KR101667189B1

KR101667189B1 - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출

Info

Publication number: KR101667189B1
Application number: KR1020130061193A
Authority: KR
Inventors: 신인경; 김건희; 이신애; 조대연
Original assignee: 주식회사 랩 지노믹스
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2016-10-18
Also published as: KR20140140386A

Abstract

본 발명은 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물 및 이를 이용하여 윌슨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ＡＴＰ７Ｂ 유전자의 돌연변이 검출{Detection of mutations in ATP7B gene using Real-Time PCR}

본 발명은 중소기업청의 중소기업이전기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제고유번호: S2043537, 과제명: 한국인 호발 열성 유전질환 선별 검사를 위한 분자진단 기술 개발]

윌슨(Wilson)병은 구리 대사 이상으로 인하여 간, 뇌, 각막, 신장 및 적혈구에 구리가 침착되어 생기는 보통염색체 열성 유전질환으로, 13번 염색체에 위치하는 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자 돌연변이에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 이 유전자의 돌연변이로 인하여 간 및 뇌에 구리가 축적되어 간 증상 혹은 신경학적 증상이 나타난다.

구리의 흡수에 관여하는 효소인 ATP7B를 코딩하는 유전자는 13번 염색체 장완 q14.3에 위치하고 있다. 이 유전자에 돌연변이가 발생하면 구리운반 P-형 ATPase 단백질에 이상이 생겨 간세포 내에서 미세담도로 구리가 배출되지 못하고, 구리가 셀룰로플라스민과 결합하지 못하여 혈액 내로 배출되지 못하여, 간세포, 적혈구, 뇌 등의 장기에 구리가 침착되어 중독증상이 나타나고, 구리이온에 의한 자유라디칼(free readical)의 발생으로 장기에 산화적 손상을 유발한다.

윌슨병은 상염색체 열성으로 유전된다. 부모 양쪽 모두가 보인자인 경우에 25%의 확률로 환자인 자녀가 생길 수 있다. 윌슨병은 희귀병이나 국내에서 지난 10년간 발생한 유전질환 중 가장 많이 발생한 질환이며 다른 나라와 비교해 발생률이 높은 편에 속한다. 따라서 윌슨병 환자에 대한 조기 진단과 치료의 중요성이 강조되고 있다.

윌슨병은 임상적, 생화학적 및 분자유전학적 소견으로 진단할 수 있다. 윌슨병의 임상적, 생화학적 진단은 특징적인 각막환(K-F 고리), 특징적인 신경학적 이상소견, 혈중 내 낮은 셀룰로플라스민 수치, 24시간 동안 소변 중 구리 배설량 증가, 간내 증가된 구리의 양을 고려하고 이들 중 2가지 이상이 양성이면 윌슨병의 확진 가능성이 매우 높다. 최근 혈중 셀룰로플라스민의 농도를 측정하여 윌슨병을 진단하는 기술이 개발되고 있으나, 셀룰로플라스민의 농도 측정은 생화학 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 초기 윌슨병 환자들은 정확한 진단이 어렵고 보인자를 판별할 수 없다는 문제가 있다.

현재, 윌슨병의 확진을 위해서 ATP7B 유전자의 돌연변이를 확인하는 분자유전학적 진단 방법이 이용되고 있다. 약 80%의 환자에서 유전자 이상을 규명할 수 있으며 임상적, 생화학적 진단법에 의한 윌슨병 확진시 도움을 줄 수 있다. 또한 증상이 없는 환자인지 이형접합 보인자인지 여부를 확진하는 데는 분자유전학적 진단방법이 표준적인 방법이다. 특히 분자유전학적 진단 방법을 이용하면 생화학, 임상양상이 비전형적이거나 생화학 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 윌슨병 초기 환자 및 현재 무증상인 환자 등 임상적으로 감별이 어려운 환자를 확진할 수 있다. 또한 돌연변이가 밝혀지면 그 가계 내에서도 산전 진단이 가능하다.

ATP7B 유전자에 대한 돌연변이는 전세계적으로 다양한 종류들이 보고되었고 인종이나 민족 간에 차이가 있는 것으로 나타났다. 중부/동부/북서부 유럽 국가에서는 H1069Q 돌연변이 빈도가 가장 높게 발견되며(17-72%), 지중해 연안 국가에서는 이탈리아, 그리스, 터키에서는 H1069Q 돌연변이(9.4-35%), 스페인에서는 M645R 돌연변이(27%), 카나리 제도에서는 L708P 돌연변이(64%)의 빈도가 가장 높다. 한국에서는 R778L 돌연변이가 37.5%로 가장 높은 빈도를 차지하고 있고, 중국의 경우도 비슷한 양상을 보인다(49.2%) (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298). 특히 한국인에서는 R778L(c.2333G>T), A874V(c.2621C>T), N1270S(c.3809A>G)의 3가지가 전체 돌연변이 대립유전자의 50% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 외에도 c.2513delA, T1029I (c.3086C>T), G1035V (c.3104G>T), L1083F (c.3247C>T), G1186S (c.3556G>T)의 돌연변이가 1 내지 8% 빈도로 확인되었다 (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298; Human Mutation 2007, 28, 1108-1113; Liver International, 2011, 31, 831-839). 따라서, 이들 돌연변이의 분석에 의해 60% 이상의 윌슨병 진단이 가능하다.

윌슨병과 같은 유전질환은 어린 나이에 발병할 수 있고, 치료법이 없는 경우가 많으므로, 조기 진단 및 조기 치료에 의해 질환의 심각성을 낮추고 치료 가능성을 높이는 것이 중요하다. 특히, 신생아 대사 검사와 같이, 저비용으로 편리하고 효율적으로 시행할 수 있는 검사법의 개발이 요구된다.

이에 본 발명자들은 한국인 호발 ATP7B 유전자의 돌연변이 및 이의 효과적인 검출 방법에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태는 ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물로서,

상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A로 구성된 군으로부터 선택되고,

상기 프라이머는 서열번호 2 내지 17의 프라이머로부터 선택되며,

상기 프로브는 서열번호 18 내지 33의 프로브로부터 선택되고,

상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되며,

상기 c.2333G>T은 서열번호 2 및 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 18 및 19의 프로브 쌍에 의해 검출되고,

상기 c.2621C>T는 서열번호 4 및 5의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 20 및 21의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,

상기 c.3809A>G는 서열번호 6 및 7의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 22 및 23의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,

상기 c.3247C>T는 서열번호 8 및 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 24 및 25의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,

상기 c.2513delA는 서열번호 10 및 11의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 26 및 27의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,

상기 c.3086C>T는 서열번호 12 및 13의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 28 및 29의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,

상기 c.3104G>T는 서열번호 14 및 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 30 및 31의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,

상기 c.3556G>A는 서열번호 16 및 17의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 32 및 33의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,

상기 프로브 쌍은 ATP7B 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 ATP7B 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어진 것인 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 ATP7B 유전자 돌연변이는 하기와 같이 정의된다:

ATP7B 유전자의 돌연변이는 서열번호 1을 기준으로 표시된다. 서열번호 1은 ATP7B 유전자(GenBank Accession No. NM_000053)의 코딩 서열(CDS)을 나타내며, 번역 개시 코돈인 ATG의 A를 뉴클레오티드 +1로 표시한다.

치환(substitution) 돌연변이는 기호'>'를 표시하여 기재하며, '>'앞의 문자는 정상인 ATP7B 유전자의 뉴클레오티드이며, '>' 뒤의 문자는 돌연변이 ATP7B 유전자의 뉴클레오티드를 의미한다. 결실(deletion) 돌연변이는 "del"로 표시하며, "del" 다음의 문자는 결실된 뉴클레오티드를 나타낸다.

돌연변이 "c.2333G>T"은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2333번째 염기의 G에서 T로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.2621C>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2621번째 염기의 C에서 T로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.3809A>G"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3809번째 염기의 A에서 G로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.3247C>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3247번째 염기의 C에서 T로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.2513delA"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2513번째 염기 A의 결실을 의미한다.

돌연변이 "c.3086C>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3086번째 염기의 C에서 T로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.3104G>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3104번째 염기의 G에서 T로의 치환을 의미한다.

돌연변이 "c.3556G>A"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2333번째 염기의 G에서 T로의 치환을 의미한다.

한국인 윌슨병 환자에 대한 연구 결과들에 의하면, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>T가 전체 돌연변이 대립유전자의 50%를 차지하며 그 외에 c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, c.3247C>T, c.3556G>T의 돌연변이도 각각 1 내지 8% 빈도를 차지하는 것으로 확인되었다 (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298; Human Mutation 2007, 28, 1108-1113; Liver International, 2011, 31, 831-839). 따라서, 이들 돌연변이의 분석에 의해 60% 이상의 윌슨병 보인자 진단이 가능하다.

본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 증폭되는 표적 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이고, 적합한 온도에서 중합효소연쇄반응액 중 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 반응 온도와 프라이머의 용도 등의 인자에 따라 정해지나, 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용하기 위한 프로브는 5' 말단에는 형광물질이 부착되고, 3' 말단에는 소광물질이 부착되어 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 소광물질은 6-TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX(carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로브의 3'-말단에 MGB(minor groove binder)가 부착될 수 있다. MGB는 형성된 이중쇄의 안정성을 증가시켜 분석의 정확도에 기여한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지될 수 있다. 야생형 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호와 돌연변이 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호가 구별되므로, 야생형 검출용 프로브의 신호가 양성이면 야생형, 돌연변이 검출용 프로브의 신호가 양성이면 돌연변이, 양자 모두의 신호가 양성이면 야생형과 돌연변이의 이형접합형인 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 검출된다.

본 발명의 일 구체예에서, 윌슨병의 진단을 위해 필요한 정보를 제공하기 위해, 검체에 대해 ATP7B 유전자 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A유전자 중 하나 이상, 또는 8종 모두의 유전형을 분석할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, 및 c.3809A>G로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, 및 c.3104G>T로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A로 이루어진 질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 윌슨병 진단용 조성물은 실시간 중합효소반응의 수행을 위해 필요한 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소, 및 완충 용액을 더 포함할 수 있다.

실시간 중합효소연쇄반응은 표적 핵산의 증폭과 측정을 동시에 진행한다. 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 산물로부터 발생하는 형광의 강도를 실시간으로 측정하므로, 전통적인 중합효소연쇄반응에 비해 신속하게 민감하게 결과를 확인할 수 있다. 또한, 증폭 산물의 분석을 위한 전기연동이나 서열결정과 같은 추가적인 단계를 필요로 하지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 통상적인 조건에서 수행되며, 실시간 중합효소연쇄반응의 진행 중 어닐링 및 연장 단계에서 형광물질이 부착된 프로브로부터의 형광을 측정한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 야생형 검출용 프로브는 5' 말단에 FAM으로 표지되고, 돌연변이 검출용 프로브는 VIC로 표지된다. 프로브가 표적 서열에 혼성화되면, 3' 말단에 존재하는 소광물질의 작용에 의해 5' 말단의 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 중합효소연쇄반응의 연장 단계에서, Taq 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5' 말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 소광물질에 의한 형광억제로부터 벗어나서 형광을 방출한다. 따라서, FAM에 의한 형광 신호는 야생형 유전형을 의미하고, VIC에 의한 형광 신호는 돌연변이 유전형을 의미한다. 두 신호가 동시에 검출되는 경우는 야생형과 돌연변이가 접합된 이형접합형을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태는 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,

검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호 2 내지 17의 프라이머로부터 선택된 프라이머 쌍 및 서열번호 18 내지 33의 프로브로부터 선택된 프로브 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계, 및

c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 ATP7B 돌연변이 부위의 유전형을 확인하는 단계를 포함하고,

상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되고,

상기 프로브 쌍은 ATP7B 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 ATP7B 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어지는 것인 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양태에서, ATP7B 돌연변이 부위의 유전형을 확인하는 단계에서 상기 ATP7B 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 프로브 신호와 돌연변이 검출용 프로브 신호의 동시 검출은 상기 검체가 윌슨병 보인자라는 것을 나타낸다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 소광물질은 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로브의 3'-말단에 MGB(minor groove binder)가 부착될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따른 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호 2 내지 17의 프라이머로부터 선택된 프라이머 쌍 및 서열번호 18 내지 33의 프로브로부터 선택된 프로브 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함한다.

실시간 중합효소연쇄반응은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 통상적인 조건에서 수행되며, 단일 또는 다중 중합효소연쇄반응으로 수행될 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응의 진행 중 어닐링 및 연장 단계에서 형광물질이 부착된 프로브로부터의 형광을 측정한다. 형광의 측정 및 분석은 실시간 중합효소연쇄반응에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따른 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 ATP7B 돌연변이 부위의 유전형을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, ATP7B 돌연변이 부위의 유전형을 확인하는 단계에서 실시간 중합효소연쇄반응은 각 ATP7B 돌연변이 부위에 대해, 유전형이 확인된 야생형 유전자 및 돌연변이형 유전자를 대조군으로 포함할 수 있다.

ATP7B 돌연변이 부위의 유전형은 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호 검출에 의해 판단된다. 야생형 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 해당 검체는 그 돌연변이 부위에 돌연변이를 갖지 않는 야생형, 즉, 정상이라는 것을 의미하고, 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 이는 그 돌연변이의 동형접합형의 존재, 즉, 윌슨병 환자라는 것을 의미하며, 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호가 모두 검출되는 경우, 이는 야생형과 돌연변이 모두가 존재하는 이형접합형을 갖는 보인자라는 것을 의미한다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 조성물을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 한국인 호발 ATP7B 돌연변이에 대한 선택적 스크리닝을 수행할 수 있고, 이에 의해 윌슨병의 조기 진단, 보인자 판별, 및 효율적 질환 관리에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응 수행 후, 검체의 유전자형을 분석한 결과를 보여준다. 검출 대상 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2621C>T이고 대립 유전자(allele) 1 및 2는 각각 C 및 T를 나타낸다. 도면의 적색 및 청색은 동형접합형인 검체를 나타내고, 녹색은 이형접합형인 검체를 나타낸다. APT7B의 야생형과 돌연변이형 검출용 프로브에 각각 상이한 형광물질을 부착시키는 것에 의해 야생형과 돌연변이형의 구별이 가능하다. 각각의 염료에 대한 형광값을 2원 분산 플롯에 나타낸 결과, 야생형, ATP7B 돌연변이 동형접합형 및 이형접합형 ATP7B 돌연변이를 명확히 구별할 수 있다는 것을 확인했다.

실시예 1. ATP7B 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 제작

서열번호 1의 ATP7B 유전자(GeneBank accession number, NM_000053)의 돌연변이는 상염색체 열성유전질환인 윌슨병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 한국인에서 높은 빈도로 발생하는 것으로 확인된 ATP7B 유전자의 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A를 검출하기 위해 이용할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였다.

ATP7B 유전자의 염기 서열을 바탕으로, Primer Express 3.0 소프트웨어(Applied Biosystems U.S.A)를 이용하여 각 표적 돌연변이를 포함하는 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였다. 하기의 표 1은 각 돌연변이에 대한 프라이머를 보여준다.

표적 돌연변이	방향	프라이머 서열 (5' 말단→3' 말단 방향)
c.2333G>T	정방향	GAG CCC TGT GAC ATT CTT CGA (서열번호 2)
	역방향	GCT GTT ACC TTT GCC AAG TGT TC (서열번호 3)
c.2621C>T	정방향	GTC ACT AAG AAA CCC GGA AGC A (서열번호 4)
	역방향	GTG GGT AGC TTT AAT GAG CAC AGA (서열번호 5)
c.3809A>G	정방향	GGG AAG AAA GTC GCC ATG GT (서열번호 6)
	역방향	AAT GGC CAC ACC CAT GTC T (서열번호 7)
c.3247C>T	정방향	TCC TCT TCC TCT CTT TCC ACC TT (서열번호 8)
	역방향	TGG CAC TGC CTG GAA GTC (서열번호 9)
c.2513delA	정방향	TGG TAT TGC CTT CCA GGA CTT T (서열번호 10)
	역방향	GTG CAG CGG GGC GAT AT (서열번호 11)
c.3086C>T	정방향	TGG TCA GTG AGT TGT GGT TGT TTT (서열번호 12)
	역방향	AGG AGC ACC CGC ATG AC (서열번호 13)
c.3104G>T	정방향	TGT GGT CAG TGA GTT GTG GTT GT (서열번호 14)
	역방향	CAG GAG CAC CCG CAT GA (서열번호 15)
c.3556G>A	정방향	CCA CGA GAT GAA AGG ACA GAC A (서열번호 16)
	역방향	CGG AAG GAA GGC AGA AGC A (서열번호 17)

또한, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A에 대하여, 해당 부위의 야생형과 돌연변이형에 완벽하게 결합하는 프로브를 제작하였다. 하기의 표 2는 각 표적 돌연변이 부위의 야생형 및 돌연변이형을 검출하는 프로브를 나타낸다. 각 프로브의 5' 말단에는 형광물질을 표지하였고, 3' 말단에는 형광을 내지 못하도록 하는 소광물질(quencher)을 표지하였다. 이때 변이가 없는 야생형 유전자 단편과 결합하는 프로브는 형광물질로 VIC을 표지하였고, 변이가 있는 유전자 단편과 결합하는 프로브는 형광물질로 FAM을 표지하였다. 또한, 상보적인 유전자 단편과의 결합이 용이하도록 3’말단에 MGB (minor groove binder)를 부착시켰다.

표적 돌연변이	분류	프로브 서열 (5' 말단→ 3' 말단 방향)
c.2333G>T	야생형	VIC-CTG GGC CGG TGG CT-NFQ (서열번호 18)
c.2333G>T	돌연변이형	FAM-CCT GGG CCT GTG GCT-NFQ (서열번호 19)
c.2621C>T	야생형	VIC-ACC CCG CAA TTA C-NFQ (서열번호 20)
c.2621C>T	돌연변이형	FAM-TAG ACC CCA CAA TTA C-NFQ (서열번호 21)
c.3809A>G	야생형	VIC-AGT CAT TGA CCC CAT CC-NFQ (서열번호 22)
c.3809A>G	돌연변이형	FAM-AGT CAC TGA CCC CAT CC-NFQ (서열번호 23)
c.3247C>T	야생형	VIC-CTG TTC CAA GTT CCT G-NFQ (서열번호 24)
c.3247C>T	돌연변이형	FAM-TGT TCC AAA TTC CTG-NFQ (서열번호 25)
c.2513delA	야생형	VIC-CTG GGA ACT TTC CC-NFQ (서열번호 26)
c.2513delA	돌연변이형	FAM-ACT GGA AAC TTC CC-NFQ (서열번호 27)
c.3086C>T	야생형	VIC-ATG TTT GAC AAG ACT GGC-NFQ (서열번호 28)
c.3086C>T	돌연변이형	FAM-TGT TTG ACA AGA TTG GC-NFQ (서열번호 29)
c.3104G>T	야생형	VIC-CAT TAC CCA TGG CGT CC-NFQ (서열번호 30)
c.3104G>T	돌연변이형	FAM-CAT TAC CCA TGT CGT CC-NFQ (서열번호 31)
c.3556G>A	야생형	VIC-TGG CTA TTG ACG GTA TCT-NFQ (서열번호 32)
c.3556G>A	돌연변이형	FAM-TGG CTA TTG ACA GTA TCT-NFQ (서열번호 33)

실시예 2. 실시간 중합효소연쇄반응에 의한 ATP7B 유전자 돌연변이의 검출

검체의 혈액, 모근, 구강상피세포 등의 샘플로부터 지노믹 DNA를 분리하였다. DNA 분리 및 정제는 Total DNA Prep Kit(인트론)를 이용하였다. 중합효소연쇄반응에는 실시예 1에서 제조한 변이부위를 포함하는 단편의 증폭용 프라이머와 프로브를 사용하였다. 중합효소연쇄반응 반응물은 각 20 ㎕ 반응을 기준으로 지노믹 DNA 주형 1㎕, 각 프라이머 900 nM, 프로브 200 nM을 포함했다. 증폭은 Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems을 이용하여 수행하였다. Real-time PCR 반응은 60℃에서 30초, 95℃에서 10분간 반응시키고, 95℃에서의 15초, 60℃에서의 60초로 이루어진 사이클을 50회 수행하고, 60℃에서 30초간 반응시켰다. 각 사이클마다 VIC과 FAM에 의한 형광을 측정하였다.

실시간 중합효소연쇄반응의 대조군은 표 1에 기재된 프라이머 조합을 이용한 중합효소연쇄반응 및 서열결정에 의해 야생형 및 돌연변이형 유전자를 준비하여 이용하였다. 즉, 표 1에 의해 프라이머의 조합을 이용한 중합효소연쇄반응에 의해 수득된 산물을 플라스미드 벡터에 클로닝하고, 이를 대장균에 형질전환시켜 야생형 유전자를 대량으로 준비하고, 서열분석에 의해 염기서열을 확인하고, 야생형 유전자에 부위-특이적 돌연변이 유발 키트(QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene Inc.)를 이용하여 돌연변이 유전자를 준비하고, 서열결정에 의해 확인한 후 이용하였다.

VIC 염료에 양성을 나타내는 샘플은 야생형 유전자를 가진 샘플이고, FAM 염료에 양성을 나타내는 샘플은 돌연변이 유전자를 가진 샘플로 진단하였다. VIC과 FAM 유전자에 모두 양성을 나타내는 샘플은 야생형과 돌연변이 유전자를 모두 갖는 이형접합 돌연변이(hetero)로 진단하였다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응 수행 후, 검체의 유전자형을 분석한 결과를 보여준다. VIC 및 FAM에 대한 형광값을 2원 분산 플롯에 나타낸 결과, ATP7B 야생형, ATP7B 돌연변이 동형접합형 및 ATP7B 돌연변이 이형접합형을 명확히 구별할 수 있다는 것을 확인했다.

실시예 3. 임상검체 유전자형 진단

실시예 1에서 제작된 한국인 윌슨병의 주요 돌연변이를 검출하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 실제 임상검체를 대상으로 유전자 검사를 실시하였다.

랩지노믹스 진단검사의학과에서 수집된 정상인 95명과 윌슨병 돌연변이 보유자 5명의 혈액으로부터 추출한 지노믹 DNA를 주형으로 하고 각 유전형에 대한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이, 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 c.2333G>T, c.2513delA, c.2621C>T, c.3086C>T, c.3104G>T, c.3247C>T, c.3556G>A, c.3809A>G 돌연변이 8종에 대한 유전형을 분석하였다. 윌슨병 돌연변이 보유자는 선행 연구를 통해 ATP7B 유전자에 대한 염기서열 분석을 통하여 표적 돌연변이 중 1종 이상의 이형접합 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 검체로 구성되었다. 검체별 돌연변이의 구성은 하기의 표 3에 기재된 바와 같다. 정상인은 윌슨병과 관련된 증상이 없는 성인 중 ATP7B 유전자에 대한 돌연변이의 유무가 확인되지 않은 검체이다.

	ATP7B 유전자 돌연변이
1	c.2621C>T
2	c.3104G>T, c.3809A>G
3	c.2333G>T, c.3247C>T
4	c.2333G>T, c.2513delA
5	c.3086C>T

100명의 검체에 임의번호를 부여하고 한국인 윌슨병 주요 돌연변이 8종에 대하여 실시예 2의 방법에 의해 유전자형을 맹검하고 결과를 확인하였다. 시험 결과에서 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 윌슨병 돌연변이 보유 검체들의 각 돌연변이를 100% 정확하게 검출할 수 있었다. 정상인에서 c.2621C>T 이형접합 변이가 1개 확인되었다. 윌슨병 환자가 아닌 정상인에서 확인된 이형접합 돌연변이의 경우 염기서열을 분석하여 돌연변이 여부를 확인하였다.

또한, 염기서열 분석을 통해, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 확인된 유전자형과 결과가 일치한다는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 발명의 진단 키트가 한국인에서 윌슨병을 유발하는 주요한 ATP7B 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 보여준다.

<110> Lab Genomics <120> Detection of ATP7B mutations using real-time PCR <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4398 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcctgagc aggagagaca gatcacagcc agagaagggg ccagtcggaa aatcttatct 60 aagctttctt tgcctacccg tgcctgggaa ccagcaatga agaagagttt tgcttttgac 120 aatgttggct atgaaggtgg tctggatggc ctgggccctt cttctcaggt ggccaccagc 180 acagtcagga tcttgggcat gacttgccag tcatgtgtga agtccattga ggacaggatt 240 tccaatttga aaggcatcat cagcatgaag gtttccctgg aacaaggcag tgccactgtg 300 aaatatgtgc catcggttgt gtgcctgcaa caggtttgcc atcaaattgg ggacatgggc 360 ttcgaggcca gcattgcaga aggaaaggca gcctcctggc cctcaaggtc cttgcctgcc 420 caggaggctg tggtcaagct ccgggtggag ggcatgacct gccagtcctg tgtcagctcc 480 attgaaggca aggtccggaa actgcaagga gtagtgagag tcaaagtctc actcagcaac 540 caagaggccg tcatcactta tcagccttat ctcattcagc ccgaagacct cagggaccat 600 gtaaatgaca tgggatttga agctgccatc aagagcaaag tggctccctt aagcctggga 660 ccaattgata ttgagcggtt acaaagcact aacccaaaga gacctttatc ttctgctaac 720 cagaatttta ataattctga gaccttgggg caccaaggaa gccatgtggt caccctccaa 780 ctgagaatag atggaatgca ttgtaagtct tgcgtcttga atattgaaga aaatattggc 840 cagctcctag gggttcaaag tattcaagtg tccttggaga acaaaactgc ccaagtaaag 900 tatgaccctt cttgtaccag cccagtggct ctgcagaggg ctatcgaggc acttccacct 960 gggaatttta aagtttctct tcctgatgga gccgaaggga gtgggacaga tcacaggtct 1020 tccagttctc attcccctgg ctccccaccg agaaaccagg tccagggcac atgcagtacc 1080 actctgattg ccattgccgg catgacctgt gcatcctgtg tccattccat tgaaggcatg 1140 atctcccaac tggaaggggt gcagcaaata tcggtgtctt tggccgaagg gactgcaaca 1200 gttctttata atccctctgt aattagccca gaagaactca gagctgctat agaagacatg 1260 ggatttgagg cttcagtcgt ttctgaaagc tgttctacta accctcttgg aaaccacagt 1320 gctgggaatt ccatggtgca aactacagat ggtacaccta catctgtgca ggaagtggct 1380 ccccacactg ggaggctccc tgcaaaccat gccccggaca tcttggcaaa gtccccacaa 1440 tcaaccagag cagtggcacc gcagaagtgc ttcttacaga tcaaaggcat gacctgtgca 1500 tcctgtgtgt ctaacataga aaggaatctg cagaaagaag ctggtgttct ctccgtgttg 1560 gttgccttga tggcaggaaa ggcagagatc aagtatgacc cagaggtcat ccagcccctc 1620 gagatagctc agttcatcca ggacctgggt tttgaggcag cagtcatgga ggactacgca 1680 ggctccgatg gcaacattga gctgacaatc acagggatga cctgcgcgtc ctgtgtccac 1740 aacatagagt ccaaactcac gaggacaaat ggcatcactt atgcctccgt tgcccttgcc 1800 accagcaaag cccttgttaa gtttgacccg gaaattatcg gtccacggga tattatcaaa 1860 attattgagg aaattggctt tcatgcttcc ctggcccaga gaaaccccaa cgctcatcac 1920 ttggaccaca agatggaaat aaagcagtgg aagaagtctt tcctgtgcag cctggtgttt 1980 ggcatccctg tcatggcctt aatgatctat atgctgatac ccagcaacga gccccaccag 2040 tccatggtcc tggaccacaa catcattcca ggactgtcca ttctaaatct catcttcttt 2100 atcttgtgta cctttgtcca gctcctcggt gggtggtact tctacgttca ggcctacaaa 2160 tctctgagac acaggtcagc caacatggac gtgctcatcg tcctggccac aagcattgct 2220 tatgtttatt ctctggtcat cctggtggtt gctgtggctg agaaggcgga gaggagccct 2280 gtgacattct tcgacacgcc ccccatgctc tttgtgttca ttgccctggg ccggtggctg 2340 gaacacttgg caaagagcaa aacctcagaa gccctggcta aactcatgtc tctccaagcc 2400 acagaagcca ccgttgtgac ccttggtgag gacaatttaa tcatcaggga ggagcaagtc 2460 cccatggagc tggtgcagcg gggcgatatc gtcaaggtgg tccctggggg aaagtttcca 2520 gtggatggga aagtcctgga aggcaatacc atggctgatg agtccctcat cacaggagaa 2580 gccatgccag tcactaagaa acccggaagc actgtaattg cggggtctat aaatgcacat 2640 ggctctgtgc tcattaaagc tacccacgtg ggcaatgaca ccactttggc tcagattgtg 2700 aaactggtgg aagaggctca gatgtcaaag gcacccattc agcagctggc tgaccggttt 2760 agtggatatt ttgtcccatt tatcatcatc atgtcaactt tgacgttggt ggtatggatt 2820 gtaatcggtt ttatcgattt tggtgttgtt cagagatact ttcctaaccc caacaagcac 2880 atctcccaga cagaggtgat catccggttt gctttccaga cgtccatcac ggtgctgtgc 2940 attgcctgcc cctgctccct ggggctggcc acgcccacgg ctgtcatggt gggcaccggg 3000 gtggccgcgc agaacggcat cctcatcaag ggaggcaagc ccctggagat ggcgcacaag 3060 ataaagactg tgatgtttga caagactggc accattaccc atggcgtccc cagggtcatg 3120 cgggtgctcc tgctggggga tgtggccaca ctgcccctca ggaaggttct ggctgtggtg 3180 gggactgcgg aggccagcag tgaacacccc ttgggcgtgg cagtcaccaa atactgtaaa 3240 gaggaacttg gaacagagac cttgggatac tgcacggact tccaggcagt gccaggctgt 3300 ggaattgggt gcaaagtcag caacgtggaa ggcatcctgg cccacagtga gcgccctttg 3360 agtgcaccgg ccagtcacct gaatgaggct ggcagccttc ccgcagaaaa agatgcagtc 3420 ccccagacct tctctgtgct gattggaaac cgtgagtggc tgaggcgcaa cggtttaacc 3480 atttctagcg atgtcagtga cgctatgaca gaccacgaga tgaaaggaca gacagccatc 3540 ctggtggcta ttgacggtgt gctctgtggg atgatcgcaa tcgcagacgc tgtcaagcag 3600 gaggctgccc tggctgtgca cacgctgcag agcatgggtg tggacgtggt tctgatcacg 3660 ggggacaacc ggaagacagc cagagctatt gccacccagg ttggcatcaa caaagtcttt 3720 gcagaggtgc tgccttcgca caaggtggcc aaggtccagg agctccagaa taaagggaag 3780 aaagtcgcca tggtggggga tggggtcaat gactccccgg ccttggccca ggcagacatg 3840 ggtgtggcca ttggcaccgg cacggatgtg gccatcgagg cagccgacgt cgtccttatc 3900 agaaatgatt tgctggatgt ggtggctagc attcaccttt ccaagaggac tgtccgaagg 3960 atacgcatca acctggtcct ggcactgatt tataacctgg ttgggatacc cattgcagca 4020 ggtgtcttca tgcccatcgg cattgtgctg cagccctgga tgggctcagc ggccatggca 4080 gcctcctctg tgtctgtggt gctctcatcc ctgcagctca agtgctataa gaagcctgac 4140 ctggagaggt atgaggcaca ggcgcatggc cacatgaagc ccctgacggc atcccaggtc 4200 agtgtgcaca taggcatgga tgacaggtgg cgggactccc ccagggccac accatgggac 4260 caggtcagct atgtcagcca ggtgtcgctg tcctccctga cgtccgacaa gccatctcgg 4320 cacagcgctg cagcagacga tgatggggac aagtggtctc tgctcctgaa tggcagggat 4380 gaggagcagt acatctga 4398 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2333G>T <400> 2 gagccctgtg acattcttcg a 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2333G>T <400> 3 gctgttacct ttgccaagtg ttc 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2621C>T <400> 4 gtcactaaga aacccggaag ca 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2621C>T <400> 5 gtgggtagct ttaatgagca caga 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3809A>G <400> 6 gggaagaaag tcgccatggt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3809A>G <400> 7 aatggccaca cccatgtct 19 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3247C>T <400> 8 tcctcttcct ctctttccac ctt 23 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3247C>T <400> 9 tggcactgcc tggaagtc 18 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forwrad primer for c.2513delA <400> 10 tggtattgcc ttccaggact tt 22 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2513delA <400> 11 gtgcagcggg gcgatat 17 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3086C>T <400> 12 tggtcagtga gttgtggttg tttt 24 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3086C>T <400> 13 aggagcaccc gcatgac 17 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3104G>T <400> 14 tgtggtcagt gagttgtggt tgt 23 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3104G>T <400> 15 caggagcacc cgcatga 17 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3556G>A <400> 16 ccacgagatg aaaggacaga ca 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3556G>A <400> 17 cggaaggaag gcagaagca 19 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.2333G>T <400> 18 ctgggccggt ggct 14 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.2333G>T <400> 19 cctgggcctg tggct 15 <210> 20 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.2621C>T <400> 20 accccgcaat tac 13 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.2621C>T <400> 21 tagaccccac aattac 16 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.3809A>G <400> 22 agtcattgac cccatcc 17 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.3809A>G <400> 23 agtcactgac cccatcc 17 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.3247C>T <400> 24 ctgttccaag ttcctg 16 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.3247C>T <400> 25 tgttccaaat tcctg 15 <210> 26 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.2513delA <400> 26 ctgggaactt tccc 14 <210> 27 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.2513delA <400> 27 actggaaact tccc 14 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.3086C>T <400> 28 atgtttgaca agactggc 18 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.3086C>T <400> 29 tgtttgacaa gattggc 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.3104G>T <400> 30 cattacccat ggcgtcc 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.3104G>T <400> 31 cattacccat gtcgtcc 17 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type probe for c.3556G>A <400> 32 tggctattga cggtatct 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant probe for c.3556G>A <400> 33 tggctattga cagtatct 18

Claims

ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물로서,
상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A로 구성되고,
상기 프라이머는 서열번호 2 내지 17의 프라이머로 구성되며,
상기 프로브는 서열번호 18 내지 33의 프로브로 구성되며,
상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되며,
상기 c.2333G>T은 서열번호 2 및 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 18 및 19의 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 4 및 5의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 20 및 21의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 6 및 7의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 22 및 23의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.3247C>T는 서열번호 8 및 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 24 및 25의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 c.2513delA는 서열번호 10 및 11의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 26 및 27의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.3086C>T는 서열번호 12 및 13의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 28 및 29의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 c.3104G>T는 서열번호 14 및 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 30 및 31의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.3556G>A는 서열번호 16 및 17의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 32 및 33의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 프로브 쌍은 ATP7B 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 ATP7B 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어진 것인 조성물로서, 상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지되는 것인 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 소광물질은 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 검출되는 것인 조성물.
실시간 중합효소연쇄반응에 의해 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호 2 내지 17의 프라이머로부터 선택된 프라이머 쌍 및 서열번호 18 내지 33의 프로브로부터 선택된 프로브 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계, 및
c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.3247C>T, c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, 및 c.3556G>A로 구성된 ATP7B 돌연변이 부위의 유전형을 확인하는 단계를 포함하고,
상기 c.2333G>T은 서열번호 2 및 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 18 및 19의 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 4 및 5의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 20 및 21의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 6 및 7의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 22 및 23의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.3247C>T는 서열번호 8 및 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 24 및 25의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 c.2513delA는 서열번호 10 및 11의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 26 및 27의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.3086C>T는 서열번호 12 및 13의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 28 및 29의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 c.3104G>T는 서열번호 14 및 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 30 및 31의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되고,
상기 c.3556G>A는 서열번호 16 및 17의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 32 및 33의 프로브로 이루어진 프로브 쌍에 의해 검출되며,
상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되고,
상기 프로브 쌍은 ATP7B 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 ATP7B 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어지는 것인 방법으로서, 상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지되는 것인 방법.
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청구항 9에 있어서, 상기 ATP7B 돌연변이 부위의 유전형을 확인하는 단계에서 상기 ATP7B 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 프로브 신호와 돌연변이 검출용 프로브 신호의 동시 검출은 상기 검체가 윌슨병 보인자라는 것을 나타내는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 소광물질은 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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