JP2004097086A - エンドセリン1遺伝子中の多型を利用した高血圧症の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子 - Google Patents
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Abstract
【課題】高血圧症の遺伝子診断に用いる核酸プローブおよびプライマーの提供。
【解決手段】エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子。
【選択図】 なし
【解決手段】エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、高血圧症の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子に関する。
【0002】
背景技術
高血圧症患者の90%以上は、遺伝素因や環境因子がその原因として複雑に関与している本態性高血圧症の患者である。本態性高血圧症はそれ自体無症候であることが多いが、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症に強く関与する。従って、これらの重篤な疾患の発症を防ぐためには、本態性高血圧症を早期から予知し、生活習慣の改善、降圧薬による薬物療法等によりこれを予防することが望まれる。
【0003】
本態性高血圧症には遺伝素因が関与するため、その原因遺伝子における遺伝的要因を調べることにより高血圧症を予知することができると考えられる。このような原因遺伝子としては、食塩感受性、インスリン抵抗性、交感神経活性等に関与する遺伝子、各種ホルモン遺伝子、心・血管作動性物質遺伝子などが考えられる。
【0004】
本態性高血圧症に大きく関与する血管作動性物質の一つにエンドセリン(ET)がある。エンドセリンは、21個のアミノ酸残基からなる極めて強力な血管収縮性ペプチドとして、ブタ血管内皮細胞からはじめて単離され、同定されたペプチドである(非特許文献1:Yanagisawa M. et al., A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells., Nature 332, 411−415, 1988)。エンドセリンには3種類のアイソフォーム(ET−1、ET−2およびET−3)が存在することが知られており(非特許文献2:Inoue A. et al., The human endothelin family: Three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2863−2867, 1989)、さらに、エンドセリン1は血管内皮細胞、肺、心房、大脳、大腸、および腎において発現し、エンドセリン2は腎および空腸において発現し、エンドセリン3は副腎、脳および空腸において発現することが知られている。また、エンドセリンは、その受容体であるETAおよびETBを介して広範な臓器で多様な生理活性を示し、血管においては昇圧作用および細胞増殖作用を示すことが知られている(非特許文献3:Yanagisawa M. et al., The endothelin system. A new target for therapeutic intervention., Circulation 89, 1320−1322, 1994)。
【0005】
エンドセリン遺伝子における多型と高血圧症との関連については、エンドセリン1遺伝子に関して幾つかの報告がある。まず、エンドセリン1遺伝子の全領域にわたる配列決定により5箇所の多型が同定されており、そのうち、第198番目のコドンでのリシン/アスパラギンのアミノ酸変異を伴う多型(Lys198Asn)が、欧州の心筋梗塞を対象とした集団(The ECTIM Study:患者648人、健常対照760人)および英国北グラスゴーの一般住民(The Glasgow Heart Scan Study:1282人)において、肥満高血圧に関連することが報告されている(非特許文献4:Tiret L. et al., The Lys198Asn polymorphism in the endothelin−1 gene is associated with blood pressure in overweight people., Hypertension 33, 1169−1174, 1999)。
【0006】
また、Lys198Asn多型は、日本人一般集団(1250人)においても、肥満者の拡張期血圧の上昇に関与することが報告されている(非特許文献5:Asai T. et al., Endothelin−1 gene variant associates with blood pressurein obese Japanese subjects. The Ohasama Study., Hypertension 38, 1321−1324, 2001)。
【0007】
さらに、Lys198Asn多型は妊娠中の子癇との間で明らかな関連は認められなかったことが報告されているが、同じ文献中において、同多型が血圧上昇に関与し、変異型のホモ接合体であるTT型を示す被検者の血中エンドセリン1濃度が他の遺伝子型を有する被検者に比べて有意に高いことが報告されている(非特許文献6:Barden A.E. et al., Association between the endothelin−1 gene Lys198Asn polymorphism blood pressure and plasma endothelin−1 levelsin normal and pre−eclamptic pregnancy., J. Hypertens. 19, 1775−1782, 2001)。
【0008】
エンドセリン1遺伝子における多型としては、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドにおけるT/Gの一塩基多型が知られているが(NCBI SNP CLUSTER ID: rs 2070699)、この多型と高血圧症との関連については報告されていない。
【0009】
【非特許文献1】
Yanagisawa M. et al., Nature 332, 411−415, 1988
【非特許文献2】
Inoue A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2863−2867, 1989
【非特許文献3】
Yanagisawa M. et al., Circulation 89, 1320−1322, 1994
【非特許文献4】
Tiret L. et al., Hypertension 33, 1169−1174, 1999
【非特許文献5】
Asai T. et al., Hypertension 38, 1321−1324, 2001
【非特許文献6】
Barden A.E. et al., J. Hypertens. 19, 1775−1782, 2001
【0010】
【発明の概要】
本発明者らは、エンドセリン1遺伝子上の、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドにおけるT/Gの一塩基多型が、高血圧症の診断に利用可能であることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【0011】
従って、本発明は、高血圧症の遺伝子診断に用いるための核酸分子およびプライマーペア、診断用キット、ならびに高血圧症の予知/検出方法の提供を目的とする。
【0012】
そして、本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子である。
【0013】
さらに、本発明によるプライマーペアは、エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるプライマーペアである。
【0014】
さらに、本発明による高血圧症の予知/検出方法は、エンドセリン1遺伝子の変異を検出することにより、高血圧症を予知または検出する方法であって、本発明による核酸分子および/または本発明によるプライマーペアを用いて、エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定する工程を含んでなる、方法である。
【0015】
さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および/または本発明によるプライマーペアを含んでなる、高血圧症の予測または診断用キットである。
【0016】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、エンドセリン1遺伝子における多型部位のヌクレオチドを同定することにより、高血圧症の遺伝子診断が可能となる。
【0017】
エンドセリン1遺伝子は、5つのエクソンと4つのイントロンとからなる。本発明により同定されるヌクレオチドは、エンドセリン1遺伝子に含まれる第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドであり、エンドセリン1遺伝子は、この位置においてT/Gの一塩基多型(本発明において「T1908G多型」という)を有する。エンドセリン1遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号3で表わされるアミノ酸配列をコードするものであり、例えば、配列番号1で表わされるゲノム配列(NCBIアクセス番号:J05008)が挙げられる。T1908G多型の位置は、配列番号1においては第2176番目のヌクレオチドに相当する。
【0018】
T1908G多型におけるGアレル、特にGGの遺伝子型は、高血圧症のリスクファクターとして使用できる。従って、T1908G多型部位のヌクレオチドがTであるかGであるかを同定することにより、高血圧症の予測または診断が可能となる。さらに、上記のGアレル(特にGGの遺伝子型)は、本態性高血圧症の予測または診断において特に好ましいリスクファクターである。
【0019】
本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子である。この核酸分子は、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【0020】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Tm(℃)およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【0021】
本発明において「核酸分子」は、DNA、RNA、およびPNA(peptide nucleic acid)を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はDNAである。
【0022】
配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、T1908G多型部位のヌクレオチドがチミン(T)であるヒトエンドセリン1遺伝子のゲノムDNAとすることができる。前記ゲノムDNAは、ヒトエンドセリン1遺伝子の全エクソン(エクソン1〜5)および全イントロン(イントロン1〜4)を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン1の5’末端からエクソン5の3’末端まで、すなわち、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものであることが好ましい。
【0023】
また、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、T1908G多型部位のヌクレオチドがグアニン(G)であるヒトエンドセリン1遺伝子のゲノムDNAとすることができる。前記ゲノムDNAは、ヒトエンドセリン1遺伝子の全エクソン(エクソン1〜5)および全イントロン(イントロン1〜4)を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン1の5’末端からエクソン5の3’末端まで、すなわち、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、第2176番目のチミン(T)がグアニン(G)に置換されたものであることが好ましい。
【0024】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【0025】
本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【0026】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は10〜100ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも12ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは15〜50ヌクレオチドとする。
【0027】
また、本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【0028】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は10〜50ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも12ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは15〜30ヌクレオチドとする。
【0029】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、15〜100ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも17ヌクレオチド、さらに好ましくは17〜50ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、上記T1908G多型部位のヌクレオチドを同定する上で好ましいものである。
【0030】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアが提供される。このプライマーペアは、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する2本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における5’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における5’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【0031】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定することができ、これにより、高血圧症を予知または検出することができる。上記の同定の結果、T1908G多型部位のヌクレオチドがGであった場合には、高血圧症が予知または検出されたと判断することができる。
【0032】
また、Gアレルを有する場合の遺伝子型としてはG/GおよびG/Tが考えられるが、被検者がG/Tを有する場合よりもG/Gを有する場合の方が、より確実に高血圧症の予知または検出を判断することができる。従って、本発明の好ましい態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、高血圧症を予知または検出する方法が提供される。
【0033】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。
【0034】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムDNA等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸増幅法およびこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはPCR法等を用いることができる。
【0035】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【0036】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー:フォワード:5’−CTGATGGCAGGCTGTGTGCTT−3’(配列番号4);
リバース:5’−CCCCATCAGATGCCACTGTGA−3’(配列番号5)
を用いて核酸増幅法を行ない、このフォワードプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【0037】
本発明による予測法または診断法においては、アレル特異的PCR法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【0038】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるエンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドの同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【0039】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムDNA等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。
【0040】
エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、SNaPshotTM法またはPyrosequencing法として知られる方法が用いられる。
【0041】
SNaPshotTM法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその3’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にddNTP(ジデオキシNTP)を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【0042】
Pyrosequencing法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、4種のdNTPを1種ずつ反応させる。dNTPのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩(PPi)が遊離し、遊離したPPiはスルフリラーゼと反応してATPを生成させ、このATPによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のdNTPを加えたときに発光が起こった場合には、そのdNTPに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、dNTPが用いられるため、SNaPshotTM法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【0043】
エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび/またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法(タイピング法)を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび/またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、TaqMan PCR法として知られる方法が用いられる。
【0044】
TaqMan PCR法においては、T1908G多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、TアレルおよびGアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする2種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が5’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー(消光物質)が3’末端に付されてなるプローブ(TaqManプローブ)が用いられ、これらをPCR反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするPCR反応を行なう。TaqManプローブおよびPCR用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる:
TaqManプローブ:
Tアレル用: Fam−ATTGTAACCCTATTCATTCA−MGB(配列番号6)
Gアレル用: Vic−TGTAACCCTAGTCATTC−MGB(配列番号7);
プライマー:
フォワード:5’−TGGACATCATTTGGGTCAACA−3’(配列番号8)
リバース:5’−CTCTAAAACTGGGCTCCAGTGG−3’(配列番号9)。
【0045】
また、2種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはFAMとVICの組合せを用いる。このPCR反応においては、まず、各アレルにTaqManプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にTaqDNAポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型(G/G、G/T、またはT/T)が容易に決定される。
【0046】
本発明による予知法、検出法、予測法および診断法において、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドがグアニン(G)であると評価されたサンプル、特に遺伝子型がG/Gであると評価されたサンプルは、高血圧症、特に本態性高血圧症を有するものと、あるいは将来においてその可能性があるものと診断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【0047】
以上のような高血圧症の予知、検出、予測および診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および/または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【0048】
【実施例】
例1:エンドセリン1遺伝子上の多型と高血圧症との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター(National Cardiovascular Center of Japan)にて健康診断を行なった被検者3390人を対象とした。遺伝子解析に先立ち、被検者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結不可能匿名化した。
【0049】
まず、日本人47人について、エンドセリン1遺伝子をダイレクトシークエンスし、これにより、7箇所の一塩基多型および2箇所の挿入/欠失多型が同定された。このうち、両アレルの頻度がともに10%以上となる多型は、第2イントロンの第30番目のヌクレオチドにおけるT/G多型(T1908G)、第2イントロンの第1393番目のヌクレオチドにおけるT/C多型(T3271C)、および肥満者における血圧上昇との関連が報告されているLys198Asn多型の3種類であった。
【0050】
次いで、このうちのT1908G多型に関し、被検者全員についてTaqMan PCR法によるタイピングを行なった。TaqMan PCR法は、TaqManシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行なった。このTaqManシステムにおいては、TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)、10ngのゲノムDNA、下記のTaqManプローブ、および下記のプライマーを含む全12.5μlの反応溶液を96ウェルプレート上に調製し、95℃で10分間の反応の後、92℃で15秒間−62℃で1分間の反応を35サイクル行なった。PCR産物の蛍光は、ABI PRISM(登録商標)7700 Sequence Detection System(ABI)を用いて測定した。また、384ウェルプレートを用いる場合には、TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)、6ngのゲノムDNA、下記のTaqManプローブ、および下記のプライマーを含む全7.5μlの反応溶液を調製し、95℃で10分間の反応の後、92℃で15秒間−58℃で1分間の反応を40サイクル行なった。PCR産物の蛍光は、ABI PRISM(登録商標)7900HT Sequence Detection System(ABI)を用いて測定した。
【0051】
TaqManプローブ
Tアレル用: Fam−ATTGTAACCCTATTCATTCA−MGB(配列番号6)(250nM)
Gアレル用: Vic−TGTAACCCTAGTCATTC−MGB(配列番号7)(350nM)
プライマー
フォワード:5’−TGGACATCATTTGGGTCAACA−3’(配列番号8)(800nM)
リバース:5’−CTCTAAAACTGGGCTCCAGTGG−3’(配列番号9)(800nM)
アレル頻度においては、Hardy−Weinberg平衡が成り立つことが確認された(GG21%、GT50%、TT29%)。
【0052】
次いで、得られたデータを共分散分析によって解析し、各遺伝子型間で血圧を比較した。この解析においては、血圧に影響する因子として、年齢、BMI、高脂血症、糖尿病、虚血性心疾患、喫煙および飲酒を共変量とした。その結果を下記の表1に示す。
【0053】
【表1】
男性ではGG:128.4/78.9、GT:129.1/79.1、TT:125.9/77.3mmHg(収縮期:p=0.020、拡張期:p=0.026)であり、女性ではGG:134.3/79.2、GT:132.0/78.0、TT:131.1/77.6mmHg(収縮期:p=0.089、拡張期:p=0.148)であった。従って、男性では有意差が認められた。また、男性では、Gアレルを有する者とTT遺伝子型を有する者との間で有意差が認められた(Gアレル:128.9/79.1;TT:125.9/77.2mmHg、収縮期:p=0.003、拡張期:p=0.002)。
【0054】
さらに、120/80mmHg未満の至適血圧を示す群(NT)と160/100mmHg以上の中等以上の高血圧を示す群(HT)との間のアレル頻度の比較を、χ2検定により行なった。その結果を下記の表2に示す。
【0055】
【表2】
女性ではGアレル頻度がHTで有意に高率であった(p=0.0209、オッズ比:1.628、95%CI:1.031〜2.571)。
【0056】
以上の解析結果から、T1908G多型におけるGアレル、特にGGの遺伝子型は、高血圧症のリスクファクターとして使用できることがわかる。
【0057】
【配列表】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、高血圧症の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子に関する。
【0002】
背景技術
高血圧症患者の90%以上は、遺伝素因や環境因子がその原因として複雑に関与している本態性高血圧症の患者である。本態性高血圧症はそれ自体無症候であることが多いが、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症に強く関与する。従って、これらの重篤な疾患の発症を防ぐためには、本態性高血圧症を早期から予知し、生活習慣の改善、降圧薬による薬物療法等によりこれを予防することが望まれる。
【0003】
本態性高血圧症には遺伝素因が関与するため、その原因遺伝子における遺伝的要因を調べることにより高血圧症を予知することができると考えられる。このような原因遺伝子としては、食塩感受性、インスリン抵抗性、交感神経活性等に関与する遺伝子、各種ホルモン遺伝子、心・血管作動性物質遺伝子などが考えられる。
【0004】
本態性高血圧症に大きく関与する血管作動性物質の一つにエンドセリン(ET)がある。エンドセリンは、21個のアミノ酸残基からなる極めて強力な血管収縮性ペプチドとして、ブタ血管内皮細胞からはじめて単離され、同定されたペプチドである(非特許文献1:Yanagisawa M. et al., A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells., Nature 332, 411−415, 1988)。エンドセリンには3種類のアイソフォーム(ET−1、ET−2およびET−3)が存在することが知られており(非特許文献2:Inoue A. et al., The human endothelin family: Three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2863−2867, 1989)、さらに、エンドセリン1は血管内皮細胞、肺、心房、大脳、大腸、および腎において発現し、エンドセリン2は腎および空腸において発現し、エンドセリン3は副腎、脳および空腸において発現することが知られている。また、エンドセリンは、その受容体であるETAおよびETBを介して広範な臓器で多様な生理活性を示し、血管においては昇圧作用および細胞増殖作用を示すことが知られている(非特許文献3:Yanagisawa M. et al., The endothelin system. A new target for therapeutic intervention., Circulation 89, 1320−1322, 1994)。
【0005】
エンドセリン遺伝子における多型と高血圧症との関連については、エンドセリン1遺伝子に関して幾つかの報告がある。まず、エンドセリン1遺伝子の全領域にわたる配列決定により5箇所の多型が同定されており、そのうち、第198番目のコドンでのリシン/アスパラギンのアミノ酸変異を伴う多型(Lys198Asn)が、欧州の心筋梗塞を対象とした集団(The ECTIM Study:患者648人、健常対照760人)および英国北グラスゴーの一般住民(The Glasgow Heart Scan Study:1282人)において、肥満高血圧に関連することが報告されている(非特許文献4:Tiret L. et al., The Lys198Asn polymorphism in the endothelin−1 gene is associated with blood pressure in overweight people., Hypertension 33, 1169−1174, 1999)。
【0006】
また、Lys198Asn多型は、日本人一般集団(1250人)においても、肥満者の拡張期血圧の上昇に関与することが報告されている(非特許文献5:Asai T. et al., Endothelin−1 gene variant associates with blood pressurein obese Japanese subjects. The Ohasama Study., Hypertension 38, 1321−1324, 2001)。
【0007】
さらに、Lys198Asn多型は妊娠中の子癇との間で明らかな関連は認められなかったことが報告されているが、同じ文献中において、同多型が血圧上昇に関与し、変異型のホモ接合体であるTT型を示す被検者の血中エンドセリン1濃度が他の遺伝子型を有する被検者に比べて有意に高いことが報告されている(非特許文献6:Barden A.E. et al., Association between the endothelin−1 gene Lys198Asn polymorphism blood pressure and plasma endothelin−1 levelsin normal and pre−eclamptic pregnancy., J. Hypertens. 19, 1775−1782, 2001)。
【0008】
エンドセリン1遺伝子における多型としては、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドにおけるT/Gの一塩基多型が知られているが(NCBI SNP CLUSTER ID: rs 2070699)、この多型と高血圧症との関連については報告されていない。
【0009】
【非特許文献1】
Yanagisawa M. et al., Nature 332, 411−415, 1988
【非特許文献2】
Inoue A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2863−2867, 1989
【非特許文献3】
Yanagisawa M. et al., Circulation 89, 1320−1322, 1994
【非特許文献4】
Tiret L. et al., Hypertension 33, 1169−1174, 1999
【非特許文献5】
Asai T. et al., Hypertension 38, 1321−1324, 2001
【非特許文献6】
Barden A.E. et al., J. Hypertens. 19, 1775−1782, 2001
【0010】
【発明の概要】
本発明者らは、エンドセリン1遺伝子上の、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドにおけるT/Gの一塩基多型が、高血圧症の診断に利用可能であることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【0011】
従って、本発明は、高血圧症の遺伝子診断に用いるための核酸分子およびプライマーペア、診断用キット、ならびに高血圧症の予知/検出方法の提供を目的とする。
【0012】
そして、本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子である。
【0013】
さらに、本発明によるプライマーペアは、エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるプライマーペアである。
【0014】
さらに、本発明による高血圧症の予知/検出方法は、エンドセリン1遺伝子の変異を検出することにより、高血圧症を予知または検出する方法であって、本発明による核酸分子および/または本発明によるプライマーペアを用いて、エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定する工程を含んでなる、方法である。
【0015】
さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および/または本発明によるプライマーペアを含んでなる、高血圧症の予測または診断用キットである。
【0016】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、エンドセリン1遺伝子における多型部位のヌクレオチドを同定することにより、高血圧症の遺伝子診断が可能となる。
【0017】
エンドセリン1遺伝子は、5つのエクソンと4つのイントロンとからなる。本発明により同定されるヌクレオチドは、エンドセリン1遺伝子に含まれる第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドであり、エンドセリン1遺伝子は、この位置においてT/Gの一塩基多型(本発明において「T1908G多型」という)を有する。エンドセリン1遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号3で表わされるアミノ酸配列をコードするものであり、例えば、配列番号1で表わされるゲノム配列(NCBIアクセス番号:J05008)が挙げられる。T1908G多型の位置は、配列番号1においては第2176番目のヌクレオチドに相当する。
【0018】
T1908G多型におけるGアレル、特にGGの遺伝子型は、高血圧症のリスクファクターとして使用できる。従って、T1908G多型部位のヌクレオチドがTであるかGであるかを同定することにより、高血圧症の予測または診断が可能となる。さらに、上記のGアレル(特にGGの遺伝子型)は、本態性高血圧症の予測または診断において特に好ましいリスクファクターである。
【0019】
本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子である。この核酸分子は、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【0020】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Tm(℃)およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【0021】
本発明において「核酸分子」は、DNA、RNA、およびPNA(peptide nucleic acid)を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はDNAである。
【0022】
配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、T1908G多型部位のヌクレオチドがチミン(T)であるヒトエンドセリン1遺伝子のゲノムDNAとすることができる。前記ゲノムDNAは、ヒトエンドセリン1遺伝子の全エクソン(エクソン1〜5)および全イントロン(イントロン1〜4)を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン1の5’末端からエクソン5の3’末端まで、すなわち、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものであることが好ましい。
【0023】
また、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、T1908G多型部位のヌクレオチドがグアニン(G)であるヒトエンドセリン1遺伝子のゲノムDNAとすることができる。前記ゲノムDNAは、ヒトエンドセリン1遺伝子の全エクソン(エクソン1〜5)および全イントロン(イントロン1〜4)を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン1の5’末端からエクソン5の3’末端まで、すなわち、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、第2176番目のチミン(T)がグアニン(G)に置換されたものであることが好ましい。
【0024】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【0025】
本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【0026】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は10〜100ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも12ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは15〜50ヌクレオチドとする。
【0027】
また、本発明による核酸分子は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【0028】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は10〜50ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも12ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは15〜30ヌクレオチドとする。
【0029】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、15〜100ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも17ヌクレオチド、さらに好ましくは17〜50ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、上記T1908G多型部位のヌクレオチドを同定する上で好ましいものである。
【0030】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアが提供される。このプライマーペアは、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する2本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における5’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における5’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【0031】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定することができ、これにより、高血圧症を予知または検出することができる。上記の同定の結果、T1908G多型部位のヌクレオチドがGであった場合には、高血圧症が予知または検出されたと判断することができる。
【0032】
また、Gアレルを有する場合の遺伝子型としてはG/GおよびG/Tが考えられるが、被検者がG/Tを有する場合よりもG/Gを有する場合の方が、より確実に高血圧症の予知または検出を判断することができる。従って、本発明の好ましい態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、高血圧症を予知または検出する方法が提供される。
【0033】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。
【0034】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムDNA等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸増幅法およびこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはPCR法等を用いることができる。
【0035】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【0036】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー:フォワード:5’−CTGATGGCAGGCTGTGTGCTT−3’(配列番号4);
リバース:5’−CCCCATCAGATGCCACTGTGA−3’(配列番号5)
を用いて核酸増幅法を行ない、このフォワードプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【0037】
本発明による予測法または診断法においては、アレル特異的PCR法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【0038】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるエンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドの同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【0039】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムDNA等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。
【0040】
エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、SNaPshotTM法またはPyrosequencing法として知られる方法が用いられる。
【0041】
SNaPshotTM法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその3’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にddNTP(ジデオキシNTP)を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【0042】
Pyrosequencing法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、4種のdNTPを1種ずつ反応させる。dNTPのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩(PPi)が遊離し、遊離したPPiはスルフリラーゼと反応してATPを生成させ、このATPによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のdNTPを加えたときに発光が起こった場合には、そのdNTPに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、dNTPが用いられるため、SNaPshotTM法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【0043】
エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび/またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法(タイピング法)を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび/またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、TaqMan PCR法として知られる方法が用いられる。
【0044】
TaqMan PCR法においては、T1908G多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、TアレルおよびGアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする2種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が5’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー(消光物質)が3’末端に付されてなるプローブ(TaqManプローブ)が用いられ、これらをPCR反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするPCR反応を行なう。TaqManプローブおよびPCR用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる:
TaqManプローブ:
Tアレル用: Fam−ATTGTAACCCTATTCATTCA−MGB(配列番号6)
Gアレル用: Vic−TGTAACCCTAGTCATTC−MGB(配列番号7);
プライマー:
フォワード:5’−TGGACATCATTTGGGTCAACA−3’(配列番号8)
リバース:5’−CTCTAAAACTGGGCTCCAGTGG−3’(配列番号9)。
【0045】
また、2種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはFAMとVICの組合せを用いる。このPCR反応においては、まず、各アレルにTaqManプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にTaqDNAポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型(G/G、G/T、またはT/T)が容易に決定される。
【0046】
本発明による予知法、検出法、予測法および診断法において、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドがグアニン(G)であると評価されたサンプル、特に遺伝子型がG/Gであると評価されたサンプルは、高血圧症、特に本態性高血圧症を有するものと、あるいは将来においてその可能性があるものと診断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【0047】
以上のような高血圧症の予知、検出、予測および診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および/または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、エンドセリン1遺伝子におけるT1908G多型部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【0048】
【実施例】
例1:エンドセリン1遺伝子上の多型と高血圧症との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター(National Cardiovascular Center of Japan)にて健康診断を行なった被検者3390人を対象とした。遺伝子解析に先立ち、被検者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結不可能匿名化した。
【0049】
まず、日本人47人について、エンドセリン1遺伝子をダイレクトシークエンスし、これにより、7箇所の一塩基多型および2箇所の挿入/欠失多型が同定された。このうち、両アレルの頻度がともに10%以上となる多型は、第2イントロンの第30番目のヌクレオチドにおけるT/G多型(T1908G)、第2イントロンの第1393番目のヌクレオチドにおけるT/C多型(T3271C)、および肥満者における血圧上昇との関連が報告されているLys198Asn多型の3種類であった。
【0050】
次いで、このうちのT1908G多型に関し、被検者全員についてTaqMan PCR法によるタイピングを行なった。TaqMan PCR法は、TaqManシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行なった。このTaqManシステムにおいては、TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)、10ngのゲノムDNA、下記のTaqManプローブ、および下記のプライマーを含む全12.5μlの反応溶液を96ウェルプレート上に調製し、95℃で10分間の反応の後、92℃で15秒間−62℃で1分間の反応を35サイクル行なった。PCR産物の蛍光は、ABI PRISM(登録商標)7700 Sequence Detection System(ABI)を用いて測定した。また、384ウェルプレートを用いる場合には、TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)、6ngのゲノムDNA、下記のTaqManプローブ、および下記のプライマーを含む全7.5μlの反応溶液を調製し、95℃で10分間の反応の後、92℃で15秒間−58℃で1分間の反応を40サイクル行なった。PCR産物の蛍光は、ABI PRISM(登録商標)7900HT Sequence Detection System(ABI)を用いて測定した。
【0051】
TaqManプローブ
Tアレル用: Fam−ATTGTAACCCTATTCATTCA−MGB(配列番号6)(250nM)
Gアレル用: Vic−TGTAACCCTAGTCATTC−MGB(配列番号7)(350nM)
プライマー
フォワード:5’−TGGACATCATTTGGGTCAACA−3’(配列番号8)(800nM)
リバース:5’−CTCTAAAACTGGGCTCCAGTGG−3’(配列番号9)(800nM)
アレル頻度においては、Hardy−Weinberg平衡が成り立つことが確認された(GG21%、GT50%、TT29%)。
【0052】
次いで、得られたデータを共分散分析によって解析し、各遺伝子型間で血圧を比較した。この解析においては、血圧に影響する因子として、年齢、BMI、高脂血症、糖尿病、虚血性心疾患、喫煙および飲酒を共変量とした。その結果を下記の表1に示す。
【0053】
【表1】
男性ではGG:128.4/78.9、GT:129.1/79.1、TT:125.9/77.3mmHg(収縮期:p=0.020、拡張期:p=0.026)であり、女性ではGG:134.3/79.2、GT:132.0/78.0、TT:131.1/77.6mmHg(収縮期:p=0.089、拡張期:p=0.148)であった。従って、男性では有意差が認められた。また、男性では、Gアレルを有する者とTT遺伝子型を有する者との間で有意差が認められた(Gアレル:128.9/79.1;TT:125.9/77.2mmHg、収縮期:p=0.003、拡張期:p=0.002)。
【0054】
さらに、120/80mmHg未満の至適血圧を示す群(NT)と160/100mmHg以上の中等以上の高血圧を示す群(HT)との間のアレル頻度の比較を、χ2検定により行なった。その結果を下記の表2に示す。
【0055】
【表2】
女性ではGアレル頻度がHTで有意に高率であった(p=0.0209、オッズ比:1.628、95%CI:1.031〜2.571)。
【0056】
以上の解析結果から、T1908G多型におけるGアレル、特にGGの遺伝子型は、高血圧症のリスクファクターとして使用できることがわかる。
【0057】
【配列表】
Claims (10)
- エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、
配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。 - 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、第2176番目のチミン(T)がグアニン(G)に置換されたものである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、
配列番号3で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。 - 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項6に記載のプライマーペア。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、第2176番目のチミン(T)がグアニン(G)に置換されたものである、請求項6に記載のプライマーペア。
- エンドセリン1遺伝子の変異を検出することにより、高血圧症を予知または検出する方法であって、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子、および/または請求項6〜8のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、エンドセリン1遺伝子における、第2イントロン中の第30番目のヌクレオチドがチミン(T)であるかグアニン(G)であるかを同定する工程を含んでなる、方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子、および/または請求項6〜8のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、高血圧症の予測または診断用キット。
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