WO2005001125A1

WO2005001125A1 - 核酸の変異及び多型の判定方法

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Publication number: WO2005001125A1
Application number: PCT/JP2004/009275
Authority: WO
Inventors: Tomonori Nagaoka
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2005-01-06
Also published as: JPWO2005001125A1

Abstract

本発明は、DNAマイクロアレイを利用して変異又は多型の解析を行う場合に試料となる核酸分子が、配列に関してヘテロ(heterozygous / heterogeneous)である場合であっても、DNAマイクロアレイ上の各スポットからのシグナルがプローブと標的核酸との間の完全にマッチしたものなのか、又は不完全にマッチしたものなのかを同定する手段を提供することを課題とする。本発明は、完全マッチプローブの候補と、完全にマッチする核酸のみからなる試料を用いて得られたシグナル値を、生データより差し引くことにより非特異的ハイブリダイゼーションに起因するシグナル分の補正を行い、その補正シグナル値が一定値以上である場合に、完全マッチに由来するシグナルと同定することを特徴とする。

Description

明細書核酸の変異及び多型の判定方法技術分野

本発明は、マイクロアレイによる変異解析における変異及び多型の判定方法に関する。背景技術

遺伝子の突然変異情報の解析、疾病の予知や診断、ウィルスのタイピング等を行う遺伝子診断に関する技術が近年大幅に進歩している。例えば、正常な遺伝子配列又は既知の突然変異を有する遺伝子配列のそれぞれに相補的な DN Aプロ一ブを予め用意しておき、ここに、試料 DN Aを各種プローブにそれぞれ別個にハイブリダィズさせ、これらのハイブリッド量を検出 '比較することにより、試料 DN A中の変異の有無を判断する方法が、遺伝子診断法として行われている。ハイブリツドの検出には、.例えば試料 DNAに検出可能な標識を施し、その標識を検出することで間接的に DN A量を検出する方法がとられている。一般にこのような標識には、蛍光や放射性同位体、化学発光等が用いられている。

また、このような DN Aの持つ相補性を利用したハイブリダィズ反応をベースとし、数百個乃至数万個の DNAプローブを格子状に 2次元的に配列させ、試料溶液中の D N Aをこのアレイ上でハイブリダィズさせることで、複数の遺伝子の情報を一括して検出する DN Aマイクロアレイと呼ばれるシステムが普及し始めている。

D N Aマイクロアレイにおいては複数の遺伝子の状態を同時に解析することが可能であり、通常は遺伝子の発現解析等に利用されることが多いが、遺伝子の突然変異や SNP (—塩基変異多型）の定性的な解析にも利用されはじめている。

例えば、米国特許第 5 , 2 0 2 , 2 3 1号明細書には、 Sequence by Hybridization (S BH)法と呼ばれる、 D N Aマイクロアレイを利用した塩基配列決定法が記載されている。 S BH法においては、ある長さについて可能なオリゴヌクレオチドの塩基配列をアレイ上に固相化して並べ、検体 DNAとのハイプリダイゼ一ション反応によって形成される、完全に相補的なハイプリッドを検出することによつて配列を決定するものである。

また、 Science(l 99 6)、 274巻、 p p.6 1 0- 6 14は、プローブと標的配列との間のハイブリダィゼーシヨンは、完全にマッチする場合と、 1 塩基のミスマッチを含む場合とではハイブリダイズ強度が異なることを示し、更にシグナル強度の差異が生じることを利用した配列判定方法を開示している。

一般に、 S BHに限らず、オリゴヌクレオチドと検体 DNAとの間の相補性を調べる場合には、 1種類のプローブによってハイプリッドの有無を検査することは困難である。なぜならば、ハイブリッドの安定性はその配列によつて影響を受けるために、完全に相補的であると判断できる、絶対的なシグナル値が存在しないからである。そのため、上記文献（Science) に記載の方法では、 1 5merのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の中心部分に、標的配列と 1塩基ミスマッチを生じる塩基を配置した配列を用意し、これを用いて完全マッチと 1塩基ミスマッチに由来するシグナルの強度を比較して、完全マッチの有無が判定されている。

DNAマイクロアレイを利用して変異解析を行う場合に試料となる核酸分子は、配列に関してへテロである場合（heterozygousな場合、及び heterogeneousな場合）がある。例えば、哺乳類の細胞には、父系の配列と母系の配列とが存在しているから 2種類の配列種が存在する場合がある。また、癌細胞の場合のように配列の多様性がある場合には、更に多くの種類の配列が混在することが考えられる。従ってこのようなヘテロな核酸分子を含む試料の変異解析を行う場合には、単純に完全マッチと不完全マッチとを区別するだけでは、変異に関する十分な知見が得られることにはならない。また、複数種類の完全マッチが、異なる量比で混在する場合には、比較的シグナル強度の弱いものが、完全マッチのものなのか、それとも不完全マッチのものなのかを判定することは、シグナル値からは直接的には判断できないと考えられる。発明の開示

本発明は斯かる問題点に鑑みてなされたものであり、解析しょうとする試料中に、プローブと標的配列との完全マッチが複数種類存在するような場合であっても、完全マッチのハイブリッドを確実に同定することを可能にする手段を提供するものである。

即ち本発明の、核酸の変異及び多型の判定方法は、以下のような構成をとる。

( i) 本発明の変異又は多型の判定方法は、標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも 1塩基のミスマツチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マッチプローブと同一である少なくとも 1の不完全マッチプローブとからなるプロ一ブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させるステップ（ 1 ) ；各スポットにおいて形成されたハイプリッドからのシグナルを測定するステツプ（2 ) ；

所定のシグナル値（閾値 A) 以下の低強度シグナルを発するハイブリッド中のプローブを不完全マッチプローブ候補と判定するステップ（3 ) ；別の所定のシグナル値（閾値 B ) 以上のシグナルの中で最高強度のシグナルを発するハイプリッド中のプロ一ブを第 1完全マッチプローブ候補と判定するステップ（4 ) ；及び

前記の不完全マッチプロ一ブ候補と第 1完全マッチプロ一ブ候補とがともに存在する場合に、前記不完全マッチプローブ候補を不完全マッチプローブと判定し、更に前記第 1完全マッチプローブを第 1完全マッチプローブと判定するステップ（5 ) ；

を含むことを特徴とする。

( i i)上記（i)の変異又は多型の判定方法においては、前記のステップ（3 ) において不完全マツチプロ一ブ候補を判定できない場合、及び/又は前記のステツプ（4 ) において完全マッチプローブ候補を判定できない場合に、前記ステップ（ 1) 及び/又は（2) において接触及び/又は測定する条件を当初の条件から変更してから再度、前記ステップ（ 1 ) 乃至（5) からなる方法を実施することを含むことができる。

(iii) 上記（i) 又は（ii) の変異又は多型の判定方法にておいては、前記ステップ（5) の後に、

前記第 1完全マッチプローブ以外のプローブであって、所定の値（閾値 C) 以上のシグナル強度の中で最大のシグナルを発する八ィプリッド中のプロ一ブを第 2完全マッチプローブ候補と同定するステップ（6) ；

前記第 2完全マッチプロ一ブ候補を含むハィブリッド中のシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（a) 、及び（b) を行うステップ（7) ：前記第 1完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第 1 補正用核酸を、前記ステップ（ 1) 乃至（6) とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第 1補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ（a) ；及び

前記ステップ（a) で求めたシグナル値を、前記ステップ（1) で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイプリッドに由来するシグナルについての第 1補正シグナル値を求めるステップ（b) ；

前記補正ステップ（b) における第 1補正シグナル値が、前記の閾値 C以上のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを、第 2完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（b) における当該第 1補正シグナル値が、閾値 C未満のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを第 2完全マツチプロ一ブではないと同定するステップ（ 8 )

を更に含めることができる。

(iv) 上記の（iii) の変異又は多型の判定方法においては、前記ステップ (4) において閾値 B以上のシグナル値を発するスポットが複数個あり、前記ステップ（ 5 )において第 1完全マツチプロ一ブが判定されている場合に、前記ステップ（8) の後で、当該複数個のプローブであって、当該第 1完全マッチプローブ以外のプローブ（第 2完全マッチプロ一ブ候補）について、そのシグナル強度が大きいものから順に、上記補正ステップ（a) 及び（b ) を行うステップ（9 )

(伹し、このステップにおいては、

当該複数個ある第 2完全マッチプロ一ブ候補の中で第 n - 1番目（nは 2以上、プローブの種類以下の整数）に大きいシグナル値を有するハイプリッド中に含まれるプローブに対しては、

当該第 n - 1番目に大きいシグナルを発するハイプリッド中のプローブと完全マッチする配列のみからなる第 n補正用核酸を、前記ステップ（1 ) 乃至（6 ) とは別個に、前記プローブセッ卜と同一のプロ一ブセッ卜に対して接触させて、当該プローブセットが当該第 n補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定し；

当該測定されたシグナル値を、第 1補正用核酸から第 n - 1補正用核酸までをそれぞれ利用して補正を累積的に行ったシグナル値から差し引いて、第 n補正シグナル値を求め；そして

当該第 n補正シグナル値が、前記の閾値 C以上のシグナル強度である場合に、当該第 n補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを、第 n完全マッチプローブと判定し、又は当該第 n補正シグナル値が、前記の閾値 C未満のシグナル強度である場合に、当該第 n補正シグナル値を有するハイプリッド中のプロ一ブを完全マッチプロ一ブではないと同定する

(但し、第 n完全マッチプローブの判定前に、閾値 C未満の強度の第 m補正シグナル値（mは、 1以上、 n未満の整数）を有するハイブリッドが X個（Xは 0以上の整数）ある場合には、上記第 n完全マッチプローブを、第（n - x ) 完全マツチプローブと判定する））

を更に含めることができる。

( V ) 前記（i i i ) 又は（i v) の変異又は多型の判定方法においては、前記の補正ステップ（b ) の後、且つ前記ステップ（8 ) の前に、

予め求めておいた、前記のプローブセット中の各プローブの固相化量を相対値に変換し、この相対値に基づいて前記補正シグナル値を、当該固相化量に比例する固定化量補正シグナル値とするステップ（C ) を更に含めることができる。

(vi) 上記の（i) 乃至（V) の何れの変異又は多型の判定方法においても、前記プローブセット中の全プローブが、標的核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れかの配列に対するものとすることができる。

(vii) また上記の（i) 乃至（V) の何れの変異又は多型の判定方法においても、前記プロ一ブセット中のプローブが、標的核酸のセンス鎖に対するもの、及びアンチセンス鎖に対するものからなるものとすることができる。

(viii) 上記（vii) の変異又は多型の判定方法においては、センス鎖、及びアンチセンス鎖のそれぞれの第一完全マッチプローブが存在し、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおいて異なる結果が出た場合に、その異なる結果を出したプローブを、センス鎖及びアンチセンス鎖における結果の相違に関わらず、完全マッチプローブとは同定しないこととしてもよい。

(ix) 上記（i) 乃至（viii) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、センス鎖、又はアンチセンス鎖に第一完全マッチプローブが存在しない場合、第一完全マッチプローブが存在しない鎖の結果を判定に使用しないこととしてもよい。

(x) 上記（i) 乃至（ix) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値 Aが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値 Bが、シグナルの絶対値とすることができる。

(xi) 上記（iii) 乃至（ix) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値 A及び Cが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値 Bが、シグナルの絶対値とすることができる。

(xii) 上記（iii) 乃至（xi) の何れかの変異又は多型判定方法においては、前記の閾値 A、 B、及び Cを、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて異なる値とすることができる。

(xiii) 上記（X) 乃至（xii) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値 Aが相対値であり、第 1完全マッチプローブを含む八イブリッドに由来するシグナル強度に対して 1 5 %以下の大きさとすることがでさる。

(xiv) 上記（x) 乃至（xiii) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値 Aが相対値であり、第 1完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して 1 0 %以下の大きさとすることがでさる。

(XV) 上記（X) 乃至（xiv) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値 Cが相対値であり、第 1完全マッチプローブを含むハイプリッドに由来するシグナル強度に対して 2 0 %以上の大きさとすることができる。

(xvi) 上記（i) 乃至（XV) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記のプローブセットは、以上のプローブサブセッ卜の集合からなり、各プローブサブセットは、当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブの両端において塩基配列を伸張するか、又は短縮したオーバーラッピングプローブからなることができる。

(xvii) 上記（i) 乃至（XV) の何れかの変異又は多型の判定方法は、 S NPのタイビングのためとすることができる。

(xviii) 上記（xvii) の SNPのタイピングは、完全マッチプローブと判定する判定順位を上位から二つまでとすることができる。

(xix) 上記（i) 乃至（xviii) の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の標的核酸を、 K- r a s遺伝子コドン 1 2とすることができる。図面の簡単な説明

図 1 この図は、本発明の変異判定方法を実施するために使用した DNA マイクロアレイ上のスポットの配置を示す図である

図 2 この図は、プローブセット（アンチセンス鎖側）が固相化されている DN Aマイクロアレイに標的核酸（K_ras遺伝子第 1 2コドンを PCRで増幅したもの）を接触させ、 DNAマイクロアレイ上の各スポットにおいて形成されたハイブリッドに由来するシグナルを測定したものを示すものである。図 3 この図は、図 2におけるシグナル値を相対値で表したものである。図 4 この図は、第 1補正用核酸とプローブセット（アンチセンス鎖側）を接触させた場合のシグナル測定値を相対値で表したものである。

図 5 この図は、第 1捕正シグナルを相対値で表したものである（アンチセンス鎖側）。

図 6 この図は、第 1補正シグナルを、第 2完全マッチプローブ候補のシグナル値に対する相対値で表したものである（アンチセンス鎖側）。

図 7 この図は、第 2補正用核酸と、プローブセット（アンチセンス鎖側）を接触させた場合のシグナル測定値を相対値で表したものである。

図 8 この図は、第 2捕正シグナル値を相対値で表したものである。

図 9 この図は、プローブセット（センス鎖側）が固相化されている D N Aマイクロアレイに標的核酸（K-ras遺伝子第 1 2コドンを PCRで増幅したもの）を接触させ、 D N Aマイクロアレイ上の各スポットにおいて形成されたハイプリッドに由来するシグナルを測定したものを示すものである。

図 1 0 この図は、図 9におけるシグナル値を相対値で表したものである。図 1 1 この図は、第 1補正用核酸とプロ一ブセット（センス鎖側）を接触させた場合のシグナル測定値を相対値で表したものである。

図 1 2 この図は、第 1補正シグナルを相対値で表したものである（センス鎖側）。

図 1 3 この図は、第 1補正シグナルを、第 2完全マッチプローブ候補のシグナル値に対する相対値で表したものである（センス鎖側）。

図 1 4 この図は、本発明の変異又は多型判定方法における手順をフローチヤ一卜にしたものである。発明を実施するための最良の形態

(定義）

本願明細書においては、以下の用語を以下に定義した意味において用いる。「核酸」とは、 D N A、人工的ヌクレオチドを含む D N A、 R N A、及び人工的ヌクレオチドを含む R NA、 P N A、人工ヌクレオチドを含む P N Aの何れをも意味する。「ハイブリッド」とは、上記の核酸の何れかの間に形成される二重鎖を意味する。

「シグナル」とは、適当な手段により適宜検出 ·測定可能な信号であって、蛍光、放射能、化学発光等が含まれる。

以下においては、本発明の実施態様についての、構成、実施方法、効果等について、適宜、図を参照しながら説明する。

本発明の変異及び多型の判定方法は、標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも 1塩基のミスマッチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マッチプローブと同一である少なくとも 1の不完全マッチプローブとからなるプローブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させ、当該プローブセット中の各プローブと試料核酸とのハイプリッドからのシグナルを検出し、そのシグナル強度を比較することにより標的核酸中の配列を決定する方法において用いられるものである。本発明の変異及び多型の判定方法においては、標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも 1塩基のミスマッチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マツチプローブと同一である少なくとも 1の不完全マッチプローブとからなるプローブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させるステップ（ 1 ) ；各スポットにおいて形成されたハイブリッドからのシグナルを測定するステップ（2 ) ；所定のシグナル値（閾値 A ) 以下の低強度シグナルを発するハイプリッド中のプローブを不完全マッチプローブ候補と判定するステップ（3 ) ；別の所定のシグナル値（閾値 B ) 以上のシグナルの中で最高強度のシグナルを発するハイプリッド中のプローブを第 1完全マツチプローブ候補と判定するステップ（4 ) ；及び前記の不完全マッチプローブ候補と第 1完全マッチプローブ候補とがともに存在する場合に、前記不完全マッチプローブ候補を不完全マッチプローブと判定し、更に前記第 1完全マッチプローブを第 1完全マッチプローブと判定するステップ（5 ) を行う。これら一連のステップを行うのは、すでに述べたように、完全マッチのハイプリッドが形成された場合に発する絶対的なシグナル値というものがないため、完全マッチと考えられる場合と、不完全マッチと考えられる場合との相対的関係によりハイプリッドの形成条件の妥当性の判断を行う必要性があるためである。

ステップ（3 ) における閾値 Aは、絶対値である場合には、測定条件下において非特異的なシグナル強度と考えられる値とすることができる。この値は、使用する標的核酸の種類、調製方法、及び使用するプローブの配列等の諸条件によって変動させるべきものであるが、経験的に定めることができるものであり、その値は当業者らには自明である。また、閾値 Aを相対値で表す場合には、最高強度のシグナルに対して 1 5 %以下、好ましくは 1 0 %以下の大きさとする。最高強度に対してこのレベルのシグナル値を有するものであれば、不完全マッチハイブリッドに由来するものである確率が高い。一方、ステップ（4 ) における閾値 Bは、測定条件下において非特異的なシグナル強度と比較して有意に大きい値であり、閾値 Aと同様に、使用する標的核酸の種類、調製方法、及び使用するプローブの配列等の諸条件によって変動させるべきものであって、経験的に定めることができるものである。その値は当業者らには自明である。標的核酸が配列に関して均質である場合には通常、一つの最大ピークが測定されるのに対し、標的核酸に複数の配列種が混在する場合には、比較的強度の強いシグナルが複数測定される。

ステップ（3 ) において不完全マッチハイブリッドに由来すると考えられるものがあること、及びステップ（4 ) において非特異的なシグナル強度とは有意に異なる大きさのピークが少なくとも 1つあることが判定できれば、これらの相対的関係から、ハイブリダィゼ一シヨンが適切な条件で行われたと推定することができ、よって、ステップ（5 ) において不完全マッチプロ —ブと完全マッチプローブとを同定することが可能となる。一つの最大ピークが測定された場合には、そのピークを、そして複数測定された場合には、その中で最高強度を発するハイプリッド中のプローブを、第 1完全マッチプローブと同定することができる。ここで、前記のステップ（3 ) において不完全マッチプローブ候補を判定できない場合、及び/又は前記のステップ（4 ) において完全マッチプローブ候補を判定できない場合には、前記ステツプ ( 1 ) 及び/又は（2 ) において接触及び/又は測定する条件が不適切であつたと考えられるから、この条件を当初の条件から変更し、再度前記ステップ

( 1 ) 乃至（5 ) からなる方法を実施して、完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブの判定を行う。判定ができれば、変更後の条件が適切であつたといえる。

本発明の変異及び多型の判定方法は、上述の変異又は多型の判定方法において、更に、

前記ステップ（5 ) の後に、

前記第 1完全マッチプローブ以外のプローブであって、所定の値（閾値 C ) 以上のシグナル強度の中で最大のシグナルを発するハイブリッド中のプロ一ブを第 2完全マッチプローブ候補と同定するステップ（6 ) ；

前記第 2完全マツチプロ一ブ候補を含むハイブリッド中のシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（a) 、及び（b ) を行うステップ（7 ) ：前記第 1完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第 1 補正用核酸を、前記ステップ（ 1 ) 乃至（6 ) とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第 1補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ ) ；及び

前記ステップ（a) で求めたシグナル値を、前記ステップ（ 1 ) で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイプリッドに由来するシグナルについての第 1補正シグナル値を求めるステップ（b ) ；

前記補正ステップ（b ) における第 1補正シグナル値が、前記の閾値 C以上のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを、第 2完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（b ) における当該第 1補正シグナル値が、閾値 C未満のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを第 2完全マツチプローブではないと同定するステップ（ 8 )

を更に含むことができる。

閾値 Cは、絶対値とすることも、最高強度のシグナル値に対する相対値とすることも可能であるが、最高強度のシグナルに対する相対値を用いた方が、下記のシグナル補正ステップにおいて、シグナルの補正を行いやすくなり、また閾値の設定がより煩雑でなくなる。ここで変換する相対値としては、最高強度を 1 0 0としたときの相対値を百分率で表すものであることが好ましい。，

ステップ（6 ) においては、前記第 1完全マッチプローブを含むハイブリツド以外のハイブリッド中のプローブであって、所定の値（閾値 C ) 以上のシグナル強度を有するシグナルを発するハイブリッドを完全マッチプロ一ブ候補と同定することが行われる。ここで、閾値 Cは、閾値 A及び Bと同様に、使用する標的核酸の種類、調製方法、及び使用するプローブの配列等の諸条件によって変動させるべきものであって、経験的に定めることができるものであり、その値は当業者らには自明である。具体的な値としては、閾値 Cは相対値で表すと、第 1完全マッチプローブを含むハイプリッドに由来するシグナル強度に対して 2 0 %以上の大きさとすることができる。

ステップ（7 ) においては、前記第 2完全マッチプロ一ブ候補を含むハイブリツドからのシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（a) 、及び ( b ) が行われる。

ここで補正ステツプは、

前記第 1完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第 1補正用核酸を、前記ステップ（ 1 ) 乃至（6 ) とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第 1補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ（a) を行い；そして

前記ステップ（a) で求めたシグナル値を、前記ステップ（1 ) で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイプリッドに由来するシグナルについての第 1補正シグナル値を求めるステップ（b ) を行うものである。

上記の補正ステップ（a) において、第 1完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第 1補正用核酸とのハイプリダイゼーシヨンを行わせるのは、標的核酸中に複数の完全マッチが含まれる可能性がある場合に、測定シグナルに比較的シグナル強度が強いものの、それが不完全マツチによるものなのか、それとも標的核酸試料中に少量の割合で含まれるその他の完全マッチによるものなのかが不明のことがあるが、それを明確にするためである。第 1完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第 1補正用核酸とのハイブリダィゼ一ションの場合であっても、当該完全マッチプロ一ブは、補正用核酸と非特異的なハイプリダイゼーションを行うことにより、ある一定のシグナルを発生することがある。そのため、この非特異的八イブリダィゼ一シヨンに由来するシグナル値を補正ステップ（a) において求めておき、次のステップ（b ) において、すでに求めたシグナル値から差し引いて、各ハイプリッドに由来するシグナルについての補正シグナル値を求める。このようなステップを経ることにより得られた補正シグナル値は、各プロ一ブが非特異的にハイブリダイズすることにより生じた八ィブリッドが発するシグナル分を差し引いたものとなり、特異的なハイプリダイゼーシヨンのみに起因したシグナル値となる。

補正ステップを行った後、前記補正ステップ（b ) における第 1補正シグナル値が、前記の閾値 C以上のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを、第 2完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（b ) における補正シグナル値が、閾値 C未満のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを第 2完全マツチプロ一ブではないと伺定するステップ ( 8 ) を行う。第 1完全マッチプローブの場合には、それが最強のシグナルを発するハイブリッドに含まれていて、且つ、少なくとも 1の不完全マッチが存在することにより相対的に同定することが可能であった。しかし、これらの中間レベルのシグナル強度の場合、即ち、第 1完全マッチプローブを含むハイプリッド由来のシグナルよりも弱いが、非特異的シグナル値よりも大きいと考えられるシグナルの場合には、それが標的核酸中に少ない割合で含まれる完全マッチによるものなのか、それともあくまで通常よりも少し高いレベルの非特異的シグナルであるのかを識別する必要が生じる。そしてこの識別は、非特異的ハイプリダイゼ一ションが比較的高頻度で生じている条件下で測定を行っている場合には、非常に重要である。本発明においては、標的核酸と各完全マッチプロ一ブとの間において生じる非特異的ハイブリダィゼ一ションに起因するシグナルを差し引いた補正値を用いているから、この補正値が閾値 C以上の相対強度である場合には、そのシグナルを発するハイブリツドには、非特異的なハイブリダィゼーシヨンにも由来せず、またパックグラウンドでもない、完全マッチプローブが含まれると判定することが可能になる。

本発明は上記したとおり、第 1完全マッチのみを同定する基本的な方法、測定条件などが適切でなかった場合に、条件の変更を行って再度測定しなおす方法、そして第 1完全マッチ以外に、第 2完全マッチも同定する方法に関するものとなつている。本発明は更に、「第 2完全マッチ、第 3完全マッチ、 · · ·」のように、第 1完全マッチ以降の完全マツチ（第 1完全マツチよりも低存在率で存在する完全マッチ）が複数個存在する場合にも、これらの全てを順次同定していく方法を提供することができる。

この態様において本発明は、前記ステップ（4 ) において閾値 B以上のシグナル値を発するスポットが複数個あり、前記ステップ（5 ) において第 1完全マッチプローブが判定されている場合、即ち、第 1完全マッチ以降の完全マツチが複数ある場合において適用されるものである。すでに第 1完全マッチが同定されていて（即ち、接触の条件が適切であったことが証明されていて）、次に第 2完全マッチ以降を同定する場合に適用されるものである。

この態様においては次に、前記ステップ（8 ) の後で、当該複数個のプロ一ブであって、当該第 1完全マッチプローブ以外のプローブ（第 2完全マッチプローブ候補）について、そのシグナル強度が大きいものから順に、上記補正ステップ（a) 及び（b ) を行うステップ（9 ) を行う。このステップ（9 ) において、第 2完全マッチプローブ以降のプローブ（第 2完全マッチプローブ候補）については、そのシグナル強度の強いものから順に、適切な補正用核酸との接触を行い、補正シグナルを求め、第 2完全マッチ、第 3完全マッチ、 · · · と同定していくことになる。より具体的には、第 2完全マッチプローブの同定には、第 2補正用核酸を用いて第 2補正シグナル値を求め、第 3完全マツチプローブの同定には、第 3補正用核酸を用いて第 3補正シグナル値を求めていくことを意味する。

しかしながらこの態様においては、第 2完全マッチプローブ候補であったものが、非特的結合等によるノイズが特別に大きかったために、第 2完全マッチプロ —ブとはならず、当初、シグナルの大きさから言って第 3完全マッチプローブとなるはずであつたものが、結果的に第 2完全マツチプローブと同定されるような場合があるために、完全マツチプローブの名称についての修正が必要となることがある。例えば上記の場合には、当初の第 3完全マッチの「3」の部分の数字を適宜調節して、第 2完全マッチとする必要がある。これには次の操作を行う。まず、当該複数個ある第 2完全マッチプローブ候補の中で第 n - 1番目（nは 2 以上、プローブの種類以下の整数）に大きいシグナル値を有するハイブリッドに含まれるプローブに対しては、当該第 n - 1番目に大きいシグナルを発するハイブリッド中のプローブと完全マッチする配列のみからなる第 n補正用核酸を、前記ステップ（1 ) 乃至（6 ) とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセッ卜に対して接触させて、当該プローブセッ卜が当該第 n補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定する。ここでは、複数個ある第 2完全マッチプローブ候補をシグナルの強い順に、第 1完全マッチプローブの場合の補正方法と本質的に同様の方法により、完全マッチであるかどうかを判定している。また、「nは 2以上、プローブの種類以下の整数」とあるのは、第 2完全マッチプローブで 1 番目にシグナルの強いものは、 2- 1 = 1であり、第 1番目に大きいシグナルとするためである。そして、補正用核酸については、すでに第 1補正用核酸が使われているので、それとは区別するために第 n ( nは 2以上）補正用核酸とするために、 nは 2以上としている。 nの上限値については、第 2完全マッチプローブ候補の数は最大でプローブの種類と等しい数までであるが、ここで「プローブの種類」とは、一つの変異や多型部分を判定するためのセンス鎖プローブのセット中に含まれるプローブの種類の数、又はアンチセンス鎖プローブのセット中に含まれるプローブの種類の数を示すものである。

次に、当該測定されたシグナル値を、第 1補正用核酸から第 n -1補正用核酸までをそれぞれ利用して補正を累積的に行ったシグナル値から差し引いて、第 n補正シグナル値を求める。ここでは補正用核酸で測定したシグナルを使って補正シグナル値を求めている。例えば、第 3完全マッチを同定しょうとする場合（即ち n = 3の場合）を例にあげると、第 3完全マッチプローブの同定に至るまでに、すでに、第 1及び第 2完全マッチプローブの同定を行っていて、それぞれの同定の工程においては、第 1及び第 2補正用核酸を利用した補正工程にかけられており、シグナル値がその分だけ累積的に補正されているはずであることを考慮していることになる。

次に、当該第 n補正シグナル値が、前記の閾値 C以上のシグナル強度である場合に、当該第 n補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第 n完全マッチプローブと判定し、又は当該第 n補正シグナル値が、前記の閾値 C未満のシグナル強度である場合に、当該第 n補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを完全マッチプローブではないと同定する。ここでは、閾値と補正シグナル値との比較により、完全マッチプローブ候補が、完全マッチプローブと同定できるのか、そうでないのかを判定している。この工程を経ることにより、最終的に第 n完全マッチプローブ候補が、第 n完全マッチプローブと認定されることになり、完全マツチプロ一ブ候補となっていたものの一つでも完全マツチプロ一ブではないと同定された場合には、「第 n」の nを適宜補正する必要が生じる。その補正のためには、第 n完全マッチプローブの判定前に、閾値 C未満の強度の第 m補正シグナル値（mは、 1以上、 n未満の整数）を有するスポットが x個（x は 0以上の整数）あった場合には、上記第 n完全マッチプローブを、第（n - x ) 完全マッチプローブと判定する。これは、例えば第 3完全マッチプローブの判定前に行った、第 2完全マッチプローブの同定工程において（n = 3の場合）、結果的に第 2完全マッチプロ一ブ候補が、完全マッチではないと同定されていた場合には、 x = lであり（即ち閾値 C未満の強度の第 2補正シグナル値を有するスポットが 1個あった場合）、従ってここで判定しょうとしている第 3完全マッチプローブとは、最終的には第 2完全マッチプローブとして判定すべきであることを意味する（3 - 1 = 2なので）。また、第 4完全マッチプローブの判定前に、第 2、第 3完全マッチプローブの候補が共に完全マッチではないと同定されていた場合には、 x = 2であり、ここで判定しょうとしている第 4完全マッチプローブとは、最終的には第 2完全マッチプローブとして判定すべきであることを意味する（4 - 2 = 2なので）。

本発明の変異及び多型の判定方法においては更に、前記の補正ステツプ ( b ) の後、且つ前記ステップ（8 ) の前に、予め求めておいた、前記のプローブセット中の各プローブの固相化量を相対値に変換し、この相対値に基づいて前記補正シグナル値を、当該固相化量に比例する固定化量補正シグナル値とするステップ（c ) を更に含めることができる。これは、各プローブの固相担体（例えば D N Aマイクロアレイなど）への固相化量の違いが大きい場合に、その差異を補正して、より正確な変異判定を行うことを可能にする。

ここで、担体に固相化されたプローブの量を測定するには、プローブに予め導入しておいた蛍光色素等から発せられるシグナルを定量することにより行うことができる。

本発明の変異及び多型の判定方法においては、前記プロ一ブセット中の全プロ一ブが、標的核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れかの配列に対するものとしてもよいし、又は、前記プローブセット中のプローブが、標的核酸のセンス鎖に対するもの、及びアンチセンス鎖に対するものからなるものとしてもよい。プロ一ブ等の調製コストの点においては、センス鎖又はアンチセンス鎖の何れかを用いる方に利点があるが、センス鎖及びアンチセンス鎖の双方を使用する方が、変異及び多型の判定の確実性にとって好ましいと考えられる。この場合、センス鎖、及びアンチセンス鎖のそれぞれの第一完全マッチプロ一ブが存在し、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおいて異なる結果が出たときは、その異なる結果を出したプローブを、センス鎖及びアンチセンス鎖における結果の相違に関わらず、完全マッチプロ一ブとは同定しないことが可能である。更に、センス鎖、又はアンチセンス鎖に第一完全マッチプローブが存在しない場合には、第一完全マッチプローブが存在しない鎖の結果を判定に使用しないことも可能である。このように確実性の高い結果のみを利用して測定結果の信頼性を高めることができる。より具体的には、前記のプローブセットが、 2以上のプローブサブセットの集合からなり、各プローブサブセットが、当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブの両端において塩基配列を伸張するか、又は短縮したオーバ一ラッピングプローブからなるものを利用すると、より正確な変異又は多型の判定が可能となる。

本発明の変異又は多型の判定方法は、 SNPのタイピングや、癌遺伝子の変異の判定、例えば K- ras遺伝子のコドン 1 2を標的核酸として使用することができる。 K_ras遺伝子のコドン 1 2を使用した具体例については、下記の実施例において記載する。実施例

以下においては、より具体的な配列を用いて本発明の変異判定方法を説明する。 '

図 1は、本発明の変異判定方法を実施するために使用した DN Aマイクロアレイ上のスポットの配置を示す図である。このマイクロアレイに固相化するプローブとしては、 K_ras癌遺伝子の第 1 2コドンの配列の、センス鎖及びアンチセンス鎖に対するプロ一ブを用いた。図中のスポット 1には、配列番号 1に示される完全マッチプローブ（センス鎖に対応）を配置し、スポット 2乃至 7においては、配列番号 2乃至 7に示される不完全マッチプロ一ブ (センス鎖に対応）を配置した。不完全マッチプローブは、完全マッチプロ —ブにおいて GGTであった配列部分を、それぞれ、 C GT、 TGT、 AG T、 GCT、 GAT、及び GTTとしたものである。スポット 8乃至 14においては、同様にしてアンチセンス鎖に対する完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブ（それぞれ配列番号 8乃至 14の配列を有する）を配置した。以下においては、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方における不完全マツチプローブ（配列番号 2乃至 7) のそれぞれを、 CGTプローブ、 TGT プローブ、 AGTプローブ、 GCTプローブ、 G ATプローブ、及び GTT プローブと呼ぶことがある。これらのプローブ群の設計 ·合成は、 G e nB a n kなどのデータベースから入手可能な配列を基にして行った。

各プローブの、 DNAマイクロアレイへの固相化には、当該技術分野で既知の方法により行った。具体的には、ピエゾ素子を利用した微量分注システムによりスポットした。

標識核酸の調製にあたっては、テンプレ一トとして人体より採取した癌細胞から抽出した核酸を使用した。この抽出核酸、及び K_ras癌遺伝子プライマー（宝酒造社製、 Cat#7112；配列番号 1 5及び 1 6に示されるもの）を P CRにおいて使用し、 5 ' に F I TCが標識された標識済標的核酸を調製した。 P C Rにより増幅した試料は、 8 %NuSieve (FMC社製）ァガロース電気泳動により確認した。増幅した標的核酸約 5 0 t gを、各プローブが固相化された上記の DN Aマイクロアレイに接触させた。

プローブと標的核酸との間の八ィブリダイゼーションは、次の条件において行った。

ハイブリダイゼーション溶液： 3 xSSPE (燐酸ナトリゥム緩衝液、技術資料： DNAマイクロアレイと最新 PCR法、細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ 1秀潤社参照）、 10 %(V/V)ExpressHyb(Clontech社）に標的核酸を 10%溶液となるように懸濁したもの；

分析器：ォリンパス光学社製 B X-51 TFRに冷却 C C Dカメラを接続した実験システム（反応フィルタ一の周りに、試料溶液駆動と温度制御とを可能にする手段が実装されており、更に蛍光スポットの画像の記録を自動的に行うことができるように設計されたものである）；

操作：直径 6mmのマイクロアレイが設置されている専用チャンバ一の反応部分に、ハイブリダィゼ一シヨン溶液で調製された反応溶液 50 1を加え、 5 0°Cでハイブリダィゼーシヨン反応を行い、蛍光画像を撮像し、その画像をハードディスクに保存した。

得られた画像を、変異判解析用にプログラムされた解析ソフトウエアを使用して解析し、画像のシグナルを数値化した。数値化されたシグナルを、以下のようにして更に解析した。

低強度シグナルを規定する閾値 Aとして、シグナルの絶対強度 1 5の値を設定した。閾値 A以下のシグナルを示す、 CGTプローブ、 TGTプローブ及び AGTプローブを、標的核酸に対する非特異的なプロ一ブ、即ち不完全マッチプローブ候補とした（図 2参照）。

一方、閾値 Bとしては、シグナルの絶対強度 1 0 0を設定した。最高強度のシグナルを発しているスポットに含まれる G G Tプローブを第 1完全マツチプローブ候補と判定した（図 2参照）。

閾値 A以下のプローブ候補、及び閾値 B以上のプローブ候補が共に存在していたから、不完全マッチプローブ候補を、不完全マッチプローブと判定し、更に第 1完全マッチプローブ候補を、第 1完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と判定した。

次に、閾値 Cとして、第 1完全マッチプローブのシグナル強度に対するシグナル値として 2 0 %を設定した。第 1完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）のシグナル値を 1 0 0 %とした時の、各プローブのシグナル値の相対値を図 3に示した。第 1完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）以外のプロ一ブが固相化されたスポットであって、当該閾値 C以上のシグナル強度を発するスポットに固相化されたプローブである G A Tプローブを第 2完全マッチプローブ候補と判定した（図 3参照）。

次に、前記第 1完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と完全マッチする配列のみからなる第 1補正用核酸を、第 1完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）の判定とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して D N Aマイクロアレイの各スポット上で接触させて、当該プローブセットが当該第 1補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定した。第 1補正用核酸は、 D N Aシークェンサによって塩基配列が G G Tを持つことが予めわかっている D N Aをテンプレートに用いて P C Rを行うことにより、 5 ' 末端に F I T C標識された、標識済コントロール核酸を調製し、これを用いた。第 1補正用核酸とのハイブリダィゼーシヨンの測定値は、図 4に示した。この図においては、 G G Tプローブのシグナル値を 1 0 0 %として、これに対する相対値で示してある。この相対値を、図 3の相対値から差し引いた値を、図 5に示した。

図 5においては、 G A Tプローブのシグナル値（相対値）が、閾値 Cの値以上であることから、 G A Tプローブを第 2完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と判定した。

G ATプローブの次に強いシグナルを発していたスポット中の GCTプローブは、 GATプローブのシグナルを 1 0 0 %とした場合に、閾値 C以上のシグナル強度を有しているから（図 6参照）、上記と同様の補正を行い、 G C Tプロ一ブが完全マツチプロ一ブであるか否かを確認した。

第 2完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と完全マッチする配列のみからなる第 2補正用核酸を、第 1完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）の判定とは別個に、前記プロ一ブセットと同一のプロ一ブセットに対して D N Aマイクロアレイの各スポット上で接触させて、当該プロ一ブセットが当該第 2補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定した。第 2補正用核酸は、 DN Aシ一クェンサによって塩基配列が G ATを持つことが予めわかつている DNAをテンプレートに用いて P CRを行うことにより、 5，末端に F I TC標識された、標識済コントロール核酸を調製し、これを用いた。第 2補正用核酸とのハイブリダィゼーシヨンの測定値は、図 7に示した。この図においては、 GATプローブのシグナル値を 1 0 0 %として、これに対する相対値で示してある。この相対値を、図 6の相対値から差し引いた値を、図 8に示した。

図 8においては、差し引き後の GCTプローブのシグナル相対値が、閾値 C以上であることから、 GCTプローブを第 3完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と判定した。

以下の工程は、アンチセンス鎖に対するプローブの代わりにセンス鎖に対するプローブを使用する以外は上記と同様にして、行ったものである。

上記と同様に、低強度シグナルを規定する閾値 Aとして、シグナルの絶対強度 1 5の値を設定した。閾値 A以下のシグナルを示す、 CGTプローブ、 TGTプローブ、及び AG Tプローブを、標的核酸に対する非特異的なプローブ、即ち不完全マッチプロ一プ候補とした（図 9参照）。

一方、閾値 Bについては、アンチセンスの場合とは異なり、シグナルの絶対強度 9 0を設定した。最高強度のシグナルを発しているスポットに含まれる GGTプローブを第 1完全マッチプローブ候補と判定した（図 9参照）。閾値 A以下のプロ一ブ候補、及び閾値 B以上のプローブ候補が共に存在していたから、不完全マッチプローブ候補と、不完全マッチプローブと判定し、更に第 1完全マッチプローブ候補を、第 1完全マッチプローブ（センス鎖側）と判定した。

次に、閾値 Cとして、上記と同様に第 1完全マッチプローブ（センス鎖側）のシグナル強度に対するシグナル値として 2 0 %を設定した。第 1完全マツチプローブ（センス鎖側）のシグナル値を 1 0 0 %とした時の、各プローブのシグナル値の相対値を図 1 0に示した。第 1完全マッチプローブ（センス鎖側）以外のプローブが固相化されたスポットであって、当該閾値 C以上のシグナル強度を発するスポットに固相化されたプローブである G ATプローブを第 2完全マッチプローブ候補と判定した（図 1 0参照）。

次に、前記第 1完全マッチプローブ（センス鎖側）と完全マッチする配列のみからなる第 1補正用核酸を、第 1完全マッチプローブの同定とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して DN Aマイクロアレイの各スポット上で接触させて、当該プローブセットが当該第 1補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定した。第 1補正用核酸は、 DNAシークェンサによって塩基配列が GGTを持つことが予めわかっている DN Aをテンプレートに用いて P CRを行うことにより、 5 ' 末端に F I TC標識された、標識済コントロール核酸を調製し、これを用いた。第 1補正用核酸とのハイブリダィゼーシヨンの測定値は、図 1 1に示した。この図においては、 GGTプローブのシグナル値を 1 0 0 %として、これに対する相対値で示してある。この相対値を、図 1 0の相対値から差し引いた値を、図 1 2に示した。

図 1 2においては、 GATプローブのシグナル値（相対値）が、閾値 Cの値以上であることから、 GATプローブを第 2完全マッチプローブ（センス鎖側）と判定した。

G A Tプローブの次に強いシグナルを発していたスポット中の G C Tプローブは、 GATプローブのシグナルを 1 0 0 %とした場合に、閾値 C以上のシグナル強度を有していないから（図 1 2参照）、完全マッチプロ一ブではないと判定した。従って、 GCTプローブは、アンチセンス鎖に対応するプ口一ブを用いた場合と、センス鎖に対応するプローブを用いた場合とで、結果がことなるから、予めそのような場合は完全マッチとしないという基準を設けておいた場合には、これは完全マッチプローブでないと判定することになる。

以上の結果より、 GGTプローブ及び G ATプローブのみが完全マッチであり、これらの配列に対応した標的核酸が試料中に含まれていたということがわかった。

以上の説明は、基板にプローブを固相化して位置によりプローブの種類を特定する DN Aマイクロアレイを例にとって説明したが、複数種類のプロ一ブが識別可能な状態でハイプリダイズ反応の検出を行うことができる構成であれば、本発明を適用することが可能である。具体的には、プローブを基板に固相化したものであれば特に制限はなく、ガラス、シリコンウェハ、各種の多孔質基板、ゲル、マイクロ夕イタ一プレートやビーズなどを基材としてプローブを固相化して用いることができる。産業上の利用性

本発明は、核酸の変異及び多型の解析を行う場合に試料となる核酸分子がその配列に関してへテロ（heterozygous/heterogeneous) である場合であつても、測定したシグナルがプロ一ブとの完全マッチによるものなのか、又は不完全マッチによるものなのかをより確実に判定することができるため、従来の変異及び多型の解析方法と比較して、試料中の核酸配列に関してより正確な情報を得ることを可能にする。配列表

<110> Olympus Optical Co., Ltd.

<120> A Method of Deciding Mutations and SNPs <130> 03P01005

<160> 16

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 17

<212> DNA

く 213> artificial sequence <400> 1

ttggagctgg tggcgta 17

<210> SEQ ID NO :2

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 2

ttggagctcg tggcgta 17

<210> SEQ ID NO :3

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

ttggagcttg tggcgta 17

<210> SEQ ID NO :4

<211> 17 <212> DNA

<213> artificial sequence <400> 4

ttggagctag tggcgta 17

<210> SEQ ID NO :5

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 5

ttggagctgc tggcgta 17

<210> SEQ ID NO :6

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 6

ttggagctga tggcgta 17

<210> SEQ ID NO :7

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

ttggagctgt tggcgta 17 <210> SEQ ID NO :8 <211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 8

tacgccacca gctccaa 17

<210> SEQ ID NO: 9

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 9

tacgccacga gctccaa 17

<210> SEQ ID NO: 10

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 10

tacgccacaa gctccaa 17

<210> SEQ ID NO: 11

<211> 17

<212> DNA <213> artificial sequence <400> 11

tacgccacta gctccaa 17

<210> SEQ ID NO: 12

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 12

tacgccagca gctccaa 17

<210> SEQ ID NO: 13

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 13

tacgccatca gctccaa 17

<210> SEQ ID NO: 14

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 14

tacgccaaca gctccaa 17 <210> SEQ ID NO: 15

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 15

gactgaatat aaacttgtgg 20

<210> SEQ ID NO: 16

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence <400> 16

ctattgttgg atcatattcg 20

Claims

請求の範囲

1. 標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも 1塩基のミスマッチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マッチプローブと同一である少なくとも 1の不完全マッチプローブとからなるプローブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させるステップ（1) ；

各スポットにおいて形成されたハイプリッドからのシグナルを測定するステツプ（2) ；

所定のシグナル値（閾値 A) 以下の低強度シグナルを発する八イブリツド中のプローブを不完全マッチプローブ候補と判定するステップ（3) ；別の所定のシグナル値（閾値 B) 以上のシグナルの中で最高強度のシグナルを発するハイプリッド中のプローブを第 1完全マッチプローブ候補と判定するステップ（4) ；及び

前記の不完全マッチプロ一ブ候補と第 1完全マッチプロ一ブ候補とがともに存在する場合に、前記不完全マッチプローブ候補を不完全マッチプロ一ブと判定し、更に前記第 1完全マッチプロ一ブを第 1完全マッチプローブと判定するステップ（5) ；

を含む、変異又は多型の判定方法。

2. 前記のステップ（3) において不完全マッチプローブ候補を判定できない場合、及び/又は前記のステップ（4) において完全マッチプローブ候補を判定できない場合に、前記ステップ（ 1) 及び/又は（2) において接触及び/又は測定する条件を当初の条件から変更してから再度、前記ステップ

( 1) 乃至（ 5) からなる方法を実施することを含む、請求項 1に記載の変異又は多型の判定方法。

3. 前記ステップ（5) の後に、

前記第 1完全マッチプローブ以外のプローブであって、所定の値（閾値 C) 以上のシグナル強度の中で最大のシグナルを発するハイブリッド中のプロ一ブを第 2完全マッチプローブ候補と同定するステップ（6) ；前記第 2完全マッチプローブ候補を含むハイプリッド中のシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（a) 、及び（b ) を行うステップ（7 ) ：前記第 1完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第 1 補正用核酸を、前記ステップ（ 1 ) 乃至（6 ) とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセッ卜が当該第 1補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ（a) ；及び

前記ステップ（a) で求めたシグナル値を、前記ステップ（1 ) で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイプリッドに由来するシグナルについての第 1補正シグナル値を求めるステップ（b ) ；

前記補正ステップ（b ) における第 1補正シグナル値が、前記の閾値 C以上のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを、第 2完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（b ) における当該第 1捕正シグナル値が、閾値 C未満のシグナル強度である場合に、当該第 1補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを第 2完全マッチプローブではないと同定するステップ（ 8 )

を更に含む、請求項 1又は 2に記載の変異又は多型の判定方法。

4 . 前記ステップ（4 ) において閾値 B以上のシグナル値を発するスポットが複数個あり、前記ステップ（5 ) において第 1完全マッチプローブが判定されている場合に、

前記ステップ（8 ) の後で、当該複数個のプローブであって、当該第 1完全マッチプローブ以外のプローブ（第 2完全マッチプローブ候補）について、そのシグナル強度が大きいものから順に、上記補正ステップ（a) 及び（b ) を行うステップ（9 )

(但し、このステップにおいては、

当該複数個ある第 2完全マッチプローブ候補の中で第 n - 1番目（nは 2以上、プローブの種類以下の整数）に大きいシグナル値を有するハイプリッド中に含まれるプローブに対しては、

当該第 n - 1番目に大きいシグナルを発するハイプリッド中のプローブと完全マッチする配列のみからなる第 n補正用核酸を、前記ステップ（1 ) 乃至（6 ) とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第 n補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定し；

当該測定されたシグナル値を、第 1補正用核酸から第 n -1補正用核酸までをそれぞれ利用して補正を累積的に行ったシグナル値から差し引いて、第 n補正シグナル値を求め；そして

当該第 n補正シグナル値が、前記の閾値 C以上のシグナル強度である場合に、当該第 n補正シグナル値を有するハイプリッド中のプローブを、第 n完全マッチプローブと判定し、又は当該第 n補正シグナル値が、前記の閾値 C未満のシグナル強度である場合に、当該第 n補正シグナル値を有するハイブリツド中のプロ一ブを完全マツチプロ一ブではないと同定する

(伹し、第 n完全マッチプローブの判定前に、閾値 C未満の強度の第 m補正シグナル値（mは、 1以上、 n未満の整数）を有するハイブリッドが X個（Xは 0以上の整数）ある場合には、上記第 n完全マッチプローブを、第（n - x ) 完全マツチプロ一ブと判定する））

を更に含む、請求項 3に記載の変異又は多型の判定方法。

5 . 前記の補正ステップ（b ) の後、且つ前記ステップ（8 ) の前に、予め求めておいた、前記のプロ一ブセット中の各プローブの固相化量を相対値に変換し、この相対値に基づいて前記補正シグナル値を、当該固相化量に比例する固定化量補正シグナル値とするステップ（c )

を更に含むことを特徴とする、請求項 3又は 4に記載の変異又は多型の判定方法。

6 . 前記プローブセット中の全プローブが、標的核酸のセンス鎖又はァンチセンス鎖の何れかの配列に対するものである、請求項 1乃至 5の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

7 . 前記プローブセット中のプローブが、標的核酸のセンス鎖に対するもの、及びアンチセンス鎖に対するものからなる、請求項 1乃至 5の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

8 . センス鎖、及びアンチセンス鎖のそれぞれの第一完全マッチプロ一ブが存在し、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおいて異なる結果が出た場合に、その異なる結果を出したプローブを、センス鎖及びアンチセンス鎖における結果の相違に関わらず、完全マッチプローブとは同定しないことを特徴とする、請求項 7に記載の変異又は多型の判定方法。

9 . センス鎖、又はアンチセンス鎖に第一完全マッチプローブが存在しない場合、第一完全マッチプローブが存在しない鎖の結果を判定に使用しないことを特徴とする、請求項 1乃至 8の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

1 0 . 前記の閾値 Aが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値 Bが、シグナルの絶対値であることを特徴とする、請求項 1乃至 9の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

1 1 . 前記の閾値 A及び Cが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値 Bが、シグナルの絶対値であることを特徴とする、請求項 3乃至 9の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

1 2 . 前記の閾値 A、 B、及び Cを、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて異なる値とすることを特徴とする請求項 3乃至 1 1の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

1 3 . 前記の閾値 Aが相対値であり、第 1完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して 1 5 %以下の大きさであることを特徴とする請求項 1 0乃至 1 2の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

1 4 . 前記の閾値 Aが相対値であり、第 1完全マッチプローブを含むハィプリッドに由来するシグナル強度に対して 1 0 %以下の大きさであることを特徴とする請求項 1 0乃至 1 3の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

1 5 . 前記の閾値 Cが相対値であり、第 1完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して 2 0 %以上の大きさであることを特徴とする請求項 1 0乃至 1 4の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。

1 6. 前記のプローブセットが、 2以上のプローブサブセットの集合からなり、各プローブサブセットが、当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブの両端において塩基配列を伸張するか、又は短縮したオーバーラッピングプローブからなることを特徴とする請求項 1乃至 1 5の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。 '

1 7. SNPのタイピングのための、請求項 1乃至 1 5の何れか一項に記載の多型の判定方法。

1 8. 前記の SNPのタイピングが、完全マッチプローブと判定する判定順位を上位から二つまでとすることを特徴とする請求項 1 7に記載の S N Pタイビングのための多型の判定方法。

1 9. 前記の標的核酸が、 K-r a s遺伝子コドン 1 2である事を特徴とする、請求項 1乃至 1 8の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。