TWI541507B - 評估肝臟病變之方法 - Google Patents

Description

評估肝臟病變之方法

本申請案主張優先於2009年9月11日申請的美國專利第61/241,709號，其內容係全文以引用方式併入本文中。

許多可能威脅生命之肝病影響大量人群。該等肝病的一實例係B型肝炎，即由B型肝炎病毒(HBV)引起的肝臟感染。其係全球主要健康問題且係最嚴重的病毒性肝炎類型，此乃因其可引起慢性肝病，其可最終導致肝硬化及肝癌。在世界範圍內，估計有二十億人已感染HBV，且有超過三億五千萬人患有慢性肝臟感染，但許多無症狀。B型肝炎係中國及亞洲其他部分之地方病。彼等地區中大多數人在童年曾感染HBV，且成年人群中有8%至10%受到慢性感染。HBV所致肝癌係男性前三大癌症死因之一，且係女性主要癌症病因。

已研發出多種肝功能測試且常規用於臨床。舉例而言，出於評估肝功能之目的，可測試患者血樣中以下物質之含量：丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素、或γ麩醯胺酸轉肽酶(GGT)。然而，由於肝病患病率較高，且尤其考慮到大多數肝病最初僅顯示輕微症狀的事實，故及早檢測及治療非常重要。業內需要可及早診斷出肝病之更靈敏的新穎方法。本發明可滿足此需要及其他相關需要。

在一態樣中，本發明提供在無肝病病徵之個體中檢測肝病之方法，例如從未顯示異常丙胺酸胺基轉移酶(ALT)測試結果者。該方法包括以下步驟：(a)測定白蛋白mRNA在取自該個體之無細胞血樣中之量或濃度；及(b)與標準對照比較步驟(a)中白蛋白mRNA之量或濃度。步驟(a)中所得量或濃度相對於標準對照有所增加表示個體中存在肝病。而若步驟(a)中白蛋白mRNA之量或濃度與標準對照實質上相同，則可認為個體未患肝病。

在一些實施例中，所測試個體係無發生肝病之風險者。欲測試之肝病之一些實例包括脂肪肝病(例如非酒精性脂肪肝病)、硬化、肝纖維化、或肝炎(例如甲型、B型或C型肝炎)。其他實例包括威爾遜病(Wilson disease)、血色素沈積症、α 1-抗胰蛋白酶缺乏、或糖原貯積病。在一些實施例中，使用本發明方法測試之肝病列表中不包括肝細胞癌(尤其在肝移植後患者中出現之肝細胞癌)。

在一些實施例中，無細胞血樣係血漿。在其他實施例中，無細胞血樣係血清。

在所主張方法之一些實施例中，步驟(a)包含通過(例如)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增白蛋白mRNA序列，包括逆轉錄酶(RT)-PCR、數位PCR、或實時定量PCR。在其他實施例中，步驟(a)包含質譜或與微陣列雜交、螢光探針、或分子信標。

在一些情形下，所主張方法可另外包括隨後使用來自該個體之相同類型的無細胞血樣重複實施步驟(a)(例如在步驟(a)中使用血清樣品時，所重複步驟可使用第二血清樣品)。若初始步驟(a)之量或濃度已表示存在肝病，則之後(即所重複步驟(a)中)白蛋白mRNA之量或濃度相對於初始步驟(a)升高表示肝病惡化，而降低表示肝病有所改善。

類似地，當初始步驟(a)中白蛋白mRNA之量或濃度表示無肝病時，所主張方法可另外包括隨後使用來自該個體之相同類型的無細胞血樣重複實施步驟(a)。之後(所重複步驟(a))白蛋白mRNA之量或濃度相對於初始步驟(a)有所增加表示出現肝病，而實質上無變化表示無肝病之生理狀態。

在所主張方法中相對於標準對照之增加或降低經常為至少1個標準偏差。在其他情況下，該相對於標準對照之增加或降低可為至少2個或甚至3個標準偏差。

在另一態樣中，本發明提供在無肝病病徵之個體或無發生肝病之風險之個體中診斷肝病之套組。該套組包括以下組份：(1)標準對照，其提供健康個體血樣中之平均量或濃度之白蛋白mRNA；及(2)兩種寡核苷酸引物，其用於特異性擴增白蛋白mRNA中之至少一個片段。通常，該套組另外含有說明手冊來幫助使用者實踐本發明方法。該套組亦可包括與白蛋白編碼序列特異性雜交之聚核苷酸探針。

在另一態樣中，本發明亦可包括於能實施本文所述所有或一些方法步驟之裝置或包含一或多個該等裝置之系統中。舉例而言，在一些情形下，該裝置或系統在接受取自所測試個體之無細胞血樣後實施以下步驟以檢測可能的肝病或監測肝臟情況之變化：(a)測定樣品中白蛋白mRNA之量或濃度；(b)與標準對照值比較該量或濃度；及(c)提供輸出來顯示該個體中是否存在肝臟病變，或該個體之肝臟情況是否有變化(即惡化或改善)。在其他情況下，本發明裝置或系統在已實施步驟(a)且已將步驟(a)之量或濃度輸入裝置中後實施步驟(b)及(c)之任務。較佳地，裝置或系統部分或完全自動化。

在實踐本發明任一上述態樣時，使用本發明方法或套組或裝置或系統測試之個體可係無肝病病徵者，或無發生肝病之已知風險者，或已接受肝移植且藉由習用測試顯示無肝臟異常症狀者。在一些情形下，可自本發明之實踐中排除先前患有肝細胞癌且肝細胞癌在肝移植後復發之肝移植後患者。

定義

本申請案中所用術語「肝病」係指任何改變患者正常肝功能之事件或病況，其在患者一生中經任一時間長度顯現其症狀。肝病之一些實例包括肝癌、硬化、肝纖維化、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、毒性或機械性肝損傷、病毒性或細菌性感染(例如各種肝炎(例如甲型、B型或C型肝炎))、威爾遜病、血色素沈積症、α 1-抗胰蛋白酶缺乏、或糖原貯積病。在一些情形下，可自出於本申請案之目的診斷之肝病中排除肝細胞癌。通常可端視病態持續時間將肝病再分類為急性或慢性。一般而言，持續超過3個月之病況可視為慢性肝病，且彼等持續短於3個月之病況可視作急性肝病。急性肝病(例如由病毒性或缺血性肝損傷引起之急性肝炎)通常突然發作，但經常可完全恢復正常肝功能。另一方面，慢性肝病通常不知不覺出現，進展緩慢，但很少能完全回復正常肝功能。

由於肝病具有多種潛在病因及臨床症狀，故有多種不同方法來診斷該等肝病。習用方法一般包括分析常用於評估以下物質含量之血清生化標誌物：丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素、或γ麩醯胺酸轉肽酶(GGT)。或者，藉由超音波、CT掃描或MRI使肝膽系統成像來檢測肝臟之結構性異常。當前已知沒有彼等異常中之任一者之個體、或在過去任一時間從未診斷出患有慢性肝病之個體、或已知已自先前急性肝病復原之個體係「無肝病病徵之個體」。此一個體之一實例係預計當前沒有異常丙胺酸胺基轉移酶(ALT)測試結果者，此乃因該個體在過去從未具有異常ALT測試結果或在前一次急性肝損傷後ALT已回復至正常含量。由於某些肝病毒(例如HBV)之攜帶者可無症狀且習用肝功能測試顯示無可引發任何可檢測異常之程度之明顯肝細胞損傷，故已知為該等病毒中任一者之攜帶者但從未具有異常肝功能測試結果之個體亦視作「無肝病病徵之個體」。將不僅沒有肝病病徵且直系親屬(父母或兄弟姐妹)亦沒有肝病病徵之個體視作沒有發生肝病之風險之個體。

醫學專業人員常規採用ALT測試。若個體出現肝病症狀(包括黃疸(皮膚或眼睛發黃)、深色尿液、噁心、嘔吐、或腹痛)，則通常要求實施ALT測試。亦可要求實施ALT測試以幫助診斷肝臟感染(例如病毒性肝炎)或監測服用了可引起肝臟相關副作用之藥物之患者。血液中ALT含量之正常範圍介於5 IU/L至60 IU/L(國際單位/升)之間。AST含量之正常範圍為5 IU/L至43 IU/L。

本文所用術語「血液」係指所測試個體之血液樣品或製劑，其用於測試可能的肝病或用於評估個體肝臟之生理狀態。「無細胞血樣」係指任何已移除全血中存在的所有細胞之至少95%之血液部分，且涵蓋諸如血清及血漿等具有常規定義之部分。遵循相同處理步驟得自不同個體或在不同時間得自相同個體之血樣稱作「相同類型之血樣」。

術語「核酸」或「聚核苷酸」係指去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈單鏈或雙鏈形式之聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有與參照核酸具有類似結合特性且以類似於天然存在核苷酸之方式代謝的天然核苷酸已知類似物的核酸。除非另有說明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如，簡並密碼子取代)、等位基因、直向同源物、單核苷酸多態性(SNP)及互補序列以及明確指出之序列。具體而言，可藉由產生其中一或多個所選擇(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃苷殘基取代的序列來達成簡並密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。術語核苷酸可與基因、cDNA、及由基因編碼之mRNA互換使用。

術語「基因」意指產生多肽鏈時所涉及之DNA；其包括基因產物轉錄/翻譯及對轉錄/翻譯之調節中所涉及的編碼區之前及之後的區域(前導區及尾區)，以及介於個別編碼片段(外顯子)之間之間插序列(內含子)。

在本申請案中，本文中之術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用，其係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為天然存在胺基酸之相應人工化學模擬物之胺基酸聚合物，以及天然存在胺基酸之聚合物及非天然存在胺基酸之聚合物。本文所用該等術語涵蓋任何長度之胺基酸鏈，包括全長蛋白質(即抗原)，其中各胺基酸殘基係藉由共價肽鍵來連接。

術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸，以及以類似於天然存在胺基酸之方式作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在胺基酸係彼等由遺傳密碼編碼者，以及彼等經後續修飾之者，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。

在本文中胺基酸可表示為眾所周知的三字母符號或IUPAC-IUB生化術語委員會推薦之單字母符號。類似地，核苷酸可表示為其公認知單字母代碼。

本申請案中所用「增加」或「減少」係指數量相對於已建立標準對照之可檢測的正或負變化。增加係較佳為對照值之至少2倍、更佳至少5倍、且最佳至少10倍之正變化。類似地，減少係較佳為對照之至少50%、更佳至少80%、且最佳至少90%之負變化。指示相對於比較基礎之數量變化或差異的其他術語(例如「更多」、「更少」、「更高」及「更低」)在本申請案中係以與上文所述相同之方式使用。相反，術語「實質上相同」或「實質上無變化」表示該數值相對於標準對照值變化極小或無變化，通常離標準對照之變化在標準對照之±10%以內，或±5%、2%以內，或甚至相差更少。

本文所用「聚核苷酸雜交方法」係指在適宜雜交條件下以具有已知序列之聚核苷酸探針根據聚核苷酸形成Watson-Crick鹼基對之能力來檢測該聚核苷酸之存在及/或數量之方法。該等雜交方法之實例包括DNA印跡法(Southern blotting)及RNA印跡法(Northern blotting)。

本文所用「引物」係指可用於擴增方法(例如聚合酶鏈式反應(PCR))中以基於對應於目標基因(例如白蛋白編碼序列)之聚核苷酸序列擴增核苷酸序列之寡核苷酸。至少一種用於擴增聚核苷酸序列之PCR引物對該序列具有序列特異性。

本文所用術語「數位聚合酶鏈式反應」係指習用聚合酶鏈式反應(PCR)方法之精密形式，其可用於直接量化並以選殖方式擴增核酸(包括DNA、cDNA或RNA)，從而使得可直接以定量方式量測靶核酸之量。數位PCR藉由以下方式來達成此直接定量量測：在多個分開的反應室中捕獲或分離存於樣品中之每一個別核酸，該等反應室能定位擴增產物並將其濃縮至可檢測含量。在PCR擴增後，藉由對各室中所含之PCR終產物進行計數來直接量測絕對核酸數量。通常藉助稀釋對個別核酸分子進行之捕獲或分離可在毛細管、微乳液、小型室陣列、或在核酸結合表面上實現。數位PCR之基本方法闡述於(例如)Sykes等人，Biotechniques 13(3): 444-449,1992中。

本文所用術語「分子計數」係指容許定量量測分子或分子複合體數量(通常為相對於具有獨特特徵之其他共存分子或複合體之相對數量)之任何方法。各種分子計數方法闡述於(例如)以下文獻中：Leaner等人，Analytical Chemistry 69:2115-2121,1997；Hirano及Fukami,Nucleic Acids Symposium Series，第44期：157-158,2000；Chiu等人，Trends in Genetics 25:324-331,2009；及美國專利第7,537,897號。

本文所用「標準對照」係指存於已建立樣品(例如無細胞血樣)中之預定量之聚核苷酸序列(例如白蛋白mRNA)。標準對照值適合在本發明方法中用作比較測試樣品中存在之白蛋白mRNA含量之基礎。用作標準對照之已建立樣品提供平均量之白蛋白mRNA，即未患任何常規定義肝病之一般健康人類的特定血樣(具體而言無細胞血樣，例如血清或血漿)中之典型量。標準對照值可隨樣品性質以及其他因素而變化，例如用來確立此一對照值之個體的性別、年齡、種族。

在闡述未患任何具有常規定義之肝病之健康人類的背景中使用之術語「一般的」係指某些特徵(尤其白蛋白mRNA在個體血液或任何無細胞血液部分(例如血清或血漿)中所發現之含量)，其代表未患任何肝臟病變之健康人類的隨機選擇組。此選擇組應包含足夠多的人類，從而使得該等個體中白蛋白mRNA在血液或血液部分中之平均含量可以適當精確度反映一般健康人群中之相應白蛋白mRNA含量。此外，所選擇組中人類之年齡一般與用來測試血樣中潛在肝病病徵之個體相似。用於實踐本發明之較佳年齡可隨所篩選之肝臟疾病/病症而有所不同。此外，亦考慮諸如性別、種族、醫療史等其他因素，且在測試個體與選擇用於建立「一般」個體組之檔案中該等因素較佳係非常相近的。

本申請案中所用術語「量」係指存於樣品中之目標聚核苷酸序列(例如白蛋白mRNA)之數量。該數量可表示為絕對性術語，即聚核苷酸序列在樣品中之總量；或表示為相對性術語，即聚核苷酸序列在樣品中之濃度。

I.　說明

分析血漿中之循環核酸使得可非侵入性地監測多種生理及病理狀況(Lo等人，Ann N Y Acad Sci 2004；1022:135-139；Chan等人，Ann Clin Biochem 2003；40:122-30)。業內已報導多種基於對人類血漿中之循環無細胞核酸之檢測的應用，包括彼等用於管控惡性腫瘤(Anker等人，hnl J Cancer 2003；103:149-52)、妊娠相關病況(Lo等人，Nat Rev Genet 2007；8:71-7)、器官移植(Lo等人，Lancet 1998；351:1329-30)及創傷(Lo等人，Clin Chem 2000；46:319-23；Chiu等人，Acta Neurochir Suppl 2005；95:471-4)之應用。該等應用之基本原理係關於對源自患病器官之細胞外核酸分子之血漿檢測。來自循環DNA分析之可用疾病特異性遺傳標誌包括對疾病相關病原體之檢測(Chan等人，Clin Chem 2005；51:2192-5)、疾病特異性突變、胎兒與其母體或移植提供者與接受者之間之性別及多態性差異。

除循環DNA以外，無細胞血漿RNA分析亦可為研發病變相關標誌物提供另一方面的機會(Lo等人，Ann N Y Acad Sci 2004；1022:135-139；Anker等人，Clin Chem 2002；48:1210-1)。可將器官或疾病之獨特表現譜靶向為血漿檢測之特異性核酸標誌。已成功地自血漿檢測到腫瘤源(Chen等人，Clin Cancer Res 2000；6:3823-6)及胎盤源RNA物質(Ng等人，Proc Natl Acad Sci USA 2003；100:4748-53)，其可用於疾病評估(Ng等人，Clin Chem 2003；49:727-31)。本發明發明者已探究了檢測循環肝源mRNA用於評估肝臟病變之可能性。

許多證據表示，在細胞死亡後釋放循環DNA及RNA(Jahr 等人，Cancer Res 2001；61:1659-65)。由於白蛋白係體內最豐富之蛋白質且係由肝臟合成，故發明者假定ALB mRNA在人類血漿中可檢測且可能係肝臟病變之靈敏標誌物。實際上，先前研究已報導在人類個體之外周全血及外周單核細胞部分中檢測ALB mRNA(Hillaire等人，Gastroenterology 1994；106:239-42；Kar等人，Hepatology 1995；21:403-7；Muller等人，Hepatology 1997；25:896-9；Barbu等人，Hepatology 1997；26:1171-5；Gion等人，Hepatology 1998；28:1663-8；Peck-Radosavljevic等人，Liver Transplant Oncology Group. J Hepatol 1998；28:497-503；Wong等人，Br J Cancer 1997；76:628-33；Wong等人，Cancer Lett 2000；156:141-9；Bastidas-Ramirez等人，Hepatol Res 2002；24:265.11)。然而，該等研究報導，對肝細胞癌(HCC)、硬化、肝炎患者及健康對照之血液ALB mRNA檢測成功率低於100%。而且，最近Kudo等人(J Vet Med Sci 2008；70:993-5)報導，在大鼠中存在血漿ALB mRNA且其濃度與肝損傷相關。

血細胞能「以非常規方式」轉錄已知主要由其他細胞類型表現之基因(Lambrechts等人，Ann Oncol 1998；9:1269-76)，且本發明發明者先前已證實，血細胞係血漿核酸之主要供體(Lui等人，Clin Chem 2002；48:421-7)。因此，發明者第一目的係確定血漿或全血ALB mRNA是否源自肝臟，且第二目的係在確認血漿ALB mRNA之肝臟來源後確定是否可在多種肝臟病變中檢測數量畸變。為達成第一目的，使用先前所述之RNA-單核苷酸多態性(SNP)策略(Lo等人，Nat Med 2007；13:218-23；Chan等人，Clin Chem 2007；53:1874-6)對在肝臟或骨髓移植接受者的循環中發現之ALB mRNA分子進行基因分型，該等移植之提供者的基因型與靶向ALB編碼SNP不同。

II.　一般方法

採用分子生物學領域之常規技術來實踐本發明。揭示本發明中所用一般方法之基本文本包括Sambrook及Russell，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編輯，1994)。

核酸大小表示為千鹼基(kb)或鹼基對(bp)。該等核酸大小係源自瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、源自核酸測序、或源自已公開DNA序列之估計值。蛋白質大小表示為千道爾頓(kDa)或胺基酸殘基數。蛋白質大小係自凝膠電泳、自蛋白質測序、自衍生胺基酸序列、或自已公開蛋白質序列來估計。

可根據(例如)首先由Beaucage及Caruthers(Tetrahedron Lett. 22:1859-1862(1981))闡述之固相亞磷醯胺三酯法使用自動化合成儀以化學方式合成非市售寡核苷酸，如Van Devanter等人，Nucleic Acids Res. 12:6159-6168(1984)中所述。使用任何業內公認策略來實施對寡核苷酸之純化，例如非變性丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換型高效液相層析(HPLC)，如Pearson及Reanier,J. Chrom. 255: 137-149(1983)中所述。

本發明中所用遺傳標誌物之序列或基因組序列(例如白蛋白基因及合成寡核苷酸(例如引物)之聚核苷酸序列)可使用(例如)用於對雙鏈模板進行測序之鏈終止方法(Wallace等人，Gene 16: 21-26(1981))來檢驗。

I II.　血樣之獲得及mRNA之提取

本發明係關於分析白蛋白mRNA在個體血液、尤其無細胞血樣中所發現之量，其作為非侵入性方式來檢測肝臟疾病或病症之存在及/或監測肝臟疾病或病症之進展。因此，實踐本發明之第一步驟係自測試個體獲得血樣並自樣品提取mRNA。

A.血樣之獲得

自欲測試或欲使用本發明方法監測肝臟病況或病症之個體獲得血樣。根據醫院或診所通常遵循之標準方案來實施自個體收集血液。收集適宜量(例如通常介於5-50 ml之間)之外周血且可在進一步製備之前根據標準程序進行儲存。

B.血樣之製備

根據本發明分析在患者血樣中發現之白蛋白mRNA可使用(例如)全血或(更通常)諸如血清或血漿等無細胞樣品來實施。自母血製備血清或血漿之方法為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，可將個體血液置於含有EDTA或諸如Vacutainer SST(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)等專門商業產品之管中以防止血液凝固，且隨後經由離心自全血獲得血漿。另一方面，可使用或不使用血液凝固後離心來獲得血清。若使用離心，則其通常(但並非排他性地)係以適宜速度(例如1500-3000×g)來實施。可對血漿或血清實施另一離心步驟，之後將其轉移至新管中以供RNA提取。自全血製備無細胞樣品之任何其他方法亦適合於本發明目的，只要該方法產生實質上無細胞(例如已移除最初存於全血樣品中之所有細胞之至少90%、95%、98%、或99%或更多)之無細胞血樣即可。

C.RNA之提取及定量

有多種方法可用於自生物樣品提取mRNA。可遵循製備mRNA之一般方法(例如Sambrook及Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版，2001中所述)；亦可使用各種市售試劑或套組自女性測試個體之生物樣品獲得mRNA，例如Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)、Oligotex Direct mRNA套組(Qiagen,Valencia,CA)、RNeasy Mini套組(Qiagen,Hilden,Germany)、及PolyATtract 9600^TM系列(Promega,Madison,WI)。亦可使用一種以上該等方法之組合。

必要的是，應自RNA製劑清除所有污染性DNA。因此，在擴增及純化步驟中應謹慎地操作樣品、使用DNA酶徹底處理，且使用適當的陰性對照。

1.　對mRNA濃度之基於PCR之定量測定

在自樣品提取mRNA後，可對白蛋白mRNA之量進行定量。測定mRNA濃度之較佳方法係藉由(例如)聚合酶鏈式反應(PCR)實施之基於擴增的方法。

在實施擴增步驟之前，必須合成白蛋白mRNA之DNA複本(cDNA)。此係藉由逆轉錄來達成，逆轉錄可作為單獨步驟來實施，或在均相逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)中實施，此反應係聚合酶鏈式反應之修改形式，其用於擴增RNA。適合於核糖核酸之PCR擴增之方法闡述於以下文獻中：Romero及Rotbart，Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications，第401-406頁；Persing等人編輯，Mayo Foundation,Rochester,MN,1993；Egger等人，J. Clin. Microbiol. 33:1442-1447,1995；及美國專利第5,075,212號。

PCR之一般方法為業內所熟知，因此本文中並未詳細闡述。關於PCR方法、方案、及引物設計原理之綜述參見(例如)Innis,等人，PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Academic Press公司，N.Y.,1990。PCR試劑及方案亦可自供應商購得，例如Roche Molecular系統。

PCR最常以自動化製程使用熱穩定酶來實施。在此製程中，使反應混合物之溫度經由變性區、引物退火區、及延伸反應區自動循環。專門適用於此目的之機器係自市場購得。

儘管在本發明實踐中通常使用PCR來擴增靶mRNA。然而，熟習此項技術者應瞭解，母血樣品中該等mRNA物質之擴增可藉由任一已知方法來完成，例如連接酶鏈式反應(LCR)、轉錄介導擴增、及自我持續序列複製或基於核酸序列之擴增(NASBA)，其各自提供充分擴增。亦可使用更晚研發出之分支DNA技術來定量測定mRNA標誌物在母血中之含量。關於用於直接定量臨床樣品中之核酸序列的分支DNA信號放大之綜述參見Nolte,Adv. Clin. Chem. 33:201-235,1998。

2.　其他定量方法

亦可使用熟習此項技術者熟知之其他標準技術來檢測白蛋白mRNA。儘管通常在檢測步驟之前實施擴增步驟，但在本發明方法中不需要擴增。舉例而言，不論是否先實施擴增步驟，均可藉由尺寸分級分離(例如凝膠電泳)來鑒定mRNA。根據熟知技術(例如，參見Sambrook及Russell，前述文獻)在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中操作樣品並用溴化乙啶進行標記後，若存在與標準對照相同尺寸之區帶則表示存在標靶mRNA，隨後可基於區帶強度，與對照組比較其含量。或者，可使用對白蛋白mRNA具有特異性之寡核苷酸探針來檢測該mRNA物質之存在，並基於探針所產生信號之強度來指示mRNA相對於標準對照之量。

序列特異性探針雜交係檢測包含其他種類核酸之特定核酸的熟知方法。在足夠嚴格之雜交條件下，探針僅與實質上互補之序列特異性雜交。可降低雜交條件之嚴格性以容忍不同數量之序列錯配。

業內熟知多種雜交模式，包括(但不限於)溶液相、固相、或混合相雜交分析。以下文獻提供對各種雜交分析模式之概述：Singer等人，Biotechniques 4:230,1986；Haase等人，Methods in Virology，第189-226頁，1984；Wilkinson,In situ Hybridization,Wilkinson編輯，IRL Press,Oxford University Press,Oxford；及Hames及Higgins編輯，Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach,IRL Press,1987。

根據熟知技術來檢測雜交複合體。可藉由若干種通常用於檢測雜交核酸之存在的方法中之任一種來標記能與標靶核酸(即mRNA或擴增DNA)特異性雜交之核酸探針。一種常用之檢測方法係使用經³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P或諸如此類標記之探針來進行放射自顯影。放射性同位素之選擇取決於研究者基於所選同位素之易合成性、穩定性、及半衰期而產生之偏好。其他標記包括與經螢光團、化學發光劑及酶標記之反配體或抗體結合之化合物(例如生物素及地高辛配基(digoxigenin))。或者，探針可直接與諸如螢光團、化學發光劑或酶等標記偶聯。標記之選擇取決於所需靈敏度、與探針偶聯之容易程度、穩定性要求、及可用儀器。

操作本發明所需之探針及引物可使用熟知技術來合成及標記。用作探針及引物之寡核苷酸可根據固相亞磷醯胺三酯法(首先闡述於Beaucage及Caruthers，Tetrahedron Letts.,22:1859-1862,1981中)使用自動化合成儀以化學方式來合成，如Needham-VanDevanter等人，Nucleic Acids Res. 12:6159-6168,1984中所述。寡核苷酸之純化係藉由非變性丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換型HPLC來實施，如Pearson及Regnier,J. Chrom.,255:137-149,1983中所述。

IV. 建立標準對照

為建立用於實踐本發明方法之標準對照，首先選擇未患任何具有常規定義之肝病之健康個體組。該等個體具有用於使用本發明方法針對肝臟病症或疾病(例如硬化、肝纖維化、肝炎及其他肝病)進行篩選及/或監測該等肝臟病症或疾病之目的的適宜參數(若適用)。視需要，該等個體具有相同性別、相似的年齡、或相似的種族背景。

藉由業內公認的常用方法來確認所選個體之健康狀況，該等方法包括(但不限於)對個體之一般體格檢查及對其醫療史之全面審查。

此外，所選健康個體組必須具有適當大小，從而使得可合理地將白蛋白mRNA在得自該組之血液中之含量/濃度視作一般健康人群中正常或平均含量之代表。較佳地，所選組包含至少10個人類個體。

一旦根據所選健康對照組中每一個體之個別數值確立了白蛋白mRNA之平均值，即可將此平均或中值或代表性數值或譜視作標準對照。在該過程期間亦測定標準偏差。在一些情形下，對於單獨定義之具有諸如年齡、性別或種族背景等獨特特徵之組可建立單獨的標準對照。

V.　套組

本發明提供用於實踐本文所述方法之組合物及套組以評估個體中肝臟之生理或病理狀態，其可用於多種目的，例如在患者、尤其沒有任何肝臟損傷、病症或疾病病徵者中檢測或診斷肝病之存在，及監測肝病之進展。

實施分析以測定白蛋白mRNA濃度之套組通常包括至少一種可用於與白蛋白編碼序列或互補序列特異性雜交之寡核苷酸。視需要，此寡核苷酸經可檢測部分標記。在一些情形下，套組可包括至少兩種可用於藉由PCR(尤其RT-PCR)擴增白蛋白mRNA之寡核苷酸引物。

通常，套組亦提供說明手冊來指導使用者分析測試樣品及評估測試個體中肝臟之生理或病理狀態。

實例

僅以說明性而非限制性方式提供以下實例。熟習此項技術者可容易地瞭解多個非關鍵參數，可對該等參數進行改變或修改而獲得基本上相同或相似之結果。

實例1 I.　材料及方法 參與者

在2006年6月與2008年4月之間，自香港威爾斯親王醫院(Prince of Wales Hospital)招募參與者，包括(i)參與內科治療科及臨床腫瘤科治療之患有多種肝臟併發症之患者；(ii)先前在外科接受肝移植(LT)之患者及與其配對之活提供者；(iii)在兒科接受骨髓移植(BMT)之患者；及(iv)健康個體。自機構審查委員會獲得倫理批准，且自所有參與者或負責的監護人獲得知情許可。

將10 mL外周血收集至EDTA管中。亦自BMT患者收集頰黏膜細胞或毛囊細胞。對於彼等已接受屍體LT之參與者，收回死亡提供者之存檔肝臟活檢組織試樣。

樣品收集及處理

在血液收集後立即將樣品保持在4℃下並在4 h內進行處理。在緩慢混合血樣後，混合0.3 mL全血與0.9 mL TRIzol LS試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)。藉由兩次離心方案來收集血漿(Chiu等人，Clin Chem 2001；47:1607-13)。在第一次離心步驟後分離血沉棕黃層且於4℃下以230 g再次離心5 min以移除任何殘留血漿。儲存所有樣品直至實施此章節中所述之核酸提取。

ALB基因分型

以ALB編碼區內之SNP,rs962004為靶。藉由對10個無關個體進行DNA測序，發現SNP具有0.37之較小等位基因頻率。藉由引物延伸反應使用同類MassEXTEND(hME)(Sequenom,San Diego,CA)分析來實施基因分型。各SNP等位基因之延伸產物可顯示獨特質量，其可藉由介質輔助雷射脫附/離子化飛行時間質譜分析來分辨(參見圖5)。SNP分析之細節可參見表3。

使用血沉棕黃層DNA來測定LT接受者及肝臟提供者之基因型。對於屍體LT情形，根據存檔肝臟活檢組織DNA來測定死亡提供者之ALB基因型。對於BMT接受者，自頰黏膜細胞或毛囊細胞DNA來檢測其初始ALB基因型。使用接受者在BMT後之血沉棕黃層DNA來評估骨髓提供者之ALB基因型。藉由對逆轉錄ALB mRNA實施相同基因分型分析來測定移植接受者血漿或全血中之ALB mRNA之基因型。

血漿中ALB mRNA轉錄物之定量

使用一步式逆轉錄-實時定量PCR(RT-qPCR)來量測血漿ALB mRNA濃度。用於ALB mRNA定量的內含子跨越分析設計為可擴增橫跨5'區域中外顯子1及外顯子2之78 bp ALB擴增子(基因庫登錄號NM_000477.3)且序列概述於表4中。藉由對HPLC純化之指定靶向ALB擴增子之單鏈合成DNA寡核苷酸(Sigma-Proligo,Singapore)實施連續稀釋來繪製用於絕對ALB mRNA定量之校正曲線(Wong等人，Clin Chem 2005；51:1786-95)，且濃度在3複本至3×10⁶複本/反應孔之範圍內。藉由ABI Prism 7900序列檢測器(Applied Biosystems,Foster City,CA)及序列檢測軟體2.2版(Applied Biosystems)來監測ALB mRNA之擴增。根據校正曲線計算，中位PCR效率為88.3%(SD：6%，範圍：81.1%-98.8%)，中位斜率為-3.64(SD：0.18，範圍：3.35-3.88)，y軸截距為40.8(SD：1.86，範圍：38.1-43.5)，且相關係數為0.9958(SD：0.0026，範圍：0.9905-0.9986)。ALB mRNA在血漿中之絕對濃度表示為複本/mL。

肝功能評估

由威爾斯親王醫院化學病理學實驗室(香港)使用DPE模塊分析系統(Roche Diagnostics)來實施針對白蛋白、總膽紅素、鹼性磷酸酶、丙胺酸轉胺酶(ALT)及α-胎兒蛋白之血漿分析。如先前所述對患有慢性B型肝炎(CHB)感染之患者血清中之B型肝炎病毒(HBV) DNA進行定量(Chan等人，J Med Virol 2002；68:182-7；Loeb等人，Hepatology 2000；32:626-629)。>10,000複本/mL之濃度可視作存在活性病毒複製之證據(Chan等人，B. J Clin Microbiol 2003；41:4693-5)。

統計分析

使用SPSS 15.0版軟體(SPSS公司，Chicago,IL)來實施統計分析。根據需要藉由Kruskal-Wallis H測試及Dunn's測試來比較患者與對照組之血漿ALB mRNA濃度。藉由斯皮爾曼等級相關(Spearman's rank correlation)來確定血漿ALB mRNA濃度與其他參數之間之聯繫。若p值小於0.05則可視作統計學上顯著且所有概率皆係雙尾檢定值。在樣品血漿ALB mRNA濃度與對應組平均值相差超過3個標準偏差時確定離群值。繪製ROC曲線來測定曲線下面積(AUC)。在最適血漿ALB mRNA濃度截止點計算靈敏度及特異性以區分肝臟併發症患者與健康個體。

樣品收集及製備

為收穫血漿，首先在4℃下以1 600 g將各血樣離心10 min(Centrifuge 581 OR,Eppendorf,German)。將上清液謹慎地轉移至聚丙烯光滑管中並在4℃下以16 000 g再離心10 min(Centrifuge 5417R,Eppendorf)(Chiu等人，Clin Chem 2001；47:1607-13)。然後將血漿轉移至新聚丙烯管中且不攪動下層沉澱。然後將每1.6 mL血漿與4.8 mL TRIzol LS試劑(Invitrogen)混合並儲存在-80℃下直至提取前(Heung等人，Prenat Diagn 2009；29:277-9)。

RNA提取

將各血漿-TRIzol LS混合物解凍並與1.28 mL氯仿混合。藉由在4℃下以12 000 g離心15 min來將RNA裂解物分離為不同相。隨後將水性層謹慎地轉移至新聚丙烯管中。對於RNA沉澱，將一體積700 mL/L乙醇添加至一體積水性層中。將混合物施加至RNeasy Mini套組(Qiagen,Valencia,CA)之離心管柱上並根據製造商方案進行處理。將總RNA洗脫至50 μL無RNA酶水中。根據製造商說明書用擴增級脫氧核糖核酸酶I(Invitrogen)預處理所有RNA樣品且隨後將其儲存在-80℃下直至使用前。

DNA提取

根據需要及製造商推薦用QIAamp Blood Mini套組(Qiagen)或QIAamp DNA Mini套組(Qiagen)對血沉棕黃層、頰黏膜細胞、毛囊細胞及經石蠟處理的肝臟活檢組織實施DNA提取。將所有DNA樣品洗脫至50 μL雙蒸水中且隨後將其儲存在-20℃下直至使用前。

藉由MassARRAY^TM同源性MassEXTEND^TM(hME)分析及隨後的質譜檢測來進行RNA-SNP分析

逆轉錄-在55℃下經1 h藉由禽類熱穩定逆轉錄酶(ThermoScript^TM逆轉錄酶，Invitrogen)用基因特異性引物(Integrated DNA Technologies；參見表3)以0.5 μM終濃度對RNA樣品進行逆轉錄。

PCR擴增-對於逆轉錄cDNA之擴增，各反應含有0.6x HotStar Taq PCR緩衝液及0.9 mM MgCl₂(Qiagen)；各為25 μM之dATP、dGTP、及dCTP；50 μM dUTP(Applied Biosystems)。對於DNA之擴增，各反應含有1×HotStar Taq PCR緩衝液及1.5 mM MgCl₂(Qiagen)；另外1 mM MgCl₂(Qiagen)；各為50 μM之dATP、dGTP及dCTP；100 μM dUTP(Applied Biosystems)。對於所有PCR，正向及反向引物(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA；參見表4)之終濃度為200 nM且HotStar Taq聚合酶(Qiagen)之終濃度為0.5 U。PCR始於在95℃下保持15 min，之後實施在95℃下經20 s變性、在56℃下經30 s退火、在72℃下經1 min延伸之45個循環，且最後在72℃下培育3 min。

鹼基延伸-用0.6 U蝦鹼性磷酸酶(Sequenom)、0.34 μL MassARRAY^TM同源MassEXTEND^TM(hME)緩衝液(Sequenom)、及3.06 μL水對PCR產物實施蝦鹼性磷酸酶(SAP)處理。在37℃下將混合物培育40 min，之後在85℃下培育5 min，從而移除過多dNTP。用hME分析(Sequenom)實施基因分型。對於RNA SNP基因分型，將9 μL含有1.2 μM延伸引物(Integrated DNA Technologies；參見表3)、1.15 U熱測序酶(Sequenom)、及各為64 μM之ddATP、ddCTP及dGTP(Sequenom)之鹼基延伸反應混合液添加至5 μL經SAP處理PCR產物中。對於DNA SNP基因分型，將4 μL含有0.771 μM延伸引物(Integrated DNA Technologies；參見表I)、1.15 U熱測序酶(Sequenom)、及各為64 μM之ddATP、ddCTP及dGTP(Sequenom)之鹼基延伸反應混合液添加至10 μL經SAP處理之PCR產物中。對於RNA-SNP基因分型，反應條件為在94℃下保持2 min，之後實施85個在94℃下保持5 s、在52℃下保持5 s、及在72℃保持下5 s之循環。對於DNA-SNP基因分型，使用75個具有相同熱曲線之循環來進行引物延伸反應。

液體分配及MALDI-TOF MS數據分析-藉由添加12 mg清潔樹脂(Sequenom)及24 μL水來淨化最終鹼基延伸產物。在旋轉器中將混合物混合20 min。在以361 g離心5 min後，藉由MassARRAY奈米分配器S(Sequenom)將10 nL反應溶液分配至SpectroCHIP(Sequenom)上。使用MassARRAY分析儀小型質譜儀(Bruker,Madison,WI)自SpectroCHIP進行數據採集。將質譜數據自動輸入MassARRAY Typer(Sequenom)數據庫中以供分析。

藉由實時定量PCR檢測血漿中之ALB mRNA轉錄物

使用Primer Express v2.0(Applied Biosystems)來設計ALB mRNA的定量分析。正向引物及反向引物分別定位於外顯子1及外顯子2中，且係由Integrated DNA Technologies合成。螢光探針(Applied Biosystems,Foster City,CA)跨越外顯子1與2之間之連接點以防止污染性基因組DNA擴增(參見表4)。實施電腦模擬之特異性篩選及序列比對以確保擴增子對ALB上之靶向位置具有特異性且沒有剪接變體。

根據製造商說明書以25 μL之反應體積來手動設定逆轉錄-定量實時PCR反應(TaqMan EZ RT-PCR Core試劑；目錄號N8080236；Applied Biosystems)。每個反應中各組份之終濃度如下所述：1x EZ緩衝液，3 mM乙酸錳溶液，300 μM dNTP，0.25單位AmpErase尿嘧啶N-轉葡糖基酶，400 μM正向引物，400 μM反向引物，200 μM探針，2.5單位rTth DNA聚合酶且不使用添加劑。對於擴增，將3 μL提取血漿RNA添加至96孔反應板(MicroAmp Optical 96-孔反應板；目錄號N8010560；Applied Biosystems)之各孔中。用於ALB mRNA分析之熱曲線如下所述：反應始於在50℃下保持2 min以使所含尿嘧啶N-轉葡糖基酶發揮作用，之後在60℃下經30 min逆轉錄。在95℃下經5 min變性後，實施45個在94℃下經20 s變性及在58℃下經1 min退火/延伸之PCR循環。一式兩份分析各樣品，且在每次分析時平行運行相應校正曲線。

每個分析中分別包括多個水空白及肝臟組織RNA作為陰性及陽性對照。亦藉由用AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems)取代rTth聚合酶來對樣品進行測試以確保其為DNA陰性。在所有水空白及「No-RT」對照分析中皆未觀察到擴增，表示該分析具有mRNA特異性。藉由凝膠電泳分析來驗證PCR產物之特異性。人們發現ALB分析之檢測限值為3複本/反應孔，此乃因成功檢測出40對孔[總計=80個孔]中98%含有3複本/反應孔，且中值(範圍)閾值循環為38.6(37.8-44.3)。藉由在樣品反應板之20對孔中量測ALB mRNA濃度調節至835複本/mL之樣品來評估ALB mRNA分析之內部分析CV，該濃度定義為藉由ROC分析鑑別肝病患者與健康對照之血漿ALB mRNA濃度之截止值濃度。自多份重複檢測之平均ALB mRNA濃度為855複本/mL，其中SD為85複本/mL且CV為9.97%。

II.　結果 循環中ALB mRNA之來源

為確定血漿及全血中之ALB mRNA是否源自肝臟，實施RNA-SNP分析來對LT及BMT接受者循環中發現之ALB mRNA分子進行基因分型。分析集中於有意義的提供者-接受者對，其定義為提供者之目標ALB SNP之基因型與其相應接受者不同。在肝移植後，若ALB mRNA確實源自肝臟，則應觀察到在接受者循環中發現之ALB mRNA分子具有與提供者一致的基因型。或者，若循環ALB mRNA庫中含有其他組織來源，則接受者之ALB基因型應可檢測。為證實造血細胞可為循環ALB mRNA之污染性來源，對BMT接受者實施類似的RNA-SNP分析。類似地，若造血細胞向循環中貢獻ALB mRNA，則循環ALB mRNA分子可表現骨髓提供者基因型。

研究二十九(29)個LT病例，其中九(9)個接受者自其在世的親屬獲得肝臟，其餘接受者的肝臟來自屍體。該等提供者-接受者對中十五(15)對因提供者與接受者顯示不同ALB基因型而被視為有意義的。表1概述有意義的提供者及接受者之基因分型數據。在有意義的病例中，在移植後於接受者血漿中所檢測到之ALB mRNA基因型與其初始基因型不同且與肝臟提供者之基因型一致。

所招募20個BMT病例中5個係有意義的且基因分型數據概述於表1中。接受者血漿中ALB mRNA之基因型在BMT之前與之後不變。因此，提供者之骨髓並非接受者血漿中ALB mRNA之重要供體。

除血漿外，亦對移植後自有意義的LT及BMT接受者收集之全血中之ALB mRNA實施RNA-SNP分析。十二(12)個有意義的LT病例及四(4)個有意義的BMT病例允許實施此分析且基因分型數據展示於表1中。與血漿數據不同，觀察骨髓提供者(病例B8及B10)及LT接受者(病例L8、L18、L23、L24及L25)對全血ALB mRNA之貢獻。總之，血漿ALB mRNA源自肝臟，而全血中之ALB mRNA沒有肝臟特異性。

對血漿ALB mRNA之定量分析

在確認血漿ALB mRNA具有肝臟特異性後，發明者在得自107個患有各種肝臟併發症之患者及207個健康個體之血漿中評估其濃度。在該等患者中，確認35個患有HCC，25個經活檢證實患有肝硬化，24個患有CHB且血清HBV DNA濃度>10,000複本/mL(即活性病毒複製)，且23個患有CHB血清且HBV DNA濃度<10,000複本/mL(即非活性病毒複製)。所有健康個體經測試皆為HbsAg陰性且肝功能測試參數皆在標準血漿生化測試之參考區間內。

關於參與者之人口統計學、生化測試、病毒學研究及ALB mRNA中值血漿濃度之資訊概述於表2中。在314個參與者之308人(98.1%)中檢測到血漿ALB mRNA，一個患者及五個對照之讀數為陰性。所有組之血漿ALB mRNA之濃度皆展示於圖1中。不同參與者組之血漿ALB mRNA濃度在統計學上顯著不同(P<0.0001，Kruskal-Wallis測試)。亞組分析顯示，患有HCC(P<0.0001)、肝硬化(P=0.0068)及活動性CHB(P<0.0001)之患者的血漿ALB mRNA濃度相對於對照在統計學上顯著提高。對照與非活動性CHB患者之血漿mRNA濃度之間無統計學上顯著之差異(P=0.4239,Dunn's測試)。該等數據進一步證實，非活動性CHB患者之肝臟狀況一般與健康對照相似。

實施ROC曲線分析來評估血漿ALB mRNA濃度是否為肝臟病變之有效指標(圖2)。AUC表示，使用血漿ALB mRNA作為肝臟病變指標之診斷效能為92.9%。藉由使用835複本/mL之血漿ALB mRNA作為截止值，檢測所評估任一肝臟病變之靈敏度及特異性分別為85.5%及92.8%。

血漿ALB mRNA濃度與習用肝功能測試參數之間之聯繫慮及所有研究參與者(患者及對照)之數據，血漿ALB mRNA濃度與血漿總膽紅素(r=0.133,P=0.018,斯皮爾曼相關)、鹼性磷酸酶(r=0.126,P=0.0255)及ALT(r=0.207,P=0.0002；圖3)呈弱相關。

在107個患者中，僅23個(21.5%)患者之ALT濃度升高(>58 IU/L)，同時有62個(73.8%)患者之血漿ALB mRNA濃度>835複本/mL。在35個經肝臟活檢確認之HCC患者中，僅17個(49%)患者之α-胎兒蛋白濃度升高(>20 μg/L)(Sherman等人，Hepatology 1995；22:432-8)。然而，該等患者中有32個(91.4%)血漿ALB mRNA濃度升高，如圖4中所示。

具有正常肝功能之個體之血漿ALB mRNA分析

值得注意的是，在肝病患者中血漿ALB mRNA升高，但其具有正常血漿ALT或AFP濃度。ALT係指示肝細胞損傷之常用生化標誌物。該等數據表示，在肝病檢測中，ALB mRNA比血漿ALT更靈敏。鑒於該等發現，僅對具有正常血漿ALT之個體之數據進行重分析。由此研究中所涉及測試實驗室提供之正常血漿ALT之參考範圍係<58 U/L。

總計291個研究參與者具有正常血漿ALT。此數量佔所有參與者之93%。關於此參與者亞組之人口統計學、生化測試、病毒學研究及ALB mRNA中值血漿濃度之資訊概述於表5中。所有具有正常血漿ALT之組之血漿ALB mRNA濃度展示於圖6中。不同亞組之間血漿ALB mRNA濃度在統計學上顯著不同(P<0.0001,Kruskal-Wallis測試)。其他分析顯示，患有HCC(P<0.0001)、肝硬化(P=0.0094)及活動性CHB(P<0.0001)之患者之血漿ALB mRNA濃度與對照相比在統計學上顯著升高。對照與非活動性CHB患者之血漿mRNA濃度之間無統計學上顯著之差異(P=0.2723，Dunn's測試)。

對此亞組實施ROC曲線分析(圖7)。AUC表示，使用血漿ALB mRNA作為肝臟病變指標之診斷效能為87%。藉由使用835複本/mL之血漿ALB mRNA作為截止值，檢測所評估任一肝臟病變之靈敏度及特異性分別為74%及93%。

此亞組分析進一步證實，甚至在具有正常肝功能測試(例如正常血漿ALT濃度)之個體中，血漿ALB mRNA分析亦係檢測肝臟病變之靈敏標誌物。

升高之血漿ALB mRNA作為未來不良結果之預測因子

進一步研究29個參與上述基因分型研究之LT接受者。除基因分型外，如上所述藉由實時定量PCR來量測血漿ALB mRNA濃度。亦在相同情形下評估血漿ALT濃度。與Cheung等人，Transplantation 2008；85:81-7中所述個體不同，在研究招募時所有患者皆不知道已患有LT後HCC。經最長125週監測參與者之任何需要醫療看護或入院之不良結果。五個參與者未返回威爾斯親王醫院(Hong Kong)進行隨診並自此研究部分中排除。剩餘24個參與者中，9個在隨後某天出現除HCC以外的不良結果，如表6中所示。該9個個體中7個在出現內科併發症之前顯示血漿ALB mRNA濃度升高(>835複本/mL)。該等個體中僅三個在採血時出現血漿ALT濃度升高。該等數據表示，血漿ALB mRNA濃度升高在LT後接受者中係肝臟相關併發症之早期預測因子，其性能優於血漿ALT。該等數據表示，除HCC以外之肝臟相關併發症亦可藉由ALB mRNA濃度升高來預測。在15個未出現肝臟相關併發症之參與者中，僅一人(表6中之病例14)之血漿ALB mRNA濃度>835複本/mL。在彼等出現及未出現肝臟相關併發症之個體中，血漿ALB mRNA升高之個體之比例在統計學上顯著不同(P<0.001,Fisher Exact測試)。該等數據表示，ALB mRNA濃度升高係肝病之相對特異性早期體徵及預測因子。血漿ALB mRNA濃度可指示肝臟併發症之嚴重度，即具有預測價值。

已自先前肝病完全復原之個體中之血漿ALB mRNA濃度

在肝臟併發症後ALB mRNA回到正常濃度表示恢復正常肝功能。所有LT接受者由於導致肝功能嚴重損傷之病況而皆需要LT。因此，藉由LT對其進行治療，其中用健康肝臟來替代初始患病肝臟。對於彼等隨後在LT後階段未出現任何肝臟相關併發症者(表6)，值得注意的是，血漿ALB mRNA濃度與圖1及6中所示之健康對照相當，無統計學上顯著之差異(P=0.686,Mann-Whitney測試)(圖8)。該等數據表示，儘管先前出現肝損傷，但在接受如正常血漿ALT及缺少相關體徵及症狀所顯示具有正常肝功能之肝臟後，血漿ALB mRNA濃度回復至正常程度。類似地，對於如正常肝功能測試及缺少相關體徵及症狀所顯示已自肝損傷復原但未接受LT治療之個體而言，血漿ALB mRNA濃度應正常化。因此，若血漿ALB mRNA濃度在復原後階段升高，其應指示出現復發或另一肝病。

III.　討論

令業內人士興奮的是，有可能研發出經由循環核酸分析來進行疾病診斷及管理之基於血液之工具(Chan等人，Ann Clin Biochem 2003；40:122-30；Anker等人，Int J Cancer 2003；103:149-52；Lo等人，Nat Rev Genet 2007；8:71-7；Lo等人，Lancet 1998；351:1329-30；Lo等人，Clin Chem 2000；46:319-23)。對循環RNA之檢測相對於DNA檢測有某些優勢(Lambrechts等人，Ann Oncol 1998；9:1269-76)。由於細胞類型及疾病之表現譜不同，可利用組織或疾病特異性轉錄物作為疾病評估之標誌物。若選擇特定器官獨有之RNA轉錄物，則RNA方法可能一般更適用於該器官之疾病，且並不限於具有特異性DNA標誌之病例部分。此外，若血漿RNA及DNA二者皆源自相同細胞群，則所釋放RNA可能在數量上比DNA更豐富。此乃因RNA轉錄物端視其表現程度可在各細胞中存在多個複本，而各細胞僅含有DNA之一個二倍體基因組等效物。實際上，某些癌症研究者已報導，對所研究血漿RNA標誌物呈陽性之癌症病例之比例大於對DNA標誌物呈陽性者(Anker等人，Int J Cancer 2003；103:149-52)。

愈來愈多之證據顯示，無細胞核酸自器官或區室釋放至血漿中可能係由於細胞死亡所致(Jahr等人，Cancer Res 2001；61:1659-65；Fournie等人，Cancer Lett 1995；91:221-7；Fournie等人，Gerontology 1993；39:215-21)。肝臟係體內最大器官之一，吾人推測因與正常細胞更新及/或病理性損傷相關之細胞死亡而在外周循環中應可檢測到肝臟所表現RNA(例如ALB)。實際上，研究已報導存在循環ALB mRNA，但成功程度不同(Cheung等人，Transplantation 2008；85:81-7)。某些研究者提出，血液ALB mRNA源自已進入外周循環之惡性或非惡性肝細胞(Hillaire等人，Gastroenterology 1994；106:239-42；Kar等人，Hepatology 1995；21:403-7)。然而，Muller等人(Hepatology 1997；25:896-9)報導，可誘導外周單核細胞表現ALB mRNA。實際上，先前報導表示，由於非常規基因轉錄(Lambrechts等人，Ann Oncol 1998；9:1269-76；Chelly等人，Proc Natl Acad Sci USA 1989；86:2617-21)，某些可在循環中檢測到之假定為器官特異性的轉錄物可能事實上源自其他細胞群，例如造血細胞(Chan等人，Clin Chem 2007；53:1874-6；Heung等人，PLoS One 2009；4:e5858)。

因此，在此研究中，發明者第一目的在於確認在人類血漿及全血中可檢測到之ALB mRNA源自肝臟且具有肝臟特異性。研究ALB編碼SNP之基因型不同的LT或BMT提供者及接受者對且測定血漿及全血中RNA-SNP之基因型。數據證實，在血漿而非全血中檢測到之ALB mRNA具有肝臟特異性。數據亦表示，在全血中檢測到之ALB mRNA庫中可能含有造血細胞表現之ALB mRNA。該等發現要求謹慎地闡釋先前所報導關於全血中之ALB mRNA檢測之數據。對於未來對ALB mRNA作為肝病生物標誌物之研究而言，血漿優於全血。為使殘留血細胞污染血漿中ALB mRNA分子之可能性降至最低，應如先前所報導藉由兩個離心步驟來製備血漿。

然後發明者實施一步式RT-qPCR分析以用於血漿ALB mRNA定量。在吾人之研究中血漿ALB mRNA之檢出率為98.1%。使用兩步式RT-qPCR之最新研究研究血漿ALB mRNA檢測在肝移植接受者中預測HCC復發中之作用，據報導檢出率為82%(Cheung等人，Transplantation 2008；85:81-7)。在上述報導之論述部分中，Cheung等人闡明，其相信血漿ALB mRNA之陽性檢測結果表示存在循環HCC細胞，而LT接受者對血漿ALB mRNA呈陰性表示循環中不存在HCC細胞。然而，來自本研究之數據顯示，可在包括健康對照在內之幾乎所有個體之血漿中檢測到血漿ALB mRNA。該等數據表示，即使循環HCC細胞是血漿ALB mRNA之來源，也並非唯一來源。因此，血漿ALB mRNA更可能係由於任何肝細胞死亡而釋放至血漿中，且可用於檢測多種肝病，並不限於LT後HCC。人們相信，本發明發明者在血漿ALB mRNA檢出率方面之改良可能與一步式RT-qPCR方案之分析靈敏度及其更多地靶向ALB基因之5'末端有關。發明者先前已報導，血漿中之循環mRNA可能並非完整全長轉錄物且顯示5'優勢(Wong等人，Clin Chem 2005；51:1786-95)。

已發現，在患有HCC、硬化及活動性CHB而非非活動性CHB之患者中，血漿ALB mRNA濃度顯著高於對照。該等數據表示，ALB mRNA係因細胞死亡而釋放至血漿中，且可能與細胞死亡程度有關。

藉由ROC曲線分析已發現，血漿ALB mRNA量測係有吸引力之檢測肝臟病變之存在的方式(92.9%)。具體而言，對於HCC組，α-胎兒蛋白僅在48.6%病例中升高，而大部分病例(91.4%)顯示ALB mRNA濃度升高。

儘管具有高診斷靈敏度，但血漿ALB mRNA並非對任何特定病因之肝臟病變具有特異性。然而，血漿ALB mRNA濃度與血清ALT活性濃度具有一定聯繫。亦發現血漿ALB mRNA在具有正常ALT濃度之肝病患者中升高(圖3)。該等觀察結果表示，血漿ALB mRNA係早期慢性肝病檢測之靈敏標誌物，其中ALT活性濃度通常在參考限值內。

總之，本發明發明者之實驗數據揭示，血漿而非全血ALB mRNA源自肝臟且具有肝臟特異性。在多種肝臟病變中觀察到血漿ALB mRNA濃度升高且需要進一步研究來研究其在評估或管理該等疾病中之臨床實用性。

實例2：藉由血漿白蛋白mRNA監測實施之對肝移植後併發症之靈敏檢測

在此研究中，本發明發明者顯示顯著升高之血漿ALB mRNA濃度與慢性肝炎、肝硬化及肝細胞癌(HCC)有關。其數據揭示，血漿ALB mRNA檢測肝臟病變之活性比血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)更靈敏。對肝功能之長期監測及對肝損傷之早期檢測係持續照護患有各種肝臟病變之患者(包括肝移植後接受者)之重要態樣。因此，此研究旨在使用肝移植接受者作為實例來研究血漿ALB mRNA量測在已知先前曾患有肝臟病變之患者的照護中是否可提供任何價值。

I.　材料及方法 參與者

自2006年6月至2009年7月，招募到24個先前曾在威爾斯親王醫院(Hong Kong)外科進行肝移植之患者。通常每三至六個月就會在肝移植診所遇到肝移植後接受者，或若為臨床上指定的診所，則會更頻繁地遇到。在每次就診期間，實施體格檢查、生化檢查及血清學檢查。在此研究中對血漿ALB mRNA之系列分析涉及在三年時間內最多7次自前臂靜脈收集6 mL外周血。自機構審查委員會獲得倫理批准且自各接受者獲得知情許可。

樣品收集及處理

樣品收集及處理方法如先前所述(Chan等人，Clin. Chem. 2010；56:82-9)。簡言之，將收集至含EDTA管中之血液試樣立即保持在4℃下並在4 h內處理。藉由兩次離心方案來收集血漿(Chiu等人，Clin. Chem. 2001；47:1607-13)。血漿RNA之提取方案涉及使用RNeasy Mini套組(Qiagen,Valencia,CA)及TRIzol LS試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)(Heung等人，Prenat. Diagn. 2009；29:277-9)。在50 μL無RNA酶水中洗脫總RNA且根據製造商說明書用擴增級脫氧核糖核酸酶I(Invitrogen)處理，且隨後將其儲存在-80℃下直至使用前。

對 血漿中 ALB mRNA轉錄物之定量

使用一步式逆轉錄定量實時聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)來量測血漿ALB mRNA濃度。簡言之，將用於ALB mRNA定量之內含子跨越分析設計為擴增橫跨5'區域中外顯子1及外顯子2之78 bp ALB擴增子。使用EZ rTth RNA PCR試劑組(Applied Biosystems,Foster City,CA)以25 μL反應體積來設定反應。藉由對高效液相層析純化之指定靶向ALB擴增子之單鏈合成DNA寡核苷酸(Sigma-Proligo,Singapore)實施連續稀釋來繪製用於絕對ALB mRNA定量之校正曲線。此分析之檢測下限係1複本/反應，且線性範圍高達10⁶複本/反應。一式兩份分析各樣品，且在每次分析時平行運行相應校正曲線。藉由ABI Prism 7900序列檢測器(Applied Biosystems)及序列檢測軟體2.2版(Applied Biosystems)來監測對ALB mRNA之擴增。ALB mRNA在血漿中之絕對濃度表示為複本/mL。

對肝功能之評估

由PWH化學病理學實驗室使用DPE模塊分析系統(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)實施對白蛋白、總膽紅素、鹼性磷酸酶(ALP)、丙胺酸轉胺酶(ALT)及α-胎兒蛋白之血漿分析。

統計分析

使用用於Windows 3.5版之SigmaStat軟體(Systat Software公司，Chicago,IL)實施統計分析。連續變量表示為中值及範圍。若適宜藉由Kruskal-Wallis H測試及Mann-Whitney U測試來比較各組之間之血漿ALB mRNA濃度及其他參數。藉由斯皮爾曼等級相關來確定介於血漿ALB mRNA濃度與其他參數之間之聯繫。若p值小於0.05則可視為統計學上顯著且所有概率皆係雙尾檢定值。

II.　結果

研究總計24個肝臟接受者(20個男性及4個女性)，在研究期間至少對其進行3次血液收集以供血漿ALB mRNA量測。在1991至2004年間於PWH實施肝移植。有9例接受活提供者肝移植，同時有15例接受死亡提供者肝移植。肝移植病徵包括HCC(12例)、硬化(7例)、肝功能衰竭(3例)、暴發性B型肝炎(1例)及酒精性肝硬化(1例)。

在此研究中，根據在研究期間是否出現肝臟相關臨床後遺症將24個接受者分為兩組。如穩定臨床狀況及生化肝功能測試曲線所反映具有不顯著病程之14個接受者(12個男性及2個女性)歸類為'穩定'組。另一方面，有證據表示在研究期間單次或多次發作肝臟相關併發症且需要住院或手術管理之10個接受者(8個男性及2個女性)歸類為‘不穩定'組。24個接受者在研究其間皆未出現HCC復發。

在研究招募時之初始分析

在招募時，24個接受者之中值年齡為56.2歲(範圍為17-69歲)，且穩定組與不穩定組之間中值年齡無統計學上顯著之差異(Mann-Whitney U測試，P=0.254)。

基於肝臟病學家之評估及良好的生化肝功能測試曲線，穩定組中所有14個接受者在招募時皆視為在臨床上穩定。對於穩定組，白蛋白、膽紅素、ALP及ALT之中值血漿濃度值分別為44 g/L(40-49)、15 μmol/L(7-38)、82 U/L(59-290)及32 U/L(10-69)。

不穩定組中之10個接受者在招募至研究中時有9個在臨床上穩定。一個例外，即第U07號接受者在招募時經診斷出現酒精性肝硬化復發及輕度慢性排斥反應。不穩定組中白蛋白、膽紅素、ALP及ALT之中值血漿濃度分別為44 g/L(38-45)、19 μmol/L(10-31)、169 U/L(73-379)及53 U/L(24-155)。兩組之間白蛋白(P=0.341)及膽紅素(P=0.538)之血漿濃度無統計學上顯著之差異。然而，不穩定組中之ALP(P=0.015)及ALT(P=0.035)之血漿濃度在統計學上顯著高於穩定組。

在招募時兩組之血漿ALB mRNA濃度展示於圖9中。穩定組之ALB mRNA中值血漿濃度為533複本/mL(69-2,399)，而不穩定組為1,540複本/mL(203-37,524)(P=0.021,Mann-Whitney U測試)。在其先前研究(Chan等人，Clin. Chem. 2010；56:82-9中)，發明者使用接收器操作特徵曲線分析將835複本/mL確定為用於區分健康對照與肝臟病變患者之靈敏特異性截止值。發明者在此研究中採用相同截止值，其發現穩定及不穩定組中分別有21%(3/14)及70%(7/10)之病例之血漿ALB mRNA濃度升高。兩組之間血漿ALB mRNA濃度升高之病例的比例在統計學上顯著不同(卡方(Chi-square)測試P<0.0001)。發明者進一步研究24個接受者中血漿ALB mRNA濃度與生化肝功能測試參數之間之聯繫。血漿ALB mRNA濃度與ALP(斯皮爾曼相關，r²=0.71，P<0.0351)及ALT(r²=0.45,P=0.03)之血漿濃度顯著相關，但與白蛋白(r²=-0.16,P=0.46)或膽紅素(r²=0.15,P=0.5)之血漿濃度不顯著相關。

連續監測血漿 ALB mRNA

經110週之中值持續時間跟蹤24個接受者之臨床病程。穩定組之總研究時間(112週，87-160週)與不穩定組(107週，69-159週)相當，無任何統計學上顯著之差異(P=0.412)。在研究期間，收集105個血液試樣(56個來自穩定組且49個來自不穩定組)用於血漿ALB mRNA分析且皆具有可檢測之血漿ALB mRNA。

具有穩定臨床病程之肝移植後接受者

在穩定組之14個接受者中有12個(86%)在整個研究期間具有不顯著臨床病程。穩定組中白蛋白、膽紅素、ALP及ALT在研究期間實施之所有量測之中值血漿濃度分別為44 g/L(35-49)、15 μmol/L(5-38)、85 U/L(59-290)及28 U/L(10-158)。與招募時所采之第一血樣一致，穩定組中血漿ALB mRNA之中值濃度為418複本/mL(52-15,320)。圖10A係自穩定組實施之所有血漿ALB mRNA量測之圖表。僅25%(14/56)血漿ALB mRNA量測值高於835複本/mL。在將所有來自穩定組之血漿ALB mRNA量測值分型時，第5及第95百分位數值分別為90複本/mL及2,400複本/mL。該12個接受者在所有情形下之生化肝功能測試曲線仍然不顯著。

在14個穩定接受者中，有2個接受者(14%)之生化肝功能測試參數偶然升高，且在未進行干預之情況下迅速回到正常範圍內。在彼等情形下量測之該兩個接受者之血漿ALB mRNA濃度為15,320及2,399複本/mL。而且，該等濃度在隨後就診後分別回到497及1,044複本/mL。相關性分析證實，在研究期間自14個穩定接受者量測之血漿ALB mRNA濃度與ALP(r²=0.41,P=0.002)以及白蛋白(r²=-0.06,P=0.68)、膽紅素(r²=-0.19,P=0.16)、ALT(r²=0.19,P=0.16)之血漿濃度皆不顯著相關。

具有不穩定臨床病程之肝移植後接受者

不穩定組中之10個接受者在研究期間至少一次發作肝臟相關併發症。表7列示不穩定組中之接受者在研究期間出現之肝臟相關併發症。對在整個研究期間獲得之所有量測值進行分型，不穩定組接受者之白蛋白、膽紅素、ALP及ALT之中值血漿濃度分別為40 g/L(16-46)、23 μmol/L(5-250)、150 U/L(46-601)及50 U/L(20-413)。不穩定組之ALB mRNA中值血漿濃度為2,721複本/mL(203-61,694)，其為穩定組(418複本/mL)之6.5倍。與在穩定接受者中觀察到之持續較低之血漿ALB mRNA濃度相反，可在不穩定接受者中觀察到高度波動或甚至持續升高之血漿ALB mRNA濃度，如圖10B中所示。不穩定組中78%(38/49)之血漿ALB mRNA量測值高於835複本/mL。穩定及不穩定組中血漿ALB mRNA濃度升高之量測值的比例在統計學上顯著不同(卡方測試，P<0.0001)。

在不穩定組中之10個接受者中，6個出現急性肝臟併發症(病例U01至U06)且四個出現慢性肝臟併發症(病例U07至U10)。對急性及慢性組血漿ALB mRNA濃度及ALT活性濃度之連續量測分別標繪在圖11及12中。

患有急性肝臟相關併發症之不穩定接受者

診斷出每次肝臟相關併發症發作之時間並標注在圖11及12內之圖表上。在6個有記錄曾患有急性肝臟相關併發症之接受者中，有4個病例在診斷出併發症之前出現血漿ALB mRNA濃度升高(超過835複本/mL之截止值)(圖11)。據記錄，病例U01至U06總計發作九次併發症。在作出診斷時在每次併發症發作期間血漿ALB mRNA濃度皆升高。相反，在九次發作中血漿ALT活性僅在四次發作中升高(>58 U/L)。

患有慢性肝臟相關併發症之不穩定接受者

不穩定組中之4個接受者總計發作五次慢性肝臟相關併發症。在診斷時血漿ALB mRNA濃度升高，但在發現病例U10患有肝膿腫時例外(圖12)。在三次發作之診斷時血漿ALT活性升高。

III.　討論

在此研究中，本發明發明者進一步確認其先前數據，即血漿ALB mRNA係肝臟病變之靈敏標誌物。在此研究中，使用肝移植後接受者作為實例。所招募24個接受者中有23個在臨床上穩定，其具有正常生化肝功能測試曲線且在臨床上判斷在招募時未患內科或外科併發症。在連續監測期間發現，血漿ALB mRNA濃度在對各種併發症作出臨床診斷時升高。在不穩定組中，14次有記錄之併發症發作中有13次與ALB mRNA濃度升高相關。事實上，在大多數發作中，血漿ALB mRNA濃度在作出診斷之前升高。該等數據進一步證實，血漿ALB mRNA係實用於肝臟病變之早期診斷之靈敏標誌物。對於併發症之大多數急性發作而言，血漿ALT活性濃度並未升高。此觀察結果表示，血漿ALB mRNA係比ALT更靈敏之肝臟病變標誌物。

另一方面，血漿ALB mRNA濃度之升高對肝臟病變之出現具有特異性。得自穩定組之大多數量測值低於先前確立之用於檢測肝病之截止值。穩定組中之兩個接受者之血漿ALB mRNA濃度瞬時升高。該等事件可能與在臨床上未確定之瞬時肝臟相關併發症有關。

總之，血漿ALB mRNA濃度上升使得可靈敏且特異性地檢測肝臟病變，甚至在接受者無症狀、血漿ALT活性濃度正常且無併發症之臨床懷疑時亦可檢測。因此，對血漿ALB mRNA濃度之量測可用作篩選肝臟病變及定期監測可能出現肝臟相關併發症之個體之有用方法。由於此項目中所研究之大多數肝移植接受者已自其初始肝病及移植完全復原，發明者在此研究中所得觀察結果可適用於任何無先前肝病史或已自先前肝病發作復原之個體。

實例3：用於檢測脂肪肝病之升高的血漿白蛋白mRNA濃度

脂肪肝病(包括非酒精性脂肪肝病)在許多國家係最常見慢性肝病(Farrell等人，J Gastroenterol Hepatol 2007；22:775-7)。其可進展為硬化及肝癌。非酒精性脂肪肝病與代謝症候群及向心性肥胖密切相關(Wong等人，Clin Gastroenterol Hepatol 2006；4:1154-61)。

可使用超音波掃描來診斷脂肪肝。然而，超音波掃描依賴操作者，且診斷脂肪肝之靈敏度及特異性有限。肝臟活檢及組織學檢查提供脂肪肝及任何相關肝臟炎症或纖維化之決定性證據，但活檢係侵入性程序且可引發諸如出血等急性併發症。隨著技術進步，現在可使用質子磁共振波譜(MRS)作為非侵入性靈敏技術來量測肝臟甘油三酯(IHTG)含量，其係脂肪肝之指標(Szczepaniak等人，Am J Physiol Endocrinol Metab 2005；288:E462-8)。然而，MRS成像很耗時，且需要專門成像設備及訓練有素之熟練操作者。在此研究中，發明者檢查在脂肪肝患者中與健康對照相比血漿ALB mRNA是否升高。

I.　材料及方法

對表面上健康之志願者實施MRS。量測IHTG含量。IHTG含量<5%之個體可視為具有健康肝臟，而彼等IHTG含量>5%者經診斷患有脂肪肝病。此外，研究亦包括藉由肝臟活檢之組織學檢查診斷患有脂肪肝病之個體。自所招募所有個體收集外周血並置於EDTA血液管中。如先前實例中所述藉由雙離心方案來處理血樣以獲得血漿。然後使用先前實例中所述之RT-qPCR分析來量測血漿ALB mRNA濃度。

II.　結果

藉由MRS發現136個志願者之IHTG含量<5%且由此招募其作為正常對照。藉由MRS發現47個個體之IHTG含量>5%且因此診斷為患有脂肪肝病。35個個體經由肝臟活檢之組織學檢查診斷患有脂肪肝病。

患有脂肪肝病之病例的血漿ALB mRNA濃度在統計學上顯著高於對照(Mann-Whitney P<0.001)(圖13)。若將脂肪肝病病例再分為彼等藉由MRS或肝臟活檢所診斷者，則比較亦具有統計學顯著性(實施Kruskal-Wallis測試，之後實施成對比較，三組之間所有成對比較皆為P<0.0001)(圖14)。量測該等患者之血漿ALT且其在大多數病例中未升高(圖15)。甚至在藉由肝臟活檢診斷患有脂肪肝病之組中，亦有46%(16/35)之ALT活性濃度處於參照截止值內。

III.　討論

脂肪肝病可視為肝臟病變之早期階段，其可進展為肝纖維化、肝硬化及甚至HCC。當脂肪肝病患者中血漿ALB mRNA比對照組升高時，此表示血漿ALB mRNA實際上的確係足夠靈敏而可檢測諸如脂肪肝病等早期肝臟病變之標誌物。

藉由肝臟活檢診斷患有脂肪肝病之群組一般患有比彼等藉由MRS診斷出者更晚期之脂肪肝病。此乃因肝臟活檢組中之個體已出現症狀或異常生化肝功能測試參數，才使就診者必需進行肝臟活檢，而MRS組則包括無症狀志願者。數據顯示，藉由肝臟活檢診斷之群組之血漿ALB mRNA濃度在統計學上顯著高於藉由MRS診斷之脂肪肝病病例。此觀察結果表示，血漿ALB mRNA濃度與肝臟病變嚴重度相關，且因此可用作評估疾病階段、預測及治療監測之工具。該等數據進一步顯示，ALT係不如血漿ALB mRNA靈敏之檢測脂肪肝病及其他早期肝臟病變之標誌物。

基於所有所述實例中之所得數據，始終表示血漿ALB mRNA係肝臟病變(涉及肝細胞損傷、死亡或細胞凋亡)之靈敏標誌物。在肝臟病變(涉及肝細胞損傷、死亡或細胞凋亡)中，ALB mRNA在血漿中之濃度高於健康對照。該等肝臟或肝膽病變包括急性病況，例如急性肝炎(包括彼等因毒性或病毒性病因所致者)、缺氧性損傷、膽管炎及急性膽道系統阻塞。該等肝臟或肝膽病變亦包括慢性病況，例如慢性肝炎(包括因B型肝炎或C型肝炎病毒所致者)、脂肪肝病、肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌，但不包括彼等在肝移植後復發者。

本發明之數據顯示，相對於健康對照升高之血漿ALB mRNA量值與肝臟病變嚴重度有關，此乃因其可反映肝細胞損傷、死亡或細胞凋亡之程度。因此，可使用血漿ALB mRNA濃度來預測並監測對所有上文所列示肝臟病變之治療的有效性。

類似地，已顯示血漿ALB mRNA之升高足夠靈敏而可檢測諸如脂肪肝病等早期肝病。所有肝臟病變皆涉及肝細胞損傷、死亡或細胞凋亡。因此，升高之血漿ALB mRNA亦可用作早期檢測肝臟病變之靈敏標誌物，該等肝臟病變為(例如)在B型肝炎病毒攜帶者中進展為活動性肝炎、肝硬化代償失調或進展、早期肝細胞癌，但不包括彼等在肝移植後復發者。

出於所有目的，本申請案中所引用所有專利、專利申請案及其他出版物(包括基因庫登錄號)皆係全文以引用方式併入本文中。

LT，肝移植；BMT，骨髓移植；---，不可得。

病例L25之提供者基因型未知，此乃因患者係在中國大陸接受肝移植。

HCC，肝細胞癌；CHB，慢性B型肝炎。年齡表示為平均值±SD。白蛋白、膽紅素、鹼性磷酸酶(ALP)、丙胺酸轉胺酶(ALT)及血漿ALB mRNA濃度高低表示為中值(範圍)。

NB. SNP基因分型之所有PCR引物皆經設計添加有10鹼基標籤(粗體)以避免在質譜中產生干擾。

NB. FAM係6-羧基螢光素，MGB係次要槽溝黏合劑且NFQ係非螢光性猝滅劑染料。

HCC，肝細胞癌；CHB，慢性B型肝炎。年齡表示為平均值±SD。白蛋白、膽紅素、鹼性磷酸酶(ALP)、丙胺酸轉胺酶(ALT)及血漿ALB mRNA濃度高低表示為中值(範圍)。

大於835複本/mL之血漿ALB mRNA濃度、升高之ALT活性濃度(>58 IU/L)、及不良臨床結果係以粗體字來顯示。

圖1。血漿ALB mRNA濃度之盒形圖。盒形之上下邊線以及穿過盒形之直線分別表示第75及第25百分位數及中值。盒鬚圖帽頂(whisker cap)表示第90及第10百分位數。離群值表示為空心圓。虛線表示藉由ROC分析來檢測肝臟病變所產生之截止值(835複本/mL)。HCC，肝細胞癌；CHB，慢性B型肝炎。

圖2。藉由血漿ALB mRNA定量檢測肝臟病變之接收器操作特徵曲線。

圖3。血漿ALB mRNA與丙胺酸轉胺酶濃度之間之聯繫。HCC，肝細胞癌；CHB，慢性B型肝炎。

圖4。肝細胞癌患者中血漿ALB mRNA與血清α-胎兒蛋白之間之聯繫。虛線框(inset)圍入彼等α-胎兒蛋白(AFP)<20 μg/L且血漿ALB mRNA濃度>835複本/mL之患者。

圖5。所得用於對ALB SNP,rs962004進行基因分型之質譜。SNP等位基因係藉由延伸產物之分子量差異來分辨。標記分別代表未延伸引物、延伸A等位基因及延伸G等位基因之峰的位置。X軸繪示以道爾頓量測之質量，同時y軸繪示以任意單位量測之離子電流強度。可實施hME分析來對DNA及RNA產物二者進行基因分型。上、中、及下圖分別展示A-等位基因為純合，G-等位基因為雜合及G-等位基因為純合之樣品。

圖6。血漿ALT未升高之參與者中血漿ALB mRNA濃度之盒形圖。盒形之上下邊線以及穿過盒形之直線分別表示第75及第25百分位數及中值。盒鬚圖帽頂表示第90及第10百分位數。離群值表示為空心圓。虛線表示藉由ROC分析檢測肝臟病變所產生之截止值(835複本/mL)。HCC，肝細胞癌；CHB，慢性B型肝炎。

圖7。在血漿ALT未升高之個體中藉由血漿ALB mRNA定量檢測肝臟病變之接收器操作特徵曲線。

圖8。在健康對照及血漿ALT未升高之肝移植後接受者中血漿ALB mRNA濃度之盒形圖。盒形之上下邊線以及穿過盒形之直線分別表示第75及第25百分位數及中值。盒鬚圖帽頂表示第90及第10百分位數。離群值表示為空心圓。虛線表示圖1及6中所用檢測肝臟病變之截止值(835複本/mL)。

圖9。展示在招募時穩定及不穩定組之血漿ALB mRNA濃度之盒形圖。盒形之上下邊線以及穿過盒形之直線分別表示第75及第25百分位數及中值。盒鬚圖帽頂表示第90及第10百分位數。離群值表示為空心圓。虛線代表835複本/mL之血漿ALB mRNA截止值程度。

圖10。在整個研究期間取自(A)穩定組及(B)不穩定組中接受者之血樣的血漿ALB mRNA濃度。穩定及不穩定接受者之血漿ALB mRNA濃度分別表示為空心符號與虛線及實心符號與實線。虛線代表835複本/mL之血漿ALB mRNA截止值程度。

圖11。對患有急性肝臟併發症之接受者之血漿ALB mRNA及ALT的連續量測。圖A-F係對不同患者實施連續量測之數據，每個圖代表一位患者。血漿ALB mRNA濃度表示為實心圓及實線，而ALT活性程度表示為空心圓及虛線。虛線代表835複本/mL之血漿ALB mRNA截止值程度。

圖12。對患有慢性肝臟併發症之接受者之血漿ALB mRNA及ALT的連續量測。圖A-D係對不同患者實施連續量測之數據，每個圖代表一位患者。血漿ALB mRNA濃度表示為實心圓及實線，而ALT活性程度表示為空心圓及虛線。虛線代表835複本/mL之血漿ALB mRNA截止值程度。

圖13。患有脂肪肝病之病例與健康對照之血漿ALB mRNA濃度。盒形之上下邊線以及穿過盒形之直線分別表示第75及第25百分位數及中值。盒鬚圖帽頂表示第90及第10百分位數。離群值表示為空心圓。

圖14。藉由肝臟活檢(Bx)或藉由磁共振波譜成像(MRI)診斷出患有脂肪肝病之病例與健康對照之血漿ALB mRNA濃度。盒形之上下邊線以及穿過盒形之直線分別表示第75及第25百分位數及中值。盒鬚圖帽頂表示第90及第10百分位數。離群值表示為空心圓。NAFLD，非酒精性脂肪肝病。

圖15。圖14中所展示個體之血漿ALT活性濃度。虛線表示參照截止值。Bx，活檢；MRI，磁共振波譜成像。NAFLD，非酒精性脂肪肝病。

(無元件符號說明)

Claims (22)

1. 一種檢測肝病之方法，其包含以下步驟：(a)測定取自無肝病病徵之個體之無細胞血樣中之白蛋白mRNA濃度；及(b)與標準對照比較步驟(a)中之白蛋白mRNA濃度，其中該步驟(a)之濃度比該標準對照增加時，表示該個體中存在肝病，其中該肝病係脂肪肝病、肝硬化或肝炎。
2. 如請求項1之方法，其中該個體具有正常丙胺酸胺基轉移酶(ALT)測試結果。
3. 如請求項1之方法，其中該肝炎係B型肝炎。
4. 如請求項1之方法，其中該步驟(a)之白蛋白mRNA濃度實質上與該標準對照相同，表示該個體未患肝病。
5. 如請求項1之方法，其中該血樣係血漿。
6. 如請求項1之方法，其中該血樣係血清。
7. 如請求項1之方法，其中步驟(a)包括擴增該白蛋白mRNA序列。
8. 如請求項7之方法，其中該擴增係藉由聚合酶鏈式反應(PCR)來進行。
9. 如請求項8之方法，其中該PCR係逆轉錄酶(RT)-PCR。
10. 如請求項8之方法，其中該PCR係數位PCR(digital PCR)。
11. 如請求項8之方法，其中該PCR係實時定量PCR(real-time quantitative PCR)。
12. 如請求項1之方法，其中步驟(a)包含質譜或與微陣列雜 交、螢光探針、或分子信標。
13. 如請求項4之方法，其進一步包括以後再使用來自該個體之相同類型的無細胞血樣重複實施步驟(a)，其中該以後測定之白蛋白mRNA濃度比初始步驟(a)增加時，表示出現肝病，若其實質上無變化則表示其生理狀態沒有肝病。
14. 如請求項1之方法，其中相對於該標準對照增加或降低至少1個標準偏差。
15. 如請求項1之方法，其中相對於該標準對照增加或降低至少2個標準偏差。
16. 如請求項1之方法，其中相對於該標準對照增加或降低至少3個標準偏差。
17. 如請求項1之方法，其中該肝病為脂肪肝病。
18. 如請求項1之方法，其中該肝病為肝硬化。
19. 如請求項1之方法，其中該肝病為肝炎。
20. 一種用於在無肝病病徵之個體中診斷肝病之套組，其包含(1)標準對照，其提供健康個體血樣中白蛋白mRNA之平均含量；及(2)兩種寡核苷酸引物，其用於特異性擴增至少一段白蛋白mRNA。
21. 如請求項20之套組，其進一步包含說明手冊。
22. 如請求項20之套組，其進一步包含與白蛋白編碼序列特異性雜交之聚核苷酸探針。