KR101076612B1 - 윌슨병 진단용 조성물 - Google Patents

윌슨병 진단용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101076612B1
KR101076612B1 KR1020090002887A KR20090002887A KR101076612B1 KR 101076612 B1 KR101076612 B1 KR 101076612B1 KR 1020090002887 A KR1020090002887 A KR 1020090002887A KR 20090002887 A KR20090002887 A KR 20090002887A KR 101076612 B1 KR101076612 B1 KR 101076612B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
sequence shown
oligonucleotide consisting
atp7b
Prior art date
Application number
KR1020090002887A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100083487A (ko
Inventor
유한욱
김구환
박중영
Original Assignee
재단법인 아산사회복지재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 아산사회복지재단 filed Critical 재단법인 아산사회복지재단
Priority to KR1020090002887A priority Critical patent/KR101076612B1/ko
Publication of KR20100083487A publication Critical patent/KR20100083487A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101076612B1 publication Critical patent/KR101076612B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

본 발명은 ATP7B(copper-transporting P-type adenosine triphosphatase)의 주요 돌연변이인 Arg778Leu, Asn1270Ser, Ala874Val 또는 Leu1083Phe를 진단할 수 프라이머, 상기 프라이머 중 적어도 하나를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물 및 상기 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행한 후 실시간 PCR 산물의 용융 곡선을 분석함으로써 윌슨병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
ATP7B, 윌슨병, 실시간 PCR, 용융 곡선 분석

Description

윌슨병 진단용 조성물{Composition for Diagnosis of Wilson's Disease}
본 발명은 윌슨병 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 ATP7B(copper transporting P-type adenosine triphosphatase)의 주요 돌연변이인 Arg778Leu, Asn1270Ser, Ala874Val 또는 Leu1083Phe를 진단할 수 프라이머, 상기 프라이머 중 적어도 하나를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물 및 상기 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행한 후 실시간 PCR 산물의 용융 곡선을 분석함으로써 윌슨병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
윌슨병(Wilson's Disease, WD)은 구리의 손상된 간내 트래피킹 및 담즙 배설로 이어져, 간, 각막 및 뇌를 포함한 다양한 기관에서 구리의 축적을 유발하는 상염색체상 열성 유전 질환이다(Scheinberg IH and Sternlieb I, (1984) Wilson's Disease. In:Smith LH, Jr (ed) Major Problems in Internal Medicine. Philadephia, Sounders, vol.23, pp12-13). WD 유전자인 ATP7B는 염색체 13q14.1에서 맵핑되었고, 구리를 운반하는 P-형 아데노신 트리포스파타제(ATPase)를 코딩하는 것으로 확인되었다(Bull PC et al. (1993) Nat Genet 5:327-337; Yamaguchi Y et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 197:271-277). WD는 전세계적으로 발생하고, 유병율은 35,000 분의 1 내지 100,000 분의 1로 추정되었다(Danks DM (1995) Disorders of copper transport. In:Scriver C, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. McGraw-Hill, New York, p 2222).
유럽과 북 아메리카에서 가장 보편적인 ATP7B 돌연변이는 p.His1069Gln으로, WD 환자의 30%에서 나타났다(Tanzi RE et al. (1993) Nat Genet 5:344-350; Thomas GR et al. (1995) Nat Genet 9:210-217). 그러나, 아시아 환자에서 가장 보편적인 ATP7B 돌연변이는 p.Arg778Leu으로, 환자의 30%에서 나타났다(Chuang LM et al. (1996) J Med Genet 33:521-523; Kim EK et al. (1998) Hum Mutat 11:275-278). 한국인 WD 환자에서 보편적인 미스센스 돌연변이는 p.Arg778Leu, c.p.Ala874Val, p.Leu1083Phe 및 p.Asn1270Ser인 것으로 확인되었고, 모두 합쳐 WD 환자의 55.4%에서 나타났다(Park S et al. (2007) Hum Mutat 28:1108-1113).
WD는 충분히 일찍 진단된다면 비가역적인 기관의 손상 없이 치료할 수 있는 유전 질환이다. WD는 한국인에서 상대적으로 빈번함에도 불구하고, 신생아를 대상으로 WD를 진단하는 방법에 대한 연구는 거의 이루어지지 못하고 있다.
본 발명자는 한국인에서 빈번한 윌슨병을 진단하기 위해 예의 노력하던 중 본 발명에 따라 특정된 프라이머가 한국인에서 윌슨병을 유발하는 주요 돌연변이를 정확하고 간편하게 검출함으로써 윌슨병을 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 ATP7B(copper-transporting P-type adenosine triphosphatase)의 주요 돌연변이인 Arg778Leu, Asn1270Ser, Ala874Val 또는 Leu1083Phe를 검출할 수 프라이머를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 중 적어도 하나를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 (1) 검체로부터 분리된 지노믹 DNA 또는 이의 일부를 주형으로 하여 상기 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 (2) 실시간 PCR 산물의 용융 곡선을 분석하는 단계를 포함하는 윌슨병의 진단방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 ATP7B(copper transporting P-type adenosine triphosphatase)의 주요 돌연변이인 Arg778Leu, Asn1270Ser, Ala874Val 또는 Leu1083Phe를 진단할 수 프라이머에 관한 것이다(표 1).
Figure 112009002314654-pat00001
본 발명의 프라이머는 짧은 길이의 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 돌연변이 염기와 정상 염기를 각각 만들어 주어 돌연변이와 정상 염기에 대한 민감성의 차이를 가지도록 작제된 것이다. 또한, 3' 말단에 하나의 틀린 염기서열만 가질 경우, 위 음성의 PCR 산물이 생성될 수 있어, 3' 말단으로부터 2-3개의 염기 위쪽으로 퓨린-피리미딘 계열의 염기를 추가로 교차 변화시켜줌으로써 PCR 반응에 대한 민감도를 증가시킨 것이다.
본 발명에서 'Arg778Leu(R778L)'은 ATP7B의 778번째 아미노산인 아르기닌이 루신으로 돌연변이된 것을 의미한다. 778번째 아미노산이 아르기닌인 경우가 정상이고, 루신이면 돌연변이에 해당한다. Arg778Leu 검출을 위하여, 정상 염기에 특이적인, 서열번호: 1에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 2에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 그리고 돌연변이 염기에 특이적인, 서열번호: 3에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 4에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
본 발명에서 'Asn1270Ser(N1270S)'은 ATP7B의 1270번째 아미노산인 아스파라긴이 세린으로 돌연변이된 것을 의미한다. 1270번째 아미노산이 아스파라긴인 경우가 정상이고, 세린이면 돌연변이에 해당한다. Asn1270Ser 검출을 위하여, 정상 염기에 특이적인, 서열번호: 5에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 6에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 그리고 돌연변이 염기에 특이적인, 서열번호: 7에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 8에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
본 발명에서 'Ala874Val(A874V)'은 ATP7B의 874번째 아미노산인 알라닌이 발린으로 돌연변이된 것을 의미한다. 874번째 아미노산이 알라닌이면 정상이고, 발린이면 돌연변이에 해당한다. Ala874Val 검출을 위하여, 정상 염기에 특이적인, 서열번호: 9에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 10에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 그리고 돌연변이 염기에 특이적인 서열번호: 11에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 12에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
본 발명에서 'Leu1083Phe(L1083F)'은 ATP7B의 1083번째 아미노산인 루신이 페닐알라닌으로 돌연변이된 것을 의미한다. 1083번째 아미노산이 루신이면 정상이고, 페닐알라닌이면 돌연변이에 해당한다. Leu1083Phe 검출을 위하여, 정상 염기에 특이적인, 서열번호: 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 그리고 돌연변이 염기에 특이적인, 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
전술된 ATP7B의 돌연변이 Arg778Leu, Asn1270Ser, Ala874Val 또는 Leu1083Phe는 윌슨병(Wilson's Disease)을 유발할 수 있는 돌연변이이므로 상기된 프라이머 세트는 윌슨병을 진단하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 전술된 프라이머 세트 중 적어도 하나를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 (1) 검체로부터 분리된 지노믹 DNA 또는 이의 일부를 주형으로 하고 전술된 프라이머 세트 중 적어도 하나를 이용하여 실시간 PCR(Real Time PCR)을 수행하는 단계; 및 (2) 실시간 PCR 산물에 대한 용융 곡선 분석을 수행하는 단계를 포함하는 윌슨병 진단방법에 관한 것이다.
상기 '검체'는 한국인이 바람직하다. ATP7B 유전자의 돌연변이 Arg778Leu, Asn1270Ser, Ala874Val, Leu1083Phe이 한국인 윌슨병 환자에서 높은 비율로 나타나기 때문이다. 또한, 상기 검체는 신생아를 대상으로 하는 것이 바람직하다. 윌슨병은 초기에 진단한다면, 비가역적인 기관(organ)의 손상 없이 치료할 수 있는 질병이므로 가능한 생후 초기에 진단하는 것이 바람직하기 때문이다.
상기 '지노믹 DNA의 일부'는 ATP7B 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 Arg778Leu, Asn1270Ser, Ala874Val 또는 Leu1083Phe 돌연변이가 위치하는 엑손을 포함하는 것이다. 즉, ATP7B 유전자의 8, 11, 15 또는 18 엑손을 포함할 수 있다.
검체로부터 분리된 지노믹 DNA 또는 이의 일부의 양이 적은 경우에는 먼저, 지노믹 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 세트 중 적어도 하나를 이용하여 PCR을 수행한 후 이 PCR 산물을 실시간 PCR의 주형으로 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 실시간 PCR 방법은 인터킬레이팅(interchelating) 방법에 기초한 것으로, 인터킬레이터로서 SYBR Green I을 이용하는 것이 바람직하다. SYBR Green I은 이중 가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약이다. 이 시약은 PCR 반응으로 합성된 이중 가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
상기 실시간 PCR 반응은 다중 PCR 반응을 도입하여 하나의 PCR 반응을 위한 시험관에서 두 개의 돌연변이를 동시에 검출하도록 설정할 수 있다. 한 양태로서, 돌연변이 Arg778Leu와 Asn1270Ser를 한 시험관에서, 돌연변이 Ala874Val와 Leu1083Phe를 한 시험관에서 검출하도록 다중 PCR 반응을 설정할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 3' 말단의 변화된 염기 뿐 아니라 2-3 염기 위쪽의 변화를 이중으로 주어 PCR 반응에 대한 온도 조건이 민감하다. 상기 프라이머에 대한 온도조건을 설정하기 위하여 50-70℃ 사이에서 1℃ 간격으로 PCR 반응 산물을 얻어 적절한 온도 조건을 선별하였고, 그 온도 조건은 아래와 같다.
돌연변이 Arg778Leu와 Asn1270Ser를 검출하기 위한 실시간 PCR은 1-9분간 94-96℃에서 초기화(initialization) 후 94-98℃에서 20-30초간 변성(denaturation), 50-55℃, 바람직하게는 53℃에서 20-40초간 어닐링(annealing), 70-80℃에서 20-40초간 연장(elongation)하는 반응을 20-40회 반복하는 것이 바람직하다.
돌연변이 Ala874Val와 Leu1083Phe를 검출하기 위한 실시간 PCR에서는 1-9분간 94-96℃에서 초기화(initialization) 후 94-98℃에서 20-30초간 변성(denaturation), 56-60℃, 바람직하게는 59℃에서 20-40초간 어닐링(annealing), 70-80℃에서 20-40초간 연장(elongation)하는 반응을 20-40회 반복하는 것이 바람직하다.
단계 (1)을 통하여 실시간 PCR 산물을 수득한 후에는 상기 산물에 대한 용융 곡선(melting curve) 분석을 수행한다. 본 발명에서 용융 곡선 분석은 65℃ - 95℃ 범위에서 0.2℃씩 온도를 높여가면서 1초 간격으로 형광도를 측정하는 것이 바람직하다.
용융 곡선이 온도 상승 추이에 따라 처음부터 끝까지 완만한 경사를 가지면 돌연변이가 없다는 의미이며, 한 개의 꺽어진 곡선은 하나의 돌연변이, 두 개의 꺽어진 곡선은 두 개의 돌연변이(compound heterozygote)를 의미하므로 용융 곡선의 패턴을 관찰함으로써 돌연변이 유무를 검출하여 윌슨병을 진단할 수 있다. 돌연변이 검출의 정확도를 높이기 위하여, 정상인의 용융 곡선 패턴과 비교하는 단계를 추가할 수도 있다.
윌슨병 환자들에 대한 유전자 돌연변이의 검색과정을 줄이고, 대중 집단에서의 보인자 검색을 통한 민족, 또는 지역 간의 유병률 확인에 응용 가능하다. 그리고, 대용량의 검체처리방법으로 적합하여 신생아 혈흔을 이용한 신생아 선별검사에 적용할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
아산 메디컬 센터로부터 476개의 신생아 혈흔과 p.Arg778Leu 및/또는 p.Asn1270Ser 돌연변이를 보유한 74명 WD 환자 및 p.Ala874Val 및/또는 p.Leu1083Phe 돌연변이를 보유한 27명 WD 환자의 혈액 시료를 입수하였다. PUREGENE DNA 분리 키트(Gentra, Minneapolis, MN)를 이용하여 혈흔으로부터 지노믹 DNA를 분리하였다. ARMS(amplification refractory mutation system)를 위한 PCR 프라이머는 표 1에 나열되었다. 각 20㎕ PCR 반응물은 신생아 혈흔의 지노믹 DNA 주형 2㎕, 각 프라이머 10pmol, 200μM dNTPs, 2㎕ 10 x 완충용액 및 0.5 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(SolGent, Daejeon, Korea)를 포함한다. 증폭은 GeneAMP PCR 시스템 9700(ABI Systems, Foster City, CA)을 이용하여 수행되었다. 용융 곡선 분석 전, SYBR Green I를 이용하는 실시간 PCR은 Chromo 4TM Four-Color real time System (MJ Research, Watertown, MA)을 사용하여 수행하였다. 증폭은 이중 시스템으로, p.Arg778Leu/Asn1270Ser 및 p.Ala874Val/p.Leu1083Phe를 이용하여 진행하였고, 각 10㎕의 반응물은 다중 PCR 산물로부터 얻은 주형 0.5㎕, 2 x DyNAmoTM HSSYBR® Green qPCR Kit(Finnzymes, Espoo, Filand) 및 각 프라이머 10pmol을 포함한다. 용융 곡선 분석은 65℃ 내지 95℃까지 진행되었고, 매0.2℃마다 리딩하고 1초 동안 중지하였다. 용융 곡선 프로필은 앰플리콘의 길이에 의해 영향을 받으므로 모든 데이터는 MJ Opticon MonitorTM Analysis software version 3.1(MJ Research)을 이용하여 분석되었다. 서열분석은 BigDye terminator kit version 3.0(ABI Systems)과의 반응 후 ABI3100 Genetic analyzer를 이용하여 수행되었다.
실시예 2: 환자 대조군과 용융 곡선 분석
돌연변이 검출을 위한 용융 곡선 분석의 정확성을 확인하기 위하여 101명의 WD 환자, 즉 p.Arg778Leu 및/또는 p.Asn1270Ser 돌연변이를 보유한 74명 WD 환자 및 p.Ala874Val 및/또는 p.Leu1083Phe 돌연변이를 보유한 27명 WD 환자의 DNA를 분석하였다. p.Arg778Leu 및/또는 p.Asn1270Ser 돌연변이를 보유한 74명 WD 환자에 대한 용융 곡선은 20개의 p.Arg778Leu 동형접합체, 33개의 p.Arg778Leu 이형접합체, 1개의 p.Asn1270Ser 동형접합체, 17개의 p.Asn1270Ser 이형접합체, 3개의 p.Arg778Leu 및/또는 p.Asn1270Ser 복합이형접합체(compound heterozygote)에 일치하는 결과를 나타내었다(도 1). p.Ala874Val 및/또는 p.Leu1083Phe 돌연변이를 보유한 27명 WD 환자에 대한 용융 곡선은 1개의 p.Ala874Val 동형접합체, 16개의 p.Ala874Val 이형접합체, 2개의 p.Ala874Val/p.Leu1083Phe 복합이형접합체, 7개의 p.Leu1083Phe 이형접합체 및 1개의 p.Leu1083Phe 동형접합체에 일치하는 결과를 나타내었다. p.Arg778Leu, p.Asn1270Ser, p.Ala874Val 및 p.Leu1083Phe에 대한 앰플리콘 크기는 95, 178, 126 및 208bp이었고(표 1), 용융 온도는 각각 83℃, 87.5℃, 80.6℃ 및 86℃이었다(도 2). 이중 조건 하에서 두 개의 앰플리콘은 이중 기울기의 용융 곡선을 보이는 반면, 어떠한 앰플리콘도 기울기를 보이지 않았다. 용융 곡선 분석에 의해 검출된 돌연변이 각각은 101 WD 환자로부터 동정된 돌연변이와 일치하였다.
실시예 3: 신생아 혈흔을 이용한 용융 곡선 분석
476명의 한국인 신생아의 혈흔의 혈액 스폿을 검사하기 위해 이중 실시간 PCR 및 용융 곡선 분석이 이용되었다. 476개의 혈흔에 대해 검사된 952개의 대립인자 중에서 1개의 p.Arg778Leu 대립인자 및 2개의 p.Ala874Val 대립인자가 있었고 그 외 대립인자는 정상이었다(도 3). 이 3개의 돌연변이 대립인자에 대한 서열분석 결과, 하나는 p.Arg778Leu와 관련된 c.2333G > T 이형접합체이었고, 둘은 p.Ala874Val과 관련된 c.2621C > T 이형접합체임을 보여주었다.
실시예 4: 한국인에서 WD의 보유자 빈도 및 유병율의 분석
3개의 돌연변이 대립인자는 p.Arg778Leu, p.Asn1270Ser, p.Ala874Val 및 p.Leu1083Phe 돌연변이의 존재에 대하여 952개 대립인자를 스크리닝함으로써 동정되었다. 상기 돌연변이가 WD 한국인 환자의 돌연변이 대립인자의 55.4%를 나타낸다는 종래의 연구를 기초로 하여 한국인에서 WD 보유자 빈도 및 유병율을 Hardy-Weinberg law에 따라 역으로 계산하였다. 유전자 빈도(q)는 0.0057로서 계산되었다(3/952는 0.554로 나눔). 유병율(q2)은 0.00003249이다. 따라서, 한국인에서 유병율(q2)은 30,778분의 1로 계산되었고, 보유자 빈도(2pq)는 88.2분의 1이었다.
도 1은 윌슨병 환자에 대한 용융 곡선 분석 결과를 나타낸 것으로, (A)는 돌연변이 Arg778Leu와 Asn1270Ser에 관한 것이고, (B)는 돌연변이 Ala874Val와 Leu1083Phe에 관한 것이며, 상단 패널은 정상 대립인자의 증폭을, 하단 패널은 돌연변이 대립인자의 증폭을 나타낸다. 화살표는 용융점을 나타내는 것으로서, Arg778Leu와 Asn1270Ser에서는 각각 83℃, 87.5℃이고, Ala874Val와 Leu1083Phe에서는 각각 80.6℃, 86℃이다.
도 2는 신생아에 대한 용융 곡선 분석 결과를 나타낸 것으로, (A)는 돌연변이 Arg778Leu와 Asn1270Ser에 관한 것이고, (B)는 돌연변이 Ala874Val와 Leu1083Phe에 관한 것이며, 상단 패널은 정상 대립인자의 증폭을, 하단 패널은 돌연변이 대립인자의 증폭을 나타낸다(Rhet: Arg778Leu 이형접합체, Nhet: Asn1270Ser 이형접합체, RN: Arg778Leu와 Asn1270Ser 복합 이형접합체, Lhom: Leu1083Phe 동형접합체, Ahom: Ala874Val 동형접합체).
<110> The ASAN Foundation <120> Composition for Diagnosis of Wilson's Disease <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgtggctgag aaggcggag 19 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtgttccag cctcc 15 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgtggctgag aaggcggag 19 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agtgttccag cctca 15 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcacacagtg aggaaggggt ct 22 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggggatggg gtaag 15 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcacacagtg aggaaggggt ct 22 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gggggatggg gtaaa 15 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 acctttgaca tctgagcc 18 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aagcactgta atagt 15 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acctttgaca tctgagcc 18 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aagcactgta atagc 15 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcacacagtg aggaaggggt ct 22 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caccttccca ggtat 15 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gcacacagtg aggaaggggt ct 22 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 caccttccca ggtac 15

Claims (13)

  1. 서열번호: 1에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 2에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 3에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호: 4에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 ATP7B(copper transporting P-type adenosine triphosphatase)의 Arg778Leu 돌연변이 검출용 프라이머 세트.
  2. 서열번호: 5에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 6에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 7에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호: 8에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 ATP7B의Asn1270Ser 돌연변이 검출용 프라이머 세트.
  3. 서열번호: 9에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 10에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 11에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호: 12에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 ATP7B의 Ala874Val 돌연변이 검출용 프라이머 세트.
  4. 서열번호: 13에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 14에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드, 서열번호: 15에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호: 16에 나타낸 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 ATP7B의 Leu1083Phe 돌연변이 검출용 프라이머 세트.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물.
  6. (1) 검체로부터 분리된 지노믹 DNA 또는 이의 일부를 주형으로 하고 제1항 내지 4항의 프라이머 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 (2) 실시간 PCR 산물에 대한 용융 곡선 분석을 실시하는 단계를 포함하는 윌슨병의 진단에 필요한 정보제공방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 검체는 한국인인 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 한국인은 신생아인 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 지노믹 DNA의 일부는 ATP7B 유전자를 포함하거나, ATP7B 유전자의 엑손 8, 11, 15 또는 18을 포함하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 실시간 PCR은 SYBR Green I를 이용하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  11. 제 6항에 있어서,
    상기 실시간 PCR이 ATP7B의 돌연변이 Arg778Leu와 Asn1270Ser를 동시에 검출하는 다중 PCR인 경우에 1-9분간 94-96℃에서 초기화 후 94-98℃에서 20-30초간 변성, 50-55℃에서 20-40초간 어닐링, 70-80℃에서 20-40초간 연장하는 반응을 20-40회 반복하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  12. 제 6항에 있어서,
    상기 실시간 PCR이 ATP7B의 돌연변이 Ala874Val와 Leu1083Phe를 동시에 검출하는 다중 PCR인 경우에 1-9분간 94-96℃에서 초기화 후 94-98℃에서 20-30초간 변성, 56-60℃에서 20-40초간 어닐링, 70-80℃에서 20-40초간 연장하는 반응을 20-40회 반복하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  13. 제 6항에 있어서,
    상기 용융 곡선 분석은 65℃ - 95℃ 범위에서 0.2℃씩 온도를 높여가면서 1초 간격으로 형광도를 측정하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
KR1020090002887A 2009-01-14 2009-01-14 윌슨병 진단용 조성물 KR101076612B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090002887A KR101076612B1 (ko) 2009-01-14 2009-01-14 윌슨병 진단용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090002887A KR101076612B1 (ko) 2009-01-14 2009-01-14 윌슨병 진단용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100083487A KR20100083487A (ko) 2010-07-22
KR101076612B1 true KR101076612B1 (ko) 2011-10-26

Family

ID=42643232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090002887A KR101076612B1 (ko) 2009-01-14 2009-01-14 윌슨병 진단용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101076612B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101915211B1 (ko) 2018-05-25 2018-11-05 김연수 멜팅 피크 분석을 이용한 하부요로 생식기 감염균 검출 방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101598598B1 (ko) * 2011-08-05 2016-02-29 주식회사 케이티 지능적 서비스를 제공하는 통합 기지국 장치 및 그 방법
KR101667189B1 (ko) * 2013-05-29 2016-10-18 주식회사 랩 지노믹스 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995008641A1 (en) 1993-09-21 1995-03-30 Hsc Research And Development Limited Partnership Wilson disease gene
US20070280927A1 (en) 2004-01-29 2007-12-06 Cellzome Ag Treatment Of Neurodegenerative Diseases By The Use Of Atp7a

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995008641A1 (en) 1993-09-21 1995-03-30 Hsc Research And Development Limited Partnership Wilson disease gene
US20070280927A1 (en) 2004-01-29 2007-12-06 Cellzome Ag Treatment Of Neurodegenerative Diseases By The Use Of Atp7a

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101915211B1 (ko) 2018-05-25 2018-11-05 김연수 멜팅 피크 분석을 이용한 하부요로 생식기 감염균 검출 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100083487A (ko) 2010-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210123102A1 (en) Single Nucleotide Polymorphism in HLA-B*15:02 and Use Thereof
CN107488711B (zh) 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
Luong et al. Variation in BMPR1B, TGFRB1 and BMPR2 and control of dizygotic twinning
US20200216903A1 (en) Mitochondrial Disease Genetic Diagnostics
KR101076612B1 (ko) 윌슨병 진단용 조성물
US20220162710A1 (en) Composition for diagnosis or prognosis prediction of glioma, and method for providing information related thereto
Sergouniotis et al. A survey of DNA variation of C2ORF71 in probands with progressive autosomal recessive retinal degeneration and controls
KR101646189B1 (ko) 내인성 아토피 피부염 진단용 마커 및 그의 용도
JP2012105644A (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法、および多型検出用キット
JP6053681B2 (ja) イヌの緑内障を診断する方法及びキット
Van Giau et al. Optimization of specific multiplex DNA primers to detect variable CLU genomic lesions in patients with Alzheimer’s disease
JP2013162783A (ja) Ｐｏｎ１遺伝子多型（ｑ１９２ｒ）を検出する方法
KR101667189B1 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출
KR101728023B1 (ko) Ｐｃｒ―ｌｄｒ을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출
KR101849602B1 (ko) 윌슨 병 원인 유전자 돌연변이 검출을 위한 pna 프로브 및 이를 이용하는 윌슨 병의 진단 방법
JP5860667B2 (ja) Ｅｇｆｒエクソン２１ｌ８５８ｒ遺伝子多型検出用プライマーセット及びその用途
KR102511596B1 (ko) 단일염기다형성을 이용한 안지오텐신 전환효소억제제 이상반응 진단용 조성물 및 이를 이용한 방법
JP5648948B2 (ja) 低フォスファターゼ症の遺伝子変異スクリーニング方法
KR101167945B1 (ko) Ａｔｇ16ｌ1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법
KR102304998B1 (ko) 우리흑돈의 전신 흑모색 식별용 snp 마커 및 이를 이용한 전신 흑모색 식별 방법
WO2015129018A1 (ja) イヌの緑内障を診断する方法及びキット
RU2556808C2 (ru) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФНОЙ ПОЗИЦИИ rs1613662 В ГЕНЕ GP6, КОДИРУЮЩЕМ ГЛИКОПРОТЕИН VI
JP2021073993A (ja) イヌ白内障の検査方法、イヌ白内障の検査をするための試薬、及びイヌ白内障の検査キット
JP2008072946A (ja) ウシの乳房炎抵抗性の遺伝子診断法
KR101075392B1 (ko) Ｆｇａ 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141001

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151005

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee