JP2006524033A - 内部基準試料を用いる核酸のメチル化検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ピリミジン環の5'位におけるシトシン(C)のメチル化は、細胞または組織試料が癌性であれば、重要な後成的決定因子であることが示されている。動物において、メチルシトシンは、主にシトシン-グアニン(CpG)ジヌクレオチドに認められるが、植物ではしばしば、シトシン-何らかの塩基-グアニン(CpNpG)トリヌクレオチド配列において認められる。
マイクロアレイまたはバイオチップ業界において、生体分子(例えば、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、オリゴペプチド等)をヌクレオチド、受容体、または他の分子の標的試料と結合する可能性がある表面上の既定の位置に置く。マイクロアレイは多様なプラットフォームにおいて利用可能な生体分子、または展開される生体分子の微小アレイである。当初、これらのマイクロアレイの焦点の多くはゲノム学に関するものであり、細胞内遺伝子発現、一塩基多型(SNP)、およびゲノムDNA検出/バリデーション、機能ゲノム学、およびプロテオミクスに重点が置かれていた(ウィルゲンブス(Wilgenbus)&リヒター(Lichter)、J. Mol. Med. 77:761、1999;アシュファリ(Ashfari)ら、Cancer Res. 59:4759、1999;クリアン(Kurian)ら、J. Pathol. 187:267、1999;ハシア(Hacia)、Nature Genetics 21 補足:42、1999;ハシア(Hacia)ら、Mol. Psychiatry 3:483、1998;およびジョンソン(Johnson)、Curr. Biol. 26:R171、1998)。
(a)分析のためのDNA試料を提供する工程と、
(b)DNA試料を第一のDNA試料と第二のDNA試料に分けて、それによって第一の試料を被検試料とし、第二の試料を内部基準試料とする工程と、
(c)メチルシトシン残基が非メチル化シトシン残基として増幅されるように、核酸増幅工程によって第二のDNA試料を増幅する工程と、
(d)双方の試料の非メチル化シトシン残基をデオキシウラシル残基に変換するために、増幅された第一のDNA試料および第二のDNA試料を亜硫酸水素塩によって変換する工程と、
(e)変換された第一のDNA試料および変換された第二のDNA試料を増幅する工程と、
(f)亜硫酸水素塩によって変換された第二のDNA試料を第二の蛍光マーカーによって標識し、亜硫酸水素塩によって変換された第一のDNA試料を第一の蛍光マーカーによって標識する工程であって、第一および第二の蛍光マーカーが重なり合わない蛍光の励起および蛍光の放射スペクトルを有する工程と、
(g)第一のDNA試料および第二のDNA試料を、亜硫酸水素塩による変換型および非変換型としてDNA試料のCpG島部位とハイブリダイズするように設計された複数のオリゴヌクレオチド捕獲プローブを有するマイクロアレイ装置上にハイブリダイズさせる工程
を含む方法を提供するものである。
(1)被検試料から得た基準試料を用いて、多数のCpG島部位のメチル化を同時に検出する方法であって、
第一DNA被検試料と内部基準とする第二DNA試料とに分けられた分析のためのDNA試料を用い、メチルシトシン残基が非メチル化シトシン残基として増幅されるように第二DNA試料を増幅する工程と、
第一DNA試料および第二DNA試料の双方について非メチル化シトシン残基をデオキシウラシル残基に変換する工程と、
互いに重なり合わない蛍光の励起および蛍光の放射スペクトルを有する第一蛍光マーカーと第二蛍光マーカーとを用い、第一DNA試料を第一蛍光マーカーによって標識するとともに、第二DNA試料を第二蛍光マーカーによって標識する工程と、
第一DNA試料および第二DNA試料を、変換型および非変換型としてDNA試料のCpG島部位とハイブリダイズするように設計された複数のオリゴヌクレオチド捕獲プローブを有するマイクロアレイ装置上にハイブリダイズさせる工程
を含む内部基準試料を用いる核酸のメチル化検出方法;
(2)被検試料から得た基準試料を用いて、多数のCpG島部位のメチル化を同時に検出する方法であって、
(a)分析のためのDNA試料を提供する工程と、
(b)DNA試料を第一のDNA試料と第二のDNA試料に分けて、それによって第一の試料を被検試料とし、第二の試料を内部基準試料とする工程と、
(c)メチルシトシン残基が非メチル化シトシン残基として増幅されるように、核酸増幅工程によって第二のDNA試料を増幅する工程と、
(d)増幅された第一のDNA試料および第二のDNA試料双方における非メチル化シトシン残基をデオキシウラシル残基に亜硫酸水素塩によって変換する工程と、
(e)変換された第一のDNA試料および変換された第二のDNA試料を増幅する工程と、
(f)亜硫酸水素塩によって変換された第二のDNA試料を第二の蛍光マーカーによって標識し、亜硫酸水素塩によって変換された第一のDNA試料を第一の蛍光マーカーによって標識する工程であって、該第一および第二の蛍光マーカーが重なり合わない蛍光の励起および蛍光の放射スペクトルを有する工程と、
(g)第一のDNA試料および第二のDNA試料を、亜硫酸水素塩による変換型および非変換型としてDNA試料のCpG島部位とハイブリダイズするように設計された複数のオリゴヌクレオチド捕獲プローブを有するマイクロアレイ装置上にハイブリダイズさせる工程
を含む方法;
(3)使用される増幅技術がPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)である、(1)または(2)に記載の方法;
(4)ハイブリダイゼーション条件が高ストリンジェントな条件である、(1)〜(3)のいずれか一つに記載の方法;
(5)重なり合わない蛍光標識が、Cy3(1,1'-ビス(ε-カルボキシペンチル)-1'エチル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン-5,5'-ジスルホン酸カリウム塩 ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、およびCy5(1,1'-ビス(ε-カルボキシペンチル)-1'エチル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン-5,5'-ジスルホン酸カリウム塩 ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法;
(6)被検DNA試料中のCpG島のシトシン部位のメチル化の検出用マイクロアレイ基板であって、
(a)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって被検シトシン部位以外のシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(b)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって全てのシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド
が固定されている、マイクロアレイ基板;
(7)以下を含む、被検DNA試料中のCpG島のシトシン部位のメチル化検出用キット:
(a)(6)に記載のマイクロアレイ基板、
(b)亜硫酸水素塩変換試薬、および/またはDNA標識試薬;
(8)以下を含む、被検DNA試料中のCpG島のシトシン部位のメチル化検出用キット:
(a)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、被検シトシン部位以外のシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(b)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、全てのシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド
を提供するものである。
5'--------------c------------3' メチル化(M)試料からの標的分子、
5'--------------u------------3' 非メチル化(U)試料からの標的分子。
5'---------------g--------------3' メチル化(M)試料に関するオリゴヌクレオチド捕獲プローブ、
5'---------------a--------------3' 非メチル化(U)試料に関するオリゴヌクレオチド捕獲プローブ。
5'--------------c------------3' メチル化(M)試料からの標的分子、
5'--------------u------------3' 非メチル化(U)試料からの標的分子。
被検試料において、全てまたはほとんどの非メチル化(U)シトシン残基は、亜硫酸水素塩変換の際にチミジンに変換する。メチル化(M)シトシン残基は変換せず、その構造を保持する。第一の蛍光色素により標識された被検標的RNAは、メチル化されたシトシンの位置を除き、当初の出発材料におけるあらゆるシトシンの位置でウラシル残基を含む。その場合、シトシン残基は、当初の出発材料におけるあらゆるシトシンの位置で被検標的RNAに存在する。
5'--------------c------------3' メチル化(M)試料からの標的分子、
5'--------------u------------3' 非メチル化(U)試料からの標的分子。
メチル化試料捕獲プローブ配列(M)
5'-uauuuuuuuagguagcggguaguaguuguuu-3' 標的配列(配列番号:1)
3'-auaaaaaaauccaucgcccaucaucaacaaa-5' 捕獲プローブ配列(3'-5')(配列番号:2)
5'-aaacaacuacuacccgcuaccuaaaaaaaua-3' 捕獲プローブ配列(5'-3')(配列番号:3);
非メチル化試料捕獲プローブ配列(U)
5'-uauuuuuuuagguaguggguaguaguuguuu-3' 標的配列(配列番号:4)
3'-auaaaaaaauccaucacccaucaucaacaaa-5' 捕獲プローブ配列(3'-5')(配列番号:5)
5'-aaacaacuacuacccacuaccuaaaaaaaua-3' 捕獲プローブ配列(5'-3')(配列番号:6)。
シトシン残基のメチル化は一般的に、CpGジヌクレオチドの位置で起こる。ゲノムの既知の領域を通してスキャンするコンピューターアルゴリズムは、シトシンのメチル化が起こる可能性がある部位を予測する(http://www.uscnorris.com/cpgislands、タカイ(Takai)&ジョーンズ(Jones)、Proc. Natl. Acad. Sci. 19:99(6):3740〜5、2002)。さらに、コンピューターデータベースにDNAメチル化部位を保存し、これらの部位周辺のDNA配列を探索および検索することが可能となる(http://www.methdb.net/)。
5'--------------c------------3' メチル化(M)試料からの標的分子、
3'--------------g------------5' メチル化(M)試料からの捕獲プローブ、
5'--------------u------------3' 非メチル化(U)試料からの標的分子、
3'--------------a------------5' 非メチル化(U)試料からの捕獲プローブ。
5'--g------------------------3'
5'----g----------------------3'
5'------g--------------------3'
5'--------g------------------3'
5'-----------g---------------3'
5'-------------g-------------3'
5'---------------g-----------3'
5'-----------------g---------3'
5'-------------------g-------3'
5'---------------------g-----3'
5'-----------------------g---3'
メチル化(M)試料のための捕獲プローブ:
5'-----g-----3'
5'------g------3'
5'-------g-------3'
5'--------g--------3'
5'---------g---------3'
5'----------g----------3'
5'-----------g-----------3'
5'------------g------------3'
5'-------------g-------------3'
(a)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、被検シトシン部位以外のシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド;および
(b)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、全てのシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド。
(a)本発明の上記マイクロアレイ基板;
(b)亜硫酸水素塩変換試薬、および/またはDNA標識試薬。
(a)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、被検シトシン部位以外のシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド;および
(b)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、全てのシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド。
実施例1
本実施例は、本発明の方法およびコンビマトリクス社(CombiMatrix Corp.)のマイクロアレイ装置(電気化学的方法によるインサイチュー合成を用いる)を用いた多重メチル化アッセイ法を説明する。
ヒトDNAミスマッチ修復遺伝子(Homo sapiens DNA mismatch repair (hMLH1) gene)(GenBankアクセッション番号U83845)、ヒト原発性結腸癌、細胞株SW480 (ATCCから購入; http://www.atcc.org/)および293T (ATCCから購入) を使用した。DNAは以下のように精製した。細胞を培養し、ディッシュから回収した。回収された細胞をPBSで3回洗浄した。洗浄された細胞を遠心分離して、-80℃で保存した。細胞凝集物を反応緩衝液中に懸濁し、プロテイナーゼKで消化した。消化の後、1:1の平衡化されたフェノール/クロロホルムの混合液により、水相を抽出した。70%エタノール沈殿によりDNAを回収し、純水またはTE(1.0 mg/mL)中に懸濁した。
5'atcacctcagcagaggcacacaagcccggttccggcatctctgctcctattggctggatatttcgtattccccgagctcctaaaaacgaaccaataggaagagcggacagcgatctctaacgcgcaagcgcatatccttctaggtagcgggcagtagccgcttcagggagggacgaagagacccagcaacccacagagttgagaaatttgactggcattcaagctgtccaatcaatagctgccgctgaagggtggggctggatggcgtaagctacagctgaaggaagaacgtgagcacgaggcactgaggtgattggctgaaggcacttccgttgagcatctagacgtttccttggctcttctggcgccaaaatg-3'(配列番号:7)
基準試料は、以下の二つのプライマーを用いてPCR増幅を行う:
フォワードプライマー1(F1): 5'-atcacctcagcagaggcacac-3' (配列番号:8)
リバースプライマー1(R1): 5'-tttggcgccagaagagccaag-3' (配列番号:9)
1μgの精製アンプリコンを50 μlの蒸留水中に希釈して、1μlの10 M水酸化ナトリウムを最終濃度0.2 Mとなるように加えることによって変性させ、37℃で10分間インキュベートした。インキュベーション後、30 μlの10 mMヒドロキノン(シグマ社)および520 μlの3M亜硫酸水素ナトリウム(pH 5.0)(シグマ社)を加えた。溶液は53℃で18〜20時間インキュベートした。
フォワードプライマー2(F2): 5'-taatacgactcactatagggattattttagtagaggtatat-3' (配列番号:10);
リバースプライマー1(R2): 5'-tttggtgttagaagagttaag-3' (配列番号:11)。
T7プロモーター配列を含む精製アンプリコン1μgを、MEGAスクリプト(MEGAscript)(登録商標)キット(アンビオン社)を用いて製造元のプロトコールに従い、10 mM Cy3 UTP(アマシャム社)5μlを加えてインビトロで全量20 μl中で転写した。転写物を、製造元のプロトコールに従って、RNイージー(RNeasy)(登録商標)精製キット(キアゲン社)を用いて精製した。
被検試料はまず、亜硫酸水素ナトリウム変換(SBC)段階において変換する。簡単に説明すると、1μgのゲノムDNAを50 μlの蒸留水中に希釈して、1μlの10 M水酸化ナトリウムを最終濃度0.2 Mとなるように加えることによって変性させ、37℃で10分間インキュベートした。インキュベーション後、30 μlの10 mMヒドロキノン(シグマ社)および520 μlの3M亜硫酸水素ナトリウム(pH 5.0)(シグマ社)を加えた。溶液は53℃で18〜20時間インキュベートした。
フォワードプライマー2(F2): 5'-taatacgactcactatagggattattttagtagaggtatat-3' (配列番号:12);
リバースプライマー1(R2): 5'-tttggtgttagaagagttaag-3' (配列番号:13)
基準転写物(4μg)を第二の蛍光色素、好ましくはCy3によって標識して、第一の蛍光色素、好ましくはCy5によって標識した被検転写物(4μg)と、6×SSPE、5×デンハルト試薬(シグマ社)、0.05%トゥイーン20 50 μl中で混合した。混合液をマイクロアレイ装置と50℃で6時間ハイブリダイゼーションさせた。マイクロアレイを6×SSCおよび0.05%トゥイーン20 300 μlで50℃にて洗浄した後、300 μlの2×SSCで48℃、 300 μlの1×SSCで室温、最後に300 μlの0.5×SSCで室温にて洗浄した。
マイクロアレイは、メチル化標的(M)に関して少なくとも一つの捕獲プローブおよび非メチル化標的(U)に関して少なくとも一つの捕獲プローブを有するように設計される。
5'-uauuuuuuuagguagcggguaguaguuguuu-3' 標的配列(配列番号:1);
3'-auaaaaaaauccaucgcccaucaucaacaaa-5' 捕獲プローブ配列(3'-5')(配列番号:2);
5'-aaacaacuacuacccgcuaccuaaaaaaaua-3' 捕獲プローブ配列(5'-3')(配列番号:3)。
5'-uauuuuuuuagguaguggguaguaguuguuu-3' 標的配列(配列番号:4);
3'-auaaaaaaauccaucacccaucaucaacaaa-5' 捕獲プローブ配列(3'-5')(配列番号:5);
5'-aaacaacuacuacccacuaccuaaaaaaaua-3' 捕獲プローブ配列(5'-3')(配列番号:6)。
最終洗浄段階の後、マイクロアレイを、CCDカメラを備えた光学検出機器(アレイWoRxバイオチップリーダー(arrayWoRx Biochip Reader)、アプライドプレシジョン社)を用いて撮像した。それぞれの蛍光色素の放射波長に対応する二つの画像を各マイクロアレイから取り込んだ。画像をマイクロコンピューターに保存して、製造元の説明書に従って分析した(ソフトWoRxトラッカー(softWoRx Tracker)、アプライドプレシジョン社)。マイクロアレイ上のそれぞれの位置での蛍光強度を定量して、プローブ配列および位置情報と共にそれぞれの色素の蛍光強度を含むスプレッドシートとして保存した。
本実施例では、単一のCpG島メチル化決定に関して実施例1に記載した技法を同時に用いて多重CpG島分析を行う。図4に示すシグナル強度は、被検シグナルチャネルおよび基準シグナルチャネルの双方において各プローブに関する比を計算することによって分析される。例えば、図4に示すマイクロアレイの最初の列は、試料中の領域1のメチル化状態を評価するように設計される。第二の列は、同じ試料の領域2におけるメチル化状態を評価するように設計される等。試料中の各領域は、メチル化(M)であっても、非メチル化(U)であってもよい。試料を、実施例1に記載したように調製する。被検試料は、それ自身の内部基準対照として用いられる。基準試料の調製物は、存在する可能性がある如何なるメチル化も除去する。基準標的を、例えばCy3蛍光色素で標識し、そのシグナルはCy3検出チャネルに出現する。被検試料を、メチル化が調製のあいだ保持されるように処理する。被検試料を、例えばCy5蛍光色素によって標識し、そのシグナルはCy5検出チャネルに出現する。図4は、それぞれのチャネルにおいて黒い部分に出現するシグナル強度を表す。
Claims (8)
- 被検試料から得た基準試料を用いて、多数のCpG島部位のメチル化を同時に検出する方法であって、
第一DNA被検試料と内部基準とする第二DNA試料とに分けられた分析のためのDNA試料を用い、メチルシトシン残基が非メチル化シトシン残基として増幅されるように第二DNA試料を増幅する工程と、
第一DNA試料および第二DNA試料の双方について非メチル化シトシン残基をデオキシウラシル残基に変換する工程と、
互いに重なり合わない蛍光の励起および蛍光の放射スペクトルを有する第一蛍光マーカーと第二蛍光マーカーとを用い、第一DNA試料を第一蛍光マーカーによって標識するとともに、第二DNA試料を第二蛍光マーカーによって標識する工程と、
第一DNA試料および第二DNA試料を、変換型および非変換型としてDNA試料のCpG島部位とハイブリダイズするように設計された複数のオリゴヌクレオチド捕獲プローブを有するマイクロアレイ装置上にハイブリダイズさせる工程
を含む内部基準試料を用いる核酸のメチル化検出方法。 - 被検試料から得た基準試料を用いて、多数のCpG島部位のメチル化を同時に検出する方法であって、
(a)分析のためのDNA試料を提供する工程と、
(b)DNA試料を第一のDNA試料と第二のDNA試料に分けて、それによって第一の試料を被検試料とし、第二の試料を内部基準試料とする工程と、
(c)メチルシトシン残基が非メチル化シトシン残基として増幅されるように、核酸増幅工程によって第二のDNA試料を増幅する工程と、
(d)増幅された第一のDNA試料および第二のDNA試料双方における非メチル化シトシン残基をデオキシウラシル残基に亜硫酸水素塩によって変換する工程と、
(e)変換された第一のDNA試料および変換された第二のDNA試料を増幅する工程と、
(f)亜硫酸水素塩によって変換された第二のDNA試料を第二の蛍光マーカーによって標識し、亜硫酸水素塩によって変換された第一のDNA試料を第一の蛍光マーカーによって標識する工程であって、該第一および第二の蛍光マーカーが重なり合わない蛍光の励起および蛍光の放射スペクトルを有する工程と、
(g)第一のDNA試料および第二のDNA試料を、亜硫酸水素塩による変換型および非変換型としてDNA試料のCpG島部位とハイブリダイズするように設計された複数のオリゴヌクレオチド捕獲プローブを有するマイクロアレイ装置上にハイブリダイズさせる工程
を含む方法。 - 使用される増幅技術がPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)である、請求項1または2に記載の方法。
- ハイブリダイゼーション条件が高ストリンジェントな条件である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 重なり合わない蛍光標識が、Cy3(1,1'-ビス(ε-カルボキシペンチル)-1'エチル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン-5,5'-ジスルホン酸カリウム塩 ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、およびCy5(1,1'-ビス(ε-カルボキシペンチル)-1'エチル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン-5,5'-ジスルホン酸カリウム塩 ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 被検DNA試料中のCpG島のシトシン部位のメチル化の検出用マイクロアレイ基板であって、
(a)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって被検シトシン部位以外のシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(b)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって全てのシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド
が固定されている、マイクロアレイ基板。 - 以下を含む、被検DNA試料中のCpG島のシトシン部位のメチル化検出用キット:
(a)請求項6記載のマイクロアレイ基板;
(b)亜硫酸水素塩変換試薬、および/またはDNA標識試薬。 - 以下を含む、被検DNA試料中のCpG島のシトシン部位のメチル化検出用キット:
(a)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、被検シトシン部位以外のシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド;および
(b)前記DNA試料中の被検シトシン部位を含むDNA断片であって、全てのシトシン部位がチミンへ置換されたDNA断片と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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