は顕著に変化しない。このチップは、株の混合 物を同時に分析するのに用いられることができ、そして混合物の10％ほどの少な さを構成する株は容易に検出されうる。 Ｃ．プロテアーゼチップ プロテアーゼチップは基礎的なタイル貼り手法を利用して構築した。このチッ プは、プロテアーゼコード配列由来の297のヌクレオチドを含む382ヌクレオチド スパンに沿ってタイル貼りした４種のプローブを含んで成る。対照配列は共通Cl ay-B HIVプロテアーゼ配列とした。種々のプローブ長さを対照配列の種々の領域 のタイル貼りのために使用した。プローブの長さは11，14，17及び20ヌクレオチ ドとし、疑問位は各プローブの中央又はその付近とした。長さは、多重タイル貼 りを有するチップを利用して事前ハイブリダイゼー ションデーターから最適化した。各タイル貼りは種々のプローブ長さを有する。 このチップを４種の一本鎖DNAプロテアーゼ標的配列(HXB2，SF２，NY５，pPOL 4mut18)とハイブリダイズさせた。センス及びアンチセンス鎖の両方を配列決定 した。チップ由来のデーターをABIシーケンサー由来のそれと対比させた。４種 の標的の配列決定からの総合的な精度を以下の表５に示す。 センス及びアンチセンス鎖由来のデーターを合わせ、チップ及びABIシーケン サーは共に、４種のクローン全てに由来する全配列について精度100％のデータ ーを供した。 更なる試験において、このチップを、ddI処置の最後において、４人の患者か ら獲得したウィルス単離体由来のプロテアーゼ標的配列にハイブリダイズさせた 。このチップから解読した配列を図15に示す。いくつかの突然変異（矢印で示す ）が後処置において獲得したサンプルの中に認められた。特に有意義なのは、隣 接位置にある２つの追加の突然変異（gt）の存在に関係なく、ヌクレオチド207 でのｇ／ａ突然変異を解読するチップの能力にある。 Ｂ．嚢胞性線維症チップ 数年前、ヒトの最も一般的な重症常染色体退縮性障害である嚢胞性線維症は、 その後嚢胞性トランスメンプラン・コンダクタンス・レギュレーター（CTFR）遺 伝子と命名された遺伝子の突然変異に関することが証明された。このCTFR遺伝子 はサイズが約250kbであり、27のエクソンを有する。野生型ゲノム配列は全ての エクソン系領域及びエクソン／イントロン境界にとって有用である（Zielenski ら、Genomics 10，214-228(1991)）。全長野生型cDNA配列も述べられている（Ri ordanら、Science 245，1059-1065(1989)）。400以上の突然変異が地図化されて いる（Tsuiら、Hu．Mutat．1，197-203(1992)参照のこと）。多くのより一般的 な突然変異を表６に示す。最も一般的な嚢胞性線維症突然変異はCTFRタンパク質 からアミノ酸#508を削除する３塩基欠失である。突然変異の頻度は種々の地理的 又は人種的起源集団で幅広く変動する（表６の第４欄参照のこと）。表現型に影 響を及ぼす全突然変異の約90％がコード領域に認められる。 CFTR突然変異の検査は数多くの観点で有用である。例えば、集団のスクリーニ ングは非対称性ヘテロ接合個体を同定しうる。かかる個体は、CFに苦しむ冒され た子孫を生み出す危険性を、もしその者がもう１人のかかる個体と生殖したとき 、有する。胎児の子宮内スクリーニングも２CFTR突然変異を有する胎児の同定に おいて有用である。かかる突然変異の同定は流産又は遺伝子治療の可能性を供す る。冒された子孫を産み出す危険性を有することのわかっているカップルにとっ て、診断は、着床前に少なくとも一つの野生型CFアレルを有する胎児を同定する in vitro繁殖手順と組合せてよい。生後すぐに子供をスクリーニングすることも 、欠陥遺伝子の２つのコピーを有する者を同定するのに有用である。早期検査は 適切な処置の投与を可能とし（例えばプルモザイム、抗生物質、百日咳処置）、 それ故生命力を向上させ、そしておそらくは個体の寿命を延命する。 CFTR突然変異の検査のための標的DNAの第２の起源は通常ゲノムである。成人 において、サンプルは血液又は口洗浄上皮細胞から獲得できる。胎児において、 サンプルはいく通りかの慣用技術、例えば羊水穿刺、絨毛膜絨毛採取又は胎児採 血により得られうる。出産時には、羊膜索由来の血液が有用な組織起源である。 標的DNAは通常PCRにより増幅させる。既知の突然変異部位を含むDNAのセグメ ントを増幅するためのプライマーの一部の適当ペアーを表５及び６に記載した。 その他のプライマーはCFTRの既知のゲノム及びcDNA配列から容易に設計できう る。プライマーの選択はむろん、スクリーニングする標的配列の領域に依存する 。プライマーの選択は増幅すべき鎖にも依存する。CFTR遺伝子の一部の領域につ いては、コード又は非コード鎖を使用するかによってハイブリダイゼーションシ グナルに若干の相違がある。その他の領域においては、一の鎖は、他よりも、対 合と誤対合プローブとの間でのハイブリダイゼーションシグナルのより良い識別 力を供しうる。１のペアーのPCRプライマーから増幅できうるセグメントの長さ の上限値は約50kbである。即ち、CFTR遺伝子全体又はほぼ全体にわたる突然変異 の分析のためには、いくつかのペアープライマーからいくつかのセグメントを増 幅することが往々にして所望される。種々のセグメントを多重PCRにより順次又 は同時に増幅させてよい。しばしば、15以上のCFTR遺伝子セグメントをPCRによ り同時に増幅させる。プライマー及び増幅条件はDNA標的を作るために好適に選 択する。ランダムラベリングのための蛍光ラベルdNTP及び60塩基以下の平均長に 至る標的断片化のためのdU TPを組込む非対称性ラベリング手法が好ましい。dUTP及びウラシルＮ−グリコシ ダーゼによる断片化の利用はサンプル間でのキャリーオーバーを排除する追加の 利点を有する。 CFTR遺伝子における突然変異は上記の任意のタイル貼り手法により検出できう る。このブロックタイル貼り手法は一の特に有用な手法である。この手法におい て、プローブのグループ（又はブロック）を、突然変異の部位のまわりにあるCF TR遺伝子からの短い連続ヌクレオチドセグメント（例えば３，５，７又は９）を 分析するのに用いた。グループの中のプローブは時折りブロック構成するものと 呼び、なぜならこのグループの全プローブがその疑問位を除き同一であるからで ある。上記の通り、プローブは相補体の領域に隣接する先行又は後続配列の存在 においても相違しうる。しかしながら、例示のし易さのため、かかる配列は存在 していないものと想定する。例えば、突然変異（例えば表６におけるいづれかの 突然変異）を含むCFTR遺伝子由来の５つの連続ヌクレオチドセグメントを分析す るため、プローブのブロックは通常少なくとも１の野生型プローブと、５セット の突然変異プローブ（それぞれは３プロールを有する）とを含む。この野生型プ ローブは、対照配列から分析すべき５つのヌクレオチドに対応する５つの疑問位 を有する。しかしながら、この疑問位の同一性は、野生型プローブの構造を５組 の突然変異プローブセットにおけるこのプローブのそれと対比させたときにのみ 明らかとなる。第１の突然変異プローブセットは３つのプローブを含んで成り、 それぞれは野生型プローブとは５つの疑問位を除き同一であり、その疑問位は３ つの突然変異プローブ及び野生型プローブのそれぞれにおいて相違する。第２か ら第５突然変異プローブは似たように構成されているが、ただし第２から第５疑 問位のそれぞれにおいて認められる野生型プローブとの相違を除く。実際には、 突然変異プローブの各セットは時折り関連の野生型プローブと並列させてチップ 上に並べることに注目すべきである。この状況において、ブロックは５つの野生 型プローブを含んで成り、それぞれは同一の情報を供するのに有効である。しか しながら、このチップの目視検査及び信頼性のある分析は、５つの野生型プロー ブにより提供される非常に冗長な情報により助長される。 ラベル化標的へのハイブリダイゼーションの後、相対ハイブリダイゼーション シグナルをプローブから解読する。第１突然変異プローブセットにおける３つの プローブの強度と、野生型プローブのそれとの対比は、第１疑問位に対応する標 的配列におけるヌクレオチドの同一性を表示する。第２突然変異プローブセット における３つのプローブの強度と、野生型プローブのそれとの対比は、第２疑問 位に対応する標的配列におけるヌクレオチドの同一性を表示する。まとめると、 相対ハイブリダイゼーション強度は対照配列の５連続ヌクレオチドのそれぞれの 同一性を表示する。 好適な態様において、第１グループ（又はブロック）プローブは野生型対照配 列を基礎にタイル貼りし、そして第２グループは野生型対照配列の突然変異バー ジョンを基礎にタイル貼りする。この突然変異は点突然変異、挿入もしくは欠失 、又は任意のそれらの組合せであってよい。プローブの第１及び第２グループの 組合せは、多数の標的配列をチップに同時に適用したときに分析を助長し、これ は診断すべき患者がCFTRアレルについてヘテロ接合である場合である。 上記の手法を図16に示し、それは野生型配列及びその点突然変異についてタイ ル貼りした２つのプローブグループを示している。野生型対照配列についての５ 組の突然変異プローブセットをwt１〜５と表示し、そして突然変異対照配列につ いての５組の突然変異プロ ーブをｍ１〜５と表示する。文字Ｎは疑問位を示し、それは同一のグループの次 のプローブセットにおいて１の位置でシフトしている。この図は、チップを、ヌ クレオチドｎ−２〜ｎ＋２を含んで成るホモ接合野生型標的配列（ここでｎは突 然変異部位である）とハイブリダイズさせたときに得られたハイブリダイゼーシ ョンパターンを示している。対照配列を基礎にタイル貼りしたプローブグループ については、４つのプローブをそれぞれの疑問位において対比させる。各位置に おいて、４つのプローブの１つは標的に対する完璧な対合を示し、そして他の３ つは単一塩基誤対合を示す。突然変異対照配列を基礎にタイル貼りしたプローブ グループについて、ここでも４つのプローブを各疑問位について対比させる。位 置ｎでは、１のプローブは完璧な対合を示し、そして３つのプローブは単一塩基 誤対合を示す。ホモ接合突然変異体に対するハイブリダイゼーションは類似のパ ターンを生み出すが、ただし野生型及び突然変異対照配列に基づいてタイル貼り したそれぞれのハイブリダイゼーションパターンは逆さまとなっている。このハ イブリダイゼーションパターンは、チップを突然変異アレルに関してヘテロ接合 となっている患者由来のサンプルとハイブリダイズさせるとき、非常に難しい（ 図17参照のこと）。野生型配列を基礎としてタイル貼りしたプローブグループに ついては、ｎを除く全ての位置において、１のプローブは各疑問位において完璧 な対合を示し、そして他の３つのプローブは単一塩基誤対合を示す。位置ｎでは 、２つのプローブは完璧な対合を示し（各アレルにつき１つ）、そして他の２つ のプローブは単一塩基誤対合を示す。突然変異配列に基づいてタイル貼りしたプ ローブグループについて、同じ結果が得られた。即ち、このヘテロ接合点突然変 異は、ホモ接合野生型及び突然変異形態の双方から、この２グループのプローブ からのハイブリダイゼーションパターン の同一性により、容易に区別できる。一般に、チップは複数組のプローブペアー グループを含んで成り、各ペアーは特定の突然変異の検出のためである。例えば 、一部のチップは突然変異の対応の数を検出するための５，10，20，40又は100 ペアーのプローブグループを含む。一部のチップは特定の集団に共通する全ての 突然変異を検出するためのペアープローブグループを含むようになっている（表 ６参照のこと）。チップは通常、適正なハイブリダイゼーションが行なわれ、そ して標的が適正にラベル化されたことを確証するためのコントロールプローブも 含む。 上記のタイル貼り手法の目標は、既知の突然変異の部位に隣接するCFTR領域の うちの短い領域を焦点とすることにある。その他のタイル貼り手法ははるかに大 きいCFTR遺伝子領域を分析し、従って今までに特性決定のされていない突然変異 を位置決め及び同定するのに適当である。例えば、全ゲノムCFTR遺伝子(250kb) は約100万プローブのアレー由来の基礎的なタイル貼り手法によりタイル貼りで きうる。かかるプローブアレーの合成及びスキャンは全体的に可能である。その 他のタイル貼り手法、例えばブロックタイル貼り、多重タイル貼り又はプールは 、より少ないプローブにより全遺伝子をカバーできる。いくつかのタイル貼り手 法はCFTR遺伝子の一部又は全体、例えばcDNAコード配列又は個々のエクソンを分 析する。エクソン10と11の分析は特に情報性であり、なぜならこれらはΔF508突 然変異を含む数多くの共通突然変異の位置であるからである。 典型的なCFTR遺伝子 １の例示的なチップは、356μｍ要素ｘが36×36アレーで並んだ、CFTR遺伝子 のエクソン10の全長をカバーする1296プローブのアレーを有する。このアレーの プローブは任意の長さ、好ましくは10〜18残基の範囲の長さを有してよく、そし て任意の単一塩基置換、及 び192塩基エクソン内のΔF508として知られる３塩基欠失を含む任意の欠失を検 出及び配列決定するために用いることができる。以下に詳細の通り、フルオレセ インでラベルした＋１モル濃度の野生型及びΔF508オリゴヌクレオチド標的核酸 のこれらのアレーに対するハイブリダイゼーションは非常に特異的なシグナルを 生成し（同焦点走査蛍光顕微鏡により検出）、これはホモ接合及びヘテロ接合の 両ケースにおいて、突然変異及び野生型標的配列間での識別を可能にする。 10〜18塩基の範囲の選定の長さにあり、且つ既知の野生型CFTR配列のサブ配列 に相補性であるプローブのセットを、エクソン10の５′側上のイントロンの数塩 基の位置から出発し、３′側のイントロンの数塩基で終えるようにして、合成す る。この遺伝子の一定のセグメントのそれぞれ可能なサブ配列についてのプロー ブがあり、そしてこれらのプローブをレーンへと編制する。このレーンは、チッ プの左上の角から右下の角に至るまでの移動が、遺伝子セグメントの５′末端か ら塩基毎の移動に対応するようにする。このプローブセットを含むレーンは、上 記した通り、「野生型レーン」と呼ぶ。 野生型レーンと異なり、置換レーン、いわゆる「Ａ−レーン」をチップ上に合 成する。Ａ−レーンプローブは隣接（対応のすぐ下流）野生型プローブと配列同 一性であるが、しかし野生型プローブの配列と関係なく、位置７（３′末端から 数えて）にdA残基を含む。同様に、置換塩基dC，dG及びdTを有する置換レーンを チップ上に「Ｃ−レーン」、「Ｇ−レーン」及び「Ｔ−レーン」のそれぞれとし て載せる。チップ上の６番目のレーンは、野生型レーンにおけるものと同一のプ ローブより成るが、ただし７位の塩基が欠失していること及びその位置において この遺伝子に相補性な塩基の５′末端への付加によりもとのプローブの長さに復 帰していることを除く。 ４つの置換レーンは、標的が様々なレーンにおけるどのプローブにハイブリダ イズしたかによる相対強度から、標的エクソン10核酸の配列の推定を可能とする 。かかるエクソン10 DNAチップの様々なバージョンを、上記の通りにして、長さ 15塩基のプローブ、並びに長さ10，14及び18塩基のプローブを有するチップとし て作り上げる。以下の結果に関し、プローブは長さ15塩基であり、そして置換の 位置は３′末端から７位である。 いくつかの重要なプローブの配列を以下に示す。各ケースにおいて、文字「Ｘ 」は一定の行のセットの疑問位を示し、従って、各配列は、「Ｘ」の代わりとし てそれぞれＡ，Ｃ，Ｇ及びＴを有することで、事実上４種のプローブを意味して いる。各プローブの５′末端から５個の塩基を除去することによって以下に示す セットから誘導したより短いプローブのセット及び各プローブの５′末端にエク ソン10配列由来の３個までの塩基を追加することによってこのセットから作った より長いプローブのセットも有用であり、且つ本発明により提供する。 野生型からのΔF508突然変異を識別するためのチップの能力を証明するため、 ２種の核酸標的／核酸配列を作っておいた。ΔF508突然変異をその中心に含む３ つの塩基を有するCFTR遺伝子のエクソン 10のサブ配列に相補性の最初の39量体を「野生型」又はwt508標的と呼び、エク ソンの111〜149位に対応し、そして以下の配列を有する： 同じ３つの塩基を除くことによりこの野生型標的から誘導した第２の36量体プ ローブは「突然変異」標的又はmu508標的と呼び、そして以下に示す配列を有す る。最初のは欠失塩基を示すダッシュを有し、次のはダッシュを有さないが、下 線の付した１の塩基を有する（以下の通り、Ｔ−レーンプローブにより欠失した 塩基を表示）： ３つの独立の実験において、野生型標的、突然変異標的及び両標的の等モル混 合物をCFチップに曝露する（それぞれ、核酸ハイブリダイゼーションに適合する 溶液中の0.1nMのwt508，0.1nMのmu508及び0.1nMのwt508＋0.1nMのmu508）。この ハイブリダイゼーション混合物を室温で一夜インキュベートし、次いでこのチッ プをリーダーでスキャンした（光子カウンティングモードで同焦点蛍光顕微鏡） ；チップのイメージは、標的溶液と接触させながら、いく段階かの連続的に高ま る温度で構築した（光子カウントから）。各温度変更の後、チップはスキャンす る前に約30分間平衡にしておいた。各セットのスキャンの後、このチップを変性 溶媒及び条件に曝露してこのチップを洗浄し、即ち結合した標的を除去し、これ により次の実験が清浄なチップで行えるようにした。 実験の結果を図18，19，20及び21に示す。図18のパネルＡ，Ｂ及びＣは、CFTR エクソン10プローブを含むDNAチップの領域から作ったイメージを示す；パネル Ａにおいて、このチップは野生型標的と ハイブリダイズさせている；パネルＣにおいては、このチップは野生型及び突然 変異標的の混合物にハイブリダイズさせている。図19のシート１〜３は、図３の パネルＡ，Ｂ及びＣに対応して、蛍光強度、対、タイル貼り位置のグラフを示す 。水平軸上のラベルは、関連のプローブの置換位に対応している野生型配列の塩 基を示す。プロットしているのは、野生型プローブを含む特徴（又は合成部位） 、最大に標的に結合した置換プローブを含む特徴（「判定」）、及び全ての置換 プローブのうち２番目に強い強度で標的に結合した置換プローブを含む特徴（「 ２番目」）から観察された強度である。 これらの図は、野生型標的及び等モル量の標的混合物に関し、対応の野生型プ ローブと同一のヌクレオチド配列を有する置換プローブが最も標的に結合し、曲 線上の点付近の文字により示している通り標的配列のあいまいな割り当てを可能 とすることを示している。従って、ハイブリダイゼーションの強さがプローブ間 で異なるとはいえ、標的wt508はチップの野生型レーンのブローブにハイブリダ イズし、おそらくは融点の相違に基づく。これにより標的のほとんどの配列が、 置換プローブのレーンのハイブリダイゼーションパターンからの推測により、チ ップから直接解読できるようになる（もし標的がＡ−レーンにおいてプローブと 最も強くハイブリダイズするなら、この標的は置換位置にＴを有することが推測 される、等々）。 突然変異標的のため、この配列は欠失の３′側で同様に判断されうる。しかし ながら、結合強度は、置換の位置が標的の３′末端から欠失部位に近づくにつれ て急降下し、従って置換の位置が欠失の３′末端にあるＴに対応する野生型プロ ーブに基づく結合強度はバックグランドに非常に近かった。そのパターンに従う と、置換の位置が欠失の中央の塩基（これもＴ）に対応する野生型プローブは標 的にもっと結合しにくくなる。しかしながら、この行セットのＴ−レーンのプロ ーブは標的に非常によく結合する。２つの標的の配列の調査は、その配列をその ３′末端において整合させると欠失がその位置においてＡを設定し、そしてＴ− レーンプローブが突然変異標的と相補性ではあるが、末端付近に２つの誤対合が あることを示す（以下に小文字で示し、置換位置に下線を付した）： 即ち、この行セットのＴ−レーンプローブは突然変異配列の適正な塩基を判定 する。２つの標的の等モル混合についてのグラフにおいて、Ｔ−レーンプローブ は同一行セットの中のＡ−レーンプローブと同じぐらいに標的に結合し、一方、 その他の行セットにおいては、野生型配列をもたないプローブは標的に全く結合 しないことに注目すべきである。即ち、その一の行セット、そして特にそのセッ ト内のＴ−レーンプローブは、ホモ接合のケースをシュミレートする条件下で、 そして更にはヘテロ接合のケースをもシュミレートする条件下で、ΔF508突然変 異を検出する。 本例において、配列は、有効なハイブリダイゼーションを可能にするほどに十 分なる標的とプローブとの重複がない標的の末端付近では、更には何らかの他の 理由、おそらくは高いAT含有量によりハイブリダイゼーションが弱い標的の中心 付近では信頼性をもって推定できなかったが、その結果は、本発明の方法及びプ ローブが注目の突然変異の検出に利用できることを示した。この突然変異標的は 、wt508標的のそれに非常に似たハイブリダイゼーションパターンを、その２つ が共通配列を共有しているその末端で示し、そして欠失がある中央では非常に異 なるパターンを示した。イメージを右か ら左にかけてスキャンすると、野生型レーンのプローブに対する標的のハイブリ ダイゼーションの強度は、wt508よりもmu508に関し、イメージの中央付近ではる かに急降下する。更に、Ｔ−レーンの中にはmu508と強くハイブリダイズし、そ してwt508とはほとんどハイブリダイズしない一のプローブがある。突然変異に ついてのヘテロ接合個体を検査するうえで遭遇しうるケースを示す２つの標的の 等モル混合物からの結果は、個々の標的の結果の合成であり、ΔF508突然変異を 含むものから野生型標的配列を識別する及び２つの配列の混合物を検出する本発 明の能力を示している。 上記の結果は、本発明のDNAチップが欠失突然変異ΔF508を検出するのにどの ようにして利用できるかを明確に示す。その他のモデル系は、このチップが同様 に点突然変異を検出するのにも利用できることを示すのに利用した。CFTR遺伝子 の１の突然変異はG480Cであり、これは通常CFTRタンパク質の#480位のシステイ ンのグリシンによる置換をもたらすエクソン10の46位のＧのＴによる置換に関与 する。このモデル標的配列は、エクソンの37〜55位にある野生型配列を表わす21 量体プローブwt480： 及び突然変異配列を表わす21量体プローブmu480： 別の実験において、DNAチップを標的wt480及びmu480のそれぞれにハイブリダ イズさせ、次いで同焦点顕微鏡でスキャンした。図20のパネルＡ，Ｂ及びＣは、 CFTRエクソン10プローブを含むDNAチップ領域から得たイメージを示す；パネル Ａにおいては、チップはwt480標的にハイブリダイズさせている；パネルＣにお いては、チップはmu480標的にハイブリダイズさせている；そしてパネルＢにお いては、チップは野生型及び突然変異標的の混合物にハイブリダ イズさせている。図20のパネルＡ，Ｂ及びＣに対応する図21のシート１〜３は、 蛍光強度、対、タイル貼り位置のグラフを示す。水平軸上のラベルは関連のプロ ーブの置換位置に対応する野生型配列の塩基を示している。プロットしているの は、野生型プローブを含む特徴（又は合成部位）、最も標的に結合する置換プロ ーブを含む特徴（「判定」）及び全ての置換プローブのうち２番目の強度をもっ て標的に結合する置換プローブを含む特徴（「２番目」）から観察した強度であ る。 これらの図は、このチップが、標的480の中心から16塩基ストレッチを配列決 定するために利用できること、及び誤対合に対する識別力が配列決定領域にわた ってかなり良好であることを示す。DNAチップを標的mu480に曝露すると、示して いるチップの一部の一のプローブのみが標的と良好に結合した：即ち、エクソン 10の46位の塩基の同定を担い、且つ置換位置にＡを有し、そして突然変異標的の 中央部分に完璧に相補性であるプローブのセットのプローブ。チップのその領域 における全てのその他のプローブは突然変異標的と少なくとも一の誤対合を有し 、それ故それにはるかに弱く結合する。この事実にもかかわらず、突然変異の両 側に対するいくつかの位置についてのmu480の配列は、野生型標的により観察さ れたものからはるかに弱められた強度にもかかわらず、このチップから解読でき た。 この結果は、２つの標的を混ぜ合わせてチップに曝露させると、観察されるハ イブリダイゼーションパターンはその他の２つのパターンの合成となることも示 した。この野生型配列はチップから容易に解読できるが、しかしmu480標的のみ が存在しているときに良好にmu480標的に結合するプローブは、混合物の中に突 然変異及び野生型標的の双方が存在しているときも良好に結合することから、野 生型標的のみのハイブリダイゼーションパターンからそれを容易に識別できる。 これらの結果も、ホモ−及びヘテロ接合個体の双方における点突然変異を検出す る本発明のDNAチップの能力を示す。 本発明のDNAチップの臨床的用途を証明するため、チップをゲノムサンプル由 来の核酸の突然変異を研究及び検出するのに用いた。野生型遺伝子のみを有する 個体及びΔF508についてヘテロ接合となっている個体由来のゲノムサンプルを、 T7 RNAポリメラーゼについてのプロモーターを含むエクソン10プライマーを用い るPCRにより増幅させた。本発明の代表的なプライマーを以下に示す。 これらのプライマーはエクソン10又はエクソン11配列を増幅するのに利用でき る。別の態様において、多重PCRを採用し、一度に複数のエクソンを増幅する２ ペアー以上のプライマーを用いた。 増幅生成物を、RNA生成物をラベルするために存在するフルオレセイン化UTPを 伴い、RNAポリメラーゼの鋳型として用いた。十分なるRNAを作った後、それを断 片化し、そしてエクソン10のDNAチップに15分適用しておき、その後チップをハ イブリダイゼーションバッファーで洗い、そして蛍光顕微鏡でスキャンした。数 多くのCFエクソン10チップ上に含まれている有用な陽性コントロールは８量体３ ′−CGCCGCCG−５′である。図22のパネルＡ及びＢは、CFTRエクソン10プローブ を含むDNAチップの領域から得たイメージを示す；パネルＡにおいては、チップ を野生型ΔF508配列を有する個体の ゲノムDNA由来の核酸配列とハイブリダイズさせている；パネルＢにおいては、 標的核酸はヘテロ接合（ΔF508突然変異との関連で）個体に由来する。図22のパ ネルＡ及びＢに対応する図23のシート１及び２は、蛍光強度、対、タイル貼り位 置のグラフを示す。 これらの図は、野生型RNAの配列が突然変異付近の塩基のほとんどで判定され うることを示す。ΔF508ヘテロ接合キャリヤーの場合、Ｔ−レーンの中の、上記 したモデル系において野生型と突然変異オリゴヌクレオチド標的とを明確に識別 させるものと同じ一の特定のプローブは大量のRNAと結合し、一方、このプロー ブは野生型の個体由来のRNAとはほとんど結合しなかった。これらの結果は、本 発明のDNAチップはヘテロ接合キャリヤーのΔF508突然変異を検出できることを 示している。 更なるチップブロックタイル貼り手法を利用して構築し、CFTR突然変異の分析 のためのプローブアレーを提供した。このアレーは11行及び４列に並んだ93mm× 96μｍの特徴を含んで成る（全部で44プローブ）。これらの行のうちの５行の中 のプローブは野生型CFTR配列に基づいてタイル貼りした４組のプローブセットに 由来し、そして突然変異の部位及び両側の２つの塩基に対応する疑問位を有する 。残りの行のうちの５つはCFTR配列の突然変異バージョンに基づいてタイル貼り した４組のプローブセットを含む。これらのプローブセットも突然変異部位及び 両側の２つのヌクレオチドに対応する疑問位を有する。11番目の行はコントロー ルプローブのための４つのセルを含んでいた。 蛍光ラベルハイブリダイゼーション標的はPCR増幅により調製した。100μｇの ゲノムDNA、0.4μＭづつのプライマー、50μＭづつのdATP，dGTP，dCTP及びdUTP (Pharmacia)ｎ，10mMのトリス−Cl，pH8.3，50mMのKCl，2.5mMのMgCl₂及び２Ｕ のTaqポリメラーゼ （Perkin-Elmer）を、Perkin-Elmer9600サーモサイクラー並びに以下の時間及び 温度を利用して36回サイクルにかけた：95℃で10sec.，55℃で10sec.，72℃で30 sec.。この反応生成物10μｌを第２の非対称PCR反応において鋳型として用いた 。条件は、１μＭの非対称性PCRプライマー、50μＭづつのdATP，dCTP，TTP，25 μＭのフルオレセイン−dGTP(Du Pont)，10mMのトリス−Cl，pH9.1，75mMのKCl ，3.5mMのMgCl₂とした。反応を、以下の条件で５回サイクルにかけた：95℃で10 sec.，60℃で10sec.，55℃で１min、そして72℃で1.5min。これに以下の条件を 利用して更に20回のサイクルを続けた：95℃で10sec.，60℃で10sec.，72℃で1. 5min。 増幅生成物を２Ｕのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ(Gibco)により30℃で30min 処理することにより断片化し、次いで95℃で５分加熱変性させた。最後に、ラベ ルした断片化PCR生成物を５ＸのSSPE及び１mMのセチルトリメチルアンモニウム ブロミド（CTAB）より成るハイブリダイゼーションバッファーに希釈した。希釈 率は10Ｘ〜25とし、40μｌのサンプルを0.4〜１mlのハイブリダイゼーション溶 液に希釈した。 標的ハイブリダイゼーションは一般に全容量が500μｌ〜１mlのハイブリダイ ゼーション溶液を含む小皿の中でチップを振盪させることにより実施した。ハイ ブリダイゼーションは全て30℃の恒温で行った。他方、一部のハイブリダイゼー ションはチップを１cm×１cmのプラスチックパッケージに封入し、そのチップを 250μｌの流体チャンバーに面して接着させて行った。250〜350μｌのハイブリ ダイゼーション溶液を導入し、そしてシリンジポンプを用いて混合した。温度は このパッケージの背面をPeltier加熱／冷却装置と接触させることにより制御し た。ハイブリダイゼーションの後、蛍光イメージの作製の前に、チップを5XSSPE ，0.1％のトリトンＸ− 100で25℃〜30℃で洗った。 ハイブリダイズした洗浄DNAチップを蛍光について、段階式走査同焦点エピ蛍 光顕微鏡及び488nmのアルゴンイオンレーザー励起を利用してスキャンした。発 光を530nmを中心とするバンドパスフィルターを通じて集めた。得られる蛍光イ メージを立体的に再構築し、そして強度データーを分析した。各行におけるピー クの蛍光強度を有する特徴を同定し、そして同じ行の残留単一塩基誤対合プロー ブ部位にある任意のシグナル強度と対比させた。最も強い強度の特徴の配列を、 次いで各サブアレーの全部で10行にわたって対比して、野生型配列及び突然変異 配列についてのピーク強度評点が類似であるか著しく異なるかを決定した。これ らの結果を、野生型（野生型プローブ行のみの高い強度のシグナル）、突然変異 体（突然変異プローブのみの高い強度のシグナル）又はヘテロ接合（野生型及び 突然変異プローブ行の双方の強い強度シグナル）のゲノムタイプ判定を得るのに 用いた。 図24（パネルＡ）はG551D（Ｇ＞Ａ）及びQ552X（Ｃ＞Ｔ）CFTR突然変異を検出 するためにデザインしたアレーの蛍光シグナルのイメージを示す。ハイブリダイ ゼーション標的は野生型ゲノムDNAから作製したエクソン11アンプリコンである 。野生型ハイブリダイゼーションパターンは両位置において明白である。突然変 異に対して相補性のプローブ、又は誤対合した配列による特徴のいづれにおいて も、有意な蛍光シグナルは得られなかった。相対蛍光強度は、突然変異及び誤対 合の特徴においてのバックグランドシグナル強度と比べ、完璧に対合した野生型 特徴について６倍明かった。更に、これらの遺伝子座にある配列はそれぞれAGGT C及びGTCAAと確証され、ここで太字は突然変異を示している。図24（パネルＢ） は、G551D突然変異についてのDNAヘテロ接合から作られた蛍光標的とのハ イブリダイゼーション後の同一のプローブアレー特徴を示す。野生型及び突然変 異プローブ行は共に有意な蛍光強度を有し、野生型及び突然変異CFTRアレルの両 者のこの部位でのハイブリダイゼーションを示唆する。野生型プローブのみが、 野生型標的配列を示唆しているQ552Xサブアレーの任意の蛍光シグナルとハイブ リダイズした。しかしながら、第１実験においてハイブリダイズしなかった追加 の特徴はこの実験において有意義な蛍光強度を示した。G551D及びQ552X突然変異 は２塩基しか離れていないため、追加の特徴におけるプローブ配列は、突然変異 G551D標的と完璧に対合する12量体重複を有する。 図25はΔF508、即ち、CFTR遺伝子のエクソン10における３塩基対欠失について の突然変異分析を示す。塩基変化突然変異において見い出せるハイブリダイゼー ションパターンに反し、塩基が挿入又は欠失している突然変異において、プロー ブアレーは異なるハイブリダイゼーションパターンを示す。同一のプローブを塩 基置換アレーの２本の中央行において合成した。その結果、突然変異又は野生型 標的ハイブリダイゼーションは常に、アレーの中央において強い蛍光強度を有す る２つの並んだ特徴（ダブレット）をもたらした。ヘテロ接合ハイブリダイゼー ションにおいては、２組のダブレットがあり、一方は野生型配列と対合し、そし てもう一方は生じている突然変異配列に対合した（図２４、パネルＢ）。一方、 野生型及び突然変異プローブ行配列は、欠失又は挿入突然変異については互いと 相殺し、従ってハイブリダイゼーションダブレットは見い出せなかった。１つの ダブレットを有する６つの強い強度シグナルの代わりとしての、交互の行での５ つの独立の特徴はホモ接合を特性決定し、そして10の特徴（各行において１）は ヘテロ接合標的により陽性となるであろう。このことは、図25パネルＡにおける ΔF508ハイブリ ダイゼーションパターンから明らかである。野生型標的がハイブリダイズされ、 そして最高の強度の特徴が野生型配列(ATCTT)を確証せしめるが、第１の突然変 異の行には追加のハイブリダイゼーションがある。そのプローブ配列の分析は、 突然変異配列と完璧に対合する10の塩基を示す。 図25、パネルＢのイメージは、DNAチップをΔF508についてホモ接合である標 的とハイブリダイズすることにより得られた。このイメージにおいて、突然変異 に相補性のプローブ配列を全てが有する５つの特徴は有意なシグナルを示した。 欠失部位ATTGGを橋渡している突然変異配列を確認した。G551D突然変異の例で認 められたもの類似して、Δ1507及びF508C突然変異を検出するのにデザインされ た隣接サブアレーにおいて追加の情報がある。このことは、それらがΔF508に近 接しており、このプローブセットがΔF508プローブと有意義に重複することより 予測される。ΔF508ホモ接合標的はΔ1507及びF508Cサブアレーにおける野生型 又は突然変異プローブと完璧に対合しなかった。しかしながら、これら２つのプ ローブブロック内には若干弱い強度のシグナルがあった。F508Cアレーは突然変 異ΔF508標的の11の塩基と対合するダブレットを有する。同様に、Δ1507アレー の８番目の行におけるハイブリダイゼーションは、標的と13／14塩基対合するプ ローブを有する。 図26は、ヘテロ接合二重突然変異ΔF508／F508Cの、上記と同じアレーに対す るハイブリダイゼーションを示す。慣用のリバース・ドット・ブロットはこのサ ンプルをホモ接合ΔF508突然変異と評価する。本アッセイにおいて、ΔF508及び F508Cアレルはそれぞれ、その突然変異を検出するようにデザインされた関連の サブアレーにより検出する。 Ｃ．癌の診断用チップ 癌細胞において往々にして異なる少なくとも２タイプの遺伝子がある。第１タ イプの遺伝子は癌遺伝子、例えば誤対合−修復遺伝子であり、そして第２タイプ の遺伝子は腫瘍抑制遺伝子、例えば転写因子である。誤対合修復癌遺伝子の例に は、hMSH2(Fishelら、Cell75，1027-1038(1993))及びhMLH1(Papadopoulosら、Sc ience 263，1625-1628(1994))が含まれる。この最もよく知られている腫瘍抑制 遺伝子の例はｐ53タンパク質遺伝子である(Buchmanら、Gene 70，245-252(1988) )。患者の癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の両方の状態をモニターすることにより （個別に、又は組合せて）、癌へのかかり易さ、癌診断に基づく患者の予後及び 治療法を定めることの決定をより効率的に行うことが可能となる。 ｐ53遺伝子はヒトでは20kbpであり、そして11のエクソンを有し、そのうちの1 0はタンパク質をコードする（Tominagaら、1992，Critical Reviews in Oncogen esis ３：257-282；引用することで本明細書に組入れる）。この遺伝子はDNA複 製を抑制する53キロダルトンのホスホタンパク質を生成する。このタンパク質は 複製を細胞サイクルにおけるGI／Ｓ境界において停止させることを担い、そして DNAが損傷を受けたときに複製を抑制する又はDNAウィルスの再生を阻止する「分 子状の警察官」を担う（Lane 1992，Nature 358：15-16；引用することで本明細 書に組入れる）。ｐ53転写因子は細胞増殖をコントロールする基礎的な経路の一 部である。野生型ｐ53は細胞増殖を止めるか、又はあるケースにおいてはプログ ラムされた細胞死をもたらす（アポプトシス）。かかる腫瘍抑制作用は様々な既 知のｐ53遺伝子突然変異を有さない。更に、ｐ53突然変異体は野生型ｐ53腫瘍抑 制細胞を奪い取るだけでなく、異常な細胞増殖をも誘因する。 腫瘍細胞において、ｐ53は今日までに発見されている最も一般的 な突然変異遺伝子である（Levinら、1991，Nature 351：453-463及びHollstein ら、1991，Science 253：49-53を参照のこと；引用することで本明細書に組入れ る）。癌と診断された650万人の患者の半分以上が１年毎にその腫瘍細胞の中に ｐ53突然変異をもつ。一般の腫瘍のうちで、結腸直腸癌の約70％、肺癌の50％、 そして乳癌の40％がｐ53突然変異を含む。全てにおいて、ヒト腫瘍のうちの51以 上のタイプ、例えば膀胱、脳、乳、頸部、結腸、食道、喉頭、肝臓、肺、卵巣、 膵臓、前立腺、皮膚、胃及び甲状腺腫瘍が、ｐ53突然変異を有することが述べら れている（Culotta & Koshland，Science 262，1958-1961（1993）；Rodrigues ら、1990，PNAS87：7555-7559；引用することで本明細書に組入れる）。David S idranskyにより示されているデーターに従うと（1992 San Diego Conference） 、ｐ53において400以上の突然変異が知られている。腫瘍におけるｐ53突然変異 の存在は、患者の予後とも相関されている。ｐ53突然変異をもつ患者は低い５年 後生存率を有する。 腫瘍細胞におけるｐ53の状態の適正な診断は、医師が適切な治療法を決めるの に重要である。例えば、リンパ節付近に侵襲性を示さない乳癌の患者は一般に標 準の外科処置及び化学療法の後は再発しないものである。外科及び化学療法の後 に再発した者の25％にとっては追加の化学療法が適切である。現在、再発する前 にかかる追加の化学療法の恩恵を受けれる患者を決定する明確な方法はない。し かしながら、ｐ53突然変異を腫瘍原性及び転移に相関させることは、医師に、か かる追加の処置を許可するかどうかの決定のための手段を提供する。 慣用の化学療法を助長することに加えて、ｐ53突然変異の適切な診断は医師に 、遺伝子治療技術により最も恩恵を受けれるであろう個体を同定する能力を供す る（この技術においては、適当に操作し たｐ53コピーを腫瘍部位に戻す）。臨床ｐ53遺伝子治療は現状行われている（Cu lotta & Koshland，前掲）。 ｐ53突然変異の分析は、どの発癌物質が特定の腫瘍をもたらしているかを同定 するのにも利用される(Harris，Science 262，198-1981(1993))。例えば、食事 用アフラトキシンＢ１曝露は、肝細胞癌のｐ53の残基249でのＧ：ＣからＴ：Ａ に至る変換に関係している(Hsuら、Nature 350，427（1991）；Bressacら、Natu re 350，429（1991）；Harris前掲)。 最も述べられているｐ53突然変異は体幹性を起源とするが、いくつかのタイプ の癌は生殖系ｐ53突然変異に関係する。例えば、Li-Fraumeni症候群は個体が突 然変異ｐ53アレルを受容する遺伝的な症状であり、様々な癌の早期発症をもたら す（Harris（前掲）；Frebourgら、PNAS 89，6413-6417（1992）；Malkiら、Sci ence 250，1233(1990)）。これらの突然変異はゲノムの残りの不安定さに関連し 、多重の遺伝子変化をもたらし、そして究極的には癌を招く。 hMLH1及びhMSH2は、突然変異hMLH1又はhMSH2アレルを有する個体の遺伝的非ポ リープ性直腸結腸癌に原因となる誤対合修復遺伝子である（Fishelら、前掲及び Papadopoulusら、前掲）。遺伝的非ポリープ性直腸結腸癌は一般的な遺伝子病で あり、200人のうち１人がかかる(Lynchら、Gastroenterology 104，1535(1993)) 。この集団におけるhMLH1及びhMSH2突然変異の検出は、病気の発現の前での非ポ リープ性直腸結腸癌にかかり易い個体の診断を可能とする。このことは、癌の早 期発見を確実とする癌にかかり易い個体にとっての特別なスクリーニングプログ ラムの遂行を可能とし、これにより冒された個体の生存率を高める。更に、遺伝 子カウンセラーは嚢胞性線維症チップに記載の通りにして、家族計画を改善でき るように、HMLH1及びHMSH2チップに由来する情報を活用できうる。h MLH1及びhMSH2の突然変異の検出は、個別に、又はｐ53と組合せて、医師が癌の 予後及び処置方式を評価することにも利用できる。最後、この情報は遺伝子治療 について適する個体の狙いを定めるのに利用できる。 全hMLH1遺伝子は長さが85kbp未満であり、2268個のコードヌクレオチドを含ん で成る（Papadopoulosら、前掲）。この遺伝子由来の配列はGen Bankに寄託され ている（承認番号U07418）。遺伝子的非ポリープ性直腸結腸癌に係る突然変異は 、エクソン５の欠失(コドン578−632)、遺伝子の解読フレームにおけるシフトを もたらしてしまうコドン727及び728の４塩基対欠失、COOM末端の伸長をもたらす コドン755及び756での４塩基対挿入、371塩基対欠失及び347位でのフレームシフ ト突然変異、並びに停止コドンの挿入をもたらしてしまうコドン252を変異の原 因となるトランスバージョン（前掲）を含む。 hMSH2は細菌MutS及びＳ．セレビジエMSH誤対合・修復遺伝子のヒト同族体であ る。MSH2は、hMLH1と同様に、遺伝的非ポリープ性癌に関与する。腫瘍組織由来 の若干のMSH2遺伝子サンプルしか特性決定されていないが、少なくとも一部の腫 瘍サンプルはcDNA配列の2020位においてＴからＣへのトランジション突然変異を 示し、イントロン・エクソンスプライスアクセプター部位の消失をもたらしてし まう。 癌に至る遺伝的素質、癌に至る腫瘍形質転換現象及び癌の予後におけるｐ53、 MSH2及び／又はhMLH1の突然変異の役割の観点において、個体をスクリーニング にかけてそれらの者が突然変異アレルを有するかどうかを決定する、及びどのよ うな突然変異をその個体が有しているかを正確に同定することは重要である。多 くの突然変異は点突然変異であるか、又は非常に小さい挿入もしくは欠失であっ て標準のサザン分析によっては一般に検出不能なものであるため、正確な診断は 遺伝子をヌクレオチド毎に調べる能力を必要とする。 hMSH2，hMLH1又はｐ53遺伝子における突然変異は、事前に特性決定されている かに関係なく、上記の任意のタイル貼り手法によって検出できる。注目の対照配 列には、全量ゲノム並びにこれらの遺伝子のそれぞれのcDNA配列及びそのサブ配 列、例えはエクソン及びイントロンが含まれる。例えば、20kbのｐ53ゲノム配列 の中の各ヌクレオチドは約80,000プローブのアレーによって基礎的手法を用いて タイル貼りできる。CFTRチップと同様に、一部の対照配列は同等に短い配列であ り、既知の突然変異及び数個の隣接ヌクレオチドを含む。一部のチップは、突然 変異の「ホットスポット」を含む対照配列をタイル貼りしている。例えば、Mdm2 ，SV40 Ｔ抗原、アデノウィルス由来のE1b及びヒトパピロマウィルス由来のＥ ６を含む様々な細胞性及びオンコウィルスタンパク質はｐ53の特定の領域に結合 する。これらの結合部位は、癌患者由来の腫瘍細胞に見い出させるｐ53の観察さ れた高頻度体幹性突然変異とある程度相関している（Harrisら、前掲参照のこと ）。ホットスポットには、エクソン２，３，５，６，７及び８、並びにエクソン ２と３，３と４及び４と５の間のイントロン領域が含まれる。特に注目されるhM LH1遺伝子のフラグメントにはコドン578−632，727，728，347，252をコードす るものが含まれる。一部のチップはhMSH2，hMLH1及びｐ53遺伝子のそれぞれ（野 生型及び突然変異バージョンの双方）における突然変異を解読するようにタイル 貼りされている。 標準又は非対象性PCRは上記のタイル貼りアッセイにおいて用いた標的DNAを作 るのに利用できる。複合PCR反応はhMSH2，hMLH1又はｐ53配列を、単一反応混合 物の中で同時に作製するのに利用できる。これらの遺伝子の任意のコード又は非 コード配列を、上記のブ ロックタイル貼りアッセイにおいて利用するために増幅させてよい。 以下の表８はhMSH2，hMHLH1及びｐ53の特定領域を合成するのに有用である。 その他のプライマーは遺伝子の既知のゲノム及びcDNA配列から設計できる。ｐ53 増幅にとって特異的な表８に記載のプライマーは標準の制限酵素クローニング部 位へのクローニングが促進されるように仕上げられている。 標的アンプリコンのPCR増幅の後、一本鎖のアンプリコンが、ストレプトアビ ジンビーズ上での所望されない鎖の補促を可能とするビオチニル化プライマーを 用いて単離できる。他方、非対称性PCRは一本鎖標的を作製するのに利用できる 。その他の手法は、Ｔ７又はいづれかのプライマーのその他のRNAポリメラーゼ プロモーターの組込みによる、PCR生成物由来の一本鎖RNAの作製を含む。この一 本鎖材料を任意的に断片化して、長い核酸よりも有意に弱い二次構造を有するよ り小さな核酸を作り上げることができる。 一のかかる方法において、断片化はラベル化と組合せる。例示のため、縮重８ 量体又はその他の縮重短鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖標的材料とハイブリダイ ズさせる。次の工程において、DNAポリメラーゼを４種のジデオキシヌクレオチ ドと共に加える（それぞれは異なる蛍光団でラベルしておく）。ハイブリダイズ した８量体をラベル化ジデオキシヌクレオチドにより伸長する。任意的な精製工 程の後、即ち、サイズ排除カラムを経た後、ラベル化９量体をチップにハイブリ ダイズさせる。その他の標的断片化法を利用してよい。一本鎖DNAはDNAseにより 部分分解することにより断片化するか、又は酸で部分的に脱プリン化して断片化 してよい。ラベリングは独立の工程で成し遂げてよく、即ち、断片化工程の前に 蛍光団ラベル化ヌクレオチドを組込むか、又は断片化前にDNA結合性蛍光団、例 えばエチジウムホモダイマーを標的に付加しておく。 典型的なチップ ａ．エクソンVIチップ かかる方法における本発明のDNAチップの価値を例証するため、DNAチップをVL SIPS（商標）法により合成して、ｐ53遺伝子のエクソン６の60塩基領域を占める 又はタイル貼りした重複プローブアレーを提供する。標的における置換突然変異 を検出する能力を実証す るため、12種の単独置換突然変異（野生型及び３つの位置それぞれにおいて異な る置換）を野生型に沿ってチップ上に占めさせた。これらの突然変異それぞれは 、一連の12本の12量体オリゴヌクレオチドプローブにより占められ、それらは一 の置換化塩基を除き、野生型標的と相補性である。12のプローブそれぞれは標的 の別々の領域に対して相補性であり、そして異なる位置において突然変異塩基を 含む。例えば、もし置換が塩基32にあるなら、プローブのセットは（塩基32を除 き）標的21−32，22−33及び32−43に対して相補性である。このことは、プロー ブ内の置換位置の効果の調査を可能とする。一部のプローブと12量体モデル標的 核酸との整合を図27に示す。 プローブの長さの効果を実証するため、追加の一連の10本の10量体プローブを 各突然変異のために含ませた（図28参照）。置換化位置付近では、野生型配列は 全ての可能な重複性12量体及び10量体プローブにより占められる。対比を簡単に するため、各変異位置に対応するプローブをチップ上に、以下の構造をもって長 方形の領域で並べた。各セルの列は１の置換を示し、最上列は野生型を示す。各 行は標的の同一領域に相補性のプローブ、即ち、標的の３′末端の左側に相補性 のプローブ及び標的の５′末端の右側に相補性のプローブを含む。２本の隣り合 う行間の相違は、プローブの配置における１塩基シフトである。可能なら、一連 の10量体プローブを同一の置換についての４列の12量体プローブの真下に４列で 載せ、そして整合させる。 モデル標的を供するため、コドン192の第１位において可能な全ての置換を含 む５′フルオレセイン化12量体を合成する（図27の標的における星印の位置を参 照のこと）。６ＸのSSPE，0.25％のトリトンＸ−100中の10nMの標的DNAを含む溶 液を室温で数時間にわた ってチップにハイブリダイズさせた。標的核酸をチップにハイブリダイズさせて いる間、チップ上の蛍光団をアルゴンレーザー由来の光により励起させ、そして そのチップを自動フォーカス同焦点顕微鏡でスキャンした。励起シグナルをイメ ージ分析ソフトウェアを用い、PCで処理してイメージを作り上げた。１〜３時間 で、シグナルはプラトーに達した。ハイブリダイズした標的を除き、そして別の 標的へのハイブリダイゼーションを可能とするため、このチップを60％のホルム アミド、２ＸのSSPEにより17℃で５分かけてストリップに付した。洗浄バッファ ー及び温度は変えてよいが、バッファーは一般に２〜３ＸのSSPE，10〜60％のホ ルムアルデヒド（多重洗浄を利用して、各洗浄毎にホルムアルデヒド濃度10％づ つ上げ、そして洗浄毎にスキャンにかけて洗浄が完了したかを決定してよい）、 及び任意的に少量のトリトンＸ−100を含み、そして温度は一般に15〜18℃の範 囲とする。 １塩基置換を有する標的とのハイブリダイゼーション、並びに同焦点顕微鏡に よる目視検査及びソフトウェアー分析を経て、非常に異なるパターンが、図29の 示す通り、観察された。一般に、標的と完璧な対合を形成するプローブは最高の シグナルを保持している。例えば、第１イメージにおいて、野生型（WT）標的と 完璧な対合を形成する12量体プローブは第１列にある（最上）。単一塩基誤対合 する12量体プローブは第２、第３及び第４列目にあり、そしてはるかに弱いシグ ナルを有する。このデーターを図30にグラフ的にも示す。各グラフにおいて、Ｘ 軸はチップ上の列におけるプローブの位置であり、そしてＹ軸はハイブリダイゼ ーション後のプローブ部位でのシグナルである。異なる一塩基置換を有する標的 をハイブリダイズさせたとき、相補性のプローブセットは最高のシグナルを有す る（図29の絵図２，３及び４、並びに図３０のグラフ２，３及び４を 参照のこと）。各ケースにおいて、標的と誤対合しないプローブセットは最高の シグナルを有する。12量体のプローブセットにおいて、シグナルは６又は７位で 最高であった。このグラフは、同じＸ軸での12量体プローブ間のシグナル相違は 、標的と相補性プローブとが10塩基対及び11塩基対を形成するときに、それぞれ ５位及び８位において最大である傾向にあることを示している。腫瘍は往々にし てWT及び突然変異ｐ53遺伝子を有するため、複合標的集団も図31に示す通りチッ プにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション溶液がWT12量体及び標的の７ 位に置換をする12量体の１：１の複合物より成るとき、双方の標的に完璧に対合 するプローブセットはその他のプローブセットよりも強いシグナルを示した。 12量体プローブアレーに比べての10量体プローブアレーのハイブリダイゼーシ ョン効率も対比させた。この10量体及び12量体プローブは同等のシグナルを供し た（図30のグラフ１−４及び図32のグラフ１〜４を参照のこと）。しかしながら 、列５〜８にある10量体プローブセット（図２９のイメージを参照のこと）は、 一の標的を他のものから決定するにおいて、12量体プローブセットよりもこのモ デル系において良好であることが認められ、一塩基誤対合は、12量体についてよ りも10量体に関して、より不安定であるとの予測と一致する。標的に対して完璧 に対合するプローブセット内のハイブリダイゼーション結果も、個々のプローブ が標的とより多くの対合を形成する度に、シグナルは高くなるという予測に従う 。しかしながら、２つの３′垂れ下がりを有する二本鎖（図30のグラフ１〜４の ６位参照のこと）は、その全長にわたって対合するプローブとほぼ同じぐらいの シグナルを有する（図３０のグラフ１〜４の７位を参照のこと）。 例示的なモデル系は、１塩基置換により相違する12量体標的は、 本発明により供される新規のプローブアレーによって互いから容易に識別でき、 そして種々の12量体の標的の決定は12量体プローブセットよりも10量体プローブ セットによる方が若干良好であることを示した。 ｂ．エクソンＶチップ ｐ53腫瘍抑制遺伝子のエクソン５由来のDNAを分析するため、重複17量体プロ ーブのセットをチップ上で合成した。WTアレルについてのプローブを、プローブ 間に単一塩基重複があるように全エクソンに沿ってタイル貼りするようにして合 成した。各WTプローブに関し、４本の追加プローブのセット（７位において可能 な塩基置換につき１本）を合成し、そしてWTプローブと関連させて行の中に載せ た。エクソン５DNAを、エクソンに隣接するプライマーにより、PCRで増幅させた 。プライマーのうちの１つをフレオレセインでラベルした。他のプライマーはビ オチンでラベルしておいた。増幅後、ビオチニル化鎖をストレプトアビジンビー ズに対する結合により除去した。フルオレセイン化鎖をハイブリダイゼーション に用いた。 増幅させた一本鎖核酸の約１／３を５ＸのSSPEの中で60℃でプローブチップに 一夜かけてハイブリダイズさせた（カバースリップの下で）。６ＸのSSPEで洗浄 後、このチップを同焦点顕微鏡を用いてスキャンした。図33は標的DNAに対して ハイブリダイズしたｐ53チップのイメージを示す。強度データーの分析は、エク ソン５の184の塩基のうち93.5％がWT配列と一致すると判定された(Buchmanら、1 988，Gene 70：245-252；引用することで本明細書に組入れる）。誤対合塩基は プローブシグナル強度が作られる位置(1.6％)及び非WTプローブが最高のシグナ ル強度を有している位置(4.9％)に由来した。図34はどのように実際の配列を解 読するかを示す。WT列の文字配列におけるギャップはコントロールプローブ又は 部位に相当 する。塩基が誤対合した位置は、WT塩基がその他の塩基により置換されているプ ローブに対応するセルの中でイタリック体の文字で表わしている。ダイヤグラム が示している通り、この誤対合塩基はイメージの低強度領域に由来し、これは分 子間ハイブリダイゼーションを阻止する標的又はプローブにおける二次構造に基 づきうる。二次構造に基づく効果を排除するため、より短い標的を使用するか（ 即ち、標的の断片化により）、又はよりストリンジェンジーなハイブリダイゼー ション条件を利用してよい。更に、二本鎖標的の一方の鎖に沿ってタイル貼りす ることにより合成したプローブのセットの利用は、他方の鎖における二次構造の 中に埋没した配列情報を提供する。しかしながら、標的自体において二次構造の 結果として形成される低強度領域のパターンは、特定の標的配列がサンプル中に 存在していることを同定するための手段を提供するもの期待されうる。より低い シグナル強度を担いうるその他の要因には、プローブ密度及びハイブリダイゼー ションの安定性の相違が含まれる。 これらの結果は、遺伝子分析に対する本発明のDNAチップにより供される利点 を実証する。別の例として、ヘテロ接合突然変異は現在、DNAのクローニング及 び再精製を含むめんどうなプロセスにより配列決定されている。クローニング工 程が必要とされ、その理由はゲル配列決定系はDNAの１：１の複合物を決定する ときでさえも劣っているからであるからである。第１に、標的DNAをPCRにより、 ベクターへの容易なるライゲーションを可能とするプライマーを用いて増幅させ る。このベクターをＥ．コリ（E.coli）の形質転換により取り込ませ、そのＥ． コリは一般にプレートで一夜培養しなくてはならない。細菌の増殖の後、DNAを 一般に約２時間かける手順で精製し、次いで少なくとも更に１時間かかる配列決 定反応を行い、そしてそのサンプルをゲル上で数時間かけて泳動させる（この 時間は配列決定するフラグメントの長さに依存する）。他方、本発明は簡単な転 写及び断片化工程を経てのPCR増幅材料の直接分析を供し、時間及び労力が節約 される。 Ｄ．ミトコンドリアゲノムチップ ヒト細胞は数百個のミトコンドリアを有することがあり、それぞれはmt DNAの 複数のコピーを有する。塩基組成において非対称な鎖があり、一の鎖（重鎖）は 比較的Ｇリッチであり、そして他方の鎖（軽鎖）はＣリッチである。Ｌ鎖は30.9 ％のＡ，31.2％のＣ，13.1％のＧ及び24.7％のＴである。ヒトmt DNAは情報性に 富み、一部の22tRNA，12Ｓ及び16Ｓ rRNA、並びに酸化リン酸化に関与する13の ポリペプチドをコードする。イントロンは検出されなかった。RNAはtRNA配列に おいて切断によりプロセシングされ、そして後翻訳的にポリアデニル化される。 一部の転写体においては、ポリアデニル化は停止コドンも作り出し、コードの倹 約を例示する。多くの個体において、mt DNAはハプロイドとして扱われうる。し かしながら、一部の個体はヘテロプラスミックであり（複数種のmt DNA配列を有 する）、そしてヘテロプラスミーの度合いは組織間で異なりうる。また、mt DNA の複製率は相違し合うことがあり、そして細胞分裂中のランダム分離と共に、経 時的なヘテロプラスミー変化を招きうる。 ヒトミトコンドリアゲノムは16,569ヌクレオチドの長さである。Ｌ−鎖の配列 はＤ−ループ領域におけるMboI−５／７境界から任意的に番号付けしている。ヒ トミトコンドリアゲノムの完全配列が公開されている。Andersonら、Nature 290 ，457-465(1981)参照のこと。ミトコンドリアDNAは母性遺伝され、そして単一コ ピー核DNAよりも10倍高いと評される突然変異率を有する(Brownら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 76，1967-1971(1979))。ヒトmt DNAは、平均 して、約70塩基置換により相違する（Wallace，Ann．Rev．Biochem．61，1175-1 212(1979)）。置換の80％以上がトランジションである（即ち、ピリミジン−ピ リミジン又はプリン−プリン）。 ミトコンドリアDNAの分析は、いくつかの目的を担っている。ミトコンドリア ゲノムの突然変異の検出は病気の数の診断を可能とする。ミトコンドリアゲノム はヒト疾患に関与するいくつかの突然変異の遺伝子座として同定されている。一 部の突然変異は構造遺伝子の中に停止コドンをもたらす。かかる突然変異は地図 化され、そしてLeber遺伝性光学ニューロパシー、神経原性筋肉虚弱症、失調症 及び色素性網膜炎の如くの疾患に関与する。その他の突然変異（ヌクレオチド置 換）がtRNAコード配列に起こり、そしておそらくは転写tRNA分子にコンホメーシ ョン欠陥を引き起こす。かかる突然変異も地図化されており、そしてミオクロー ヌスてんかん及びぼろ（Ragged）赤筋線維病に関与する。一般に見い出せる他の タイプの突然変異は欠失及び／又は挿入である。一部の欠失は数kbのセグメント で広がる。ここでも、かかる突然変異は地図化されており、そして例えば眼性ミ オパシー及びPerson症候群の如くの病気に関連している。Wallace，Ann．Rtv．B iochem．61-1175-1212（1992）を参照のこと；引用することで本明細書に組入れ る）。かかる病気の早期発見は、復帰可能な損傷が生ずる前に代謝又は遺伝子治 療を投ずることを可能とする。前掲。ミトコンドリアDNAの分析は法医学スクリ ーニングにとっても重要である。ミトコンドリアゲノムは個体間で変動性の高い 遺伝子座であるため、ミトコンドリアDNAのほぼ全長の配列決定は、個体に高度 に特異的なフィンガープリントを提供する。ミトコンドリアDNAの分析は進化及 び疫学研究にとっても重要である。 対照配列は全ミトコンドリアゲノムでも任意のそのフラグメント であってもよい。法医学及び疫学研究のためには、対照配列は往々にして、個体 間の変動が最大であるＤ−ループ領域の全体又はその一部である／例えば16024 〜16401及び29−408)。突然変異の検出のため、全ゲノムの分析は対照配列とし て有用であるが、しかしながらより短いセグメントは既知突然変異部位を含み、 従って約１〜20の隣接塩基も有用である。一部のチップは、配列の野生型及び突 然変異バージョンを代表するペアー対照配列をタイル貼りするプローブを有する 。第２対照配列のタイル貼りは眼性ミオパシー及びPearson症候群の30〜50％に おいて起こる挿入突然変異を検査するのに極めて有用である。この挿入は配列AC CTCCCTCACCAの直接リピートより成る。一部のチップは複数のミトコンドリアゲ ノムに由来する対照配列を含む。 ミトコンドリア対照配列は上記の任意の手法を利用してタイル貼りできる。こ のブロックタイル貼り手法は短い対照配列又は既知の突然変異を分析するのに極 めて有用である。ブロック手法又は基礎的手法のいづれも長い対照配列を分析す るのに適当である。多くのタイル貼り手法において、配列情報の有意義な損失を 伴うことなく、その他のチップにおいて用いられている数に比べて少ない数のプ ローブを利用することが可能である。前述の通り、ミトコンドリアDNAにおける ほとんどの点突然変異はトランジションであり、従って対照配列における各野生 型ヌクレオチドにとって、３つの可能なヌクレオチド置換のうちの１つは他の２ つよりもはるかにその傾向を有する。従って、基礎的なタイル貼り手法において 、例えば、対照配列は２組のプローブセットのみを用いてタイル貼りしてよい。 １のプローブセットは複数のプローブを含んで成り、各プローブは対照配列に対 してまさに相補性のセグメントを有する。第２プローブセットは第１セットの各 プローブに対して相補性のプローブを含 んで成る。しかしながら、第２プローブセット由来のプローブは第１プローブセ ット由来の対応のプローブとは疑問位において相違し、それにおいては第２プロ ーブセット由来のプローブは、第１プローブセット由来のプローブの中のその位 置に存在するヌクレオチドのトランジションを含む。 標的ミトコンドリアDNAは、その他のチップについて説明したのと同じ手順を 利用して、ハイブリダイゼーションの前に増幅、ラベル及び断片化してよい。少 なくとも２つのラベル化ヌクレオチドの利用が均一なラベリングを達成するのに 所望される。一部の典型的なプライマーを以下に説明し、そしてその他のプライ マーはミトコンドリアDNAの既知の配列からデザインできる。ミトコンドリアDNA はセル当り複数のコピーにおいて存在しているため、これは前増幅抜きでチップ に直接ハイブリダイズさせてもよい。 典型的なチップ 本発明は、ヒトミトコンドリアDNAの最も多形性な領域である「Ｄ−ループ」 領域由来のヒトミトコンドリアDNAの1.3kbのフラグメントの中に含まれている配 列を分析するためのDNAチップを提供する。一のかかるチップは長さが９〜14ヌ クレオチドにおいて変動し、様々な重複を有し、１cm×１cmのアレーサイズで60 0×600ミクロン特徴又は合成部位で配備されている269の重複オリゴヌクレオチ ドプローブのセットを含んで成る。このチップ上のプローブは以下の縦段におい て示す。本発明の代表的なミトコンドリアDNAチップは以下のプローブを含んで 成る（Ｘ，Ｙ軸を示し、それに配列が続いている；「DL３」はプローブの３′末 端を示し、これはチップ面に共有結合されている）。 以下の位置にはプローブは存在していない： チップ上の各プローブの長さは融点の相違及び交差ハイブリダイゼーションの 可能性を最少限とするために様々とした。配列の中の各位置は少なくとも１のプ ローブにより占められ、そしてほとんどの位置は２以上のプローブで占められて いる。前述の通り、オリゴヌクレオチド間の重複の程度はプローブ間で変わる。 図35はヒトミトコンドリアゲノムを示す；「Ｏ_H」はＨ鎖複製起点を表わし、そ して矢印はクローニングした陰影のない配列を示す。 DNAを６人のドナーの毛根から調製し（mt１〜mt６）、次いでPCRにより増幅し 、そしてＭ13にクローニングした；得られるクローンを連鎖ターミネーターを用 いて配列決定し、所望の特異的な配列があるかを確認した。配列決定したＭ13ク ローン由来のDNAをPCRにより増幅し、in vitroで転写し、そしてＴ３ RNAポリメ ラーゼを用いてフルオレセイン−UTPによりラベルした。1.3kbのRNA転写体を断 片化し、そしてチップにハイブリダイズさせた。結果は、各々の個々の個体が、 チップ上に固有のハイブリダイゼーションフィンガープリントを生成し、そして 観察されたパターンにおける相違が、クローニングされたゲノムDNA配列の相違 と相関しうることを示した。結果はまた、非常に長い標的核酸配列が、重複する オリゴヌクレオチドの特異的なセットとして明瞭に表わされること、及びかかる プローブセットのアレーが遺伝子分析に有用に適用されうることも示した。 サンプルの核酸を6XSSPE，0.1％のトリトン−Ｘ100より成る溶液の中で15℃で 60分かけてチップにハイブリダイズさせた。次いで このチップを同焦点走査蛍光顕微鏡によりスキャンした。チップ上の個々の特徴 は588×588ミクロンとしたが、ただしアレーの中の左下の５×５の正方形特徴は プローブを含んでいない。データーを定量化するため、ピクセルカウント数を各 合成部位内で測定した。ピクセルは50×50ミクロンを占める。各特徴についての 蛍光強度を27の明るい特徴から決定した平均値（mean）に対して評価した。スキ ャンの後、このチップをストリップに付し、そして再ハイブリダイズした。６つ のサンプルを全て同一のチップにハイブリダイズさせた。図36はDNAチップ上のm t４サンプルから観察されたイメージを示す。図38は、２つのサンプルと対照配 列との間での誤対合に基づく DNAチップ上のmt４とmt５サンプルとの推定の相 違イメージを示す（Andersonら、前掲）。図39は実際に観察された相違イメージ を示す。 この結果は、ほとんどのケースにおいて、誤対合したプローブ／標的ハイブリ ドが、完璧に対合したハイブリドよりも弱い蛍光強度をもたらすことを示した。 にもかかわらず、一部のプローブは他よりも良好に突然変異（又は特定の配列） を検出し、そしていくつかのケースにおいては、その相違はノイズレベル内であ った。改善は、プローブ間の重複の度合いを高めることにより、それ故全プロー ブ密度を高めることにより実現でき、そして二本鎖DNA標的にとっては、標的の 第２鎖に対応する第２のプローブセット（同一又は別のチップ上）により実現で きうる。図40のシート１及び２は、アレーの列10及び11にわたる標準化強度のプ ロット並びに検出された突然変異のまとめを示す。 図41はこのチップにより得られた野生型及び突然変異ハイブリド間で識別を示 す。各プローブについての６段の標準化ハイブリダイゼーション評点の中央値を 採った。このグラフは、標準化ハイブリ ダイゼーションを評価する中央値、対、平均カウント数の比でプロットしている 。このグラフ上で、1.6の比及び50を超える平均カウント数は偽陽性をもたらさ ず、そして一部の検出は改善されたことが明らかであるだけでなく、アレーのサ イズの小ささを考えると、優れた識別が達成された。図42は塩基誤対合の同一性 が、オリゴヌクレオチド内の誤対合の位置よりもどの程度、突然変異と野生型配 列とを識別する能力に影響を及ぼしうるかを示す。誤対合は３′末端からのプロ ーブの長さの％として表わす。塩基変化をグラフ上に示す。これらの結果は、DN Aチップが標準のリバース・ドット・ブロット方式の能力を数桁高め、この手法 の能力を何倍にも高め、そして本発明の方法が、核酸配列及び突然変異分析のゲ ルベース法よりも一層効率的であり、且つ一層自動化し易いことを示す。 これらの更なる利点を説明するため、第２チップをヒトミトコンドリアDNA（m t DNA）由来のより長いセグメントを分析するために調製した。このチップはヒ トＨ鎖mt DNAの16280位〜356位を含んで成る対照配列の648ヌクレオチドを通じ て「タイル貼り」しており、そして対照配列の中の各ヌクレオチドの分析を可能 とする。アレーの中のプローブは長さ15ヌクレオチドであり、そして標的配列に おける各位置は４プローブのセット（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ置換）により占められ、そ れらは互いと３′末端から７位において相違する。このアレーは13ブロックの４ ×50のプローブより成る；各ブロックは50ヌクレオチドの連続mt DNA配列にわた ってスキャンする。これらのブロックはブランク列により分けられている。４つ の角の行はコントロールプローブを含む；1.28×1.28平方cmの領域（特徴）の中 に全部で2600のプローブがあり、各領域は257×197ミクロンである。 標的RNAを上記の通りにして調製した。RNAを断片化し、そして ６ＸのSSPE，0.1％のトリトンＸ−100より成る溶液の中で18℃で60分かけてオリ ゴヌクレオチドアレーにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしなかった材料 をバッファーで洗い流し、そしてこのチップを25ミクロンのピクセル解像でスキ ャンした。 図43はチップ上のプローブに対応するーの標的を挙げた５′〜３′配列を提供 している。標的の中で異なっている位置（即ち、表示部位においてプローブと誤 対合する位置）を太字とする。図44はサンプルにハイブリダイズさせてチップを スキャンすることにより生成される蛍光イメージを示す。一部のプローブは優れ た識別力を供せず、そして一部のプローブは標的に対してハイブリダイズしない ようであったが、優れた結果が達成された。この標的配列はプローブセットとは ６つの位置で相違した：４つのトランジション及び２つの挿入。４つのトランジ ションは全て検出され、そして特定のプローブをアレーの中に容易に組込んで挿 入又は欠失を検出することができた。図45は、チップ上の野生型プローブに比し ての標的配列における４つのトランジションの検出を例証している。 ２人のヒトに由来するmt DNA配列の全Ｄ−ループ領域(1.3kb)にわたってタイ ル貼りしたプローブを含んで成る更なるチップを構築した。これらのプローブは 基礎的タイル貼り手法を利用して４列にタイル貼りされている。これらのプロー ブは、３′末端からヌクレオチドにおいて疑問位を有する重複15量体である。一 人目由来の対照配列上にタイル貼りしたプローブの完全グループ（mt１と表示） はチップの上半を占めている。チップの下半は２番目のクローンmt２に基づく類 似の配備を含む。プローブを1.28×1.28cmの領域において合成し、これは115×1 20セルの行列を含んでいた。このチップは全部で10,488のmt DNAプローブを含む 。 標的DNAの６つのサンプルを６人の個体の毛根から抽出した。ヒ トmt DNAの15935〜667位に広がる1.3kbの領域をPCR増幅し、バクテリオファージ Ｍ13にクローニングし、そして慣用の方法により配列決定した。この1.3kbの領 域を、Ｔ３及びＴ７RNAポリメラーゼプロモーター配列で標識したプライマー を用い、ファージクローンから再増幅した。ラベル化したRNAを、Ｔ３ RNAポリ メラーゼ及びフルオレセイン化ヌクレオチドを用いるin vitro転写により作り、 断片化し、そしてmt DNAコントロール再配列決定（resequencing）チップに６Ｘ のSSPE＋0.05％のトリトンＸ−100の中で室温で60分かけてハイブリダイズさせ た。６ＸのSSPE＋0.005％のトリトンＸ−100を用いて室温で６回洗浄を行い、そ してそのチップを解読した。シグナル強度はチップ上でかなり異なるが、この検 出系の広いダイナミックレンジは数桁にわたる強度の高精度な定量を可能とした 。比較的低いシグナル強度でさえも高精度な結果をもたらした。 ５種類のクローン（mt１〜５）をそれぞれ別々のチップにハイブリダイズさせ た。対照配列も対比目的のためにハイブリダイズさせた。プローブセル当りの平 均カウント数を決定し、そして自動化ベースコーリング(basecalling)ソフトウ ェアにより配列を解読するのに用いた。チップからの解読した配列の精度を以下 にまとめる。分析した５つの標的由来のデーターを合成すると、チップは全部で 6310ヌクレオチドを解読した。標的配列の中のこれらのヌクレオチドのうち、55 は対照配列とは異なっていた（慣用の配列決定により判断）（この55のヌクレオ チドのうちの41はチップから検出及び適正に解読された）。55のヌクレオチドの うちの６つはあいまいなも のとして検出されたが、その同一性は解読できなかった。55のヌクレオチドのう ちの２つは突然変異として検出されたが、その同一性は誤まっていた。55のヌク レオチドのうちの６つは野生型として不正確に判定された。対照配列と同一であ った標的配列の中の6255のヌクレオチドのうち、わずかに36（0.57％）のみが誤 まりであるか又はあいまいなものと評価された。 全ミトコンドリアゲノムを含んで成る対照配列に沿ってタイル貼りしたプロー ブを含んで成る更なるチップを構築した。このチップにおいては、ブロックタイ ル貼り手法を利用した。各ブロックは標的配列由来の７つのヌクレオチドを分析 するようにデザインされている。各ブロックは４組のプローブセットより成り、 このプローブセットはそれぞれ７本のプローブを有する。ブロックをチップの上 に、４本のプローブの７本の行で並べた。最上のプローブは各行において同一で あり、これは対照配列のサブ配列に対してまさに相補性なプローブである。各行 のその他の３つのプローブは最上のプローブとは疑問位を除き同一であり、それ らは行の中の４本のプローブそれぞれにおいて異なる塩基により占拠されている 。即ち、プローブの行のそれぞれに１つある７つの疑問位を除き、ブロックを占 拠しているプローブは全て同一であった。このアレーは多くのかかるブロックを 含んで成り、それぞれはミトコンドリアDNA対照配列の連続サブ配列へとタイル 貼りされている。全てにおいて、チップは15,569ヌクレオチドの対照配列がタイ ル貼りされており、42位において二重タイル貼りが伴う。62,276のプローブは30 4×315セルのアレーを占拠し、各セルは42×41ミクロンの領域を有する。 このチップをＤ−ループ領域について述べた通りにして同じ標的配列にハイブ リダイズさせたが、ただしハイブリダイゼーションは15℃で２hrとした。このチ ップを５ミクロンの解像度でスキャンし 、セル当り約64ピクセルを有するイメージを供した。Ｄ−ループ領域に沿ってタ イル貼りされたプローブブロックについては、配列特異的ハイブリダイゼーショ ンパターンが得られた。その他のブロックに関しては、バックグランドハイブリ ダイゼーションしか観察されなかった。 これらの結果は、慣用の配列決定法に比べ（これでは解読長さはゲル電気泳動 の解像度により制限される）、本発明のDNAチップ及び方法を利用してより長い 配列が解読できることを示す。ハイブリダイゼーション及びシグナル検出は１時 間も必要とせず、そしてバッファー、温度、プローブ及び試薬の適宜の選定によ り容易に短縮できうる。III．本発明の実施の態様 Ａ．VLSIPS（商標）技術 前述の通り、VLSIPS（商標）技術は数多くの特許公開物に記載されており、そ して本発明のオリゴヌクレオチドアレーを作るのに好適である。どのようにして この技術をDNAチップを作製及びスクリーンするのに利用できるかの簡単な説明 を本実施例及び添付図面に供する。このVLSIPS（商標）法においては、光をマス クを通じて、固相支持体の表層上の光除去性保護基で保護された官能基（オリゴ ヌクレオチドについては、一般に−OH）に照射して活性化させる。光活性化の後 、それ自身が光除去性保護基により保護されている（５′−OHで）ヌクレオチド 構成単位をこの支持体の活性化領域にカップリングさせる。このプロセスは異な るマスク又はマスク方向及び構成単位を用いて繰り返して、多種多様なオリゴヌ クレオチドの非常に高密なアレーを作ることができる。このプロセスを図46に示 す；図47はどのようにしてこのプロセスが、ダイマー、トリマー等々を形成する ように４種の全てのヌクレオシドをカップリングする ことによって合成する「ヌクレオシド順列組合せ」又はオリゴヌクレオチドを調 製するのに利用されうるかを例示している。 ペプチド、ポリカルバメート及びオリゴヌクレオチドアレーの順列組合せの化 学合成についての新しい方法が近年報告されている（Fodorら、1991，Science 2 51：767-773；Choら、1993，Science 261：1303-1305；及びSouthernら、1992， Genomics 13：1008-10017を参照のこと；各々は引用することで本明細書に組入 れる）。これらのアレー、又は生物学的チップ(Fodorら、1993，Nature 364：55 5-556；引用することで本明細書に組入れる)は高密度の情報性に富む方式で正確 な位置において特定の化学化合物を有し、そして生物学的認識過程の研究にとっ ての有力な手段である。このアレー技術の特に注目される用途はDNA配列分析の 分野にある。短いオリゴヌクレオチドプローブに対するDNA標的のハイブリダイ ゼーションパターンをDNA標的の一次構造情報を増やすために用いた。この方式 はハイブリダイゼーションによる配列決定、DNA診断及び核酸認識に影響を及ぼ す熱動力学的パラメーターの明確化において重要な用途を有する。 慣用のDNA配列決定技術は、ラベル化DNAフラグメントの電気泳動サイズ分離を 要するめんどうな手順である。別の手法、いわゆる「ハイブリダイゼーションに よる配列決定」（SBH）が提唱されている（Lysovら、1988，Dokl．Akad．Nauk S SSR 303：1508-1511；Bainsら、1988，J．Theor．Biol．135：303-307；及びDrm anacら、1989，Genomics 4：114-128；引用することで本明細書に組入れる）。 この方法は、より長いDNA標的鎖に基づく相補性配列の探索のために規定の配列 の短いオリゴヌクレオチドプローブのセットを利用する。ハイブリダイゼーショ ンパターンを標的DNA配列を再構築するために用いる。大量のプローブのハイブ リダイゼーション分 析を長いDNAの鎖を配列決定するのに利用できることが着想される。このハイブ リダイゼーション方法論の即時の用途において、局部のDNA配列を調べるために 少ない数のプローブを使用できる。 SBH手法は以下の実施例により例証できる。12量体の標的DNA配列AGCCTAGCTGAA をオリゴヌクレオチドプローブの完璧なセットと混合する。もし完璧な相補性の みを考慮するなら、65,536オクタマープローブのうちの５つ が標的とハイブリダイズするであろう。ハイブリダイズするプローブからの重複 配列の整合はオリジナルの12量体標的の相補体を再構築する： ハイブリダイゼーション方法論は標的DNAを表層に付加することにより実施で きる。標的を１度にオリゴヌクレオチドプローブセットで調べる（Strezoskaら 、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：10089-10093及びDrmanacら、1993，S cience 260：1649-1652を参照のこと；引用することで本明細書に組入れる）。 この手法は固定化及びハイブリダイゼーション検出のよく樹立された方法により 実施できるが、ただし数多くの操作を含む。例えは、オクタヌクレオチドの全セ ットを利用して配列をプロービングするには、数万回のハイブリダイゼーション 反応を行なわなくてはならない。他方、SBHは、プローブの各部位の同一性が既 知であるアレー方式においてプローブを表層に付加することにより実施できる。 次いで標的 DNAをプローブのアレーに付加する。一回の実験で決定されたハイブリダイゼー ションパターンは全ての相補性プローブの同一性を直接示す。 前述の通り、好適なオリゴヌクレオチドプローブ合成法は、高密度小型化アレ ーにおけるオリゴヌクレオチドプローブ合成を誘引する光の利用を含む。光分解 性５′保護化Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシドホスホラミジット、表層リンカ ー化学、及び多様順列組合せ合成手法がこの技術のために開発されている。立体 的に規定されたオリゴヌクレオチドプローブの行列ができ、そして相補性配列を 同定するためにこれらのアレーを利用する能力は、この方法により作られたDNA チップに対して蛍光ラベル化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによ り実証される。このハイブリダイゼーションパターンは高度の塩基特異性を示し 、そしてオリゴヌクレオチド標的の配列を示す。 光誘導式オリゴヌクレオチド合成のための基礎的な手法（１）を図46に概略す る。光分解性保護基（Ｘ）により修飾された固相支持体の表層をホトリトグラフ ィーマスクを通じて照光し、照光領域において反応性ヒドロキシル基を作った。 ３′−Ｏ−ホスホラミジット活性デオキシヌクレオシド（５′−ヒドロキシルに おいて光分解性基で保護）がその表層に供され、そして光に曝露した部位でカッ プリングを起こさせた。キャッピング及び酸化の後、この支持体をすすぎ、そし てその表層を第２のマスクを通じて照光し、カップリング用の更なるヒドロキシ ル基を曝露させた。第２の５′保護化３′−Ｏ−ホスホラミジット活性化デオキ シヌクレオシドがその表層に供される。選択光脱保護及びカップリングサイクル を所望の生成物セットが得られるまで繰り返す。 光誘導式化学合成は非常に効率的な合成手法であり、最少の化学 工程で最大数の化合物を作り出す。例えば、４ⁿのポリヌクレオチド（長さｎ） の完璧なセット又はこのセットの任意のサブセットがたった４×ｎ回の化学工程 で製造できる。照光のパターン及び化学反応の順序がその生成物及び位置を最終 的に決める。ホトリトグラフィーを使用しているため、この方法はオリゴヌクレ オチドプローブの高密度アレーを作るのに小型化できうる。かかるアレーの記述 にとって有用な命名法の例として、dA及びdTの全ての可能なオクタヌクレオチド を含むアレーは（Ａ＋Ｔ）⁸と記される。この多項式の展開はAAAAAAAAからTTTTT TTTに至る全部で256のオクタヌクレオチドプローブの同定を発揮する。ジヌクレ オチドの完璧なセットより成るDNAアレーは２の複雑性（complexity）を有する ものと称する。VLSIPS（商標）技術を利用してプローブの予めデザインしておい たアレーを並べるコンピューター補助法が1994年５月24日提出の同請受人の同時 係属出願USSN 08／249,188号に記載されている（全目的のため引用することで本 明細書に組入れる）。 プローブアレーに対するDNA標的のハイブリダイゼーションを実施するため、 これらのアレーを恒温制御式ハイブリダイゼーションチャンバーに入れた。フル オレセインラベル化DNA標的をチャンバーの中に入れ、そしてハイブリダイゼー ションを５minから24hr進行させた。このマトリックスの表層を光子カウント電 子部品の付いたエピ蛍光顕微鏡（２eiss Axioscop 20）において、アルゴンイオ ンレーザー（Spectra Physics Model 2020）由来の50〜100μＷの488nmのエキサ イテーションを利用してスキャンした。測定は、標的溶液をプローブマトリック スと接触させ、そして洗浄してから行うことができる。光子カウントを保存し、 そして８ビットイメージフォーマットへの変換を経たイメージファイルを提供す る。図51参照のこと。 DNA標的をオリゴヌクレオチドアレーにハイブリダイズさせるとき、Ｎ＝Lt− （Lp−１）の相補性ハイブリドが予測される（ここで、Ｎはハイブリド数、Ltは DNA標的の長さ、そしてLpはアレー上のオリゴヌクレオチドプローブの長さであ る）。例えば、オリゴヌクレオチドアレーにハイブリダイズした１量体標的に関 しては、Ｎ＝４である。プローブのいづれかの末端から２〜３残基の位置で誤対 合を有するハイプリダイゼーションは検出可能なシグナルを発するであろう。Ｎ についての上記の標識を改変することにより、長さLtのDNA標的及び複雑度Ｃの アレーについての検出可能なハイブリダイゼーションの数（Nd）を評価する関係 にまで到達できる。平均して５つの位置がバックグランドより高いシグナルを供 すると仮定する： Nd＝（１＋５（Ｃ−１））［Lt−（Lp−１）］。 オリゴヌクレオチドのアレーは光誘導式合成により効率的に作ることができ、 そしてDNA標的配列の同一性を決定するのに利用できる。順列組合せ手法を利用 するため、化合物の数は対数的に増え、一方化学カップリングサイクルの数は直 線的にのみ増える。例えば、４⁸（65,536）オクタヌクレオチドの完璧なセット を合成すると、その合成に、16回の追加サイクルのためにわずかに４時間多くか かるだけである。更に、順列組合せ合成手法は任意の所望の組成物のアレーを作 るために実施されうる。例えばドデカマー（４¹²）の全セットは48の光分解及び カップリングサイクルで生成できるため（ｂⁿ化合物はｂｘｎサイクルを必要と する）、ドデカマーの任意のサブセット（より短いオリゴヌクレオチドの任意の サブセットを含む）は48以下の化学カップリング工程において、適正なリトグラ フィーマスクデザインにより構築されうる。更に、アレーの中の化合物の数は合 成部位の密度及び全アレーサイズのみにより制約される 。近年の実験は、25μｍの部位において合成したプローブに対するハイブリダイ ゼーションを実証した。この解像度では、65,536オクタヌクレオチドの全セット は0.64cm²のアレーにおいて載せることができ、そして1,048,576ドデカヌクレオ チドのセットは2.56cmのアレーのみを必要とする。 ゲノム配列決定プロジェクトはDNA配列決定工学により最終的に制約される。 現状の配列決定方法論は複雑な手順を非常に頼りとし、そして実質的に人的作業 を必要とする。ハイブリダイゼーションによる配列決定は数多くの人的作業をよ り効率的、且つ自動化された方式へと変換せしめる能力を有する。光誘導型合成 はSBHのための小型化アレーの大量スクール生産のための効率的な手段である。 オリゴヌクレオチドアレーは一次配列決定用途に制約されない。単一塩基変化は ハイブリダイゼーションパターンに多重変化を引き起こすため、オリゴヌクレオ チドアレーは事前に推定されたDNA配列の精度をチェックする又は配列内の変化 をスキャンするための有力な手段を担う。オクタヌクレオチドの場合、標的DNA における単一塩基変化は８の相補体の損失をもたらし、そして８の新たな相補体 をもたらす。ハイブリダイゼーションパターンの対合は標準ゲル技術からのあい まいさの配列決定の解析、又はDNA突然変異現象の迅速検定において有用であり うる。光誘導式オリゴヌクレオチドアレーのこの潜在的に非常に高度な情報含有 量は遺伝子診断検査を変えるであろう。数百から数千の異なる遺伝子の配列対比 は、現状の１回の方式当り１又は数遺伝子ではなく、同時にアッセイされるであ ろう。慣用のアレーは多種多様な病原生物の迅速なる同定のための遺伝子マーカ ーを含むように構築することもできうる。 オリゴヌクレオチドアレーはRNA又はタンパク質DNA相互作用の配列特異性を研 究するのにも適用できうる。実験は、非Watson−Cr ickオリゴヌクレオチド構造の特異的な法則を推定するのに、又はアンチセンス 又はトリプルヘリックスの用途のための新規の合成ヌクレオシド類似体の利用を 調べるためにデザインされうる。適当に保護したRNAモノマーをRNA合成のために 採用してよい。このオリゴヌクレオチドアレーはオリゴヌクレオチド複合体の形 成及び安定性を支配する熱動力学的及び反応速度論的法則を推定する幅広い用途 に有用でありうる。 光除去性保護基の利用以外に、このヌクレオシドカップリング化学はオリゴヌ クレオチド合成のために今日日常的に利用されているものと非常に似ている。図 48は固相DNA合成法の脱保護、カップリング及び酸化工程を示す。図49はこの方 法において利用されるヌクレオシド構成単位の例示的な合成ルートを示す。図50 は好適な光除去性保護基MeNPOC、及びその基を活性形態で調製する方法を示す。 以下に記載の手順はどのようにしてこれらの試薬を調製するかを示す。ヌクレオ シド構成単位は、 ５′−MeNPOC−チミジン−３′−OCEP；５′−MeNPOC−Ｎ⁴−ｔ−ブチル フェノキシアセチル−デオキシシチジン−３′−OCEP；５′−MeNPOC-Ｎ⁴−ｔ− ブチル フェノキシアセチル−デオキシグアノシン−３′−OCEP；及び５′−MeNPOC−Ｎ⁴ −ｔ−ブチル フェノキシアセチル−デオキシアデノシン−３′−OCEPである。 １．4.5−メチレンジオキシ−２−ニトロアセトフェノンの調製 200mlの氷酢酸中の50ｇ（0.305mole）の3.4−メチレンジオキシアセトフェノ ン（Aldrich）の溶液を700mlの冷（２〜４℃）70％HNO₃に30分かけて撹拌しなが ら滴下した（注意：この反応は氷浴からの外部冷却抜きではオーバーヒートして しまい、これは危険であり、且つ副産物をもたらしてしまう）。しかしながら、 ０℃以下の温度では、反応は遅い。３〜５℃の温度が最適と思われる。この混合 物を３〜５℃で更に60分撹拌し、次いで周囲温度にまで到達させた。TLCによる 分析(ヘキサン中25％のEtOAc)は１〜２時間以内での出発材料の完全な変換を示 唆した。この反応が完了したら、その混合物を〜３リットルのクラッシュアイス に注ぎ、そして得られる黄色固体を濾過し、水で洗い、そして吸引乾燥した。収 量は〜53ｇ（84％）であり、更に精製することなく使用した。 ２．１−（４，５−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）エタノールの調 製 ナトリウムボロハイドライド(10ｇ；0.27mol)を氷、400mlのメタノール中の53 ｇ(0.25mol)の４，５−メチレンジオキシ−２−ニ トロアセトフェノンの撹拌懸濁物にゆっくりと加えた。この温度をNaBH₄のゆっ くりとした添加及び氷浴での外部冷却により10℃以下に保った。撹拌を周囲温度 で更に２時間続け、その時点でTLC(CH₂Cl₂)はケトンの完璧な変換を示した。こ の混合物を１リットルの氷冷水に注ぎ、そして得られる懸濁物を塩化アンモニウ ムで中和し、次いで400mlのCH₂Cl₂又はEtOAcで３回抽出した（その生成物は濾過 により回収し、そしてこの時点で洗浄してよいか、しかしそれは水に若干可溶性 であり、従ってたった〜60％の収率しかもたらさない）。合わせた有機抽出物を ブラインで洗い、MgSO₄で乾かし、そしてエバポレートした。その粗生成物を主 要副産物から、少量のCH₂Cl₂又はTHF(〜175ml)の中での溶解、及びその後の撹拌 しながらのヘキサン(100ml)のゆっくりとした添加による沈殿により、精製した （収量51ｇ：全体で80％）。これは再結晶させてよいが（例えばトルエン−ヘキ サン）、これは収率を下げる。 ３．１−（４，５−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）エチルクロロホ ルメート（MeNPOC−Cl） ホスゲン（Flnka由来の20％ｗ／ｖ 500ml；965mmole；４当量）を400mlのドラ イTHF中の50ｇ（237mmole；１当量）の１−（４，５−メチレンジオキシ−２− ニトロフェニル）エタノールの冷撹拌溶液にゆっくりと加えた。この溶液を周囲 温度で一夜撹拌し、その時 点でTLC(20％のEt₂O／ヘキサン）は＞95％の変換を示した。この混合物をエバポ レートし（過剰のホスゲンを除くには、下流に水性NaOHトラップの付いたオイル ・レス・ポンプが推奨される）、粘性の茶色油を得た。精製は、20％のEt₂O／ヘ キサンで溶出させる短いシリカゲルカラム（９×13cm）でのフラッシュクロマト グラフィーにより行った。一般に55ｇ（85％）の固形黄色MeNPOC−Clかこの手順 により得られる。この粗材料を１：１のエーテル／ヘキサンの中で２〜３回再結 晶させた。このスケールで、１回目では〜100mlを使用し、数％のTHFを加えて溶 解を助け、次いで−20℃で一夜冷却した（この手順は最適化していない）。この 生成物を−20℃でデシケート保存すべきである。 ４．５′−Menpoc−２′−デオキシヌクレオシド−３′−（Ｎ，Ｎ−ジイソプ ロピル−２−シアエチルホスホラミジット （ａ）５′−MeNPOC−ヌクレオシド Base＝チミジン（Ｔ）；Ｎ−４−イソブチル２′−デオキシシチジン(ibu−dC) ； Ｎ−２−フェノキシアセチル２′デオキシグアノシン(PAC−dG)；及び Ｎ−６−フェノキシアセチル２′デオキシアデノシン(PAC−dA) ４種の５′−MeNPOCヌクレオシドの全てを以下の手順により塩基−保護化２′ −デオキシヌクレオシドから調製した。この保護化２′−デオキシヌクレオシド （90mmole）を250mlの無水ピリジンによる２回の共エバポレーションにより乾燥 させた。次にこのヌクレオ シドをアルゴン下で300mlの無水ピリジン(又はdG^PACヌクレオシドについては１ ：１のピリジン／DMF)の中に溶解し、そして水浴の中で〜２℃に冷却した。100m lのドライTHF中の24.6ｇ(90mmole)のMeNPOC−Clの溶液を30分かけて撹拌しなが ら加えた。水浴を除き、そしてこの溶液を室温で一夜撹拌した(TLC：CH₂Cl₂中の ５〜10％のMeOH；２つのジアステレオマー）。溶媒を真空でエバポレーション後 、粗材料を250mlの酢酸エチルに含ませ、そして飽和水性NaHCO₃及びブラインで 抽出した。その有機相をNa₂SO₄で乾かし、濾過し、そしてエバポレートして黄色 フォームを得た。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより最終的に 精製して（９×30cmのシリカゲルカラムで、CH₂Cl₂中の２％〜６％のMeOHの段階 式勾配）。精製したジアステレオマー混合物の収率は65〜75％の範囲であった。 （ｂ）５′−Menpoc−２′−デオキシヌクレオシド−３′−（Ｎ，Ｎ−ジイソ プロピル）２−シアノエチルホスホラミジット ４種のデオキシヌクレオシドを、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル クロロホスホラミジット、又は２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ イソプロピルホスホラミジットのいづれかを用いてホスフィチル化した。16.6ｇ (17.4ml；55mmole)の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトライソプロ ピルホスホロ ジアミジットを、250mlのドライCH₂Cl₂中の50mmoleの５′−MeNPOC−ヌクレオシ ド及び4.3ｇ（25mmol）のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの溶液にア ルゴン下で周囲温度で加えた（反応はTLC：45：45：10のヘキサン／CH₂Cl₂／Et₃ Nによりモニターした）。有機相を飽和水性NaHCO₃及びブラインで洗い、次いでN a₂SO₄で乾かし、そして乾くまでエバポレートした。粗アミジットをフラッシュ クロマトグラフィーにより精製した（９×25cmのシリカゲルカラム；ヘキサン／ CH₂Cl₂／TEA−Ａ，Ｃ，Ｔについては45：45：10；Ｇについては０：90：10）。 精製アミジットの収率は約90％であった。 Ｂ．ラベル化DNAの調製／アレーへのハイブリダイゼーション １．PCR PCR増幅は一般に、反応当り以下のものより成る混合物の中で行う： １μｌのゲノムDNA；10μｌづつのプライマー（10pmol／μｌストック）；10μ ｌの10×PCRバッファー（100mMトリス−Cl pH8.5，500mM KCl，15mM MgCl₂）；1 0μｌの２mMのdNTPs（100mM dNTPストックより調製）；2.5 ＵのTaqポリメラー ゼ（Perkin Elmer Ampli Taq^TM，５Ｕ／μｌ）；及びH₂Oを100μｌまで。 サイクル条件は通常40サイクルとするが（94℃で45sec.，55℃で30sec.，72℃で 60sec.）、しかしサンプルのタイプ間でかなり変えることを要しうる。これらの 条件は、Perkin Elmer 7600サーモサイクラーの中の0.2mlの薄壁チューブについ てである。Perkin Elmer 1992／93カタログの9600サイクルタイム情報について 参照のこと。標的、プライマーの長さ及び配列組成も、いろいろな他の要因のう ちでパラメーターに影響を及ぼしうる。 200〜1000bpサイズの範囲における生成物に関し、反応体の２μ ｌを適当なサイズの標準品を用いて1.5％の0.5×TBEアガロースゲルでチェック した(HaeIIIで切断したphiX 174が慣用である）。PCR反応は数ピコモルの生成物 をもたらすべきである。夾雑の可能性をチェックするのにネガティブコントロー ル（即ち、ゲノムDNAの代わりに１μｌのTE）を含ませるのが有用である。夾雑 を避けるためには、先の実験由来のPCR生成物を、適宜フィルターチップを用い て、その後の反応から隔離しておく。一連のワーキング溶液及び保存用マスター 溶液を別々に利用することが、マスター溶液ストックを汚染してしまわないこと に限り、有用である。 ゲノムDNAからの短いフラグメントの簡単な増幅のため、一般に、Mg²⁺濃度を 最適化する必要はない。良好な手順は以下の通りである：酵素抜きのマスター混 合物を作る；ゲノムDNAサンプルを個々のチューブ又は反応ウェルに分注する； 酵素をマスター混合物に加える；そして各ウェルに、各時新しいフィルターチッ プを用いて、マスター溶液を分注する。 ２．精製 組込まれなかったヌクレオチド及びプライマーのPCRサンプルからの除去はPro mega Magic RCR Preps DNA精製キットを用いて行った。完全サンプルはキットに より供される仕様書に従って行うことができる（章IIIＢ「Sample preparation for direct purification from PCR reactions」）。50μｌのTE又はH₂Oの中で のPCR生成物の溶出の後、溶出液をマイクロ遠心機で12,000rpmで20sec.遠心し、 そして任意の目視可能なペレットの形成を避けるように注意しながら新しいマイ クロ遠心チューブに45μｌを移し入れた。樹脂は時折り溶出工程の際にキャリー オーバーされる。この移入は「Magic PCR」樹脂との線形増幅反応の過失的な夾 雑を防ぐ。その他の方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィーも利用してよい 。 ３．線形増幅 0.2mlの薄壁PCRチューブの中で、４μｌの精製PCR生成物；２μｌのプライマ ー（10pmol／μｌ）；４μｌの10×PCRバッファー；４μｌのdNTPs（２mM dA，d C，dG，0.1mM dT）；４μｌの0.1mM dUTP；１μｌの１mMのフルオレセインdUTP （Amersham RPN 2121）；１ＵのTaqポリメラーゼ（PerKin Elmer，５Ｕ／μｌ） ；を混合し、そしてH₂Oを40μｌとなるまで加えた。 40サイクル（92℃で30sec.，55℃で30sec.，72℃で90sec.)のPCRを行う。これら の条件は、300ヌクレオチドのミトコンドリアDNAフラグメントを増幅するのに用 いるが、しかしその他のフラグメントにも適用できる。アガロースゲル上に目に 見える生成物バンドがなくても、容易に検出できるハイブリダイゼーションシグ ナルを供するに足りる生成物があるであろう。DNAをウラシルDNAグリコシラーゼ で処理しないとき（４参照のこと）、dUTPは反応から省略してよい。 ４．断片化 Promega Magic PCR Preps DNA精製キットを用い、線形増幅生成物を上記の第 ２章に従って精製した。0.2mlの薄壁PCRチューブの中で、40μｌの精製ラベル化 DNA；40μｌの10×PCRバッファー；及び0.5μｌのウラシルDNAグリコシラーゼ（ BRL １Ｕ／μｌ）を混合する。この混合物を37℃で15min、次いで97℃で10minイ ンキュベートし、使用するまで−20℃で保存する。 ５．ハイブリダイゼーション、スキャン及びストリッピング ハイブリダイゼーションバッファーのみでのスライドのブランクスキャンは、 スライドの使用準備が整っているかをチェックするのに有用である。バッファー をフローセルから取り出し、そしてハイブリダイゼーションバッファーの中の１ mlの（断片化）DNAと交換し 、そしてよく混合した。スキャンはラベル化標的の存在下で行った。図51はDNA チップをスキャンするための検出系を例示する。25℃のハイブリダイゼーション 温度を用いる30min間隔での一連のスキャンは非常に明確なシグナルを、通常は 少なくとも30minから２時間で生み出すか、しかしより長い時間、即ち一夜ハイ ブリダイズすることが所望されうる。50μＷ及び50μｍのピクセルのレーザーパ ワーを用い、新しいスライド当り数百から数千／ピクセルの域で最大カウント数 が得られるであろう。終了したら、このスライドを50％のホルムアルデヒドを用 いてストリッピングし、脱イオンH₂Oでよくすすぎ、ブロー乾燥し、そして室温 で保存する。 Ｃ．ラベル化RNAの調製／アレーへのハイブリダイゼーション １．標識化プライマー 標的核酸を増幅するのに用いるプライマーは、増幅核酸からRNAを作ることを 所望するなら、プロモーター配列を有すべきである。適当なプロモーター配列を 以下に示す： （１）Ｔ３プロモーター配列： （２）Ｔ７プロモーター配列： 及び（３）SP６プロモーター配列： 所望のプロモーター配列をPCRプライマーの５′末端に付加する。PCRプライマ ーペアーの各プライマーに異なるプロモーターを付加して、いづれかの鎖を一本 鎖PCR生成物から転写することが好都合でありうる。 DMT基が残るようにPCRプライマーを合成する。精製に基づくD MTはPCRにとっては不要であるが、しかし転写にとっては重要のようである。25 μｌの0.5ＭのNaOHを、オリゴヌクレオチドの回収の前にコレクションバイアル に入れておき、DMTグループが載っていることを保つ。標準の化学を利用して脱 保護する−55℃で一夜が好都合である。 HPLC精製はオリゴヌクレオチドを乾かし、１mlの 0.1ＭのTEAA(2.0Ｍのストッ クを脱イオン水に希釈し、0.2ミクロンのフィルターで濾過)に再懸濁し、次いで 0.2ミクロンのフィルターで濾過した。逆相HPLCに0.5mlを載せる（カラムはHami lton PRP-1セミ・プレップ、#79426であってよい）。勾配は０→50％のCH₃CN，2 5minとする(プログラム0.2μmol．prep.０〜50，25min)。所望の画分をプールし 、乾かし、200μｌの80％のHAcの中でRTで30min再懸濁する。200μｌのEtOHを加 え、乾かす。200μｌのH₂Oに再懸濁し、20μｌのNaAc pH5.5，600μｌのEtOHを 加える。氷の上に10分置き、マイクロ遠心機の中で12,000rpmで10min遠心する。 そのペレットを１mlのEtOMですすぎ、乾かし、200μｌのH₂Oに再懸濁する。乾か し、200μｌのTEに再懸濁する。A260を測定し、TE（10mMのHl2Cl，pH8.0，0.1mM のEDTA）中の10pmol／μｌの溶液とする。42量体のHPLC精製の後、0.2μmolのス ケール合成から約15nmolの収量が一般である。 ２．ゲノムDNA調製 500μｌ（10mMのトリスCl，pH8.0，10mMのEDTA，100mMのNaCl，２％（ｗ／ｖ ）のSDS，40mMのDTT、フィルター除菌）をサンプルに加える。1.25μｌの20mg／ mlのプロテイナーゼＫ（Boehringer）を加える。55℃で２時間インキュベートし 、１又は２回ボルテックスにかける。0.5mlの１：１フェノール：CHCL₃抽出を２ 回行う。各抽出の後、マイクロ遠心機で12,000rpmで５min遠心し、そし て0.4mlの上清液を回収する。35μｌのNaAc pH5.2と１mlのEtOHを加える。氷の 上に45分載せておく、次いで12,000rpmで30min遠心し、すすぎ、30分エアー乾燥 し、そして100μｌのTEに再懸濁する。 ３．PCR PCRは、一回の反応当り：１μｌのゲノムDNA；４μｌづつのプライマー（10pm ol／μｌストック）；４μｌの10×PCRバッファー(100mMのトリスCl pH8.5；500 mMのKCl；15mMのMgCl)；４μｌの２mMのdNTP(100mMのdNTPストックより調製)； １ＵのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer，５Ｕ／μｌ）；40μｌに至るH₂Oを含む 混合物の中で行った。約40サイクル（94℃で30sec.，55℃で30sec.，72℃で30se c.）を行ったが、ただしサイクル条件は変えることを要しうる。これらの条件は Perkin Elmer 9600の中の0.2mlの薄壁チューブ用である。200〜1000bpサイズ域 における生成物について、適当なサイズ標準品を用いて1.5％の0.5×TBEアガロ ースゲルで２μｌの反応体をチェックする。より大きい又はより小さい容量のた め（20〜100μｌ）、同量のゲノムDNAを使用してよいが、その他の成分を調節し ておく。 ４．in vitro転写 混合物：３μｌのPCR生成物；４μｌの５×のバッファー；２μｌのDTT；2.4 μｌの10mMのrNTP(Pharmacia由来の100mMの溶液)；0.48μｌの10mMのフルオレセ イン−UTP（フルオレセイン−12−UTP，10mMの溶液；Boehringer Mannheim由来 ）；0.５μｌのRNAポリメラーゼ（Promega Ｔ３又はＴ７ RNAポリメラーゼ）； を混合し、そしてH₂Oを20μｌとなるように加える。37℃で３ｈインキュベート する。反応物２μｌをサイズ標準品を用い、1.5％の0.5×TBEアガロースゲル上 でチェックする。５×バッファーは200mMの トリスpH7.5，30mMのMgCl₂，10mMのスペルミジン、50mMのNaCl及び100mMのDTTで ある（酵素を供給）。このPCR生成物は精製する必要がなく、そして転写混合物 に直接加えてよい。20μｌの反応は初期試験実験及びハイブリダイゼーションを 考慮している。100μｌの反応は「調製スケール」を考慮している（この反応は より多くの標的を得るためにスケールアップしてよい）。加えるPCR生成物の量 は様々とする；一般には、PCR反応は数pmolのDNAを生成するであろう。もしPCR 反応が多くの標的を生成しないなら、転写反応に加えるDNAの量を増やすべきで ある（同様にPCRを最適化すべき）。フルオレセイン−UTP、対、UTPの比は１： ５以上とするが、しかし１：３〜１：10も有効であろう。ビオチン−UTPでラベ ルし、そしてストレプアビジン−FITCにより検出して、フルオレセイン−UTP検 出と同じような結果を得ることもできる。 RNAの未変性アガロースゲル電気泳動につき、RNAバンドは通常DNA鋳型バンド よりも若干早く泳動するであろうが、しかしながら時折りその２本のバンドは一 緒に泳動する。ゲルの温度はRNAバンドの泳動に影響を及ぼしうる。in vitro転 写より生成したRNAはかなり安定であり、そして任意の分解の徴候を伴うことな く−20℃で数ケ月（少なくとも）にわたって保存できる。これは除菌していない ６ＸのSSPE，0.1％のトリトンＸ−100の中で−20℃で数日（少なくとも）保存で き、そして調製又は使用中に特別な予備注意を払うことなく、ハイブリダイゼー ションのために２回（少なくとも）再利用できる。RNA夾雑はむろん避けるべき である。細胞からRNAを抽出するとき、非常にす早く作業し、そして強力な変性 条件を利用することが好ましい。RNAの事前に夾雑したガラスウェアーを利用す るのは避けておく。新しいディスポーザブルプラスチックウェアーを使用するの が好ましく（滅菌は要しない）、なぜなら新たな プラスチックチューブ、チップ等は本質的にRNaseを有さないからである。DEPC による処理又はオートクレーブ処理は一般に不要である。 ５．断片化 転写混合物を94℃で40分加熱する。断片化の濃度はMg²⁺程度（一般には30mM） 、温度及び加熱時間を変えることにより調節する。 ６．ハイブリダイゼーション、スキャン及びストリッピング ハイブリダイゼーションバッファーのみの中のスライドのブランクスキャンは 、スライドの使用の準備ができているかをチェックするのに有用である。バッフ ァーをフローセルから取り出し、そしてハイブリダイゼーションバッファー中の １mlの(加水分解)RNAと交換し、そしてよく混合する。18℃で15〜30minインキュ ベートする。ハイブリダイゼーション溶液を取り出し、これは次の実験のために 保存しておく。フローセルを18℃に平衡化しておいた６ＸのSSPE／0.1％のトリ トンＸ−100の４〜５回の新鮮交換によりすすぐ。このすすぎはすばやく行うが 、しかし次のすすぎの前にフローセルが空となっていること及びセルの液をよく 混合することが重要である。25℃のハイブリダイゼーション温度を利用する30mi n間隔での一連のスキャンは通常少なくとも30minから２時間で非常に明瞭なシグ ナルを生み出すが、しかしより長い時間、即ち一夜ハイブリダイズすることが所 望されうる。50μＷ及び50μｍのピクセルのレーザーパワーを用い、新しいスラ イドのために数百から数千／ピクセルの域の最大カウント数が得られるであろう 。終了したら、このスライドを温水でストリッピングする。 これらの条件は例示であり、そして〜15ヌクレオチドのプローブ長さを想定し ている。ストリッピング条件はかなり厳重と考えられるが、しかし若干のシグナ ルがもし洗浄が厳重でないとしたら残り うる。にもかかわらず、洗浄後に残っているカウント数は標的RNAの存在下での シグナルに比べて非常に弱いであろう。あるケースにおいては、はるかに緩やか なストリッピング条件が有効である。ハイブリダイゼーション温度が低く、ハイ ブリダイゼーション時間が長いほど、スライドをストリッピングするのが難しく なる。より長い標的はより短い標的をストリッピングするよりも難しいことがあ る。 ７．シグナルの増幅 アレー上のプローブに結合したラベル化標的の検出度を高めるのに様々な方法 が利用できる。一の態様において、タンパク質MutS（Ｅ．コリ由来）又は同等の タンパク質、例えば酵母MSH1，MSH2及びMSH3；マウスRep−３及びストレプコッ カスHex−Ａを、標的ハイブリダイゼーションと共に利用して、誤対合塩基対を 含むプローブ−標的複合体を検出できる。直接的にラベルした又は間接的にラベ ルしたタンパク質は、標的核酸のハイブリダイゼーション中又はその後に加えて よく、そしてホモ−及びヘテロ−二本鎖核酸に示差的に結合する。多種多様な色 素及びその他のラベルを類似の目的のために使用してよい。例えば色素YOYO−１ は３以上のＧ残基のランを含んで成る配列を含む核酸に優先的に結合することで 知られる。 ８．反復配列の検出 ある状況においては、即ち反復配列又は高Ｇ／Ｃ含有量を有する標的核酸にお いては、非常に長いプローブが時折り最適検出のために必要である。DNAチップ により標的核酸中の特定の配列を検出する一の態様において、反復配列は以下の 通りにして検出する。このチップは各先端から様々な距離で変動する反復領域に 及ぶのに十分な長さのプローブを含んで成る。このサンプルは、ハイブリダイゼ ーションの前に、反復領域と相補性であるが、反復の全長よりも短 いラベル化オリゴヌクレオチドで処理する。この標的核酸を第２の異なるラベル でラベルする。ハイブリダイゼーションの後、このチップを、ラベル化標的及び ラベル化オリゴヌクレオチドプローブの双方に結合したプローブについてスキャ ンする；かかる結合プローブの存在は、少なくとも２つの反復配列があることを 示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フォドール，スティーブン ピー．エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303, パロ アルト，ナザン ウェイ 3863 (72)発明者 ジンジャース，トーマス アール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95054, サンタ クララ，ビスタ クラブ サーク ル 1568 (72)発明者 ヒュアン，エクシャロヒュア シー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94043, マウンテン ビュー，ジャクソン ストリ ート 937 (72)発明者 ヒュッベル，アール エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94040, マウンテン ビュー，クリサント ＃425 1929 (72)発明者 リップシュッツ，ロバート ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94301, パロ アルト，パロ アルト アベニュ 970 (72)発明者 ロバーン，ピーター イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94301, パロ アルト，ローウェル アベニュ 273 (72)発明者 ミヤダ，チャールズ ガレット アメリカ合衆国，カリフォルニア，サニー ベール（番地なし) (72)発明者 モリス，マクドナルド エス. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95172, サン ホセ，ピー，オー，ボックス 720488（番地なし) (72)発明者 シャー，ニラ アメリカ合衆国，カリフォルニア 95070, サラトガ，サラグレン 12135 (72)発明者 シェルドン，エドワード エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94025, メンロ パーク，アシュトン アベニュ 2031

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般のタイル貼りの請求項 １．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て、少なくとも２セットの以下のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成り、 （１）複数のプローブを含んで成る第１プローブセット：各プローブは対照配 列のサブ配列に対してまさに相補性である少なくとも３つのヌクレオチドのセグ メントを含んで成り、このセグメントは対照配列の対応ヌクレオチドに対して相 補性である少なくとも１の疑問位を含む； （２）前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含 んで成る第２プローブセット：この第２プローブセットにおけるこの対応プロー ブは、この第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又は少なく とも１の疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、その少なく とも１の疑問位が前記第１及び第２プローブ由来の２つの対応プローブのそれぞ れにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されていることを除き、同一である； ここで前記第１プローブセットにおけるプローブは前記対照配列における２つ の連続ヌクレオチドのそれぞれに各々が対応する少なくとも２つの疑問位を有し ている； 前記アレー。 ２．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て、少なくとも４セットの以下のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成り、 （１）複数のプローブを含んで成る第１プローブセット：各プロ ーブは対照配列のサブ配列に対してまさに相補性である少なくとも３つのヌクレ オチドのセグメントを含んで成り、このセグメントは対照配列の対応ヌクレオチ ドに対して相補性である少なくとも１の疑問位を含む； （２）前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含 んで成る第２、第３及ひ第４プローブセット、この第２、第３及び第４プローブ セットにおけるこれらのプローブは、この第１プローブセット由来の対応プロー ブを含んで成る配列又は少なくとも１の疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオ チドのサブ配列と、その少なくとも１の疑問位が前記第４組のプローブセット由 来の４つの対応プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠され ていることを除き、同一である； 前記アレー。 ３．前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含ん で成る第５プローブセットを更に含んで成り、前記第５プローブセット由来の対 応プローブは、前記第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又 はその少なくとも１の疑問位を含む、少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、 前記第５プローブセット由来の対応プローブにおいて前記少なくとも１の疑問位 が欠失していることを除き、同一である、請求項２記載のオリゴヌクレオチドア レー。 ４．前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含ん で成る第６プローブセットを更に含んで成り、前記第６プローブセット由来の対 応プローブは、前記第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又 はその少なくとも１の疑問位を含む少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、前 記第１プローブセットの由来の対応プローブにおけるその少なくとも１の疑問位 の隣りに追加のヌクレオチドが挿入されていることを除き、同一である、請求項 ２記載のオリゴヌクレオチドアレー。 ５．前記第１プローブセットが、前記対照配列における３連続ヌクレオチドの それぞれに対して各々が対応する少なくとも３の疑問位を有している、請求項２ 記載のアレー。 ６．前記第１プローブセットが、前記対照配列における50連続ヌクレオチドの それぞれに対して各々が対応する少なくとも50の疑問位を含んでいる、請求項２ 記載のアレー。 ７．前記第１プローブセットが、前記対照配列における100連続ヌクレオチド のそれぞれに対して各々が対応する少なくとも100の疑問位を有している、請求 項１又は２記載のアレー。 ８．前記第１プローブセットが、対照配列のヌクレオチドのうちの少なくとも 30％のヌクレオチドのそれぞれに対応する疑問位を有し、そして前記対照配列が 少なくとも100のヌクレオチドを含んで成る、請求項１又は２記載のオリゴヌク レオチドアレー。 ９．前記第１プローブセットが、前記対照配列を完璧に包括する複数のプロー ブを含んで成り、これらのプローブは前記対照配列との関係で、配列において互 いと重複し合っている、請求項８記載のオリゴヌクレオチドプローブ。 10．前記第１プローブセットが、前記対照配列の各ヌクレオチドに対応する疑 問位を有している、請求項９記載のオリゴヌクレオチドアレー。 11．前記プローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項10記載の オリゴヌクレオチドアレー。 12．前記アレーが100〜10,000のプローブを含んで成る、請求項１又は２記載 のオリゴヌクレオチドアレー。 13．前記アレーが10,000〜100,000のプローブを含んで成る、請 求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドアレー。 14．前記アレーが100,000〜10,000,000のプローブを含んで成る、請求項１又 は２記載のオリゴヌクレオチドアレー。 15．前記プローブがスペーサーを介して前記支持体に連結されている、請求項 １又は２記載のオリゴヌクレオチドアレー。 16．前記対照配列のサブ配列にまさに相補性である前記第１プローブセットの 各プローブにおけるセグメントが９〜21ヌクレオチドである、請求項１又は２記 載のオリゴヌクレオチドアレー。 17．前記セグメントがｎヌクレオチドの長さであり、そして前記サブ配列が少 なくともｎ−２ヌクレオチドの長さである、請求項16記載のオリゴヌクレオチド アレー。 18．前記第１プローブセットの各プローブが、前記対照配列のサブ配列にまさ に相補性であるセグメントより成る、請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド アレー。 19．前記第２、第３及び第４プローブセットのプローブが、前記第１プローブ セット由来の対応プローブと、その少なくとも１の疑問位が４組のプローブセッ ト由来の４つの対応プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠 されていることを除き、同一である、請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド アレー。 20．第５、第６及び第７プローブセットを更に含んで成り、ここで、前記第１ セットにおける各プローブのセグメントは、前記対照配列のヌクレオチドにそれ ぞれが対応する少なくとも２の疑問位を含み； この第２、第３及び第４プローブセットはそれぞれ前記第１プローブセットに おける各プローブに対する対応プローブを含んで成る、この第２、第３及び第４ プローブセットにおけるこれらの対応プローブは、この第１プローブセット由来 の対応プローブを含んで成 る配列又は第１疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、その 第１疑問位がこの４組のプローブセット由来の４つの対応プローブのそれぞれに おいて異なるヌクレオチドにより占拠されていることを除き、同一であり； この第５、第６及び第７プローブセットはそれぞれの前記第１プローブセット における各プローブに対する対応プローブを含んで成り、この第５、第６及び第 ７プローブセットにおけるこれらのプローブは、この第１プローブセット由来の 対応プローブを含んで成る配列又は第２疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオ チドのサブ配列と、その第２疑問位がこの４組のプローブセット由来の４つの対 応プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されていることを 除き、同一である； 請求項２記載のアレー。 21．前記第１プローブセットの各プローブが、前記対照配列の第２サブ配列に まさに相補性である少なくとも３ヌクレオチドの第２セグメントを更に含んで成 り、そして前記第２、第３及び第４プローブセット由来のプローブは、第１プロ ーブセット由来の対応プローブ又は少なくとも１の疑問位を除き前記第１及び第 ２セグメントを含んで成るそのサブ配列を含んで成る、請求項２記載のアレー。 22．１又は２つの位置を除き、前記対照配列のサブ配列に対してまさに相補性 である少なくとも７ヌクレオチドのセグメントを含んで成る少なくとも１のプロ ーブを含んで成る第５プローブセット：ここでこのセグメントは前記１又は２つ の位置ではない前記対照配列のヌクレオチドに対応する少なくとも１の疑問位を 含む； 前記第５プローブセットにおける各プローブに対するプローブをそれぞれが含 んで成る第６、第７及び第８プローブセット：ここでこの第６、第７及び第８プ ローブセット由来の対応プローブは第５ プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又は少なくとも１の疑問位 と前記１又は２つの位置とを含むその少なくとも９ヌクレオチドのサブ配列と、 その少なくとも１の疑問位であって４つのプローブそれぞれにおいて異なるヌク レオチドにより占拠されている位置を除き、同一である； を更に含んで成る請求項２記載のアレー。 23．前記第１プローブセットが前記プローブと前記対照配列との重複を反映す るような順序で前記支持体に一列で並ぶようにして前記プローブが支持体の上で 配備されており、そして追加のプローブセットが前記第１セットのプローブとの 関連で行で配備されており、これにより同一の疑問位を有するプローブは同一の 行に収まり、そして各行が少なくとも４つのプローブを含んで成るようになって いる、請求項２記載のアレー。 24．前記プローブが長さ12〜17ヌクレオチドである、請求項２記載のアレー。 25．前記プローブが長さ15ヌクレオチドであり、そして前記プローブの３′末 端上の部位に対する共有結合により付加されており、そして前記疑問位が前記プ ローブの３′末端に対して７位に位置している、請求項２記載のアレー。 26．第５、第６、第７及び第８プローブセットを更に含んで成り、 （１）第５プローブセットは複数のプローブを含んで成り、各プローブは第２ 対照配列のサブ配列に対してまさに相補性である少なくとも３ヌクレオチドのセ グメントを含んで成り、前記セグメントが前記対照配列の対応ヌクレオチドに対 して相補性である少なくとも１の疑問位を含み； （２）第６、第７及び第８プローブセットはそれぞれ前記第５プ ローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含んで成り、前記第６ 、第７及び第８プローブセットのプローブは、前記第５プローブセット由来の対 応プローブを含んで成る配列又はその少なくとも１の疑問位を含むその少なくと も３ヌクレオチドのサブ配列と、その少なくとも１の疑問位が、第５、第６、第 ７及び第８プローブセット由来の４つの対応プローブのそれぞれにおいて異なる ヌクレオチドにより占拠されていることを除き、同一である； 請求項２記載のアレー。 27．前記第１、第２、第３及び第４プローブセットが第１の長さのプローブを 有しており、そして前記第５、第６、第７及び第８プローブセットがその第１の 長さとは異なる第２の長さのプローブを有する、請求項22記載のアレー。 野生型及び突然変異対照配列についてのタイル貼り 28．固相支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであって 、前記アレーが第１及び第２プローブグループの少なくとも１のペアーを含んで 成り、各グループが請求項１に規定するオリゴヌクレオチドプローブの第１及び 第２セットを含んで成り； ここで前記第１グループ由来の第１プローブセットの各プローブは第１対照配 列のサブ配列に対してまさに相補性であり、そして前記第２グループ由来の第１ プローブセットの各プローブは第２対照配列のサブ配列に対してまさに相補性で ある、 アレー。 29．前記第２対照配列が第１対照配列の突然変異形態である、請求項28記載の アレー。 30．各グループが第３及び第４プローブセットを含んで成り、それぞれが第１ プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含んで成り、この第 ２、第３及び第４プローブセットのプロ ーブは、この第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又はその 疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、その疑問位がこの４ 組のプローブセット由来の４つの対応プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレ オチドにより占拠されていることを除き、同一である、請求項28記載のアレー。 31．少なくとも５ペアーの第１及び第２プローブグループを含んで成り、ここ でこれら５ペアーの第１グループ由来の第１プローブセットにおけるプローブは 、５種類の異なる関連第１対照配列由来のサブ配列とまさに相補性である、請求 項30記載のアレー。 32．少なくとも40ペアーの第１及び第２プローブグループを含んで成り、ここ でこれら40ペアーの第１グループ由来の第１プローブセットにおけるプローブは 、40種類の関連第１対照配列由来のサブ配列とまさに相補性である、請求項30記 載のアレー。 ブロックタイル貼り 33．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て、少なくとも以下のプローブのグループを含んで成るアレー： 対照配列のサブ配列に対してまさに相補性である少なくとも３ヌクレオチドの セグメントを含んで成る野生型プローブ：このセグメントはこの対照配列の第１ 及び第２ヌクレオチドに対応する少なくとも第１及び第２疑問位を有する； ３つの突然変異プローブの第１セット：それぞれは前記野生型プローブを含ん で成る配列又は前記第１及び第２疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドの サブ配列と、その第１疑問位であって前記３つの突然変異プローブ及び野生型プ ローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている位置を除き 、同一である； ３つの突然変異プローブの第２セット：それぞれは前記野生型プローブを含ん で成る配列又は前記第１及び第２疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドの サブ配列と、その第２疑問位であって前記３つの突然変異プローブ及び野生型プ ローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている位置を除き 、同一である。 34．前記野生型プローブのセグメントが、前記対照配列に３〜20の関連ヌクレ オチドに対応する３〜20の疑問位を含んで成り、そして前記アレーが３つの突然 変異プローブの３〜20の関連セットを含んで成り、これらの３つのプローブはそ れぞれ野生型プローブを含んで成る配列又はこの３〜20の疑問位を含むそのサブ 配列と、その３〜20の疑問位の１つがこれらの３つの突然変異プローブ及び野生 型プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されていることを 除き、同一であり、その３〜20の疑問位の１つはこれら３つの突然変異プローブ の３〜20の関連セットのそれぞれにおいて異なっている、請求項23記載のアレー 。 35．２組のプローブグループを含んで成る固相支持体に固定化されたプローブ のアレーであって、各グループは請求項33により規定されている通りであり、第 １グループは第１対照配列のサブ配列に対してまさに相補性であるセグメントを 含んで成る野生型プローブを含んで成り、そして第２グループは第２対照配列の サブ配列に対してまさに相補性であるセグメントを含んで成る野生型プローブを 含んで成る、アレー。 36．少なくとも10〜100組のプローブグループを含んで成り、それぞれは少な くとも10〜100の関連対照配列のサブ配列にまさに相補性であるセグメントを含 んで成る野生型プローブを含んで成る、請求項35記載のアレー。 プール化プローブ 37．標的配列を対照配列と対比させる方法であって： 対照配列とは少なくとも１のヌクレオチドで異なる対照配列変異体を同定する 、 各変異体に表示を割り当てる； プローブのプールアレーを用意する、各プールはアレーの個別のセルを占拠し ており、ここで各プールは特定の表示の割り当てられた各変異配列に対してまさ に相補性であるセグメントを含んで成り； 前記アレーを前記対照配列変異体を含んで成る標的配列と接触させる； 前記標的配列に対する前記アレーにおける前記プールの相対ハイブリダイゼー ション強度を決定する； 前記プールの相対ハイブリダイゼーション強度から前記標的配列を決定する； ことを含んで成る方法。 38．前記変異体が、エラーコードに従って割り当てられた番号である、請求項 37記載の方法。 39．前記変異体に、少なくとも１のアラビア数字及びそのアラビア数字につい ての少なくとも１の値を有する表示を割り当て、そして各プールが、特定のアラ ビア数字の特定の値が割り当てられている各変異配列に対してまさに相補性であ るセグメントを含んで成るプローブを含んで成る、請求項33記載の方法。 40．前記変異体に、ｎ個のアラビア数字を有する基数ｍの番号付け系の連続番 号が割り当てられており、そして前記アレーがｎ×（ｍ−１）のプローブプール を含んで成る、請求項39記載の方法。 41．各プールが、前記対照配列に対してまさに相補性であるセグ メントを含んで成るプローブを含んで成る、請求項40記載の方法。 格子タイル貼り 42．プールヌクレオチドＮにより第１疑問位が占拠されていることを除き対照 配列のサブ配列にまさに相補性であるセグメントを含んで成るプールプローブで あって、第２疑問位が（１）Ｍ又はＫ、（２）Ｒ又はＹ及び（３）Ｓ又はＷより 成る３つの群から選ばれるプールヌクレオチドにより占拠されており、そして第 ３疑問位がその群から選ばれる第２プールヌクレオチドにより占拠されており、 ここで、この第２疑問位を占拠しているプールヌクレオチドはその第２プールプ ローブと対照配列とを最大に整合させるときにその対照配列由来の対応のヌクレ オチドに相補性であるヌクレオチドで含んで成り、そしてこの第３疑問位を占拠 している３プールヌクレオチドはその第３プールプローブと対照配列とを最大に 整合させたときにその対照配列由来の対応のヌクレオチドに相補性であるヌクレ オチドを含んで成り、 ここでＮはＡ，Ｃ，Ｇ又はＴ（Ｕ）、ＫはＧ又はＴ（Ｕ）、ＭはＡ又はＣ、Ｒ はＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ（Ｕ）、ＷはＡ又はＴ（Ｕ）、そしてＳはＧ又はＣで ある、プールプローブ。 43．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て： それぞれが第１、第２及び第３プールプローブにより占拠されている第１、第 ２及び第３セル：各プールプローブは第１疑問位がプールヌクレオチドＮにより 占拠されていることを除き対照配列のサブ配列に対してまさに相補性であるセグ メントを含んで成り、第２疑問位が（１）Ｍ又はＫ、（２）Ｒ又はＹ及び（３） Ｓ又はＷより成る３つの群から選ばれるプールヌクレオチドにより占拠されてお り、そして第３疑問位がその群から選ばれる第２プールヌクレオチ ドにより占拠されており、ここで、この第２疑問位を占拠しているプールヌクレ オチドはこのプールプローブと対照配列とを最大に整合させるときにその対照配 列由来の対応のヌクレオチドに相補性であるヌクレオチドで含んで成り、そして この第３疑問位を占拠している３プールヌクレオチドはそのこのプールプローブ と対照配列とを最大に整合させたときにその対照配列由来の対応のヌクレオチド に相補性であるヌクレオチドを含んで成り、 ただし、この３つのプールプローブそれぞれにおける３つの疑問位の１つは対 照配列における同一の対応ヌクレオチドと整合されており、この疑問位はプール プローブの１つにおいてＮにより占拠され、そして他の２つのプールプローブの それぞれにおいて異なるプールヌクレオチドにより占拠されていることを条件と し、 ここでＮはＡ，Ｃ，Ｇ又はＴ（Ｕ）、ＫはＧ又はＴ（Ｕ）、ＭはＡ又はＣ、Ｒ はＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ（Ｕ）、ＷはＡ又はＴ（Ｕ）、そしてＳはＧ又はＣで ある、プールプローブ。 44．それぞれが第４及び第５プールプローブにより各々占拠されている第４及 び第５セル：ここで各プールプローブは請求項43に規定の通りである； を更に含んで成る請求項43記載のアレーであって、 ここで第２、第３及び第４プールプローブにおける３つの疑問位の１つは前記 対照配列の同一の対応ヌクレオチドと整合しており、この疑問位は、プールプロ ーブの１つにおいてＮにより占拠されており、そしてその他の２つのプールプロ ーブのそれぞれにおいて別のプールプローブにより占拠されており； ここで第３、第４及び第５プールプローブにおける３つの疑問位の１つは対照 配列における同一の対応ヌクレオチドと整合しており、この疑問位は、プールプ ローブの１つにおいてＮにより占拠され ており、そしてその他の２つのプールプローブのそれぞれにおいて別のプローブ により占拠されている； 前記アレー。 45．前記プールプローブが疑問位を除き同一である、請求項44記載のアレー。 46．前記第１、第２、第３、第４及び第５プールプローブは、互いと１個のヌ クレオチドの増加分により異なる５種類の対照配列関連サブ配列にまさに相補性 である、請求項44記載のアレー。 ブリッジタイル貼り 47．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て、以下の４つのプローブを含んで成るアレー： 第１及び第２セグメントを含んで成る第１プローブ：それぞれは少なくとも３ ヌクレオチドであり、そして対照配列の第１及び第２サブ配列に対してまさに相 補性であり、これらのセグメントは対照配列のヌクレオチドに相補性である少な くとも１の疑問位を含み、ここで（１）この第１及び第２サブ配列は不連続であ るか、又は（２）この第１及び第２サブ配列は連続しており、そしてこの第１及 び第２セグメントは対照配列の第１及び第２サブ配列の相補体に対して逆さまと なっている； 第１プローブを含んで成る配列又は前記第１及び第２セグメントのそれぞれに 由来する少なくとも３ヌクレオチドを含んで成るそのサブ配列と、プローブのそ れぞれにおいて異なる少なくとも１の疑問位を除いて、同一である、第２、第３ 及び第４プローブ。 48．前記第１及び第２サブ配列が対照配列の１又は２個のヌクレオチドにより 隔てられている、請求項47記載のアレー。 ２つの疑問位（野生型でない） 49．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの アレーであって、４プローブのセットを少なくとも１組含んで成り、各プローブ は対照配列由来のサブ配列とまさに相補性である少なくともヌクレオチドのセグ メントを含んでなり、ただしそのセグメントは２つの疑問位においてはまさに相 補性であってもそうでなくてもよく、ここで： 第１疑問位は４つのプローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占 拠されており； 第２疑問位は４つのプローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占 拠されており； 第１及び第２プローブにおいて、このセグメントは、その疑問位のうちの１つ 以下を除き、このサブ配列にまさに相補性であり；そして この第３及び第４プローブにおいて、このセグメントは、双方の疑問位を除き 、このサブ配列にまさに相補性である； アレー。 50．支持体に固定化されたプローブアレーであって、４プローブのセットを少 なくとも100組含んで成り、各セットは請求項44に規定の通りであり、少なくと も100セット由来のプローブは少なくとも100の関連セグメントを含んで成り、こ のセグメントは少なくとも100の関連の第１及び第２疑問位を有する、プローブ 。 ヘルパー突然変異 51．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て、以下のプローブセットを含んで成るアレー： １又は２つの位置を除き、対照配列のサブ配列にまさに相補性である少なくと も７ヌクレオチドのセグメントを含んで成る第１プローブ：このセグメントはこ の１又は２つの位置でない疑問位を含む； 第２、第３及び第４突然変異プローブ：それぞれは野生型プローブを含んで成 る配列又は前記疑問位と前記１又は２つの位置を含むそのサブ配列と、その疑問 位であって４つのプローブそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠され ている位置を除き、同一である。 完璧に対合したプローブの省略 52．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て、以下の少なくとも２セットのオリゴヌクレオチドプローブを含んで成り： （１）複数のプローブを含んで成る第１プローブセット：各プローブは疑問位 を除き、対照配列の少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列にまさに相補性である セグメントを含んで成る； （２）前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含 んで成る第２プローブセット：この第２プローブセットにおける対応プローブは 、この第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又は疑問位を含 むその少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、その少なくとも１の疑問位が前 記２つの対応プローブ及び前記対照配列に対する相補体のそれぞれにおいて異な るヌクレオチドにより占拠されていることを除き、同一である； ここで前記第１プローブセットにおけるプローブは前記対照配列における３連 続ヌクレオチドのそれぞれに各々が対応する少なくとも３つの疑問位を有する、 アレー。 方法 53．標的核酸と所定のヌクレオチド配列を含んで成る対照配列とを対比させる 方法であって： （ａ）この標的核酸を、固相支持体上に固定化されたオリゴヌク レオチドプローブのアレーにハイブリダイズさせる、ここでこのアレーは： （１）複数のプローブを含んで成る第１プローブセット：各プローブは対照配 列のサブ配列に対してまさに相補性である少なくとも３つのヌクレオチドのセグ メントを含んで成り、このセグメントは対照配列の対応ヌクレオチドに対して相 補性である少なくとも１の疑問位を含む； （２）前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含 んで成る第２プローブセット：この第２プローブセットにおけるこの対応プロー ブは、この第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又は少なく とも１の疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、その少なく とも１の疑問位が前記第１及び第２プローブ由来の２つの対応プローブのそれぞ れにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されていることを除き、同一である； を含んで成り、 ここで前記第１プローブセットにおけるプローブは前記対照配列における少な くとも３つのヌクレオチドのそれぞれに各々が対応する少なくとも３つの疑問位 を有している；そして （ｂ）前記アレーの中のどのプローブが、互いと比較して、前記標的核酸に特 異的に結合するかを決定し、ここでこのプローブの相対的特異的結合が、この標 的配列が対照配列と同一又は異なることを示唆する； ことを含んで成る方法。 54．前記アレーが、第３及び第４プローブセットを更に含んで成り、それぞれ は前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含んで成 り、この第２、第３及び第４プローブセ ットにおけるプローブは第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配 列又は前記少なくとも１の疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドのサブ配 列と、この少なくとも１の疑問位が４組のプローブセット由来の４つの対応プロ ーブそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されていることを除き、同 じである、請求項53記載の方法。 55．前記標的配列が、少なくとも１の未決定位置において対照配列に比して置 換されたヌクレオチドを有しており、そしてこのプローブの相対的特異的結合が 、標的配列におけるこの位置の位置決め及びそ位置を占拠するヌクレオチドを示 す、請求項54記載の方法。 56．前記ハイブリダイズ工程が、標的核酸及び第２標的核酸を前記アレーにハ イブリダイズさせることを含んで成り；そして 前記アレーの中のどのプローブが、互いと比べ、前記標的核酸又は第２標的核 酸に特異的に結合するかを決定する、ここでこのプローブの相対的特異的結合は この標的配列が対照配列と同一であるか又は異なるかを示し、且つこの第２標的 配列がこの対照配列と同じであるか又は異なるかを示唆する； ことを含んで成る方法。 57．前記標的配列がラベルを有し、そして前記第２標的配列が前記ラベルと異 なる第２ラベルを有する、請求項56記載の方法。 58．第１及び第２比率の前記第１及び第２標的配列を前記アレーにハイブリダ イズさせ、そして前記特異的結合がこの比率を示唆する、請求項56記載の方法。 59．（ｃ）前記標的核酸を前記アレーから除去する； （ｄ）第２標的核酸を前記アレーにハイブリダイズさせる； （ｅ）前記アレーの中のどのプローブが、互いと比べ、前記第２ 標的核酸に特異的に結合するかを決定する、ここでこのプローブの相対的特異的 結合は、この第２標的配列が対照配列と同一であるか又は異なるかを示唆する； ことを更に含んで成る方法。 60．標的核酸と所定のヌクレオチド配列を含んで成る対照配列とを対比させる 方法であって： 前記標的配列を請求項28記載のアレーとハイブリダイズさせる； どのプローブが、互いと比べ、前記標的配列にハイブリダイズするかを決定す る、ここでこのプローブの相対的特異的結合は、この標的配列が第１対照配列と 同一であるか異なるかを示唆する； どのプローブが、互いと比べ、前記標的配列にハイブリダイズするかを決定す る、ここでこのプローブ相対的特異的結合は、この標的配列が第２対照配列と同 一であるか異なるかを示唆する； ことを含んで成る方法。 61．前記ハイブリダイゼーション工程が、前記標的配列及び第２標的配列を前 記アレーにハイブリダイズさせることを含んで成り、そして第１グループ由来の プローブの相対的特異的結合はその標的が第１対照配列と同一であるかを示唆し 、そして第２グループ由来のプローブの相対的特異的結合はこの第２標的配列が この第２対照配列と同一であるかを示唆する、請求項60記載の方法。 62．前記第１及び第２配列が遺伝子のアレルである、請求項61記載の方法。 対比ハイブリダイゼーション 63．標的核酸と所定のヌクレオチドに配列を含んで成る対照配列とを対比させ る方法であって： （ａ）この標的核酸を、固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプロ ーブのアレーにハイブリダイズさせる、ここでこのア レーは： （１）複数のプローブを含んで成る第１プローブセット：各プローブは少なく とも１の疑問位を除き、対照配列のサブ配列に対してまさに相補性である少なく とも３つのヌクレオチドのセグメントを含んで成る； （２）前記第１プローブセットにおける各プローブに対する対応プローブを含 んで成る第２プローブセット：この第２プローブセットにおけるこの対応プロー ブは、この第１プローブセット由来の対応プローブを含んで成る配列又は少なく とも１の疑問位を含むその少なくとも３ヌクレオチドのサブ配列と、その少なく とも１の疑問位が前記第１及び第２プローブ由来の２つの対応プローブのそれぞ れにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されていることを除き、同一である； を含んで成り、そして （ｂ）前記アレーの中のどのプローブが、互いと比較して、前記対照配列に特 異的に結合するかを決定する； （ｃ）前記標的配列を前記アレーにハイブリダイズさせる； （ｄ）前記アレーの中のどのプローブが、互いと比較して、前記標的配列に特 異的に結合するかを決定する； ことを含んで成り、ここで、この対照及び標的配列に対する前記プローブの相 対的特異的結合は、前記対照配列が前記標的配列と同一であるか異なるかを示唆 する、方法。 64．前記対照配列が第１ラベルを有し、そして前記第２対照配列が前記第１ラ ベルとは異なる第２ラベルを有し、そして工程（ａ）及び（ｃ）を同時に行う、 請求項63記載の方法。 HIVチップ 65．前記対照配列がヒト免疫不全ウィルスに由来する、請求項２ 記載のアレー。 66．前記対照配列がヒト免疫不全ウィルスの逆転写酵素遺伝子に由来する、請 求項65記載のアレー。 67．前記対照配列がヒト免疫不全ウィルスのプロテアーゼ遺伝子に由来する、 請求項66記載のアレー。 68．前記対照配列が全長逆転写酵素遺伝子である、請求項66記載のアレー。 69．少なくとも3200本のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る請求項68記 載のアレー。 70．前記HIV遺伝子がBRU HIV株に由来する、請求項66記載のアレー。 71．前記HIV遺伝子がSF2 HIV株に由来する、請求項66記載のアレー。 72．前記対照配列が、ヒト免疫不全ウィルスの逆転写酵素遺伝子のコード鎖に 由来し、そして前記第２対照配列が、この逆転写酵素遺伝子の非コード鎖に由来 する、請求項28記載のアレー。 73．前記第１対照配列がヒト免疫不全ウィルスの逆転写酵素遺伝子に由来し、 そして前記第２対照配列が少なくとも１のヌクレオチドの置換を有する前記第１ 対照配列のサブ配列を含んで成る、請求項28記載のアレー。 74．前記置換が、前記第２対照配列を含んで成るヒト免疫ウィルスに対して薬 剤耐性を授ける、請求項73記載のアレー。 75．前記第１及び第２対照配列がヒト免疫不全ウィルスの第１及び第２株に由 来する逆転写酵素遺伝子である、請求項28記載のアレー。 76．前記第１対照配列がヒト免疫不全ウィルスの逆転写酵素遺伝子に由来し、 そして前記第２対照配列が病原微生物に由来の16S R NA又は16S RNAをコードするDNAに由来する、請求項28記載のアレー。 77．前記第１対照配列がヒト免疫不全ウィルスの逆転写酵素遺伝子に由来し、 そして前記第２対照配列がヒト免疫不全ウィルスのプロテアーゼ遺伝子に由来す る、請求項28記載のアレー。 78．前記対照配列がヒト免疫不全ウィルスに由来する、請求項54記載の方法。 79．前記対照配列がヒト免疫不全ウィルスに由来し、そして前記標的配列が第 ２ヒト免疫不全ウィルスに由来する、請求項78記載の方法。 80．前記標的配列が、少なくとも１の未決定位置において対照配列に比して置 換されたヌクレオチドを有しており、そしてこのプローブの相対的特異的結合が 、標的配列におけるこの位置の位置決め及びその位置を占拠するヌクレオチドを 示唆する、請求項79記載の方法。 81．前記標的配列が、少なくとも１の位置において前記対照配列に比して置換 されたヌクレオチドを有しており、前記置換がヒト免疫不全ウィルスに対して薬 剤耐性を授け、そしてプローブの相対的特異的結合が置換を示唆する、請求項80 記載の方法。 82．前記ハイブリダイズ工程が、標的核酸及び第２標的核酸を前記アレーにハ イブリダイズさせることを含んで成り；ここでこの第２標的配列は第３のヒト免 疫不全ウィルスの逆転写酵素遺伝子に由来し；そして 前記アレーの中のどのプローブが、互いと比べ、前記標的核酸又は第２標的核 酸に特異的に結合するかを決定する、ここでこのプローブの相対的特異的結合は この標的配列が対照配列と同一であるか又は異なるかを示し、且つこの第２標的 配列がこの対照配列と同じ であるか又は異なるかを示唆する； ことを含んで成る方法。 83．前記標的配列が第１ラベルを有し、そして前記第２標的配列が前記第１ラ ベルと異なる第２ラベルを有する、請求項82記載の方法。 84．第１及び第２比率の前記第１及び第２標的配列を前記アレーにハイブリダ イズさせ、そして前記特異的結合がこの比率を示唆する、請求項82記載の方法。 CFTRチップ 85．前記対照配列がCFTR遺伝子に由来する、請求項２記載のアレー。 86．前記対照配列がCFTR遺伝子のエクソン10であり、そして前記アレーが、長 さが10〜18ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブを1000本以上含んで成る 、請求項85記載のアレー。 87．前記アレーが、次の配列の群から選ばれる特定のヌクレオチド配列を含ん で成るプローブのセットを含んで成る、請求項85記載のアレー。 ３′−TTTATAXTAG; ３′− TTATAGXAGA; ３′− TATAGTXGAA; ３′− ATAGTAXAAA; ３′− TAGTAGXAAC; ３′− AGTAGAXACC; ３′− GTAGAAXCCA; ３′− TAGAAAXCAC; 及び ３′− AGAAACXACA; （ここで各セットは４プローブを含んで成り、そし て、Ｘは個別に各セットにつきＡ，Ｇ，Ｃ，及びＴで ある）。 88．前記配列の群が以下の配列を含んで成る、請求項85記載のアレー。 ３′−TTTATAXTAGAAACC; ３′− TTATAGXAGAAACCA; ３′− TATAGTXGAAACCAC; ３′− ATAGTAXAAACCACA; ３′− TAGTAGXAACCACAA; ３′− AGTAGAXACCACAAA; ３′− GTAGAAXCCACAAAG; ３′− TAGAAAXCACAAAGG; 及び ３′− AGAAACXACAAAGGA;（ここで各セットは４プローブを含んで成り、 そして、Ｘは個別に各セットにつきＡ，Ｇ，Ｃ，及びＴである）。 89．前記40の第１対照配列がCFTR遺伝子に由来する、請求項32記載のアレー。 90．前記40の第１対照配列が突然変異部位及び少なくとも１の隣接ヌクレオチ ドを含む、請求項89記載のアレー。 91．前記40の第１対照配列がCFTR遺伝子に由来する少なくとも５連続のヌクレ オチドを含んで成る、請求項90記載のアレー。 92．少なくとも一の第１対照配列が嚢胞性線維症遺伝子のコード鎖に由来し、 そして少なくとも一の第１対照配列がCFTR遺伝子の非コード鎖に由来する、請求 項89記載のアレー。 93．固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーであっ て、以下のプローブの少なくとも１のグループを含んで成るアレー： 嚢胞性線維症遺伝子由来の対照配列のサブ配列にまさに相補性で ある野生型プローブ：このセグメントは対照配列の５連続ヌクレオチドに対応す る少なくとも５つの疑問位を有する； ３つの突然変異プローブの第１セット：それぞれは、野生型プローブと、この ５つの疑問位のうちの第１位であって、この３つの突然変異プローブ及び野生型 プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている位置を除 き、同一である； ３つの突然変異プローブの第２セット：それぞれは、野生型プローブと、この ５つの疑問位のうちの第２位であって、この３つの突然変異プローブ及び野生型 プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている位置を除 き、同一である； ３つの突然変異プローブの第３セット：それぞれは、野生型プローブと、この ５つの疑問位のうちの第３位であって、この３つの突然変異プローブ及び野生型 プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている位置を除 き、同一である； ３つの突然変異プローブの第４セット：それぞれは、野生型プローブと、この ５つの疑問位のうちの第４位であって、この３つの突然変異プローブ及び野生型 プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている位置を除 き、同一である； ３つの突然変異プローブの第５セット：それぞれは、野生型プローブと、この ５つの疑問位のうちの第５位であって、この３つの突然変異プローブ及び野生型 プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドにより占拠されている位置を除 き、同一である。 94．第１及び第２プローブグループを含んで成り、各グループは請求項93に規 定の通りであり、前記第１グループは第１対照配列にまさに相補性である野生型 プローブを含んで成り、そして前記第２グループは第２対照配列にまさに相補性 である野生型プローブを含んで成り、ここでこの第２対照配列は第１対照配列の 突然変異形態 である、請求項93記載のアレー。 95．前記第１対照配列がCFTR遺伝子に由来し、そして前記第２対照配列が第１ 対照配列の突然変異形態である、請求項94記載のアレー。 96．前記標的配列及び第２標的配列がCFTR遺伝子のヘテロ接合アレルに由来す る、請求項56記載の方法。 Ｐ53チップ 97．前記対照配列がｐ53遺伝子に由来する配列である、請求項２記載のアレー 。 98．前記対照配列がhMLH1遺伝子に由来する、請求項２記載のアレー。 99．前記対照配列がMSH2遺伝子に由来する、請求項２記載のアレー。 100．前記対照配列がヒトｐ53遺伝子に由来し、そして前記第２対照配列がhML H1遺伝子に由来する、請求項28記載のアレー。 101．第９、第10、第11及びプローブセットを更に含んで成る請求項100記載の アレであって： （１）第９プローブセットは複数のプローブを含んで成り、各グループは第３ 対照配列のサブ配列にまさに相補性である少なくとも３ヌクレオチドのセグメン トを含んで成り、このセグメントはこの第３対照配列の対応のヌクレオチド相補 性である少なくとも１の疑問位を含み； （２）この第10、第11及び第12プローブセットはそれぞれ第９プローブセット における各プローブに対する対応プローブを含んで成り、この第10、第11及び第 12プローブセットにおけるプローブはこの第９プローブセット由来の対応プロー ブを含んで成る配列又はその少なくとも１の疑問位を含むその少なくとも３ヌク レオチドのサ ブ配列と、その少なくとも１の疑問位が、この第９、第10、第11及び第12プロー ブセット由来の４つの対応プローブのそれぞれにおいて異なるヌクレオチドによ り占拠されていることを除き、同一である； 前記アレー。 102．前記第１プローブセットが、エクソン６由来の少なくとも60連続ヌクレ オチドに対応する少なくとも60の疑問位を有する、請求項97記載のアレー。 103．前記対照配列がｐ53遺伝子のエクソン５であり、前記プローブが17ヌク レオチドの長さであり、そして前記第１プローブセットが前記対照配列にまさに 相補性であり、そして少なくとも１の疑問位が、各プローブの３′末端に対して ７位にあり、この３′末端は支持性に共有結合している、請求項98記載のアレー 。 ミトコンドリアチップ 104．前記対照配列がミトコンドリアゲノムに由来する、請求項２記載のアレ ー。 105．前記対照配列がＤ−ループ領域の配列である、請求項104記載のアレー。 106．前記Ｄ−ループ領域が全長である、請求項104記載のアレー。 107．前記対照配列が全長ミトコンドリアゲノムの少なくとも90％である、請 求項104記載のアレー。 108．前記対照配列がミトコンドリアゲノムの16280〜3566位により結合してい る、請求項104記載のアレー。