WO2007055244A1 - 遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法 - Google Patents

遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法 Download PDF

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WO2007055244A1
WO2007055244A1 PCT/JP2006/322280 JP2006322280W WO2007055244A1 WO 2007055244 A1 WO2007055244 A1 WO 2007055244A1 JP 2006322280 W JP2006322280 W JP 2006322280W WO 2007055244 A1 WO2007055244 A1 WO 2007055244A1
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mutation
gene
group
probes
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Tomoki Naoe
Yasuko Yoshida
Kazunari Yamada
Kousuke Niwa
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National University Corporation Nagoya University
Ngk Insulators, Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Definitions

  • the present invention relates to a gene mutation detection array and a detection method.
  • the present invention employs the following means in order to achieve at least a part of the above-described object.
  • a first probe spot group including one or more probes whose sequence portion hybridizing to the polynucleotide is exactly complementary to the normal sequence of the gene mutation, and a mutation in which the sequence portion includes the mutation portion of the gene mutation
  • the gene mutation is a gene mutation relating to drug sensitivity or drug resistance, the array according to any one of (1) to (4) (preferably the drug is imatib or a salt thereof, AMN107 or a salt thereof BMS—354825 or salt thereof, NS-187 or salt thereof, ON O-12380 or salt thereof, and VX-680 or salt force thereof are selected, whichever is o)
  • Tm is based on the Nearest Neighbor method.
  • Tm is based on the Nearest Neighbor method.
  • the first probe spot group and the second probe spot group include any one of 1 to 225 combinations of probes selected from Table 4 below (12 ) Array.
  • Each of the first probe spot group and the second probe spot group has a probe spot corresponding to a combination of combination number 33 in Table 4 above. The array described.
  • the first probe spot group and the second probe spot group are respectively In Table 4, the array according to (13), which has a probe spot of a probe corresponding to the combination of combination number 225.
  • Each of the first probe spot group and the second probe spot group has probe spots of probes each including a normal sequence and a mutant sequence of the gene mutation shown in Table 1, and these The array as described in (9), wherein the probe is also selected to have a Tm force of 0 ° C or more and 80 ° C or less by the nearest neighbor method.
  • a kit for detecting gene mutation comprising the array according to any one of (1) to (16).
  • a probe set for detecting gene mutation associated with chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia
  • the gene mutation is an amino acid mutation T3151 in the kinase domain of the BCR-ABL gene, the first probe group including one or more probes that are exactly complementary to the normal sequence of the gene mutation, and the gene And a second probe group including one or more probes that are exactly complementary to the mutant sequence including the mutated portion of the mutation, wherein the first probe group is selected from Table 5 below.
  • a probe set comprising two or more kinds of probes, wherein the second probe group comprises one or more kinds of probes selected from Table 6 below.
  • Tm is based on the Nearest Neighbor method. (19) The first probe group and the second probe group each include any one of 1 to 225 combinations of probe selection forces selected from Table 7 below. (18) The probe set described.
  • the gene mutation is one or more selected from Table 1 showing amino acid mutations in the kinase domain of the BCR-ABL gene, and is exactly complementary to the normal sequence of these gene mutations.
  • a second probe group including one or more probes that are exactly complementary to a mutant sequence including a mutated portion of the gene mutation, and these probes include: Probe set in which Tm force by the nearest base method (Nearest Neighb or Method) range force from 0 ° C to 80 ° C is also selected.
  • a method for detecting a gene mutation comprising:
  • a first probe spot group including one or more probes whose sequence portion hybridizing to the polynucleotide is exactly complementary to the normal sequence of the gene mutation, and a mutation in which the sequence portion includes the mutation portion of the gene mutation Providing an array having on a solid support a second probe spot group comprising one or more probes that are exactly complementary to the sequence;
  • a detection method comprising:
  • a first probe spot group including one or more probes whose sequence portion hybridizing to the polynucleotide is exactly complementary to the normal sequence of the gene mutation, and a mutation in which the sequence portion includes the mutation portion of the gene mutation Providing an array having on a solid support a second probe spot group comprising one or more probes that are exactly complementary to the sequence;
  • An inspection method comprising:
  • the drug is imatinib or a salt thereof, AMN107 or a salt thereof, BMS-35 4825 or a salt thereof, NS-187 or a salt thereof, ONO-12380 or a salt thereof, and VX-6
  • the inspection method according to (27) or (28), wherein 80 or its salt power is also selected.
  • the drug may also be selected from Imatib or a salt thereof, AMN107 or a salt thereof, BMS-35 4825 or a salt thereof, NS-187 or a salt thereof, ONO-12380 or a salt thereof, and VX-6 80 or a salt power thereof.
  • the gene mutation detection array and the detection method of the present invention comprise a first probe spot group and a first probe spot group.
  • the two probe spot groups By combining with the two probe spot groups, it is possible to accurately detect gene mutations, especially genes related to drug sensitivity or drug resistance to chronic myelogenous leukemia.
  • the gist is that the gene mutation can be accurately detected by using.
  • FIG. 1 Comparison of fluorescence images of control and mutation-containing samples.
  • FIG. 2 Comparison of signal between control sample and mutation-containing sample.
  • FIG. 5 is a comparison diagram between a control sample at 42 ° C. and 100 pM and a mutation-containing sample.
  • FIG. 6 Comparison of 42 ° C 10pM control sample and mutation-containing sample.
  • FIG. 7 is a comparison diagram of a control sample at 55 ° C. and 10 nM and a mutation-containing sample.
  • FIG. 8 is a comparison diagram of a 55 ° ClnM control sample and a mutation-containing sample.
  • FIG. 9 is a comparison diagram of a control sample at 55 ° C. and 100 pM and a mutation-containing sample.
  • FIG. 12 is a comparison diagram of mixed samples at 42 ° ClnM.
  • FIG. 13 is a comparison diagram of mixed samples at 42 ° C. and 100 pM.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram showing the vicinity of amino acid mutations in the abl kinase domain region.
  • polynucleotide includes genomic DNA, mRNA, cDNA, or a part of a gene having a gene mutation.
  • the length of the polynucleotide is not particularly limited, but preferably has 30 or more nucleotide residues, more preferably 50 or more nucleotide residues! /.
  • the polynucleotide is preferably appropriately labeled.
  • the probe in the present invention includes not only oligonucleotides, RNA, and PNAs that can be hybridized with polynucleotides, but also nucleic acid derivatives obtained by publicly modifying bases.
  • the probe spot is a region where a group of one or more, preferably 10 3 to 10 13 identical probes, is separated from other probes.
  • the probe spot group means a group of probe spots composed of probes having the same sequence and the same length. Furthermore, this population consists of 1 or more, preferably 2 or more probe spots, more preferably 10 or less probe spots.
  • the probe spot may include two or more probe spots composed of probes of different lengths, or may include two or more probe spots composed of probes of the same length and different sequences, or the same. Two or more probe spots consisting of probes of the same sequence in length may be provided. More accurate detection is possible by providing two or more probe spots consisting of probes of different lengths. It becomes ability. Also, by providing probe spots with the same length and the same sequence, the accuracy of the signal for the same probe can be improved, and as a result, highly accurate detection becomes possible.
  • the first probe spot group and the second probe spot group may be such that probe spots made of probes having the same length are arranged to face each other. If the probe spot group has probe spots composed of probes having different lengths, the probe spots may be arranged in the order of length.
  • probe spots consisting of probes with different lengths and probe spots having the same probe force in the probe spot group can be set as necessary.
  • Probe spots can be arranged in a matrix by combining columns and rows.
  • first probe spot group and the second probe spot group may be held on a solid phase carrier as a pair, the first probe spot group and the second probe spot group may be paired with one normal probe spot group. Thus, a plurality of second probe spot groups may be arranged.
  • the method for immobilizing the probe on the solid phase carrier is not particularly limited, and a conventionally known method can be employed. Further, the probe may be directly synthesized on the solid phase carrier, or the synthesized probe may be fixed to the solid phase carrier. The probe is generally bound to a solid phase carrier via a linker or a spacer.
  • the probe is fixed by a method of supplying and fixing the probe to a predetermined position on the solid phase carrier by inkjet, bubble jet (registered trademark), pin method or the like. , Prefer to be.
  • the polynucleotide used in the detection method of the present invention can be prepared by PCR or the like from a genomic DNA isolated from a sample such as blood or a portion containing total gene mutation from total RNA.
  • a labeled polynucleotide can be obtained by using a primer to which Cy5 or Cy3 is bound.
  • base modification and the like may be performed as necessary.
  • the hybridization reaction can be performed by a conventionally known method.
  • a liquid containing a polynucleotide is appropriately supplied to the probe spot group. It is preferable to perform the nobduction at an appropriate temperature ranging from room temperature to 80 ° C. Chilling time is preferably in the range of 1 to 30 hours.
  • a washing step is appropriately performed, and then the presence or absence of the gene mutation or the extent thereof can be detected by detecting the labeling signal of the hybridization reaction product.
  • the signal ratio of the normal probe to the 20mer mutant probe can be detected as 0.4537.
  • the presence or absence of mutation and the mutation ratio in the sample can be detected. According to such a detection method, it is possible to detect a decrease in drug resistance or sensitivity, and it is possible to efficiently change a drug or search for an effective drug.
  • the target mutation is not particularly limited, but is preferably a genetic mutation related to drug resistance and drug sensitivity. According to the method of the present invention, it is possible to detect a plurality of these mutations or a large number thereof at a high sensitivity, and it is possible to select an effective drug by comprehensively judging drug resistance and sensitivity.
  • the genetic mutation may be a congenital mutation! Or an acquired mutation! In the case of acquired mutation, it is important to monitor the number and level of mutations.
  • the method of the present invention is suitable for such monitoring.
  • the drug for chronic myelogenous leukemia is the target drug.
  • Imabib or its salt, AMN107 or its salt, BMS 354825 or its salt, NS-187 or its salt, ONO-12380 or its salt and VX-680 or its salt power are selected It is preferable to use either drug as the target drug.
  • the target gene mutation is preferably a mutation in the BCR-ABL fusion gene on the Philadelphia chromosome, and more preferably, the amino acid mutation in the kinase domain of the BCR-ABL gene is also selected. 1 type or 2 types or more. Furthermore, it is preferably an amino acid mutation of T3151. This amino acid mutation is strongly related to resistance to imatinib.
  • One or more programs comprising a step of analyzing the presence or absence of a mutation based on the test result and a degree of the mutation, and a step of extracting a suitable drug based on a gene mutation and a drug sensitivity / resistance database constructed in advance.
  • Synthetic oligo DNA (manufactured by Nippon Genetic Laboratory Co., Ltd.) with 5 and terminal modified with an amino group was spotted on a Codelink substrate manufactured by Amersham Bioscience.
  • the gene used was T315I.
  • three spots of the same type of oligo DNA were spotted. After spotting, the mixture was incubated at 20 ° C and 75% relative humidity. Next, it was immersed for 15 minutes in Blocking Sol.
  • RNA having a wild type was used as a hybridization sample.
  • samples were prepared by amplification under the following RT-PCR conditions.
  • Tm is calculated using the nearest neighbor method.
  • the PCR amplification procedure for cDNA is as follows.
  • the above sample (PCR amplified sample only, synthetic DNA sample does not require denaturation to single strand) was converted to single strand in Streptavidin Sepharose in the presence of NaOH, and then 20 X SSC 25 After adding ⁇ L and 5% L of 10% SDS (total 100 ⁇ L), it was placed on a 95 ° C heat block for 2 minutes and then allowed to stand at room temperature for 3-5 minutes. Next, the sample solution was injected into the chamber, the inlet was closed with a seal, and hybridized in an oven for 16 hours.
  • the chamber was peeled off and immersed in 2 X SSC—0.1% SDS solution for 5 minutes. Next, it was immersed in 1 X SSC solution for 5 minutes. Finally, it was immersed in a 0.1 X SSC solution for 5 minutes and then centrifuged and dried at lOOOrpm for 10 minutes.
  • the fluorescence power was measured by appropriately adjusting the laser power with an Agilent MicroArrayScanner, and the signal of the image obtained with GenePix Pro was numerically calculated. (See figure)
  • Fig. 3 Fig. 4, Fig. 5 (control sample) and Fig. 11, Fig. 12, Fig. 13 (mutation-containing sample) fluorescence images and signals compared.
  • the probe and detection method of the present invention are effective for detecting and monitoring gene mutations corresponding to drug resistance and reduced sensitivity, and provide useful indicators for drug selection and treatment. Can do.
  • the present invention relates to an array that enables more accurate detection of gene mutations and a method for accurately detecting gene mutations using this array.
  • the presence of a mutant type in a mutant gene can be easily detected, and even a low mutation rate can be easily detected.

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Abstract

　第１のプローブスポット群と第２のプローブスポット群とを組み合わせることにより、遺伝子変異、なかでも、慢性骨髄性白血病に対する薬剤感受性又は薬剤耐性に関係する遺伝子を正確に検出することが可能であり、この遺伝子変異検出用アレイを用いることで、該遺伝子変異を正確に検出することができる。

Description

明 細 書
遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法に関する。
背景技術
[0002] ポストゲノム時代を迎え、遺伝子配列中の塩基種を正確に、効率よぐさらには低コ ストで検出するための新しい技術が求められている。例えば、遺伝子変異の一形態 である SNP (Single Nucleotide Polymerphism：—塩基多型）はヒトゲノム中に約 0. 1% の割合で存在する最も頻度の高!、多型である。 SNPを含む遺伝子の変異は不完全 なタンパク質の合成を生じさせる原因となり、様々な疾病に関連することが明らかにな りつつある。このため、診断や遺伝的治療法等を目的として遺伝子変異を正確に判 定することの重要性が強く認識されてきており、そのための手法としてアレイ技術が用 いられおり、精度向上のために様々な手法が開発されている。例えば、特開 2004— 298017号公報に記載された手法を用いると、アレイ上で核酸合成とハイブリダィゼ ーシヨン反応を行うことができるため、精度を向上することができる。
発明の開示
[0003] ところで、アレイの検出精度は、アレイに固定されたプローブによっても大きく影響 を受けることが知られている。例えば、 SNPの野生型遺伝子と多型遺伝子のそれぞれ に由来する cDNAの違 、は一塩基のみであるため、両者の違!、を検出するためには 、非常に精度の高いプローブを設計する必要がある。
[0004] 本発明は、遺伝子変異の有無を正確に検出できるアレイ及び検出方法等を提供す ることを一つの目的とする。また、本発明は、遺伝子変異の程度を検出することので きるアレイ及び検出方法等を提供することを目的とする。さらに、本発明は、薬剤感 受性及び Z又は薬剤耐性が先天的な又は後天的な遺伝子変異によって変化する 場合の遺伝子変異を検出することを目的とする。さらにまた、本発明は、遺伝子変異 によって薬剤感受性及び Z又は薬剤耐性が変化するような薬剤、特に分子標的薬 剤の選択、投与及びこうした薬剤を用いた治療方法を提供することを目的とする。 [0005] 本発明は、上述の目的の少なくとも一部を達成するために以下の手段を採った。
[0006] (1)遺伝子変異を検出するためのアレイであって、
ポリヌクレオチドにハイブリダィズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正 確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブスポット群と、前記配列部 分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプ ローブを含む第 2のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイ。
(2)前記第 1のプローブスポット群及び Z又は前記第 2のプローブスポット群は、 2 以上のプローブスポットを含む、（1)に記載のアレイ。
(3)前記第 1のプローブスポット群及び Z又は前記第 2のプローブスポット群は、異 なる長さのプローブからなるプローブスポットを含んでいる、（1)又は（2)に記載のァ レイ。
(4)前記第 1のプローブスポット群及び Z又は前記第 2のプローブスポット群にぉ ヽ て、プローブの長さの順に 2以上のプローブスポットが配列されている、（3)に記載の アレイ。
(5)前記遺伝子変異は、薬剤感受性又は薬剤耐性に関する遺伝子変異である、 ( 1)〜 (4)のいずれかに記載のアレイ (薬剤は、好ましくはィマチ-ブ若しくはその塩、 AMN107若しくはその塩、 BMS— 354825若しくはその塩、 NS- 187若しくはその塩、 ON O-12380若しくはその塩及び VX-680若しくはその塩力 選択される 、ずれかである o )
(6)前記遺伝子変異は、後天的変異である、（1)〜（5)のいずれかに記載のアレイ
(7)前記遺伝子変異は、慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う変異である 、（1)〜（6)のいずれかに記載のアレイ。
(8)前記遺伝子変異は、フィラデルフィア染色体上の BCR— ABL融合遺伝子にお ける変異である、 (7)に記載のアレイ。
(9)前記遺伝子変異は、 BCR— ABL遺伝子のキナーゼドメインにおける以下のァ ミノ酸変異を示す以下の表 1から選択される 1種又は 2種以上である、 (8)に記載のァ レイ。 [表 1]
Figure imgf000004_0001
(10)前記遺伝子変異は、 T315Iである、 (9)に記載のアレイ。
(11)前記第 1のプローブスポット群は、以下の表 2から選択される 1種又は 2種以上 のプローブのプローブスポットを含んでいる、（10)に記載のアレイ。
[表 2] オリ]'鎖長 塩基配列 (5'— 3') Tm
リ T除く） ( ）
18mer atatcatcattgagttca (配列番号： 1 ) 47
19mer atatcatcattgagttcat (配歹幡号： 2 ) 48
20mer tatatcatcattgagttcat (配歹' J番号： 3 ) 49
21mer tatatcatcattgagttcatg (酉 3列番号： 4 ) 52
Tmは、 最近接塩基対法 (Nearest Neighbor method) による。
(12)前記第 2のプローブスポット群は、以下の表 3から選択される 1種又は 2種以上 のプローブのプローブスポットを含んでいる、（11)に記載のアレイ。
[表 3]
Figure imgf000005_0001
Tmは、 最近接塩基対法 （Nearest Neighbor method) による。
(13)前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、以下の 表 4から選択されるプローブの 1〜225とおりの組見合わせ力も選択されるいずれか を備えている、（12)に記載のアレイ。
Figure imgf000006_0001
( 14)前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、それぞ れ前記表 4中、組み合わせ番号 33の組み合わせに相当するプローブのプローブス ポットを有している、（13)に記載のアレイ。
( 15)前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、それぞ れ前記表 4中、組み合わせ番号 225の組み合わせに相当するプローブのプローブス ポットを有している、（13)に記載のアレイ。
(16)前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、前記表 1 に示す遺伝子変異の正常配列及び変異配列のそれぞれを含むプローブのプローブ スポットをそれぞれ有しており、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighbo r Method)による Tm力 0°C以上 80°C以下の範囲力も選択される、 (9)に記載のァレ ィ。
(17) (1)〜（16)のいずれかに記載のアレイを含む、遺伝子変異検出のためのキ ッ卜。
(18)慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するための プローブセットであって、
前記遺伝子変異は、 BCR— ABL遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異 T3151であって、前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である 1以上のプロ一 ブを含む第 1のプローブ群と、前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確 に相補的である 1以上のプローブを含む第 2のプローブ群とを含んでおり、 前記第 1のプローブ群は、以下の表 5から選択される 1種又は 2種以上のプローブ を含み、前記第 2のプローブ群は、以下の表 6から選択される 1種又は 2種以上のプ ローブを含んでいる、プローブセット。
[表 5]
[表 6]
Figure imgf000007_0001
Tmは、 最近接塩基対法 （Nearest Neighbor method) による。 (19)前記第 1のプローブ群及び前記第 2のプローブ群は、以下の表 7から選択さ れるプローブの 1〜225とおりの組見合わせ力も選択されるいずれかを備えている、 ( 18)に記載のプローブセット。
[表 7]
Figure imgf000008_0001
(20)前記第 1のプローブ群及び前記第 2のプローブ群は、それぞれ前記表 7中、 組み合わせ番号 33の組み合わせに相当するプローブを有している、 (19)に記載の プローブセット。
(21)前記第 1のプローブ群及び前記第 2のプローブ群は、それぞれ前記表 7中、 組み合わせ番号 225の組み合わせに相当するプローブのプローブを有している、 (1 9)に記載のプローブセット。
(22)慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するための プローブセットであって、
前記遺伝子変異は、 BCR— ABL遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を 示す前記表 1から選択される 1種又は 2種以上であり、これらの遺伝子変異の正常配 列に正確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブ群と、前記遺伝子 変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプローブを含む第 2のプローブ群とを含んでおり、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighb or Method)による Tm力 0°C以上 80°C以下の範囲力も選択される、プローブセット。
(23) (1)に記載のアレイ用である、 (18)〜（22)に記載のプローブセット。
(24)遺伝子変異を検出する方法であって、
ポリヌクレオチドにハイブリダィズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正 確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブスポット群と、前記配列部 分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプ ローブを含む第 2のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する 工程と、
被験遺伝子力 検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、 前記プローブとポリヌクレオチドとのノ、イブリダィズによる得られるシグナルを検出す る工程と、
を備える、検出方法。
(25)前記シグナル検出工程において得られた第 1のプローブスポット群の 1種又は 2種以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第 2のプローブスポット群の 1種又は 2種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有 無又は程度について解析する、 (24)に記載の検出方法。
(26)前記遺伝子変異は、以下の表 8から選択される 1種又は 2種以上である、 (24 )又は（25)に記載の検出方法。
[表 8]
Figure imgf000010_0001
(27)慢性骨髄性白血病の薬剤感受性又は薬剤耐性の検査方法であって、 BCR—ABL遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を示す以下の表 9から 選択される 1種又は 2種以上の遺伝子変異を対象として、
ポリヌクレオチドにハイブリダィズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正 確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブスポット群と、前記配列部 分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプ ローブを含む第 2のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する 工程と、
被験遺伝子力 検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、 前記プローブとポリヌクレオチドとのノ、イブリダィズによる得られるシグナルを検出す る工程と、
を備える、検査方法。
[表 9]
アミノ酸 base Wild sequence Mutant sequence
変異 exchange
M244V a-g accatgaag accfftgaag
L248V c-g aagctgggc
G250E g-a ggcgggggc ggcgagggc
G250A g-c ggcgggggc ggcgcgggc
Q252H g-c ggccagtac ggccactac
Q252H g-t ggccagtac ggccattac
Q252R a- ggccagtac ggccggtac
Y253F a-t cagtacggg cagttcggg
Y253H t一 c cagcacggg
E255K g-a ggggaggtg gggaagKtg
E255V a-t o ggggaggtg gggfftggtg
D276G a-g gaggacacc gagggcacc
F311 L t一 c ccgt (0tctat ccgctctat
F31 1I t-a ccgttcO Htat ccgatctat
T315I c-t atcactgagd bu atcattgag
T315N c-a atcactgag atcaatgag
F317L t-c Kagttcatg gagctcatE
F317L c-g gagttcatg gagttgatg
343T t-c tacatggcc tacacggcc 351T t-c gccatggag gccacggag
E355G a-g ctagagaag ctagggaa Og
E355D g-t ctagagaag ctagataag
F359V t-g aacttcatc aacgtcatc
V379I g-a aaggtagct aagatagct
F382L t-c gattttggc gatcttggc
L387M t-a agffttgatg aggatgatg
H396P a~c gcccatgct gcccctgct
H396R a-g gcccatgct gCCCfftECt
S417Y c-a ttctccatc ttctacatc
E459K g-a atgaagcgc atgaaacgc
F486S t-c tcctttgct tcctctgct
(28)前記シグナル検出工程において得られた第 1のプローブスポット群の 1種又は 2種以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第 2のプローブスポット群の 1種又は 2種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有 無又は程度について解析する、 (27)に記載の検査方法。
(29)前記薬剤は、ィマチ-ブ若しくはその塩、 AMN107若しくはその塩、 BMS— 35 4825若しくはその塩、 NS-187若しくはその塩、 ONO-12380若しくはその塩及び VX-6 80若しくはその塩力も選択される 、ずれかである、 (27)又は（28)に記載の検査方 法。
(30)慢性骨髄性白血病に対する薬剤投与方法又は治療方法であって、
(27)に記載の検査方法の検査結果から得られる前記遺伝子変異の有無又はその 程度に基づいて薬剤を選択する工程を備える、方法。
(31)前記薬剤は、ィマチ-ブ若しくはその塩、 AMN107若しくはその塩、 BMS— 35 4825若しくはその塩、 NS-187若しくはその塩、 ONO-12380若しくはその塩及び VX-6 80若しくはその塩力も選択されるいずれかである、 (30)に記載の方法。
(32)慢性骨髄性白血病に対する薬剤選択プログラムであって、
(27)に記載の検査方法の検査結果から前記遺伝子変異の有無又はその程度を 解析する解析するステップと、
該解析結果に基づいて有効な薬剤を抽出する薬剤抽出ステップと、
を 1又は 2以上のコンピュータに実行させるプログラム。
[0007] 本発明の遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法は、第 1のプローブスポット群と第
2のプローブスポット群とを組み合わせることにより、遺伝子変異、なかでも、慢性骨 髄性白血病に対する薬剤感受性又は薬剤耐性に関係する遺伝子を正確に検出す ることが可能であり、この遺伝子変異検出用アレイを用いることで、該遺伝子変異を 正確に検出することができることを要旨とする。
[0008] この遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法では、第 1のプローブスポット群と第 2 のプローブスポット群とを組み合わせることにより、遺伝子変異、なかでも、慢性骨髄 性白血病に対する薬剤感受性又は薬剤耐性に関係する遺伝子変異を正確に検出 することが可能であり、この遺伝子変異検出用アレイを用いることで、該遺伝子変異 を正確に検出することができる。 図面の簡単な説明
[図 1]コントロールサンプルと変異含有サンプルの蛍光画像の比較図。
[図 2]コントロールサンプルと変異含有サンプルのシグナルの比較図。
[図 3]42°C10nMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図 < [図 4]42°ClnMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
[図 5]42°C100pMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
[図 6]42°C10pMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
[図 7]55°C10nMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
[図 8]55°ClnMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
[図 9]55°C100pMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
[図 10]42°C各濃度における PCRサンプルの比較図。
[図 ll]42°C10nMにおける混合サンプルの比較図。
[図 12]42°ClnMにおける混合サンプルの比較図。
[図 13]42°C100pMにおける混合サンプルの比較図。
[図 14]ablキナーゼドメイン領域アミノ酸変異近傍配列を表す説明図。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明にお!/、てポリヌクレオチドとは、遺伝子変異のある遺伝子のゲノム DNA、 mR NA、 cDNA又はこれらの一部が挙げられる。ポリヌクレオチドの長さは特に限定しな いが、好ましくは 30以上、より好ましくは 50以上のヌクレオチド残基を有していること が好まし!/、。ポリヌクレオチドは好ましくは適宜標識されて 、る。
[0011] また、本発明においてプローブとは、ポリヌクレオチドとハイブリダィズ可能であれば よぐオリゴヌクレオチド、 RNA、 PNAのほか、塩基に公知に修飾を施した核酸誘導 体が挙げられる。
[0012] 本発明においてプローブスポットは、 1以上好ましくは 103〜1013個の同一プローブ の集団が他のプローブと分離されて存在する領域である。また、プローブスポット群と は、同一配列でかつ同じ長さのプローブからなるプローブスポットの集団を意味して いる。さらに、この集団は、 1以上、好ましくは 2以上のプローブスポットからなり、より 好ましくは 10以下のプローブスポットからなる。プローブスポットは、異なる長さのプロ ーブからなる 2以上のプローブスポットを備えていてもよいし、同一長さで異なる配列 のプローブからなる 2以上のプローブスポットを備えていてもよいし、同一長さで同一 配列のプローブからなる 2以上のプローブスポットを備えていてもよい。異なる長さの プローブからなる 2以上のプローブスポットを備えることで、より精度の高い検出が可 能となる。また、同一長さで同一配列のプローブスポットを備えることでも、同一プロ一 ブに対するシグナルの正確性を高めることができ、結果として精度の高い検出が可 能となる。
[0013] 第 1のプローブスポット群と第 2のプローブスポット群とは、互いに同じ長さのプロ一 ブからなるプローブスポットが対向して配列して 、てもよ 、。プローブスポット群に長さ の異なるプローブからなるプローブスポットを有する場合には、長さの順にプローブス ポットが配列されて 、てもよ 、。
[0014] プローブスポット群における長さの異なるプローブからなるプローブスポット及び Z 又は同一のプローブ力もなるプローブスポットの配列は必要に応じて設定できる。縦 列と横列とを組み合わせることでプローブスポット群をマトリックス状に配置できる。
[0015] なお、第 1のプローブスポット群と第 2のプローブスポット群とを一対として固相担体 上に保持していてもよいが、正常型に対応する一つの第 1のプローブスポット群に対 して複数の第 2のプローブスポット群を配置してもよい。
[0016] プローブを固相担体に固定ィヒする方法は特に限定されないで従来公知の方法を 採用できる。また、プローブは固相担体上で直接合成されていてもよいし、合成され たプローブを固相担体に固定されていてもよい。プローブは、一般的にはリンカ一や スぺーサーを介して固相担体に結合されて 、る。
[0017] 本発明のアレイは、インクジェット、バブルジェット（登録商標）、ピン方式などによつ て、固相担体上の所定位置にプローブを供給して固定ィ匕する方法によってプローブ が固定されて 、ることが好まし 、。
[0018] 本発明の検出方法において用いるポリヌクレオチドは、血液などの試料から単離し たゲノム DNA又は全 RNAから目的の遺伝子変異を含む部分を PCR法等によって調 製することができる。なお、 PCRによるポリヌクレオチドの調製に際して、 Cy5や Cy3 などが結合したプライマーを用いることで標識ポリヌクレオチドを得ることができる。ま た、塩基の修飾等を必要に応じて行っても良い。
[0019] ハイブリダィズ反応は、従来公知の方法で行うことができる。例えば、プローブスポ ット群に対してポリヌクレオチドを含有する液体を適宜供給する。ノヽイブリダィゼーショ ンは、室温から 80°Cの範囲の適当な温度で行うことが好ましぐまたノヽイブリダィゼー シヨン時間も 1〜30時間程度の範囲で行うことが好ましい。
[0020] ノ、イブリダィズ反応後は、適宜洗浄工程を実施し、その後、ハイブリダィズ反応産物 の標識シグナルなどを検出することによって遺伝子変異の有無又はその程度を検出 できる。
[0021] 例えば、本発明方法によれば、図 1及び図 2に示すように、
ポリヌクレオチドにお!/、て正常：変異 = 1： 0であるとき 20merの変異型プローブに 対する正常型プローブのシグナル比が 0. 2943、
ポリヌクレオチドが正常：変異 = 0 : 1であるとき 20merの変異型プローブに対する正 常型プローブのシグナル比が 13. 5403、
ポリヌクレオチドが正常：変異 = 1： 1であるとき 20merの変異型プローブに対する正 常型プローブのシグナル比が 1. 2849、
ポリヌクレオチドが正常：変異 = 10： 1であるとき 20merの変異型プローブに対する 正常型プローブのシグナル比が 0. 6451、
ポリヌクレオチドが正常：変異 = 100： 1であるとき 20merの変異型プローブに対す る正常型プローブのシグナル比が 0. 4537として検出することができる。
[0022] すなわち、予め求められたシグナル比あるいはアツセィ毎に所定の正常:変異の比 率のスタンダードを用いることにより、サンプルにおける変異の有無や変異の比率を 検出することができる。こうした検出方法によれば、薬剤耐性ィ匕ゃ感受性の低下を検 出することが可能であり、薬剤の変更や有効な薬剤の探索を効率的に行うことができ る。
[0023] 目的とする変異は特に限定しないが、好ましくは薬剤耐性や薬剤感受性に関する 遺伝子変異である。本発明方法によれば、高感度にこれらの変異を複数、あるいは 多数を一挙に検出することができ、薬剤耐性や感受性を総合的に判断して、有効な 薬剤選択が可能となる。
[0024] 遺伝子変異としては、先天的変異であってもよ!、し、後天的変異であってもよ!、。後 天的変異の場合には、変異数や変異レベルをモニターすることが重要である力 本 発明方法はこうしたモニターに好適である。
[0025] 薬剤感受性及び薬剤耐性に関しては、慢性骨髄性白血病の薬剤を対象薬剤とす ることが好ましぐなかでもィマチ-ブ若しくはその塩、 AMN107若しくはその塩、 BMS 354825若しくはその塩、 NS-187若しくはその塩、 ONO-12380若しくはその塩及び VX-680若しくはその塩力 選択される 、ずれかを対象薬剤とすることが好ま 、。 さらに、対象遺伝子変異としては、フィラデルフィア染色体上の BCR—ABL融合遺 伝子における変異であることが好ましぐより好ましくは、 BCR— ABL遺伝子のキナ ーゼドメインにおけるアミノ酸変異を列挙する図 14力も選択される 1種又は 2種以上 である。さらに、好ましくは、 T3151のアミノ酸変異である。このアミノ酸変異は、ィマチ ニブに対する耐性ィ匕に関し強い関連がある。
[0026] こうした検査結果に基づく変異の有無や変異の程度の解析ステップ、及び予め構 築された遺伝子変異と薬剤感受性や耐性のデータベースに基づいて好適な薬剤を 抽出するステップを備えるプログラムを 1又は 2以上のコンピュータに実行させることで 、薬剤選択を効率的に行うことができるようになる。
[0027] 本発明によれば、こうした薬剤選択に基づ!/ヽて薬剤を投与し、治療する方法も提供 される。
[0028] なお、本明細書には、国際出願番号 PCTZJP2005Z005612の全内容が引用 により組み込まれるものとする。 実施例
[0029] (a)サンプルの抽出
Amersham Bioscience社製 Codelink基板に 5，末端をァミノ基で修飾した合成オリゴ DNA (株式会社日本遺伝子研究所製)をスポットした。使用した遺伝子は T315I。各 遺伝子の Major Homoタイプに相補的な配列をもち長さの異なる 4種類のオリゴ D NAと Minor Homoタイプに相補的な配列をもち長さの異なる 4種類のオリゴ DNA を使用した。（表 10及び表 11参照）また、同一種類のオリゴ DNAを 3スポットずつス ポットした。スポット後、 20°C、相対湿度 75%の条件下でー晚インキュベートした。次 に、 0.1%SDSとなるように調製した Blocking Sol. (lM Tris pH8 20mlと 99%エタノールァ ミン 0.6mlと 10% SDS 2mlと滅菌水 177.4mlとを混合したもの）に 15分間浸漬した。次に 、滅菌水で 2回洗浄を行った。次に、 4 X SSC 0.1%SDS(50°C)で 30分洗浄を行った後 、滅菌水で 1回洗浄を行った。次に、沸騰水 (98°C)に 2分浸漬した後、滅菌水で 2回洗 浄を行った。その後、遠心器で 800rpmで 5分間遠心し、乾燥した。
[0030] ハイブリダィゼーシヨンサンプルは遺伝子の型が Wildまたは Mutantタイプの 150mer 合成 DNA、または Wild型の totalRNAを用いた。 totalRNAでは以下の RT-PCR条件で 増幅しサンプル調製した。
[0031] T315Iプローブ配列
下記表 10は Mutantプローブ、表 11は Wildプローブを示したものであり、表中の
Tmは、最近接塩基対法（Nearest Neighbor method)を用いて算出したものである。
[表 10]
[表 11]
Figure imgf000018_0001
[表 12]
Figure imgf000018_0002
[0032] (b) totalRNAから cDNAの作成手順
[表 13] 溶液し ii、 inの作成手 H
溶液 I
1) 5 xFirst strand buffer 4 a 1
(酵素付属の反応液）
2) dNT P mixture 2 1
(5mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 添加順序
lOOmM DTT (酵素付属） 2 L
40 u n i t ENase inhibitor 2. 5 II 溶液 11
1 ) UEPC処理水 1 1
添加順序
2) Oligo (dT) Primer 1 1
3) totalRN A 5 1 ( 5 g ) 溶液 Π
1) 滅菌水 20 I
2) 0.5M EDTA (pH8) 5111 添加順序
3) IN N a OH 1 0 w 1 溶液 I、 Π、を調製した。次に溶液 IIを 70°Cヒートブロックで 5分反応させた後、 42°Cヒ ートブロックに直接移して 3分反応させた。次に、溶液 I中に、溶液 IIを入れ混合した後
、し、 S¾il (Invitrogen社製 buper Script IIReverse Transcriptase)を 1 μ L添カロし、 混合、遠心し、 42°Cヒートブロックで 40分反応させた。さらに SSII (Invitrogen社製 Supe r Script IIReverse Transcriptase)を 0.5 μ L添加し、混合、遠心し、 42°Cヒートブロック で 40分反応させた。次に、溶液 III (滅菌水 20 μ 1、 0.5Μ EDTA, ρΗ8 5 1、 IN NaO H 10 /zl)をこの順番に添加、混合、遠心した後、 65°Cヒートブロックで 60分反応させ た。反応後、 Tris(lM、 pH7. 5)を 25 μ L入れ、混合、遠心し、キアゲン（QIAquickT M or MinEluteTM)カラム使用し、以下の手順でサンプルを精製した。
(c)サンプル精製手順
cDNA溶液に対し、 PB吸着液を、 5倍量入れて混合後、混合液を QIAquick™力 ラム内に入れて遠心（13000rpm、 1分）した。次に、 PE洗浄液 (キット内添付:あらかじ めエタノール入れておく）を 750 1入れて、遠心（13000rpm、 1分）した。再度 PE洗浄 液を 750 1入れて、遠心（13000rpm、 1分）した。完全に PE液を除去するために、何 も入れないでさらに遠心（13000rpm、 1分）した後、滅菌水を 44 1入れて回収した。 次に cDNAの PCR増幅を行った。 (d) cDNAの PCR増幅手順
cDNAの PCR増幅手順は以下の通りである。
RT- PCR条件
[表 14]
Figure imgf000020_0001
プライマー 1 50pmol (5，末端 Cy3標識）
プライマー 2 50pmol (5 '末端 Biotin標識）
X I。緩衝液 10 ^ 1
2. 5mM dNTP 8 μ 1
Taq DN Aポリメラーゼ 2. 5U
cDNAサンプル lOOng
増幅条件
94°C ' 30秒
94°C · 30秒、 64°C · 30秒、 68°C · 40秒（35サイクル）
72°C 5分、 4。C
増幅後は上記 QIAquick™カラムを用いて精製した。
(e) BSAブロッキング手順
(試薬調製）
1 %BS Aブロッキング溶液
1)滅菌水 137. 5 mL
2) 20 X SSC 50 mL
3) 5%BSA(50 mg/ml) 50mL
4) 10%SDS 12. 5mL
スライドガラスを上記試料で調製された 1 %BSAブロッキング溶液中に浸漬し、 42 °C恒温槽内で 45分間インキュベートした後、滅菌水を入れた染色バット内に入れた スライドラックにスライドガラスをセットし、滅菌水で 5回上下振とう洗浄（1回目）した。 再度滅菌水で 5回上下振とう洗浄 (2回目）した後、 900rpmで 1分間遠心乾燥した。 [0036] (f)ハイプリ操作手順
ハイブリダィゼーシヨンは上記サンプル（PCR増幅サンプルのみ、合成 DNAサンプ ルは一本鎖への変性不要）を Streptavidinセファロース中 NaOH存在下で一本鎖に変 性した後、サンプルに 20 X SSC 25 μ L、 10%SDS 5 μ Lを添カ卩（合計 100 μ L)し、 95°C ヒートブロックに 2分かけた後、室温に 3〜5分放置した。次に、サンプル液をチャンバ 一内に注入し、注入口をシールで閉じ、オーブン中で 16時間ハイブリダィズした。
[0037] (g)ハイプリ洗浄手順
チャンバ一をはがし、 2 X SSC— 0.1%SDS溶液に 5分浸漬した。次に 1 X SSC溶液に 5分浸漬した。最後に、 0. 1 X SSC溶液に 5分浸漬した後に、 lOOOrpmで 10分間遠心 乾燥した。
Agilent社製 MicroArrayScannerにて適宜、レーザーパワーを調節し、蛍光画像を測 定し、 GenePix Proにて得られた画像のシグナルを数値ィ匕した。（図参照）
[0038] (h)サンプルおよびハイブリ条件と結果
本発明により得られた結果を以下の図に示す。
•図 1、図 2
図 3、図 4、図 5 (コントロールサンプル）と図 11、図 12、図 13(変異含有サンプル)の 蛍光画像及びシグナルを比較したもの。
•図 3、図 4、図 5、図 6
サンプル種： 5， Cy3標識合成 DNA (150mer)、 Wild, Mutantそれぞれ単独 サンプル濃度： 10ηΜ、 1ηΜ、 100pM、 10pM
ノヽイブリ条件： 42。C、 16hr
•図 7、図 8、図 9
サンプル種： 5， Cy3標識合成 DNA (150mer)、 Wild, Mutantそれぞれ単独 サンプル濃度： 10ηΜ、 1ηΜ、 100pM
ノヽイブリ条件： 55。C、 16hr '図 10
サンプル種： 5， Cy3標識 PCRサンプル（ 1462mer)、 Wild単独
サンプル濃度： 10ηΜ、 1ηΜ、 ΙΟΟρΜ
ノヽイブリ条件： 42。C、 16hr
•図 11、図 12、図 13
サンプル種： 5， Cy3標識合成 DNA (150mer)、 Wildと Mutantを混合
サンプル濃度： 10nM (l : l、 10 : 1、 100 : 1)、 1ηΜ (1 : 1、 10 : 1)、 100pM (l : l)
(Wild: Mutant)
ノヽイブリ条件： 42。C、 16hr
[0039] これらの結果によれば、変異遺伝子における変異型の存在を容易に検出すること ができ、低い変異率であっても容易に検出することができることがわかる。また、正常 型:変異型の比率も容易に検出できることがわかる。したがって、本発明のプローブ や検出方法は、薬剤の耐性化や感受性の低下などに対応した遺伝子の変異の検出 やモニターに有効であるとともに、薬剤選択や治療のための有用な指標を提供する ことができる。
[0040] 本出願は、 2005年 11月 8日に出願された米国仮出願番号 60/734, 278を優先 権主張の基礎としており、引用によりその内容の全てが本明細書に含まれる。
産業上の利用可能性
[0041] 本発明は、より正確な遺伝子変異の検出を可能とするアレイと、このアレイを用いて 正確な遺伝子変異の検出を行う方法に関するものである。この発明によって、変異遺 伝子における変異型の存在を容易に検出することができ、低い変異率であっても容 易に検出することができる。また、正常型:変異型の比率も容易に検出できる。したが つて、本発明のプローブや検出方法は、薬剤の耐性ィ匕ゃ感受性の低下などに対応 した遺伝子の変異の検出やモニターに有効であるとともに、薬剤選択や治療のため の有用な指標の提供に利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] 遺伝子変異を検出するためのアレイであって、
ポリヌクレオチドにハイブリダィズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正 確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブスポット群と、前記配列部 分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプ ローブを含む第 2のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイ。
[2] 前記第 1のプローブスポット群及び Z又は前記第 2のプローブスポット群は、 2以上 のプローブスポットを含む、請求項 1に記載のアレイ。
[3] 前記第 1のプローブスポット群及び Z又は前記第 2のプローブスポット群は、異なる 長さのプローブからなるプローブスポットを含んでいる、請求項 1又は 2に記載のァレ ィ。
[4] 前記第 1のプローブスポット群及び Z又は前記第 2のプローブスポット群にぉ 、て、 プローブの長さの順に 2以上のプローブスポットが配列されている、請求項 3に記載 のアレイ。
[5] 前記遺伝子変異は、薬剤感受性又は薬剤耐性に関する遺伝子変異である、請求 項 1〜4のいずれかに記載のアレイ
[6] 前記遺伝子変異は、後天的変異である、請求項 1〜5のいずれかに記載のアレイ。
[7] 前記遺伝子変異は、慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う変異である、請 求項 1〜6のいずれかに記載のアレイ。
[8] 前記遺伝子変異は、フィラデルフィア染色体上の BCR—ABL融合遺伝子における 変異である、請求項 7に記載のアレイ。
[9] 前記遺伝子変異は、 BCR—ABL遺伝子のキナーゼドメインにおける以下のァミノ 酸変異を示す以下の表 1から選択される 1種又は 2種以上である、請求項 8に記載の アレイ。
[表 1]
Figure imgf000024_0001
前記遺伝子変異は、 T3151である、請求項 9に記載のアレイ。
前記第 1のプローブスポット群は、以下の表 2から選択される 1種又は 2種以上のプ ローブのプローブスポットを含んでいる、請求項 10に記載のアレイ。
[表 2] 才リコ'鎖長 塩基配列 (5 '— 3') Tm
(ホ'リ T除く) (
18mer atatcatcattgagttca (配列番号： 1 ) 47
1 mer atatcatcattgagttcat (配歹J番号： 2 ) 48
20mer tatatcatcattgagttcat (配歹番号： 3 ) 49
21mer tatatcatcattgagttcatg (酉己列番号： 4 ) 52
Tmは、 最近接塩基対法 （Nearest Neighbor method) による。 前記第 2のプローブスポット群は、以下の表 3から選択される 1種又は 2種以上のプ ローブのプローブスポットを含んで!/、る、請求項 11に記載のアレイ。
[表 3]
Figure imgf000025_0001
Tmは、 最近接塩基対法 （Nearest Neighbor method) による。
前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、以下の表 4か ら選択されるプローブの 1〜225とおりの組見合わせ力 選択されるいずれかを備え ている、請求項 12に記載のアレイ。
[表 4]
Figure imgf000026_0001
[14] 前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、それぞれ前記 表 4中、組み合わせ番号 33の組み合わせに相当するプローブのプローブスポットを 有している、請求項 13に記載のアレイ。 [15] 前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、それぞれ前記 表 4中、組み合わせ番号 225の組み合わせに相当するプローブのプローブスポット を有している、請求項 13に記載のアレイ。
[16] 前記第 1のプローブスポット群及び前記第 2のプローブスポット群は、前記表 1に示 す遺伝子変異の正常配列及び変異配列のそれぞれを含むプローブのプローブスポ ットをそれぞれ有しており、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighbor M ethod)による Tm力 0°C以上 80°C以下の範囲力 選択される、請求項 9に記載のァ レイ。
[17] 請求項 1〜16のいずれかに記載のアレイを含む、遺伝子変異検出のためのキット。
[18] 慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するためのプロ ーブセットであって、
前記遺伝子変異は、 BCR— ABL遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異 T3151であって、前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である 1以上のプロ一 ブを含む第 1のプローブ群と、前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確 に相補的である 1以上のプローブを含む第 2のプローブ群とを含んでおり、 前記第 1のプローブ群は、以下の表 5から選択される 1種又は 2種以上のプローブ を含み、前記第 2のプローブ群は、以下の表 6から選択される 1種又は 2種以上のプ ローブを含んでいる、プローブセット。
[表 5]
[表 6]
Figure imgf000027_0001
Tmは、 最近接塩基対法 （Nearest Neighbor method) による。 [19] 前記第 1のプローブ群及び前記第 2のプローブ群は、以下の表 7から選択されるプ ローブの 1〜225とおりの組見合わせ力 選択されるいずれかを備えている、請求項 18に記載のプローブセット。
[表 7]
Figure imgf000028_0001
[20] 前記第 1のプローブ群及び前記第 2のプローブ群は、それぞれ前記表 7中、組み合 わせ番号 33の組み合わせに相当するプローブを有している、請求項 19に記載のプ ローブセット。
[21] 前記第 1のプローブ群及び前記第 2のプローブ群は、それぞれ前記表 7中、組み合 わせ番号 225の組み合わせに相当するプローブのプローブを有している、請求項 19 に記載のプローブセット。
[22] 慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するためのプロ ーブセットであって、
前記遺伝子変異は、 BCR— ABL遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を 示す前記表 1から選択される 1種又は 2種以上であり、これらの遺伝子変異の正常配 列に正確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブ群と、前記遺伝子 変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプローブを含む第 2のプローブ群とを含んでおり、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighb or Method)による Tm力 0°C以上 80°C以下の範囲力も選択される、プローブセット。
[23] 請求項 1に記載のアレイ用である、請求項 18〜22のいずれかに記載のプローブセ ッ卜。
[24] 遺伝子変異を検出する方法であって、
ポリヌクレオチドにハイブリダィズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正 確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブスポット群と、前記配列部 分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプ ローブを含む第 2のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する 工程と、
被験遺伝子力 検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、 前記プローブとポリヌクレオチドとのノ、イブリダィズによる得られるシグナルを検出す る工程と、
を備える、検出方法。
[25] 前記シグナル検出工程において得られた第 1のプローブスポット群の 1種又は 2種 以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第 2のプローブスポット群の 1種 又は 2種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有無又 は程度につ 、て解析する、請求項 24に記載の検出方法。
前記遺伝子変異は、以下の表 8から選択される 1種又は 2種以上である、請求項 24 又は 25に記載の検出方法。
[表 8] アミノ酸 base Wild sequence Mutant sequence 変異 exchange
M244V a-g accatgaag accgtgaag
L248V c-g aagctgggc aaggtgggc
G250E g - a ggcgggggc ggcgagggc
G250A g—c ggcgggggc ggcgcgggc
Q252H g-c ggccagtac ggccactac
Q252H g-t ggccagtac ggccattac
Q252R a-g ggccagtac ggccggtac
Y253F a-t cagtacggg cagttcggg
Y253H t-c cafitacggg cagcacggg
E255K g-a ggggaggtg gggaaggtff
E255V a-t ggggaggtg ggggtggtg
D276G a-g gaggacacc gagggcacc
F311 L t-c ccgttctat ccgctctat
F311I t一 a ccgttctat ccgatctat
T315I c-t atcactgag atcattgag
T315N c~a atcactgag atcaatgag
F317L t-c gagttcatg gagctcatg
F317L c-g gagttcatg gagttgatg
343T t-c tacatggcc tacacggcc
M351T t-c gccatggag gccacggag
E355G a-g ctagagaag ctagggaag
E355D g-t ctagagaag ctagataag
F359V t-g aacttcatc aacgtcatc
V379I g-a aaggtagct aagatagct
F382L t-c gattttggc gatcttggc
L387M t-a aggttgatg aggatgatg
H396P a-c gcccatgct gcccctgct
H396R a-g gcccatgct gcccgtgct
S417Y c~a ttctccatc ttctacatc
E459K g-a atgaagcgc atgaaacgc
F486S t-c tcctttgct tcctctgct 慢性骨髄性白血病の薬剤感受性又は薬剤耐性の検査方法であって、
BCR— ABL遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を示す から 選択される 1種又は 2種以上の遺伝子変異を対象として、
ポリヌクレオチドにハイブリダィズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正 確に相補的である 1以上のプローブを含む第 1のプローブスポット群と、前記配列部 分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である 1以上のプ ローブを含む第 2のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する 工程と、
被験遺伝子力 検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、 前記プローブとポリヌクレオチドとのノ、イブリダィズによる得られるシグナルを検出す る工程と、
を備える、検査方法。
[表 9]
Figure imgf000032_0001
[28] 前記シグナル検出工程において得られた第 1のプローブスポット群の 1種又は 2種 以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第 2のプローブスポット群の 1種 又は 2種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有無又 は程度につ 、て解析する、請求項 27に記載の検査方法。
[29] 前記薬剤は、ィマチ-ブ若しくはその塩、 AMN107若しくはその塩、 BMS— 354825 若しくはその塩、 NS-187若しくはその塩、 ONO-12380若しくはその塩及び VX-680若 しくはその塩力も選択されるいずれかである、請求項 27又は 28に記載の検査方法。
[30] 慢性骨髄性白血病に対する薬剤投与方法又は治療方法であって、
請求項 27に記載の検査方法の検査結果から得られる前記遺伝子変異の有無又は その程度に基づいて薬剤を選択する工程を備える、方法。
[31] 前記薬剤は、ィマチ-ブ若しくはその塩、 AMN107若しくはその塩、 BMS— 354825 若しくはその塩、 NS-187若しくはその塩、 ONO-12380若しくはその塩及び VX-680若 しくはその塩力も選択されるいずれかである、請求項 30に記載の方法。
[32] 慢性骨髄性白血病に対する薬剤選択プログラムであって、
請求項 27に記載の検査方法の検査結果から前記遺伝子変異の有無又はその程 度を解析する解析するステップと、
該解析結果に基づいて有効な薬剤を抽出する薬剤抽出ステップと、
を 1又は 2以上のコンピュータに実行させるプログラム。
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