WO2005090565A1 - Ｄｎａアレイと一塩基多型の検出方法 - Google Patents

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probe
gene
dna array
probe spot
single nucleotide
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Mitsuo Kawase
Yasuko Yoshida
Kazunari Yamada
Yutaka Takarada
Kouzo Hashimoto
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Toyobo Co., Ltd.
Ngk Insulators, Ltd.
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    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/501—Detection characterised by immobilisation to a surface being an array of oligonucleotides

Definitions

  • the invention of this application relates to a DNA array and a method for detecting a single nucleotide polymorphism. More specifically, the invention of this application relates to a DNA array capable of more accurately detecting a single nucleotide polymorphism, and a method for detecting a single nucleotide polymorphism using the DNA array.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • a single nucleotide polymorphism is a condition in which one base of a genomic gene is replaced with another base, for example, the wild type is a GC base pair, while the polymorphic form is an AT base pair.
  • each allele of the dimer chromosome is polymorphic II (homozygous polymorphism) and one where the allele is wild-type and the other is polymorphism (heterozygous polymorphism).
  • Such single nucleotide mutations may result in the synthesis of mutant amino acids due to codon mutations (missense mutation) or incomplete protein synthesis due to the generation of stop codons (nonsense mutation). Therefore, it is becoming clear that the presence or absence of SNPs is related to various diseases (for example, SNP of p53 gene for lung cancer: Non-patent document 1).
  • Judge accurately (SNP typing) is becoming increasingly important. This SNP is also a useful polymorphic marker when searching for genes related to disease susceptibility and drug responsiveness, and is attracting attention as important genetic information for tailor-made medicine.
  • Non-Patent Document 4 a DNA array was used. BRCA1 gene SNP detection cases have been reported. This DNA array for SNP detection is composed of, for example, a first probe spot complementary to a wild-type sequence of a target gene and a second probe spot complementary to a single nucleotide polymorphism sequence of the gene on a solid-phase substrate. It is located above.
  • the target gene cDNA prepared by means such as PCR amplification using a fluorescent-labeled primer is brought into contact with this DNA array. If the target gene is wild-type, the labeled cDNA hybridizes to the first probe, and a fluorescent signal is obtained only from the spot of the first probe (homozygous wild-type form). On the other hand, when both alleles of the target gene are SNPs, a fluorescent signal is obtained only from the second probe spot (homozygous SNP form). The same level of fluorescent signal is obtained in both the probe spot and the second probe spot (heterozygous SNP form).
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 5,605,662
  • Patent Document 3 International Publication No. 95/251 1 16 Pan fret
  • Patent Document 4 WO 95/35505 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Biros et al. Neoplasma 48 (5): 407-l 1, 2001
  • Non-Patent Document 2 Schena, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10614- 10619, 1996
  • Non-Patent Document 3 Heller, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997.
  • Non-Patent Document 4 Hacia JG et al. Nat. Genet. 14: 441-447, 1996
  • the labeled cDNA derived from each of the wild-type gene and the polymorphic gene has a difference of only one base. Therefore, most of the wild-type cDNA hybridizes to a completely complementary wild-type probe (first probe), but also partially hybridizes to a second probe having a different base. Similarly, the polymorphic cDNA partially hybridizes to the first probe. Therefore, SNP detection using a DNA array is performed by comparing the fluorescence signals of the first probe spot and the second probe spot, but it may be difficult to compare the signal intensities of both.
  • an object of the invention of this application is to provide a DNA array that enables more accurate SNP detection, and a SNP detection method using the DNA array. Further, the invention of this application provides a method for determining a probe length that enables more accurate detection in SNP detection using a DNA array, and a DNA array having a probe of a specific length determined by this method. The challenge is to do that. The inventors of the present application have completed the present invention by finding that the length of a probe capable of obtaining an optimum labeling signal for accurately determining the SNP form differs for each test gene to be subjected to SNP detection. .
  • This application provides a DNA array for detecting a monobasic polymorphism of a gene as a first invention for solving the above-mentioned problem, wherein a sequence portion that hybridizes to a gene polynucleotide has a sequence portion of the gene.
  • a first set of probe spots consisting of one or more probes that are exactly complementary to the first polymorphic form, and one or more that have the same sequence portion exactly complementary to the second polymorphic form of the gene
  • the probe spots having the second probe spots and the second probe spots on the solid-phase substrate, and constituting the first probe spots and the second probe spots, are provided for each probe spot.
  • a DNA array having a different probe length is provided for each probe spot.
  • the first probe spot group and the second probe spot group each consist of 2 to 10 probe spots. Further, in the above aspect of the first invention, a preferable aspect is that 2 to 10 probe spots are arranged in the order of the length of the probe.
  • This application provides, as a second invention, a kit for detecting a single nucleotide polymorphism in a gene, the kit comprising at least the DNA array of the first invention.
  • the present invention provides, as a third invention, a method for detecting a single nucleotide polymorphism of a gene using the DNA array according to the first invention, comprising the following steps:
  • each of the first probe spot group and the second probe spot group measured in the step (c) is used. Comparing nulls is a further preferred embodiment.
  • the present invention provides, as a fourth invention, a method for determining an appropriate probe length for detecting a single nucleotide polymorphism using the DNA array of the first invention, comprising the following steps:
  • the present invention provides, as a fifth invention, a DNA array for detecting a single nucleotide polymorphism in a gene, wherein the sequence portion hybridizing to the gene polynucleotide is exactly complementary to the first polymorphic form of the gene.
  • the DNA array of the first invention is provided with probe spots having various probe lengths, which can more accurately perform various single nucleotide polymorphism forms. Therefore, by the method of the third invention using the DNA array of the first invention, More accurate SNP detection becomes possible. Further, by the method of the fourth invention, an appropriate prop length is determined for each gene targeted for SNP detection.
  • the DNA array of the fifth invention including a probe spot having a probe length suitable for SNP detection of each gene is provided.
  • single nucleotide polymorphism refers to a case having a single nucleotide mutation different from a gene sequence registered in a gene database or the like. Therefore, a gene sequence registered in a database or the like does not always mean a wild type (normal type), and a gene having a single nucleotide mutation is not a mutant gene.
  • the wild type can be defined as “normal type” and the single nucleotide polymorphism can be defined as “mutant type”.
  • the “first polymorphic form” and “second polymorphic form” of a gene basically do not mean “wild type” and “mutant type”.
  • the first polymorphic form is the form of the gene sequence registered in the database, etc.
  • the second polymorphic form is that one base in the sequence of the first polymorphic form is replaced with another base. It is defined as a form consisting of an array.
  • the “gene polynucleotide” in the invention of this application specifically means genomic DNA of a gene to be detected for SNP, mRNA transcribed from genomic DNA, or cDNA synthesized from mRNA.
  • the polynucleotide is a molecule to which a plurality of nucleotides, preferably 30 or more, more preferably 50 or more nucleotides are bound.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration example of a DNA array of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing another configuration example of the DNA array of the present invention.
  • Fig. 4 [Fig. 4] A fluorescence image showing an example in which the SNP of the gene MTHFR was detected using the DNA array of the present invention.
  • FIG. 5 is a fluorescence image showing an example in which SNPs of the genes CYP 2C 19-2 and CYP 2C 19-3 were detected using the DNA array of the present invention.
  • the DNA array of the first invention comprises a first probe spot group consisting of one or more probes and a second probe spot group consisting of one or more probes. It has on the base.
  • the sequence portion that hybridizes to the gene polynucleotide to be analyzed is exactly complementary to the first polymorphic form of the same gene, and the second Configure probe spots
  • the sequence portion that hybridizes to the polynucleotide of the gene is exactly complementary to the second polymorphic form of the gene.
  • the probe spots constituting each of the first probe spot group and the second probe spot group are constituted by probes having different lengths.
  • a “probe spot” is a population of one or more, preferably 10 3 to 10 i 3 , identical probes (probes of the same sequence and length) separated from other probe spots.
  • the “probe spot group” means a group of probe spots consisting of probes having the same sequence and different lengths. This group is, in one preferred embodiment, a group consisting of 2 to 10 probe spots. In a preferred embodiment, these probe spots are arranged in the order of the lengths of the probes constituting the probe spots.
  • the probe spot group thus arranged may be referred to as a “probe spot row”. Further, in the first probe spot row and the second probe spot row, probe spots having the same probe length may be opposed to each other.
  • the row of the first probe spots (black circles) and the row of the second probe spots (white circles) are each constituted by eight probe spots.
  • the probes contained in each probe spot are arranged in order from the longest to the shortest in the first to eighth stages. That is, the probes constituting each of the first probe spot row and the second probe spot row in the first row are n nucleotides (n mer). -1 mer, n-2 mer, n-3 mer, n-4 mer, n-5 mer, n-6 mer, n-7 mer.
  • “nj t is about 10 to 100, preferably about 20 to 50”.
  • the “length order” may be in the order of long-short, or may be in the order of short ⁇ long.
  • the difference in probe length may be a single base difference, or two or three bases. Differences may be different.
  • the spots of the first probe spot row and the second probe spot row are set vertically (from top to bottom). Although they are arranged, they may be arranged in the ⁇ direction (right to left). Furthermore, about 2 to 5 probe spots composed of the same probe (probe having the same sequence and the same length) may be arranged. For example, in FIG. 2, in each row of the first probe spot row and the second probe spot row, three probe spots made of the same probe are arranged in parallel.
  • the DNA array of the first invention can be prepared in the same manner as a normal DNA array except that the probe spot groups (preferably, probe spot rows) are arranged as described above.
  • the probe spot groups preferably, probe spot rows
  • methods for preparing a DNA array a method of synthesizing a probe directly on the surface of a solid support (on-chip method) and a method of immobilizing a previously prepared probe on the surface of a solid support are known.
  • the DNA array of the present invention is preferably prepared by the latter method.
  • a probe into which a functional group is introduced is synthesized, the probe is spotted on the surface of the surface-treated solid substrate, and covalently bonded (for example, Lamture, JB).
  • Lamture, JB et al. Nucl. Acids Res. 22: 2121-2 125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22: 5456-5465, 1994).
  • the probe is generally covalently bonded to a surface-treated solid substrate via a spacer or a crosslinker.
  • a method of aligning a small piece of polyacrylamide gel on a glass surface and covalently attaching a probe thereto (Yershov, G. et al. Proc.
  • the DNA array of the present invention can be prepared by any of the above methods. Also, spotting is performed by dropping the probe on the surface of the solid substrate. The pinning can be performed by a pin method (for example, US Pat. No. 5,807,5223), but the ink jet method disclosed in JP-A-2001-116750 and JP-A-2001-186881 is adopted. This is preferable for forming a uniform and uniform spot. In addition, in this ink jet system, the number of probes included in each probe spot can be made equal, so that differences in hybridization due to differences in probe length can be accurately measured.
  • a second invention is a kit for detecting a single nucleotide polymorphism, comprising the DNA array.
  • the kit may, for example, can be constituted by a DNA array, primers, PCR buffer, dNTP, M g Cl 2, Taq DNA polymerase Ichize like.
  • the method of the third invention is a method for detecting a single nucleotide polymorphism of a gene using the DNA array of the first invention, and is characterized by including the following steps as essential.
  • test gene in step (a) is a gene for which the presence of SNP is known, and its labeled polynucleotide is, for example, an existing SNP database (for example, http://SNP.ims.u-tokyo.ac.jp/ It can be prepared as a PCR product (cDNA) from a genomic gene or total RNA isolated from a subject by using a set of primers published on indexJa.html).
  • a labeled primer eg, a cyanine-based organic dye; a primer to which Cy3, Cy5, or the like is bound
  • the target nucleotide sequence is brought into contact with the DNA array and hybridized to the probes of the DNA array.
  • Hybridization can be carried out by spotting an aqueous solution of labeled polynucleotide dispensed on a 96-well or 384-well plastic plate onto a DNA array. The amount of spotting can be on the order of 1-100 nl.
  • the hybridization is preferably carried out at a temperature in the range of room temperature to 70 for 1 to 20 hours.
  • washing is performed using a mixed solution of a surfactant and a buffer to remove unreacted labeled polynucleotide.
  • a surfactant It is preferable to use sodium dodecyl sulfate (SDS) as the surfactant.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • As the buffer a citrate buffer, a phosphate buffer, a borate buffer, a Tris buffer, a good buffer, and the like can be used, but a citrate buffer is preferably used.
  • step (c) a signal obtained from the labeled polynucleotide hybridized to the probe is measured.
  • the cutoff value of the obtained signal is set to 20,000, and at least one of the signals in the first probe spot group and the second probe spot group is more than 20,000 in the first probe spot group and the second probe spot group.
  • test gene is determined to be a homozygous first polymorphism.
  • signal ratio is ⁇ 0.2, the test gene is determined to be a homozygous second polymorphism.
  • the test gene is determined to be a heterozygous polymorphism.
  • the DNA array illustrated in FIG. 1 signals are observed in all eight spots constituting the first probe spot row, and the signal is observed in the second probe spot row.
  • this test gene is determined to be a homozygous first polymorphism.
  • the sum of the signal intensities of the signal spots of the first probe spot row is equal to the second.
  • the criterion of the above (3) may be that the number of signal spots is the same, and the sum of the signal intensities of each is 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less. it can. That is, in the conventional method, the signal intensity of each of the single first probe spot and the second probe spot is compared, whereas in the method of the third invention, the probe spots each composed of a plurality of spots are compared. Measure the number of spots that emit more signals from the bird group and compare them. This makes it possible to detect SNPs with much higher accuracy than the conventional method.
  • the preparation of the labeled polynucleotide and the hybridization procedure in the third invention are described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-095574, a number of patent documents and non-patent documents. Can be adopted as appropriate.
  • the method of the fourth invention is a method of determining an appropriate probe length for detecting a single nucleotide polymorphism of each gene using the DNA array of the first invention.
  • the probe length most suitable for detecting SNPs by the method of the third invention that is, the probe length that can accurately reflect each single nucleotide polymorphism form, is:
  • the probe length is determined in the fourth invention.
  • the DNA array of the fifth invention is provided, which is provided with a probe spot having an appropriate probe length for each gene.
  • the DNA array of the fifth invention is provided with “one” first probe spot and second probe spot for one test gene.
  • the probes that make up each probe spot are the optimal length for detecting the SNP of that gene. Therefore, the DNA array of the fifth invention can have a probe spot for detecting SNPs of a much larger number of genes than the DNA array of the first invention, and the SNP detection system can It is substantially the same as the DNA array of the first invention.
  • the first probe whose sequence portion that hybridizes to the polynucleotide (cDNA) of each gene GNB3 and MTHFR is exactly complementary to the first polymorphic form of each gene.
  • a second professional that is complementary to Were synthesized with different lengths by one base each.
  • the nucleotide sequence of each probe is SEQ ID No. 1-8 for the first probe (GNB3C-01 to 08) for gene GNB3, and SEQ ID No. 9- for the second probe (GNB3T-01 to 08). 16.
  • the first probe (MTHFRC-01 to 08) for the gene MTHFR is SEQ ID No. 17-24
  • the second probe (MTHFRT-01-08) is SEQ ID No. 25-32.
  • the base sequence “TTTTT” is linked to the 5 ′ side of each base sequence of SEQ ID Nos. 1-32.
  • the 5 'of these probes was modified with an amino group, and 200 pL of a 50 pmol / L solution per spot was spotted on an epoxy glass substrate for oligo DNA immobilization.
  • the configuration of the first probe spot row and the second probe spot row consisted of three probe spots consisting of the same probe arranged in parallel.
  • the plate was incubated at 42 "C and 50% relative humidity for 1 minute. Then, the plate was washed with 0.2% SDS aqueous solution at room temperature for 2 minutes, and then twice with sterile water at room temperature for 1 minute. Finally, after incubating for 20 minutes in 50 T of sterile water, the mixture was centrifuged in a centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes and dried.
  • amplification was performed under the following PCR conditions to prepare a labeled polynucleotide.
  • the labeled polynucleotide prepared in the above (2) was mixed with 0.3 N NaOH (final concentration) and denatured to a single strand. Then, 200 mM citrate-phosphate buffer ( ⁇ 6.0), 2% SDS, 750 mM NaCL 0.1% NaN 3 (all final concentrations) was added and mixed to obtain a sample. Next, the hybridization sample was dropped onto the DNA array prepared in the above (1), covered with a cover glass, and incubated in a moisture chamber at 55% relative humidity of 100%. After the reaction, the cover glass was removed, and the plate was immersed in a 2X SSC, 1% SDS aqueous solution preheated to 55 at 55 for 20 minutes. Next, it was immersed in a 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.025% Tween20 aqueous solution for 15 minutes, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes in a centrifuge, and dried.
  • Fluorescent images were measured with a Scan Array (manufactured by Packard Bioscience) using 100% of laser laser and 100% of total. The obtained images are as shown in Figs. The obtained image signals were quantified using GenePix Pro (Axon) (Table 1-3).
  • the cut-off value of the fluorescent signal is 20,000, and the ratio of the fluorescent signal of the first probe and the second probe in the portion where the fluorescent signal of at least one of the first probe and the second probe is 20,000 or more (1Z2) is Calculated.
  • the fluorescence signal ratio was> 5
  • the homozygous first polymorphism was determined
  • the homozygous second polymorphism was determined
  • the fluorescence signal ratio was 0.2 or more to 5 or less
  • the heterozygous polymorphism was determined. However, it was confirmed that it was consistent with the fact.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the gene polymorphisms of the genes CYP 2C19-2 and CYP 2C19-3 were detected and tested.
  • the nucleotide sequence of each probe is as follows: the first probe (CYP 2C19-2-G-Ol ⁇ 05) for the gene CYP 2C19-2 is SEQ ID No. 33-37, the second probe (CYP 2C19-2- A-06 to 010) SEQ ID No. 38-42, the first probe of the gene CYP 2C19-3 (CYP 2C19-3-G-0Il to O5) is SEQ ID No. 43-47, the second probe (CYP 2C19-3-G-0Il to O5).
  • CYP 2C19-3-A-06 to 010) is SEQ ID No. 48-52.
  • the nucleotide sequence “TTTTT” is linked to the 5 ′ side of each nucleotide sequence of SEQ ID Nos. 33-52.
  • each of the genes CYP 2C19-2 and CYP 2C19-3 was as shown in the left column of FIG. That is, in the case of the array for CYP 2C19-2, 1 to 5 are the first probe spot rows, and 6 to ⁇ are the second probe spots ⁇ . Also, the array for CYP 2C19-3 In this case, 11 to 15 are the first probe spot rows, and 16 to 20 are the second probe spot rows.
  • the invention of this application relates to a DNA array that enables more accurate SNP detection and a method for performing accurate SNP detection using this DNA array.
  • the invention of this application also relates to a method for determining an appropriate probe length according to a gene to be subjected to SNP detection, and a DNA array provided with a probe having the probe length determined by this method. According to these inventions, it is possible to search for genes related to disease susceptibility and drug responsiveness, or SNPs as important genetic information for tailor-made medicine: ⁇ Reliable and reproducible detection It becomes.

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Abstract

遺伝子の一塩基多型を検出するためのDNAアレイであって、遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が遺伝子の第1の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第1のプローブスポット群と、同配列部分が遺伝子の第2の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第2のプローブスポット群とを固相基体上に有し、第1プローブスポット群と第2プローブスポット群のそれぞれを構成するプローブスポットは、プローブスポット毎にプローブの長さが異なる。このDNAアレイは、より正確なSNP検出を可能とする。

Description

明細書
DNAアレイと一塩基多型の検出方法
技術分野 この出願の発明は DNA アレイと一塩基多型の検出方法に関するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 一塩基多型をより正確に検出することので きる DNA アレイと、 この DNAアレイを用いた一塩基多型の検出方法に関する ものである。
背景技術 ポストゲノムの時代を迎え、 ヌクレオチド配列中の塩基種を正確に、 効率よく、 さらには低コストで検出するための新しい技術が求められている。 例えば、 SNP (Single Nucleotide Polymorphism:—塩基多型） はヒトゲノムに約 0.1。/。 （約 1000 塩基に一塩基） の割合で存在する最も頻度の高い多型である。 すなわち、 この一塩基多型とは、 ゲノム遺伝子の一塩基が他の塩基に置換することによって、 例えば野性型が G-C塩基対であるのに対し、 多型形態では A-T塩基対となって いる状態を意味する。 また二媒体染色体のそれぞれの対立遺伝子が多型形 IIであ る場合 （ホモ接合型多型形態） と、 一方が野性型、 他方が多型形態である場合 (ヘテロ接合型多型形態） とが存在する。 このような一塩基の変異は、 例えばコドン変異による変異アミノ酸の合成 （ミ スセンス変異） や終止コドンの生成による不完全タンパク質の合成 （ナンセンス 変異） を生じさせる場合がある。 従って、 SNP の有無が様々な疾病にも関連す ることが明らかになりつつあり （例えば肺癌に関する p53 遺伝子の SNP ：非特 許文献 1) 、 診断や遺伝的治療法等を目的として SNP の有無を正確に判定する こと （SNP タイピング） の重要性が強く認識されてきている。 また、 この SNP は疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカ 一でもあり、 テーラ一メイド医療のための重要な遺伝子情報としても注目されて いる。
SNP タイピングの方法としては、 「ハイブリダィゼーシヨン効率を利用した 方法」 、 「酵素認識効率を利用した方法」 、 「電気的手法を利用した方法」 等が 知られているが、 特にハイブリダィゼ一シヨン効率を利用した方法は、 DNA ァ レイ （例えば特許文献 1-4、 非特許文献 2、 3参照） への適用が様々に検討され ており、 例えば非特許文献 4には DNAアレイを用いた BRCA1遺伝子 SNPの 検出例が報告されている。 この SNP検出用の DNA アレイは、 例えば、 標的遺伝子の野性型配列に相補 的な第 1 プロ一ブスポットと、 その遺伝子の一塩基多型配列に相補的な第 2 プ ローブスポットとを固相基体上に配置している。 そして、 SNP の検出に当たつ ては、 蛍光標識プライマーを用いた PCR 増幅等の手段によって調製された標的 遺伝子 cDNAをこの DNAアレイに接触させる。 標的遺伝子が野性型の場合、 そ の標識 cDNA は第 1 プローブにハイブリダィズし、 第 1プローブのスポットか らのみ蛍光シグナルが得られる （ホモ接合型野性型形態） 。 一方、 標的遺伝子の 両方の対立遺伝子が SNPの場合には、 第 2 プローブスポットのみから蛍光シグ ナルが得られ （ホモ接合型 SNP形態） 、 一方の対立遺伝子が SNPの塲合には、 第 1 プローブスポッ卜と第 2 プローブスポッ卜との両方に同程度の蛍光シグナ ルがえられる （ヘテロ接合型 SNP形態） 。 特許文献 1 米国特許第 5，474，796号明細書
特許文献 2 米国特許第 5,605,662号明細書
特許文献 3 国際公開第 95/251 1 16号パンフレツ卜
特許文献 4 国際公開第 95/35505号パンフレツ卜
非特許文献 1 Biros et al. Neoplasma 48(5):407- l 1 , 2001
非特許文献 2 Schena, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10614- 10619, 1996
非特許文献 3： Heller, R. A. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150- 2155, 1997
非特許文献 4： Hacia JG et al. Nat. Genet. 14:441-447, 1996
発明の開示
DNAァレイを用いた SNP検出では、 それぞれのプロ一ブスポットの蛍光シグ ナルを指標として明確に野性型形態、 ホモ接合型 SNP形態、 ヘテロ接合型 SNP 形態を区別することは容易ではない。 すなわち、 野性型遺伝子と多型遺伝子のそ れぞれに由来する標識 cDNA は一塩基のみの違いである。 従って、 野性型 cDNA の多くはそれに完全に相補的な野性型プローブ （第 1 プローブ） にハイ ブリダィズするが、 一部は一塩基が異なる第 2 プローブにもハイブリダィズす る。 同様に多型 cDNA も一部は第 1 プローブにもハイブリダィズする。 そこで DNAァレイによる SNP検出は、 第 1 プロ一ブスポットと第 2 プロ一ブスポッ トのそれぞれの蛍光シグナルを比較することによって行われるが、 両者のシグナ ル強度の比較が困難な場合があり、 結果として誤った SNP 判定を行ってしまう という不都合が存在した。 そこでこの出願の発明は、 より正確な SNP検出を可能とする DNA アレイと、 この DNAアレイを用いた SNP検出方法を提供することを課題としている。 さらにこの出願の発明は、 DNAアレイを用いた SNP検出において、 より正確 な検出を可能とするプローブ長を決定する方法と、 この方法により決定された特 定長のプローブを備えた DNAアレイを提供することを課題としている。 この出願の発明者らは、 SNP 検出の対象となる被験遺伝子毎に、 SNP 形態を 正確に判定するための最適標識シグナルを得ることのできるプローブ長が異なる ことを見出してこの発明を完成させた。 この出願は、 前記の課題を解決するための第 1 .の発明として、 遺伝子の一塩 基多型を検出するための DNA アレイであって、 遺伝子ポリヌクレオチドに八ィ ブリダィズする配列部分が遺伝子の第 1 の多型形態に正確に相補的である 1 以 上のプローブからなる第 1のプローブスポッ ト群と、 同配列部分が遺伝子の第 2 の多型形態に正確に相補的である 1 以上のプローブからなる第 2 のプロ一ブス ポット群とを固相基体上に有し、 第 1 プローブスポット群と第 2 プロ一ブスポ ット群のそれぞれを構成するプローブスポッ トは、 プローブスポット毎にプロ一 ブの長さが異なる、 ことを特徴とする DNAアレイを提供する。 この第 1発明の DNAアレイにおいては、 第 1プローブスポット群と第 2プロ —ブスポット群は、 それぞれ、 2〜10 のプロ一ブスポットからなることを好ま しい態様としている。 またこの第 1 発明の前記態様においては、 2〜10 のプロ一ブスポットが、 そ のプローブの長さの順に配置されていることを好ましい態様としている。 この出願は、 第 2の発明として、 前記第 1発明の DNAアレイを少なくとも含 む、 遺伝子の一塩基多型を検出するためのキットを提供する。 この出願は、 第 3の発明として、 前記第 1発明の DNAアレイを用いて遺伝子 の一塩基多型を検出する方法であって、 以下のステップ：
(a) 被験遺伝子から、 標識ポリヌクレオチドを調製するステップ；
(b) 標識ポリヌクレオチドをプローブ付固相基体に接触させるステップ； (c) DNAアレイ上のプローブにハイブリダィズした標識ポリヌクレオチドより 得られるシグナルを測定するステップ；
を含むことを特徴とする一塩基多型の検出方法を提供する。 この第 3 発明の方法においては、 前記ステップ (c)において測定された、 前記 第 1 のプロ一ブスポット群と前記第 2 のプローブスポッ卜群のそれぞれのシグ ナルを比較することをさらに好ましい態様としている。 この出願は、 第 4の発明として、 前記第 1発明の DNAアレイを用いて、 遺伝子 の一塩基多型を検出するための適切なプローブ長を決定する方法であって、 以下 のステップ：
(a) 被験遺伝子から、 標識ポリヌクレオチドを調製するステップ；
(b) 標識ポリヌクレオチドを DNAアレイに接触させるステップ；
(c) DNAァレイ上の各プローブに結合した標識ポリヌクレオチドの標識シグナ ルを測定し、
以下の基準：
(i) 被験遺伝子がホモ接合性第 1多型形態の場合に第 1のプローブスポッ ト群に 標識シグナルが観察されること、
(ii) 被験遺伝子がホモ接合性第 2多型形態の場合に第 2のプローブスポッ ト群 に標識シグナルが観察されること、
(iii) 被験遺伝子がヘテロ接合性多型形態の場合に第 1のプローブスポッ ト群と 第 2のプロ一ブスポット群とに同程度の標識シグナルが観察されること、 を満たすプローブスポットのプローブ長を、 その遺伝子の一塩基多型を検出する ための適切なプローブ長と決定することを特徴とする方法を提供する。 さらにこの出願は、 第 5 の発明として、 遺伝子の一塩基多型を検出するため の DNA アレイであって、 遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダィズする配列部 分が遺伝子の第 1 の多型形態に正確に相補的である 1 以上のプローブからなる 第 1 のプローブスポットと、 同配列部分が遺伝子の第 2 の多型形態に正確に相 補的である 1 以上のプロ一ブからなる第 2 のプローブスポットとを固相基体上 に有し、 第 1 および第 2 のプローブスポットを構成するプローブ長が、 前記第 4発明の方法で決定された長さである DNAアレイを提供する。 第 1発明の DNAアレイは、 様々な 1塩基多型形態に対してより正確に八イブ リダィズすることのできる様々なプローブ長からなるプローブスポットを備えて いる。 従って、 この第 1発明の DNAアレイを用いた第 3発明の方法によって、 より正確な SNP検出が可能となる。 また第 4 発明の方法によって、 SNP検出の対象となる遺伝子毎に適切なプロ ープ長が決定される。 そして、 この方法によって、 各遺伝子の SNP検出に適し たプローブ長からなるプローブスポットを含む第 5発明の DNAアレイが提供さ れる。 なおこの出願の発明において、 「一塩基多型」 とは例えば遺伝子データベース 等に登録された遺伝子配列とは異なる一塩基変異を有する場合を言う。 従って、 データべ一ス等に登録された遺伝子配列が必ずしも野性型 （正常型） を意味する わけではなく、 また一塩基変異を有する遺伝子が変異遺伝子であるわけでもない。 ただし、 一塩基の変異が疾患等に関連することが知られている遺伝子については、 野性型を 「正常型」 、 一塩基多型を 「変異型」 と定義することもできる。 この出 願の発明においては、 従って、 遺伝子の 「第 1 の多型形態」 と 「第 2 の多型形 態」 とは、 基本的に 「野性型」 および 「変異型」 を意味するものではなく、 以下 の説明では、 第 1 の多型形態はデータベース等に登録されている遺伝子配列の 形態、 第 2 の多型形態は第 1 多型形態の配列中の一塩基が他の塩基に置換した 配列からなる形態と定義する。 この出願の発明における 「遺伝子ポリヌクレオチド」 とは、 具体的には、 SNP 検出の対象となる遺伝子のゲノム DNA、 ゲノム DNAから転写された mRNA、 または mRNAから合成された cDNAを意味する。 またこのポリヌクレオチドは、 複数のヌクレオチド、 好ましくは 30以上、 より好ましくは 50以上のヌクレオ チドが結合した分子である。 この出願の各発明における具体的構成は、 発明の実施形態の説明や実施例にお いて詳しく説明する。 またこの発明に係る用語や概念は、 特別に規定したものを 除き、 当該技術分野において通常使用されている範囲のものである。 さらにこの 発明を実施するために使用する様々な技術は、 特にその出典を明示した技術を除 いては、 公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。 例えば、 遺伝子工学および分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Aus bel, F. M. et al.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載され ている。
図面の簡単な説明 図 1は、 この発明の DNAアレイの構成例を示した模式図である。 図 2はこの発明の DNAァレイの別の構成例を示した模式図である。 図 3 «：、 この発明の DNAアレイを用いて遺伝子 GNB3の SNPを検出した例 を示した蛍光画像である。 図 4【ま、 この発明の DNAァレイを用いて遺伝子 MTHFRの SNPを検出した 例を示した蛍光画像である。 図 5 は、 この発明の DNA アレイを用いて遺伝子 CYP 2C 19-2 および CYP 2C 19-3 のそれぞれの SNPを検出した例を示した蛍光画像である。
発明を実施するための最良の形態 第 1発明の DNAァレイは、 1以上のプローブからなる第 1のプロ一ブスポッ ト群と、 同じく 1 以上のプローブからなる第 2 のプローブスポット群とを固相 基体上に有している。 第 1 のプローブスポット群を構成する各プローブは、 解 析対象となる遺伝子ポリヌクレオチドにハイプリダイズする配列部分が、 同遺伝 子の第 1 の多型形態に正確に相補的であり、 第 2 のプローブスポット群を構成 する各プローブは、 同遺伝子ポリヌクレオチドにハイプリダイズする配列部分が、 同遺伝子の第 2 の多型形態に正確に相補的である。 そして、 第 1 プロ一ブスポ ット群と第 2 プロ一ブスポット群のそれぞれを構成するプローブスポットは、 それぞれ長さの異なるプローブによつて構成されている。 さらに詳しくは、 「プロ一ブスポット」 とは、 1 以上、 好ましくは 103~ 10 i3 個の同一プローブ （同一配列、 同一長のプローブ） の集団が他のプローブスポッ トと分離されて存在する領域を言う。 「プローブスポット群」 とは、 同一配列で、 かつ長さの異なるプロ一ブからなるプロ一ブスポットの集団を意味する。 この集 団は、 一つの好ましい態様として、 2~ 10 のプロ一ブスポットからなる集団で ある。 またこれらのプロ一ブスポットは、 それを構成するプロープの長さの順に 整列配置されていることを好ましい態様としている。 以下、 このように整列配置 されているプロ一ブスポット群を 「プローブスポット列」 と記載することがある。 さらに、 第 1 プロ一ブスポッ ト列と第 2 プローブスポッ ト列は、 互いに同一プ ローブ長からなるプロ一ブスポットが相対向してもよい。 図 1 ま、 第 1発明の DNAアレイの構成例である。 この第 1図の例では、 第 1 プローブスポット （黒丸） の列と、 第 2 プローブスポッ ト （白丸） の列は、 そ れぞれ 8 個のプローブスポットによって構成されている。 また、 各プロ一ブス ポットは、 それぞれに含まれるプローブが長→短の順に 1〜8段目までに整列配 置されている。 すなわち、 第 1段目の第 1 プローブスポット列と第 2プローブ スポッ ト列のそれぞれを構成するプローブは n 個のヌクレオチドであり （n mer) 、 以下第 2 段目スポッ卜のプローブから順に、 n- 1 mer、 n-2 mer、 n-3 mer、 n-4 mer、 n-5 mer、 n-6 mer、 n-7 merである。 この場合の 「nj tま 10 ~ 100程度、 好ましくは 20〜50程度である。
「長さの順番」 は長—短の順番であってもよく、 短→長の順番であってもよレ また、 プローブ長の違いは 1塩基づつの違いでもよく、 あるいは 2 または 3塩 基づつの違いであってもよい。 さらに、 この図 1 の例では第 1 プロ一ブスポッ ト列と第 2 プローブスポット列のそれぞれのスポッ トを縦方向 （上から下） に 配置しているが、 橫方向 （右から左） に配置してもよい。 さらにまた、 同一プローブ （同一配列、 同一長のプローブ） からなるプローブ スポット 2〜5個程度を整列配置するようにしてもよい。 例えば、 図 2は、 第 1 プロ一ブスポット列と第 2 プロ一ブスポッ ト列の各段には、 同一プローブから なる 3 個のプローブスポットがそれぞれ並列配置されている。 すなわち、 同一 プローブからなる複数個のプロ一ブスポットの存在によって、 個々のプローブス ポッ卜に含まれるプローブ数に若干の変動による影響を排除することができる。 第 1発明の DNAアレイは、 以上のとおりのプローブスポット群 （好ましくは プロ一ブスポット列） を配置することを除き、 通常の DNA アレイと同様にして 作製することができる。 DNA アレイの作製方法としては、 固相担体表面で直接 プローブを合成する方法 （オン ·チップ法） と、 予め調製したプローブを固相基 体表面に固定する方法とが知られているが、 この発明の DNA アレイは後者の方 法で作製することが好ましい。 予め調製したプローブを固相基体表面に固定する 場合には、 官能基を導入したプローブを合成し、 表面処理した固相基体表面にプ ローブを点着し、 共有結合させる （例えば、 Lamture, J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2 125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22: 5456-5465, 1994) 。 プローブは、 一般的には、 表面処理した固相基体にスぺ一サ一やクロ スリンカ一を介して共有結合させる。 ガラス表面にポリァクリルアミドゲルの微 小片を整列させ、 そこにプローブを共有結合させる方法 （Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:49 13, 1996) 、 あるいはポリ L一リジンを被覆 した固相基体にプローブを結合する方法 （特開 2001— 186880 号公報） も知ら れている。 また、 シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、 電極上 にはストレプトアビジンを含むァガロースの浸透層を設けて反応部位とし、 この 部位をプラスに荷電させることでビォチン化プローブを固定し、 部位の荷電を制 御することで、 高速で厳密なハイプリダイゼーションを可能にする方法も知られ てレ る ( Sosnowski, R.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1 1 19- 1 123 , 1997) 。 この発明の DNA アレイは、 以上のいずれの方法によっても作製する ことができる。 また、 プローブを固相基体表面に滴下させてスポッティングを行 ぅ塲合には、 ピン方式 （例えば米国特許第 5,807,5223 号） によって行うこと もできるが、 特開 2001- 1 16750号公報ゃ特開 2001- 186881号公報に開示され ているインクジェット方式を採用することが、 均一で一定形状のスポット形成の ために好ましい。 また、 このインクジェット方式では、 個々のプローブスポット に含まれるプローブ数を等しくすることができるため、 プロ一ブ長の違いによる ハイブリダィゼ一シヨンの違いを正確に測定することができる。 さらに、 特開 2001- 186880 号公報に開示されているような、 スポッティング重ね打ちを行う こと、 あるいは WO 03 /038089 A1号パンフレツトに開示された組成からなる プローブ溶液 （保湿性物質を含む溶液） を使用することも、 好ましいスポット形 成のために推奨される。 スポッティングの後は、 冷却、 スポッ トに対する水分付加 （湿度〜 80%程度 に一定時間保持） 、 焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、 各スポッ トを固相基体上に固定するし、 DNAアレイを完成することができる。 なお、 DNA アレイの固相基体は、 通常の DNA アレイに使用されるガラス (スライドガラス） の他、 プラスチック、 シリコーン、 セラミック等を使用する こともできる。 第 2発明は、 前記の DNAアレイを含むことを特徴とする一塩基多型検出用の キットである。 このキッ トは、 例えば、 DNA アレイ、 プライマー、 PCR緩衝液、 dNTP、 MgCl2、 Taq DNAポリメラ一ゼ等によって構成することができる。 第 3発明の方法は、 前記第 1発明の DNAアレイを用いて遺伝子の一塩基多型 を検出する方法であって、 以下のステップを必須として含むことを特徴としてい る。
(a) 被験遺伝子から、 標識ポリヌクレオチドを調製するステップ。
(b) 標識ポリヌクレオチドをプローブ付固相基体に接触させるステツプ。
(c) DNAァレイ上のプローブにハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドより 得られるシグナルを測定するステップ。 ステップ (a)における被験遺伝子は、 SNP の存在が知られている遺伝子であり、 その標識ポリヌクレオチドは、 例えば既存の SNP データベース （例えば http:/ /SNP.ims.u-tokyo.ac.jp/indexJa.html) 等で公開されているプライマ 一セットを用いて、 被験者から単離したゲノム遺伝子またはトータル RNAから の PCR産物 （cDNA) として調製することができる。 この PCR増幅の際に、 標 識プライマ一 （例えばシァニン系有機色素； Cy3、 Cy5などを結合したプライマ 一） を取り込ませて標識ポリヌクレオチドとする。 ステップ (b)では、 標的ヌクレオチド配列を DNA アレイに接触させ、 DNA ァ レイのプローブにハイブリダィズさせる。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 96 穴も しくは 384 穴プラスチックプレートに分注した標識ポリヌクレオチド水性液を、 DNAアレイ上に点着することによって実施することができる。 点着の量は、 1〜 100 nl 程度とすることができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 室温〜 70 の温 度範囲で、 1 ~20 時間の範囲で実施することが好ましい。 ハイブリダィゼーシ ヨン終了後、 界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、 未反応の標 識ポリヌクレオチドを除去する。 界面活性剤としては、 ドデシル硫酸ナトリウム ( SDS) を用いることが好ましい。 緩衝液としては、 クェン酸緩衝液、 リン酸 緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 トリス緩衝液、 グッド緩衝液等を用いることができるが、 クェン酸緩衝液を用いることが好ましい。 そして、 ステップ (c)において、 プローブにハイブリダィズした標識ポリヌク レオチドより得られるシグナルを測定する。 そして、 得られたシグナルから、 例 えば、 以下のとおりに SNPを検出する。 まず、 得られたシグナルのカッ トオフ値を 20,000とし、 第 1プローブスポッ ト群と第 2 プローブスポッ ト群の少なく ともどちらか一方のシグナルが、 20,000以上の部分の第 1 プローブスポット群と第 2プロ一ブスポット群のシグ ナル比 （第 1 /第 2) を算出し、
( 1) シグナル比が >5 の時は被験遺伝子をホモ接合性第 1 多型形態と判定する。 (2) シグナル比が <0.2 の時は被験遺伝子をホモ接合性第 2 多型形態と判定す る。
(3) さらに、 シグナル比が 0.2 以上 5 以下の時は被験遺伝子をへテロ接合性 多型形態と判定する。 更に別の判定方法としては、 図 1に例示した DNAアレイを用いた場合に、 第 1プロ一ブスポット列を構成する 8個のスポット全てにシグナルが観察され、 第 2プローブスポット列を構成する 4個のスポットにシグナルが観察された場合に は、 前記（1 )に該当し、 この被験遺伝子はホモ接合型第 1 多型形態と判定される。 あるいはまた、 第 1 プロ一ブスポット列と第 2 プロ一ブスポット列のそれぞれ から同数のシグナルスポットが得られた場合であっても、 第 1 プローブスポッ ト列のシグナルスポットのシグナル強度の総和が第 2 プローブスポット列のそ れより多い場合には、 前記（1)に該当し、 この被験遺伝子はホモ接合型第 1 多型 形態と判定される。 また前記 (3)の判定基準は、 シグナルスポットの数が同一であり、 それぞれの シグナル強度の総和が 30 %以下、 好ましく は 20 %以下、 より好ましくは 10 % 以下である塲合とすることもできる。 すなわち、 従来方法では、 それぞれ単一の第 1 プロ一ブスポットと第 2 プロ 一ブスポットのシグナル強度の多寡を比較するのに対し、 この第 3 発明の方法 では、 それぞれ複数個のスポットからなるプローブスポッ卜群からより多くのシ グナルを発するスポット数を測定し、 それを比較する。 これによつて、 従来方法 に比べてはるかに高精度で SNPを検出する ことが可能となる。 なお、 第 3 発明における標識ポリヌクレオチドの調製や、 ハイブリダィゼー シヨン手続等は、 例えば特開 2001-095574号公報を初め、 多くの特許文献、 非 特許文献に記載されており、 それらの文献記載の方法を適宜に採用して行うこと ができる。 第 4発明の方法は、 前記第 1発明の DNAアレイを用いて、 各遺伝子の一塩基 多型を検出するための適切なプローブ長を決定する方法である。 具体的には、 前 記第 3発明の方法で SNPを検出する際に最も適したプローブ長、 すなわち、 そ れぞれの 1 塩基多型形態を最も正確に反映することのできるプローブ長が、 こ の第 4発明において決定されるプローブ長となる。 従って、 被験者の SNP検出 を目的とした第 3 発明の方法によって得られるデ一夕から、 適切なプローブ長 を得ることができる。 そして、 各遺伝子について適切なプローブ長からなるプロ一ブスポッ卜をそれ ぞれに備えた第 5発明の DNAアレイが提供される。 この第 5発明の DNAァレ ィは、 一つの被検遺伝子に対して、 それぞれ 「一つ」 の第 1 プローブスポッ ト と第 2 プローブスポットを備えている。 それぞれのプローブスポッ トを構成す るプローブは、 その遺伝子の SNP を検出するための最適の長さである。 従って、 この第 5発明の DNAァレイは、 第 1発明の DNAァレイと比較してはるかに多 くの遺伝子の SNP 検出を対象とするプロ一ブスポットを備えることができ、 し かも SNP検出制度は第 1発明の DNAアレイと実質的に同一である。
実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例 1
( 1) DNAアレイの作成
遺伝子 GNB3、 MTHFR のそれぞれのポリヌクレオチド （cDNA) にハイブリ ダイズする配列部分がそれぞれの遺伝子の第 1 多型形態に正確に相補的である 第 1 プローブ、 同じく配列部分が第 2 多型形態に正確に相補的である第 2 プロ ーブを、 それぞれ 1 塩基異なる長さで合成した。 各プローブの塩基配列は、 遺 伝子 GNB3用の第 1プローブ （GNB3C-01〜08) は SEQ ID No. 1-8、 第 2プ ローブ （GNB3T-01~08) は SEQ ID No. 9-16、 遺伝子 MTHFR用の第 1プロ ーブ （MTHFRC-01〜08) は SEQ ID No. 17-24、 第 2プローブ （MTHFRT-01 -08) は SEQ ID No. 25-32である。 また、 SEQ ID Nos. 1-32の各塩基配列 の 5' 側には塩基配列 「TTTTT」 が連結されている。
これらのプローブの 5' をァミノ基で修飾し、 オリゴ DNA 固定化用エポキシ ガラス基板に、 1 スポット当たり、 50pmol/ Lの溶液を 200pLずつスポッテ イングした。 また、 第 1 プロ一ブスポット列と第 2 プロ一ブスポット列の構成 は、 図 2 に示したように、 同一プロ一ブからなるプローブスポットを 3 個づっ 並列配置した。
スポッティング後、 42"C、 相対湿度 50%の条件下で一晚インキュベートした。 次に、 0.2% SDS水溶液で室温にて 2分間洗浄し、 さらに滅菌水で室温にて 1 分間の洗浄を 2 回行った。 最後に 50Tの滅菌水中で 20 分間インキュベーした 後、 遠心器で 1000rpmX5分間遠心し、 乾燥した。
(2) 標識ポリヌクレオチドの調製
遺伝子型が判明している被験者血液から抽出した DNA をテンプレートとし、 以下の PCR条件で増幅を行い、 標識ポリヌクレオチドを調製した。
· プライマ一 1 : 5pmol (5' 末端 Cy3標識）
• プライマー 2： 5pmol
• X 10緩衝液： 2.5 1
• 2 mM dNTP： 2.5 il
• 25 mM MgCl2 ： 2.5^1
· Taq DNAポリメラーゼ： 1U
•抽出 DNA溶液： 20 ng
•増幅条件
94V 5分
94 /30秒、 6CTC/30秒、 72 /30秒 （35サイクル）
72で/2分 (3) ハィブリダイゼーシヨン
前記 (2)で調製した標識ポリヌクレオチドを 0.3 N NaOH (終濃度） と混合し、 一本鎖に変性した後、 200 mM クェン酸—リン酸緩衝液 （ρΗ6 ·0) 、 2 % SDS、 750 mM NaCL 0.1 % NaN 3 (全て終濃度） を添加、 混合し、 サンプルとした。 次に、 前記（1)で作製した DNAアレイ上にハイブリダイゼーションサンプルを 滴下し、 カバーガラスをかけ、 55 、 相対湿度 100 %のモイスチャーチャンバ —内でー晚インキュベートを行った。 反応後、 カバーガラスをはずし、 あらかじ め 55 に加温した 2 X SSC、 1 % SDS水溶液に、 55でで 20 分間浸漬した。 次に 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 、 0.025 % Tween20水溶液に 15分間浸漬し た後、 遠心器で 1000 rpmで 5分間遠心し、 乾燥した。
(4) シグナル測定
Scan Array (Packard Bioscience社製） にて、 レーザーノ ワ一 100 %、 フォ トマル 100 %で蛍光画像を測定した。 得られた画像は図 3、 4 に示したとおりで ある。 また、 得られた画像シグナルを GenePix Pro (Axon社製） にて数値化し た （表 1-3) 。
蛍光シグナルのカツトオフ値を 20,000 とし、 第 1 プローブと第 2 プロ一ブ の少なくともどちらか一方の蛍光シグナルが 20,000以上の部分の第 1 プローブ と第 2プローブの蛍光シグナル比 （第 1Z第 2) を算出した。 蛍光シグナル比が > 5 の時はホモ接合型第 1 多型形態、 < 0.2 の時はホモ接合型第 2多型形態、 0.2以上 5以下の時はへテロ接合性多型形態と判定したところ、 事実と一致した ことが確認できた。
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ζ拏
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τ拏
91
CI9S00/C002df/X3<I S9S060/S00i OAV L7 m 3
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実 SS例 2 実施例 1 と同様にして、 遺伝子 CYP 2C19-2および CYP 2C19- 3のそれぞれ の遺伝子多型を検出試験した。 各プロ 一ブの塩基配列は、 遺伝子 CYP 2C19-2 用の第 1 プローブ （CYP 2C19-2-G-Ol~05) は SEQ ID No. 33-37、 第 2 プ ローブ （CYP 2C19-2-A-06~010) SEQ ID No. 38-42、 遺伝子 CYP 2C19- 3の第 1プローブ （CYP 2C19-3-G-0Il〜O5) は SEQ ID No.43-47、 第 2プロ —ブ （CYP 2C19-3-A-06~010) は SEQ ID No. 48-52 である。 また、 SEQ ID Nos.33-52の各塩基配列の 5' 側 tこは塩基配列 「TTTTT」 が連結されている。
これらのプローブを実施例（1)と同賴にしてエポキシガラス基板に固定し、 DNA マイクロアレイを作成した。 なお、 遺伝子 CYP 2C19-2 および CYP 2C19-3のそれぞれのマイクロアレイ構成は図 5の左欄に示したとおりである。 すなわち、 CYP 2C19-2 用アレイの ±昜合には、 ①〜⑤が第 1 プローブスポット 列、 ⑥〜⑩が第 2 プローブスポット ΰである。 また、 CYP 2C19-3 用アレイの 場合には、 ⑪〜⑮が第 1 プロ一ブスポッ卜列、 ⑯〜⑳が第 2 プローブスポット 列である。
標識ポリヌクレオチドの調製、 ハイプリダイゼーシヨン、 シグナル測定はそれ ぞれ実施例 1 と同様にして行った。 得られた蛍光画像は図 5 に示したとおりである。 また、 得られた画像シグナ ルを数値化した結果は表 4 (CYP 2C19-2) および表 5 (CYP 2C19-3) に示し たとおりである。 実施例 1 と同様に蛍光シグナル比 （第 1/第 2) を算出し、 蛍 光シグナル比が >5の時はホモ接合型第 1多型形態、 <0.2の時はホモ接合型第 2多型形態、 0.2以上 5以下の時はへテロ接合性多型形態と判定したところ、 事 実と一致したことが確認された。 表 4
Major
プローブ名 シグナル値 プローブ名 シグナル値 シグナル比
① CYP 2C19-2-G-01 64465 ⑥ CYP 2C19-2-A-06 64895 1.0
② GYP 2C19-2-G-02 64984 ⑦ GYP 2C19-2-A-07 65023 1.0
③ CYP 2C19 - 2 - G— 03 64690 ⑧ CYP 2C19-2-A-08 39170 1.7
④ CYP 2C19-2-G-04 65309 ⑨ CYP 2C19-2-A-09 13075 5.0
⑤ CYP 2C19-2-G-05 65060 ⑩ CYP 2C19-2-A-10 8229 7.9
Hetero
プローブ名 シグナル値 プローブ名 シグナル値 シグナル比
① CYP 2C19-2-G-01 65303 ⑥ CYP 2C19-2-A-06 64989 1.0
② GYP 2C19-2-G-02 64907 ⑦ CYP 2C19-2-A-07 64656 1.0
③ CYP 2C19-2-G-03 43602 ⑧ CYP 2G19-2-A-08 65083 0.7
④ CYP 2G19-2 - G-04 48739 ⑨ CYP 2C19-2-A-09 65040 0.7
⑤ CYP 2C19 - 2 - G— 05 18641 ⑩ CYP 2C19-2-A-10 64823 0.3
Minor
プローブ名 シグナル値 プローブ名 シグナル値 シグナル比
① CYP 2C19-2-G-01 10371 ⑥ CYP 2C19-2-A-06 64764 0.2
② CYP 2C19-2-G-02 8176 ⑦ CYP 2C19-2-A-07 64869 0.1
③ CYP 2C19-2 - G-03 - ⑧ CYP 2G19-2-A— 08 64914 0
④ CYP 2C19-2-G-04 - ⑨ CYP 2C19 - 2 - A-09 64990 0
⑤ CYP 2G19 - 2 - G— 05 一 ⑩ CYP 2C19-2-A-10 65147 0 表 5
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産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明は、 よ り正確な SNP 検出を可能 とする DNAアレイと、 この DNAアレイを用いて正確な SNP検出を行う方法に 関するものである。 またこの出願の発明は、 SNP検 tliの対象となる遺伝子に応 じた適切なプローブ長を決定する方法と、 この方法により決定されたプローブ長 からなるプローブを備えた DNA アレイに関するものである。 これらの発明によ つて、 疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子の 索、 あるいはテーラーメ イド医療のための重要な遺伝子情報としての SNP を： Ε確かつ再現性よく検出す ることが可能となる。

Claims

請求の範囲
1. 遺伝子の一塩基多型を検出するための DNA アレイであって、 遺伝子 ポリヌクレオチドに八イブリダイズする配列部分が遺伝子の第 1の多型形態に正 確に相補的である 1以上のプローブからなる第 1のプローブスポット群と、 同配 列部分が遺伝子の第 2の多型形態に正確に相補的である 1以上のプローブからな る第 2のプローブスポット群とを固相基体上に有し、 第 1プロ一ブスポット群と 第 2プローブスポッ ト群のそれぞれを構成するプローブスポットは、 プロ一ブス ポット毎にプローブの長さが異なる、 ことを特徴とする DNAアレイ。
2. 第 1プロ一ブスポット群と第 2プロ一ブスポット群は、 それぞれ、 2 〜 1 0のプローブスポットからなる請求項 1の DNAアレイ。
3. 2〜 1 0のプローブスポットが、 そのプローブの長さの順に配置され ている請求項 2の DNAアレイ。
4. 請求項 1から 3のいずれかの DNA アレイを少なくとも含む、 遺伝子 の一塩基多型を検出するためのキット。
5. 請求項 1から 3のいずれかの DNA ァレイを用いて遺伝子の一塩基多 型を検出する方法であって、 以下のステップ：
(a) 被験遺伝子から、 標識ポリヌクレオチドを調製するステップ；
(b) 標識ポリヌクレオチドをプローブ付固相基体に接触させるステップ； (c) DNA アレイ上のプローブにハイブリダィズした標識ポリヌクレオチドより 得られるシグナルを測定するステツプ；
を含むことを特徴とする一塩基多型の検出方法。
6. 前記ステップ (c)において測定された、 前記第 1のプロ一ブスポット 群と前記第 2のプローブスポット群のそれぞれのシグナルを比較する請求項 5の 一塩基多型の検出方法。
7. 請求項 1から 3のいずれかの DNA アレイを用いて、 遺伝子の一塩基 多型を検出するための適切なプローブ長を決定する方法であって、 以下のステツ プ：
(a) 被験遺伝子から、 標識ポリヌクレオチドを調製するステップ；
(b) 標識ポリヌクレオチドを DNAアレイに接触させるステップ；
(c) DNAアレイ上の各プローブに結合した標識ポリヌクレオチドの標識シグナ ルを測定し、
以下の基準：
(i) 験遺伝子がホモ接合性第 1多型形態の場合に第 1のプローブスポット群に標 識シグナルが観察されること、
(ii) 被験遺伝子がホモ接合性第 2多型形態の場合に第 2のプローブスポッ 卜群に 標識シグナルが観察されること、
(iii)被験遺伝子がヘテロ接合性多型形態の場合に第 1のプローブスポッ卜群と第 2のプローブスポット群とに同程度の標識シグナルが観察されること、 を満たすプローブスポッ卜のプローブ長を、 その遺伝子の一塩基多型を検出する ための適切なプローブ長と決定することを特徴とする方法。
8. 遺伝子の一塩基多型を検出するための DNAアレイであって、 遺伝子 ポリヌクレオチドにハイプリダイズする配列部分が遺伝子の第 1の多型形態に正 確に相補的である 1以上のプローブからなる第 1のプローブスポットと、 同配列 部分が遺伝子の第 2の多型形態に正確に相補的である 1以上のプローブからなる 第 2のプローブスポットとを固相基体上に有し、 第 1および第 2のプローブスポ ッ トを構成するプローブ長が、 請求項 7の方法で決定された長さである DNAァ レイ。
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