ES2324128A1

ES2324128A1 - Metodo para el diagnostico de carcinoma hepatocelular mediante el empleo de marcadores moleculares.

Info

Publication number: ES2324128A1
Application number: ES200502369A
Authority: ES
Inventors: Fernando Corrales Izquierdo; Enrique Santamaria Martinez; Javier Muñoz Peralta; Jesus Prieto Valtueña; Matias Avila Zaragoza
Original assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Current assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2009-07-30
Also published as: CA2624026A1; JP2009509517A; EP1929307A2; WO2007039550A3; AU2006298765A1; RU2008115312A; WO2007039550A2; CN101313220A; US20090181379A1; BRPI0617560A2

Abstract

Mediante una aproximación proteómica se han identificado los marcadores de carcinoma hepatocelular (HCC) en el hígado de un ratón knockout (MAT1A-/-) para el gen MAT1A (deficiente en la síntesis de S-adenosilmetionina). Se han detectado 27 proteínas cuya expresión se encuentra alterada en, al menos, el 50% de los tumores analizados. De entre ellas, 13 proteínas han sido validadas en biopsias de pacientes con HCC de diferente etiología, y 7 de ellas en biopsias de pacientes con cirrosis hepática, estadío previo al desarrollo de HCC, lo que permite distinguir entre estadíos previos de la enfermedad e incluso entre diferentes etiologías (vírica y alcohólica). El disponer de un panel de marcadores puede contribuir a definir con más precisión las alteraciones asociadas al desarrollo de HCC y con ello facilitar el pronóstico y el diagnóstico de esta enfermedad.

Description

Método para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular mediante el empleo de marcadores moleculares.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona, en general, con el análisis de los cambios existentes en la expresión de genes y proteínas en tejido hepático tumoral procedente de pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC). En particular, la invención se relaciona con un conjunto de genes y proteínas humanas, que se expresan diferencialmente en tejido hepático canceroso procedente de un sujeto que padece HCC en comparación con la expresión de dichos mismos genes y proteínas en tejido hepático sano. Dichos genes y proteínas actúan, por tanto, como marcadores moleculares o biomarcadores de HCC.

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Antecedentes de la invención

El carcinoma hepatocelular (HCC), también llamado hepatoma maligno, es la quinta enfermedad neoplásica de mayor incidencia y la tercera causa de muerte por cáncer con más de 500.000 nuevos casos diagnosticados anualmente. A pesar de que las principales causas de HCC son conocidas, entre ellas, infección por virus de hepatitis B (HBV), o C (HCV), el consumo de alimentos contaminados con aflatoxina, o el consumo abusivo de alcohol, el pronóstico de los pacientes con HCC es malo debido a la agresividad de la lesión en el momento de la diagnosis y a la falta de terapias eficaces.

El HCC es difícil de detectar en estadios tempranos debido a la inespecificidad de los síntomas que presenta, entre los que se incluyen la pérdida de apetito y peso, fiebre, fatiga y debilidad. Las únicas herramientas disponibles actualmente para la detección precoz de HCC son la medición de los niveles séricos de alfa-fetoproteína (AFP) y la ultrasonografía hepática. Sin embargo, los niveles de AFP presentan una sensibilidad y una especificidad baja, por lo que sus aplicaciones como biomarcador son muy limitadas. Por otro lado, la ultrasonografía es dependiente del operador y limitada a la hora de diferenciar HCC de nódulos regenerativos. Métodos adicionales de diagnóstico incluyen métodos de diagnóstico por imagen no radiactivos (rayos X, angiogramas, CT scans, MRIs, etc.), escáner hepático utilizando materiales radiactivos, o biopsias hepáticas. El tratamiento del HCC es, a menudo, muy poco eficiente debido a que su detección se produce demasiado tarde. Entre los métodos de tratamiento se incluye la cirugía, quimioterapia y radioterapia, solas o en combinación.

Por tanto, la mejora del conocimiento sobre la patogénesis molecular del HCC y la identificación de biomarcadores que permitan una diagnosis precoz son de sumo interés y una de las principales prioridades de la hepatología clínica.

El reciente desarrollo de técnicas como la genómica y la proteómica (técnicas que permiten el análisis simultáneo de miles de genes y proteínas) ha dado lugar a la aparición de una serie de biomarcadores de HCC (Lok AS, Marrero J. Newer markers for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology 2004;127:S113-S119; Chen Li, Ye-Xiong Tan, Hu Zhou et al. Proteomic analysis of hepatitis B virus associated hepatocellular carcinoma: Identification of potential tumor markers. Proteomics 2005;5:1125-1139; Beretta L, Chignard N. Proteomics for Hepatocellular Carcinoma Marker Discovery. Gastroenterology 2004;127:S120-S125; Schwegler EE, Cazares L et al. SELDI-TOF MS profiling of serum for detection of the progression of chronic hepatitis C to hepatocellular carcinoma. Hepatology 2005;41:634-42; Yokoyama Y, Kuramitsu Y et al. Proteomic profiling of proteins decreased in hepatocellular carcinoma from patients infected with hepatitis C virus. Proteomics 2004;4:2111-6; Thorgeirsson S et al. Genome-scale profiling of Gene expression in Hepatocellular Carcinoma: Classification, survival prediction and identification of therapeutic targets. Gastroenterology 2004;127:851-855; María W. Smith, Zhaoxia N et al. Identification of novel tumors markers in Hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma. Cancer research 2003;63:859-864; Xin Chen, Siu Tim Cheung et al. Gene expression patterns in human liver cancers. Molecular Biology of the Cell
2002;13:1929-1939).

Mediante el empleo de proteómica diferencial, se ha obtenido un panel de proteínas específicamente alteradas que se proponen como biomarcadores de HCC, y, en ocasiones, se las ha asignado un papel clave en el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, los diferentes repertorios de proteínas identificadas en los distintos estudios tienen poco en común por lo que su valor como biomarcadores de HCC es relativo. Las discrepancias entre los trabajos realizados en los distintos laboratorios podrían tener su origen en diferencias en la metodología empleada así como en la naturaleza o tipo de muestra analizada.

Entre los biomarcadores de HCC identificados en diferentes estudios preclínicos se encuentran los que se recogen a continuación (traducido de Lok AS, Manero J. Newer markers for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology 2004;127:S113-S119).

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A pesar de los diversos estudios realizados para intentar entender las características clínico-patológicas de la enfermedad y mejorar el tratamiento de los pacientes con HCC, los parámetros clínico-patológicos convencionales tienen una capacidad de predicción muy limitada. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar biomarcadores moleculares asociados al HCC. La identificación de dichos biomarcadores moleculares y el estudio de sus efectos funcionales, ayudaría en la prevención y/o tratamiento del HCC así como en la búsqueda y desarrollo de fármacos útiles para el tratamiento, preventivo y/o curativo, de HCC.

Compendio de la invención

Se ha utilizado una aproximación proteómica para la identificación de marcadores de hepatocarcinogénesis en el hígado de un ratón knockout (MAT1A-/-) para el gen MAT1A (deficiente en la síntesis de S-adenosilmetionina). Se han detectado 27 proteínas cuya expresión se encuentra alterada en. al menos. el 50% de los tumores analizados. De entre ellas, 13 proteínas han sido validadas en biopsias de pacientes con HCC de diferente etiología, y 7 de ellas en biopsias de pacientes con cirrosis hepática, estadio previo al desarrollo de HCC. Este estudio ha permitido distinguir entre estadios previos de la enfermedad e incluso entre diferentes etiologías (vírica y alcohólica), por lo que el hecho de presentar un panel de candidatos a biomarcadores puede contribuir a definir con más precisión las alteraciones asociadas al desarrollo de HCC y con ello facilitar el pronóstico y el diagnóstico de esta enfermedad.

Para la identificación de dichos biomarcadores se ha utilizado el ratón MAT1A-/- como sistema de filtrado previo al análisis de muestras humanas. Dicho modelo experimental permite realizar estudios longitudinales desde estadios preneoplásicos y permite identificar proteínas asociadas al proceso de hepatocarcinogénesis, por lo que dicho modelo experimental resulta eficaz en la identificación de marcadores de HCC. El patrón de expresión proteico que ha sido generado en la presente invención proporciona un sistema para el pronóstico más preciso de la enfermedad comparado con los sistemas hasta ahora descritos, tanto de biomarcadores como los basados en criterios histológicos y clínicos.

Ahora se ha encontrado que los niveles de expresión de determinados genes (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT) y proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT) están reducidos en muestras de tejido hepático de pacientes con HCC en comparación con los niveles de expresión de dichos mismos genes y proteínas en muestras de tejido hepático procedentes de sujetos sanos, sin enfermedad hepática (controles). Asimismo, también se ha encontrado que los niveles de expresión de determinados genes (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM) y proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM) están reducidos en muestras de tejido hepático de pacientes con cirrosis, estadio previo al desarrollo de HCC, en comparación con los niveles de expresión de dichos mismos genes y proteínas en muestras de tejido hepático procedentes de sujetos sanos (controles).

Por tanto, la invención se relaciona, en general, con el uso de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT y/o de las correspondientes proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT) como biomarcadores de HCC. La invención también se relaciona con el uso de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, y/o de las correspondientes proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM) como biomarcadores de estadios previos al desarrollo de HCC. Además, la invención se relaciona con métodos y kits para la puesta en práctica de la presente inven-
ción.

En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar HCC en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad, que comprende el empleo de dichos genes (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT) y/o proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT) como biomarcadores de HCC.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para identificar un estadio previo al desarrollo de HCC-en un sujeto que comprende el empleo de dichos genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, y/o proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM) como biomarcadores de estadios previos al desarrollo de HCC.

Aspectos inventivos adicionales se recogen en las reivindicaciones.

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Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un conjunto de fotografías de hígados de distintos ratones que muestran los nódulos tumorales analizados mediante técnicas de proteómica. A) Hígado WT de 18 meses. B) Hígado MAT1A-/- en el que se observan 2 nódulos tumorales de aproximadamente 5 mm de tamaño. C) Hígado MAT1A-/- en el que se observa un nódulo tumoral de 10 mm.

La Figura 2 muestra la heterogeneidad del proteoma tumoral. A) Secciones de geles bidimensionales que ilustran la variabilidad proteómica de los nódulos tumorales analizados. B) Gráfica que ilustra el aumento de variabilidad entre nódulos tumorales de distintos ratones MAT1A-/-. El porcentaje de variabilidad se definió como el porcentaje de diferencias observadas respecto al número total de bandas analizadas. Se realizaron al menos 3 experimentos independientes por grupo.

La Figura 3 muestra la correlación lineal entre el Pm y el pI deducidos a partir de la secuencia de las proteínas identificadas, y la movilidad relativa (RD de las bandas correspondientes calculada a partir de los geles 2D.

La Figura 4 muestra el análisis global de las proteínas diferencialmente expresadas en los nódulos tumorales. Las 151 proteínas identificadas se clasificaron A) según el proceso biológico en el que están implicadas y B) según su localización subcelular. Las columnas indican las proteínas alteradas en cada una de las 6 comparaciones WT vs tumor. Las proteínas cuya expresión disminuye o aumenta se representan en verde y en rojo respectivamente.

La Figura 5 muestra las proteínas asociadas a HCC que disminuyen su expresión en el hígado del ratón MAT1A-/-.

La Figura 6 muestra las proteínas asociadas a HCC. A) Proteínas asociadas a HCC que aumentan su expresión en el hígado del ratón MAT1A-/-. B) Proteínas asociadas a HCC que presentan un comportamiento electroforético anómalo.

La Figura 7 muestra los potenciales biomarcadores de HCC identificados en la presente invención. Se han comparado los niveles de ARNm entre individuos control y pacientes con diferentes enfermedades hepáticas mediante el test estadístico de U de Mann-Whitney. El número de asteriscos hace referencia al nivel de significación alcanzado
(* indica p<0,05; ** indica p<0,01;*** indica p<0,001).

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Descripción detallada de la invención Definiciones

Para facilitar la comprensión de la invención objeto de la presente solicitud de patente, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:

El término "sujeto" se refiere a un miembro de una especie de un animal mamífero, e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.

El término "HCC" se refiere a carcinoma hepatocelular o hematoma maligno.

El término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación.

El término "anticuerpo" se refiere a una proteína con capacidad de unión específica a un "antígeno". El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos que conservan la capacidad de unirse al antígeno, anticuerpos recombinantes, combibodies, etc., tanto humanos o humanizados como de origen no humano.

El término "oligonucleótido iniciador", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica, que es complementaria de una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado. Cada oligonucleótido iniciador hibrida con su secuencia nucleotídica diana y actúa como un sitio de inicio para la polimerización del ADN.

Biomarcadores moleculares de HCC y aplicaciones

Muchas funciones biológicas están acompañadas de la alteración de la expresión de diversos genes mediante un control de la transcripción (e.g., a través del control del inicio, precursores del ARN, procesamiento del ARN) y/o de la traducción. A modo ilustrativo, ciertos procesos biológicos fundamentales, tales como el ciclo celular, la diferenciación celular y la muerte celular, se caracterizan por variaciones en los niveles de expresión de grupos de genes.

Asimismo, cambios en la expresión génica están asociados con la génesis de diversas patologías (patogénesis); por ejemplo, la ausencia de una expresión suficiente de genes supresores de tumores funcionales y/o la sobreexpresión de oncogenes/proto-oncogenes podría conducir hacia tumorigénesis o crecimiento hiperplásico de las células. Por tanto, cambios en la expresión de determinados genes (e.g., oncogenes o supresores de tumores) pueden utilizarse para evaluar la presencia y progresión de diversas patologías.

La monitorización de cambios en la expresión génica también puede proporcionar ciertas ventajas durante el screening y desarrollo de fármacos.

Utilizando una aproximación proteómica para la identificación de marcadores de hepatocarcinogénesis en el hígado de un ratón knockout (MAT1A-/-) para el gen MAT1A, los inventores han detectado 27 proteínas cuya expresión se encuentra alterada en, al menos, el 50% de los tumores analizados. De entre ellas, 13 proteínas han sido validadas en biopsias de pacientes con HCC de diferente etiología, y 7 de ellas en biopsias de pacientes con cirrosis hepática, estadio previo al desarrollo de HCC, lo que permite distinguir entre diferentes estadios de la enfermedad e incluso entre diferentes etiologías (vírica y alcohólica), por lo que puede contribuir a definir con más precisión las alteraciones asociadas al desarrollo de HCC y con ello facilitar el pronóstico y el diagnóstico de esta enfermedad.

La invención proporciona composiciones y métodos para detectar el nivel de expresión de genes y proteínas que pueden ser expresados diferencialmente dependiendo del estado de la célula (e.g., no cancerosa vs cancerosa). Estos perfiles de expresión proporcionan unas herramientas moleculares útiles para, entre otras aplicaciones, diagnosticar la enfermedad (HCC), o para evaluar la predisposición o riesgo de un sujeto a desarrollar dicha enfermedad, el seguimiento de dicha enfermedad, la identificación de fármacos potencialmente útiles para el tratamiento de dicha enfermedad, así como la toxicidad y metabolismo de dichos fármacos. Cambios en el perfil de expresión de dichos genes y/o proteínas en comparación con el nivel de expresión basal de dichos genes y/o proteínas en una muestra de control (valores de referencia, normales o control) pueden ser utilizados como una indicación de tales efectos. Los expertos en la materia pueden usar cualquiera de la variedad de técnicas conocidas para evaluar los niveles de expresión de uno o más de los genes y/o fragmentos de los mismos y/o proteínas identificadas en la presente invención para observar cambios en perfil de expresión en un tejido o muestra de interés.

En un aspecto, la invención identifica unos genes expresados diferencialmente en tejido hepático canceroso (HCC) y no canceroso. En concreto, la presente invención se basa en el descubrimiento de que el nivel de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAHI, AdDHm, OAT y/u OCT y/o de las correspondientes proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT) está reducido en muestras de tejido hepático canceroso procedentes de pacientes diagnosticados de HCC con respecto al nivel de dichos mismos genes y/o proteínas en muestras de tejido hepático de sujetos no diagnosticados de HCC o sin historial clínico de HCC (sujetos control).

Una reducción en los niveles de expresión de dichos genes y/o proteínas entre la muestra de tejido hepático de un sujeto bajo estudio y una muestra de tejido hepático utilizada como control de, al menos, un 5%, ventajosamente, de, al menos, un 10%, preferentemente, de, al menos, un 15%, más preferentemente, de, al menos, un 20%, aún más preferentemente, de, al menos, un 25%, es indicativa de que el sujeto cuya muestra se ha analizado sufre HCC, o tiene un riesgo o predisposición a desarrollar HCC.

Un experto en la materia puede seleccionar uno o más de dichos genes y/o proteínas para ensayar una muestra particular. A modo ilustrativo, se puede seleccionar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 de dichos genes o proteínas para estudiar una muestra de tejido hepático de un sujeto. En una realización particular se seleccionan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 de dichos genes o proteínas. En otra realización particular, se seleccionan los 13 genes o proteínas para estudiar la muestra de tejido hepático del sujeto bajo estudio. La expresión diferencial (reducida frente al control) de dichos 13 genes (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT) constituye una huella genómica de HCC. Asimismo, la expresión diferencial (reducida frente al control) de dichas 13 proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT) constituye una huella proteómica de HCC. La identificación de un panel de marcadores, más que la utilización de marcadores individuales, podría contribuir a realizar un diagnóstico más específico de la patología. Disponer de un panel de marcadores permite, además, evaluar la evolución en el tiempo de los mismos y, de este modo, poder asociar la progresión de la enfermedad (o el estadio de evolución de la misma) con la aparición de determinados marcadores representativos en un momento dado.

En consecuencia, la evaluación y comparación de los niveles de expresión de dichos genes y/o de sus correspondientes proteínas, en una muestra de tejido hepático de un sujeto puede ser utilizada con fines de diagnóstico o de pronóstico de HCC. A modo ilustrativo, un nivel reducido de uno o más de los marcadores de HCC identificados en esta invención en una muestra de tejido hepático de un sujeto respecto a los niveles de los mismos marcadores en muestras biológicas procedentes de sujetos control (es decir, sujetos sin historial clínico de HCC y/o que no presentan HCC) o con valores normales de referencia (obtenidos, en general, a partir de sujetos control) es indicativo de HCC, o de un mayor riesgo o predisposición de un sujeto a desarrollar dicha enfermedad. La comparación de los niveles de dichos marcadores, en un momento dado, en un sujeto, diagnosticado o no de HCC, con los de muestras previas del mismo sujeto puede ser indicativo de la evolución y pronóstico de dicha enfermedad o de la eficacia del tratamiento que se le está administrando (en su caso).

Por tanto, las enseñanzas de la presente invención pueden ser utilizadas, entre otras aplicaciones, en ensayos de diagnóstico o de evaluación del riesgo o predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, en ensayos de pronóstico, en ensayos de monitorización del efecto de la terapia administrada a un sujeto para analizar la eficacia de la terapia y la evolución de la enfermedad, y en ensayos de screening de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de HCC.

La invención proporciona, entre otras cosas, métodos para detectar y cuantificar la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH,. SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, y/o la de sus correspondientes proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT), en una muestra de tejido hepático de un sujeto.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar carcinoma hepatocelular (HCC) en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha patología en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, en adelante método de la invención, que comprende:

a): cuantificar el nivel de expresión de un gen en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, en donde dicho gen se selecciona entre el gen que codifica para la alcohol deshidrogenasa (ADH) [gen ADH], el gen que codifica para la proteína antioxidante 2 (AOP2) [gen AOP2], el gen que codifica para la regucalcina (SMP30) [gen SMP30], el gen que codifica para la proteína transportadora de esterol 2 (NSLT) [gen NSLT], el gen que codifica para la sorbitol deshidrogenasa (SDH) [gen SDH], el gen que codifica para la albúmina (SAP) [gen SAP], el gen que codifica para la fosfoglucomutasa (PGM) [gen PGM], fenilalanina 4-hidroxilasa (P4H) [gen P4H], el gen que codifica para la apolipoproteína Al (APOA1) [gen APOA1], el gen que codifica para la carbónico anhidrasa III (CAIII) [gen CAIII], el gen que codifica para la aldehído deshidrogenasa de clase 2 (AdDHm) [gen AdDHm], ornitina aminotransferasa (OAT) [gen OAT], el gen que codifica para la ornitina carbamoiltransferasa (OCT) [gen OCT], y combinaciones de los mismos; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de HCC;

o, alternativamente,

a): cuantificar el nivel de una proteína en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, en donde dicha proteína se selecciona entre alcohol deshidrogenasa (ADH), proteína antioxidante 2 (AOP2), regucalcina (SMP30), proteína transportadora de esterol 2 (NSLT), sorbitol deshidrogenasa (SDH), albúmina (SAP), fosfoglucomutasa (PGM), fenilalanina 4-hidroxilasa (P4H), apolipoproteína Al (APOA1), carbónico anhidrasa III (CAIII), aldehído deshidrogenasa de clase 2 (AdDHm), ornitina aminotransferasa (OAT), ornitina carbamoiltransferasa (OCT), y combinaciones de las mismas; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de HCC.

El método proporcionado por esta invención presenta una alta sensibilidad y especificidad, y se basa en el hecho de que el tejido hepático (canceroso) de sujetos con diagnóstico de HCC, presentan bajos niveles de ARNm correspondientes a los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, y/o concentraciones disminuidas de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, en comparación con los niveles de dichos genes y/o proteínas en muestras de tejido hepático procedentes de sujetos sanos, sin enfermedad hepática y sin historial clínico de HCC, utilizadas como muestras de control.

Para la puesta en práctica del método de la invención, se obtiene una muestra de tejido hepático del sujeto a estudiar. Dicha muestra puede ser obtenida por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante biopsias de tejido hepático obtenidas por resección quirúrgica. Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos previamente diagnosticados de HCC (pacientes), o bien de sujetos no diagnosticados previamente de HCC, o bien de pacientes diagnosticados de HCC que se encuentren bajo tratamiento, o bien de pacientes diagnosticados de HCC que han sido previamente tratados.

En una realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de expresión de un gen seleccionado entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT, OCT, y combinaciones de los mismos, en una muestra de tejido hepático de un sujeto y comparar dicho nivel con el de una muestra de tejido hepático de control, en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel de los mismos genes en la muestra de control es indicativo de HCC. El método de la invención incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de uno sólo cualquiera de dichos genes, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 genes cualesquiera de dichos genes, e incluso el nivel de dichos 13 genes.

El nivel de expresión de un gen puede ser cuantificado mediante la cuantificación del nivel de ARN mensajero (ARNm) de un gen, resultado de la transcripción de dicho gen, o, alternativamente, del nivel del ADN complementario (ADNc) a dicho ARNm. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener el ARN total, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, o de sus ADNc correspondientes. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm de dichos genes pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, mediante, por ejemplo, hibridación con una sonda apropiada marcada y detección de la señal, o alternativamente, mediante Northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm de interés (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT), mapeo con la nucleasa S1, RT-LCR, hibridación, microarrays, etc. Análogamente, los niveles de los ADNc correspondientes a dichos ARNm de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc; en una realización particular, la amplificación se lleva a cabo de manera cualitativa o cuantitativa, mediante PCR (e.g., PCR cuantitativa, PCR cuantitativa a tiempo real usando un marcador apropiado, etc.) usando oligonucleótidos iniciadores que amplifican específicamente regiones de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT.

En otra realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de una proteína seleccionada entre las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT, OCT, y combinaciones de las mismas, en una muestra de tejido hepático de un sujeto y comparar dicho nivel con el de una muestra de tejido hepático de control, en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel de las mismas proteínas en la muestra de control es indicativo de HCC. El método de la invención incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de una sola de dichas proteínas, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 proteínas cualesquiera de dichas proteínas, e incluso dichas 13 proteínas.

El nivel (concentración) de dichas proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dichas proteínas en una muestra de un sujeto. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener un extracto proteico que contenga dichas proteínas, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales.

Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dichas proteínas pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquimicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dichas proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc.

En una realización particular, la cuantificación de los niveles de ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT se lleva a cabo mediante el empleo de anticuerpos con capacidad para unirse a ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados, por ejemplo, mediante técnicas inmunoquímicas que permitan la cuantificación de la unión antígeno-anticuerpo, por ejemplo, Western blot, ELISA, biochips de proteína, etc.; preferentemente, la cuantificación de los niveles de ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT se lleva a cabo mediante biochips de proteínas o mediante Western blot utilizando los anticuerpos apropiados capaces de unirse a dichas proteínas. Dichos anticuerpos existen en el mercado o pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

El método de la invención también comprende la etapa de comparar los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT y/o los niveles de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, determinados en la muestra de tejido hepático del sujeto objeto de estudio con los niveles de dichos genes y/o proteínas en una muestra de tejido hepático utilizada como control (es decir, con los valores de referencia generalmente obtenidos a partir de sujetos sanos, sin enfermedad hepática). Los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, así como los niveles de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, pueden ser determinados por las técnicas mencionadas previamente en muestras de tejido hepático procedentes, preferentemente, de sujetos sanos, sin enfermedad hepática. Una disminución en los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, o de los niveles de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, en la muestra de tejido hepático del sujeto objeto de estudio respecto a los niveles correspondientes en la muestra de tejido hepático de control es indicativo de HCC.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación y evaluación de la eficacia de los tratamientos de HCC. El método contempla la cuantificación de los niveles de proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT y/o de los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT en un mismo sujeto a lo largo de las distintas fases o etapas de la enfermedad, o durante los periodos de tratamiento y de ausencia del mismo, y su comparación con valores control considerados normales o con valores previos del mismo sujeto. Cuando un agente terapéutico aumente la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, o de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, dicho agente se convierte en un candidato para el tratamiento de HCC.

En una realización particular, la invención se relaciona con un método in vitro para evaluar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con HCC, que comprende (i) cuantificar el nivel de expresión de un gen en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, en donde dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT, OCT y combinaciones de los mismos, y/o el nivel de expresión de una proteína seleccionada entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT, OCT, y combinaciones de las mismas; y (ii) comparar dicho nivel con el de una muestra de tejido hepático del mismo sujeto, antes de la administración de la terapia. En este caso, un incremento en el nivel de expresión de dichos genes y/o proteínas en relación con los niveles anteriores a la administración de la terapia es indicativa de que la terapia administrada al sujeto es eficaz. La cuantificación de los niveles de expresión de dichos genes y/o proteínas, al igual que la comparación de dichos niveles de expresión, puede llevarse a cabo por métodos convencionales tal como se ha descrito previamente en relación con el método de la invención.

Las secuencias nucleotídicas de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT, pueden utilizarse para diseñar oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar fragmentos específicos de dichos genes así como para obtener sondas potencialmente útiles para identificar dichos genes; por tanto, dichas secuencias nucleotídicas de dichos genes, así como dichos oligonucleótidos iniciadores y sondas pueden ser utilizados para diagnosticar in vitro HCC en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC, por ejemplo, para evaluar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.

Asimismo, las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT, o fragmentos de las mismas que comprendan uno o más determinantes antigénicos (epítopos) de dichas proteínas, pueden utilizarse para producir anticuerpos frente a dichas proteínas. Por tanto, dichas proteínas y fragmentos de las mismas, así como dichos anticuerpos con capacidad de unirse a dichas proteínas pueden ser utilizados para diagnosticar in vitro HCC en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC, por ejemplo, para evaluar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un anticuerpo para diagnosticar in vitro HCC en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC, por ejemplo, para evaluar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos de dichas proteínas. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos que conservan la capacidad de unirse a dichas proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT), por ejemplo, fragmentos Fab, scFv, etc., anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano.

Los biomarcadores moleculares identificados en esta invención, tales como los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, y/o las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, pueden ser utilizados en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de HCC.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de HCC que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un nivel reducido de un gen, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si la expresión de dicho gen aumenta, el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de HCC, en donde dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT, OCT y combinaciones de los mismos. Dicho sistema celular puede ser prácticamente cualquier sistema celular en la que uno o más de dichos marcadores estén disminuidos, e.g., líneas celulares transformadas humanas que presentan una disminución en los niveles de dichos marcadores tales como las líneas celulares HepG2, Huh7, etc. La expresión de dichos genes puede ser evaluada por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante la cuantificación de los niveles de ARNm correspondientes a dichos genes o sus ADNc correspondientes, o bien mediante la cuantificación de dichas proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT por cualquiera de los métodos mencionados previamente en relación con el método de la invención. Cuando un compuesto aumente la expresión de ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT u OCT, dicho compuesto se convierte en un candidato potencialmente útil para el tratamiento de HCC. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, y/o de dichas proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de HCC.

Los compuestos que potencian la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, o la actividad de las proteínas ADH; AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, pueden ser utilizados en el tratamiento de HCC. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos compuestos incluyen moduladores positivos de la expresión de dichos genes o de la actividad de dichas proteínas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que potencia la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, o la actividad de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende un modulador positivo de la expresión de dichos genes o un modulador positivo de la actividad de dichas proteínas.

Los excipientes, vehículos y sustancias auxiliares deben ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables y han de poder ser combinados con otros componentes de la formulación y no ejercer ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en cualquier forma de administración apropiada, por ejemplo, en formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral y parenteral (incluyendo, e.g., la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal e intratecal). Las formulaciones pueden ser de una única dosis, y serán preparadas de acuerdo con los métodos clásicos de galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto que potencia la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, o la actividad de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de HCC.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una pareja de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar específicamente un fragmento de ARNm o ADNc de un gen, en el que dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una sonda útil para identificar un gen seleccionado entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT. En una realización particular, la invención proporciona 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 sondas útiles para identificar dichos 13 genes, estando dichas sondas fijadas sobre un soporte sólido, tal como una membrana, un plástico o un vidrio, opcionalmente tratado para facilitar la fijación de dichas sondas al soporte. Dicho soporte sólido que comprende, al menos, una sonda útil para identificar un gen, en el que dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA 1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT, puede ser utilizado en la identificación de los productos de transcripción de dichos genes (o de sus ADNc correspondientes) mediante la tecnología de arrays, y constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho soporte sólido comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 de dichas sondas.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT. En una realización particular, la invención proporciona 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 anticuerpos útiles para identificar dichas 13 proteínas, estando dichos anticuerpos fijados a un soporte sólido, tal como una membrana, un plástico o un vidrio, opcionalmente tratado para facilitar la fijación de dichos anticuerpos al soporte. Dicho soporte sólido que comprende, al menos, un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína e identificarla, en la que dicha proteína se selecciona entre las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT, puede ser utilizado en la identificación de proteínas mediante la tecnología de arrays, y constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho soporte sólido comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 de dichos anticuerpos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit útil para la puesta en práctica de la metodología aquí descrita. Así, dicho kit puede contener los reactivos necesarios para la detección de los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, o de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y/u OCT, entre los que se incluyen:

-: una o más parejas de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar específicamente fragmentos de los ARNm (o de sus correspondientes ADNc) de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT; y/o

-: una o más sondas útiles para identificar uno o más genes seleccionados entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT; y/o

-: uno o más anticuerpos con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, P4H, APOA1, CAIII, AdDHm, OAT y OCT, o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos.

El kit de la invención puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 parejas de oligonucleótidos iniciadores, siendo cada una de ellas específica de uno de dichos genes. Alternativamente, el kit de la invención puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 sondas, siendo cada una de ellas específica para la identificación de uno de dichos genes. En otra realización alternativa, el kit de la invención puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 anticuerpos, teniendo cada uno de ellos capacidad para unirse a una de dichas proteínas.

Dichos reactivos, en particular, las sondas y los anticuerpos, pueden estar fijados sobre un soporte sólido tal como se ha mencionado previamente.

El kit de la invención puede ser utilizado para diagnosticar in vitro HCC, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC, por ejemplo, para evaluar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.

Marcadores de estadíos previos al desarrollo de HCC

Como se ha indicado previamente, la invención también identifica unos genes expresados diferencialmente en tejido hepático cirrótico (es decir, en un estadio previo al desarrollo de HCC) y sano; en concreto, también se ha observado que el nivel de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM y/o de las correspondientes proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM) está reducido en muestras de tejido hepático procedentes de pacientes con cirrosis (estadio previo al desarrollo de HCC) con respecto al nivel de dichos mismos genes y/o proteínas en muestras de tejido hepático de sujetos sanos, sin enfermedad hepática (sujetos control). Una reducción en los niveles de expresión de dichos genes y/o proteínas entre la muestra de tejido hepático de un sujeto bajo estudio y una muestra de tejido hepático utilizada como control de, al menos, un 5%, ventajosamente, de, al menos, un 10%, preferentemente, de, al menos, un 15%, más preferentemente, de, al menos, un 20%, aún más preferentemente, de, al menos, un 25%, es indicativa de que el sujeto bajo estudio padece cirrosis que, con el tiempo, puede evolucionar a HCC.

Un experto en la materia puede seleccionar uno o más de dichos genes y/o proteínas para ensayar una muestra particular. A modo ilustrativo, se puede seleccionar 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 de dichos genes o proteínas para estudiar una muestra de tejido hepático de un sujeto. En una realización particular se seleccionan 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de dichos genes o proteínas. En otra realización particular, se seleccionan los 7 genes o proteínas para estudiar la muestra de tejido hepático del sujeto bajo estudio. La expresión diferencial (reducida frente al control) de dichos 7 genes (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM) constituye una huella genómica de un estadio previo al desarrollo de HCC (cirrosis). Asimismo, la expresión diferencial (reducida frente al control) de dichas 7 proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM) constituye una huella proteómica de un estadio previo al desarrollo de HCC (cirrosis).

En consecuencia, la evaluación y comparación de los niveles de expresión de dichos genes y/o de sus correspondientes proteínas, en una muestra de tejido hepático de un sujeto puede ser utilizada para identificar un estadio previo al desarrollo de HCC y adoptar las medidas oportunas.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para identificar un estadio previo al desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC) en un sujeto, que comprende:

a): cuantificar el nivel de expresión de un gen en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, en donde dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, y combinaciones de los mismos; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de un estadio previo al desarrollo de HCC;

o, alternativamente,

a): cuantificar el nivel de una proteína en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, en donde dicha proteína se selecciona entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, y combinaciones de las mismas; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de un estadio previo al desarrollo de HCC.

Para la puesta en práctica de dicho método, se obtiene una muestra de tejido hepático del sujeto a estudiar, por ejemplo, mediante una biopsia, tal como se ha indicado previamente en relación con el método in vitro para diagnosticar HCC proporcionado por esta invención. Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos con cirrosis.

En una realización particular, el método descrito previamente comprende cuantificar el nivel de expresión de un gen seleccionado entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, y combinaciones de los mismos, en una muestra de tejido hepático de un sujeto y comparar dicho nivel con el de una muestra de tejido hepático de control, en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel de los mismos genes en la muestra de control es indicativo de un estadio previo al desarrollo de HCC. La puesta en práctica de dicho método incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de uno sólo cualquiera de dichos genes, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de 2, 3, 4, 5, ó 6 genes cualesquiera de dichos genes, e incluso el nivel de dichos 7 genes. El nivel de expresión de dicho gen puede ser cuantificado mediante cuantificación del nivel de ARNm de dicho gen, o, alternativamente, del nivel del ADNc a dicho ARNm, tal como se ha mencionado previamente en relación con el método in vitro para diagnosticar HCC proporcionado por esta invención. En una realización particular, el nivel de expresión de ARNm se determina mediante Northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm de interés (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP o PGM), o bien mediante PCR cuantitativa, e.g., PCR cuantitativa a tiempo real, usando oligonucleótidos iniciadores que amplifican específicamente regiones de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP o PGM.

En otra realización particular, el método descrito previamente comprende cuantificar el nivel (concentración) de una proteína seleccionada entre las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM, y combinaciones de las mismas, en una muestra de tejido hepático de un sujeto y comparar dicho nivel con el de una muestra de tejido hepático de control, en donde una disminución en dicho nivel respecto al nivel de las mismas proteínas en la muestra de control es indicativo de un estadio previo al desarrollo de HCC. La puesta en práctica de dicho método incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de una sola de dichas proteínas, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de 2, 3, 4, 5 ó 6 proteínas cualesquiera de dichas proteínas, e incluso dichas 7 proteínas. El nivel de dichas proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional tal como se ha mencionado previamente en relación con el método in vitro para diagnosticar HCC proporcionado por esta invención. En una realización particular, la cuantificación de los niveles de ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM se lleva a cabo mediante el empleo de anticuerpos con capacidad para unirse a dichas proteínas (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados, por ejemplo, mediante técnicas inmunoquímicas que permitan la cuantificación de la unión antígeno-anticuerpo, por ejemplo, Western blot, ELISA, biochips de proteína, etc.

El método descrito previamente también comprende la etapa de comparar los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM y/o los niveles de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, determinados en la muestra de tejido hepático del sujeto objeto de estudio con los niveles de dichos genes y/o proteínas en una muestra de tejido hepático utilizada como control (es decir, con los valores de referencia generalmente obtenidos a partir de sujetos sanos, sin enfermedad hepática). Una disminución en los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, o de los niveles de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, en la muestra de tejido hepático del sujeto objeto de estudio respecto a los niveles correspondientes en la muestra de tejido hepático de control es indicativo de un estadio previo al desarrollo de HCC.

Las secuencias nucleotídicas de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, pueden utilizarse para diseñar oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar fragmentos específicos de dichos genes así como para obtener sondas potencialmente útiles para identificar dichos genes; por tanto, dichas secuencias nucleotídicas de dichos genes, así como dichos oligonucleótidos iniciadores y sondas pueden ser utilizados para identificar in vitro un estadio previo al desarrollo de HCC en un sujeto.

Asimismo, las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, o fragmentos de las mismas que comprendan uno o más determinantes antigénicos (epítopos) de dichas proteínas, pueden utilizarse para producir anticuerpos frente a dichas proteínas. Por tanto, dichas proteínas y fragmentos de las mismas, así como dichos anticuerpos con capacidad de unirse a dichas proteínas pueden ser utilizados para identificar in vitro un estadio previo al desarrollo de HCC en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un anticuerpo para identificar in vitro un estadio previo al desarrollo de HCC en un sujeto, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM, o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos de dichas proteínas. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonal es, anticuerpos poli clonal es, intactos, o fragmentos de ellos que conservan la capacidad de unirse a dichas proteínas (ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP o PGM), por ejemplo, fragmentos Fab, scFv, etc., anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano.

Los biomarcadores moleculares identificados, tales como los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, y/o las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, pueden ser utilizados en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de estadios previos al desarrollo de HCC en un sujeto.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de estadios previos al desarrollo de HCC que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un nivel reducido de un gen, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si la expresión de dicho gen aumenta, el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de un estadio previo al desarrollo de HCC, en donde dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP, PGM y combinaciones de los mismos. Dicho sistema celular puede ser prácticamente cualquier sistema celular en la que uno o más de dichos marcadores estén disminuidos, e.g., líneas celulares transformadas humanas que presentan una disminución en los niveles de dichos marcadores. La expresión de dichos genes puede ser evaluada por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante la cuantificación de los niveles de ARNm correspondientes a dichos genes o sus ADNc correspondientes, o bien mediante la cuantificación de dichas proteínas por cualquiera de los métodos mencionados previamente. Cuando un compuesto aumente la expresión de ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, dicho compuesto se convierte en un candidato potencialmente útil para el tratamiento de estadios previos al desarrollo de HCC.

Consecuentemente, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, y/o de dichas proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de estadios previos al desarrollo de HCC.

Los compuestos que potencian la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, o la actividad de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, pueden ser utilizados en el tratamiento de estadios previos al desarrollo de HCC. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos compuestos incluyen moduladores positivos de la expresión de dichos genes o de la actividad de dichas proteínas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que potencia la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, o la actividad de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende un modulador positivo de la expresión de dichos genes o un modulador positivo de la actividad de dichas proteínas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto que potencia la expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, o la actividad de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de estadios previos al desarrollo de HCC.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una pareja de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar específicamente un fragmento de ARNm o ADNc de un gen, en el que dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una sonda útil para identificar un gen seleccionado entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM. En una realización particular, la invención proporciona 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 sondas útiles para identificar dichos 7 genes, estando dichas sondas fijadas sobre un soporte sólido, tal como una membrana, un plástico o un vidrio, opcionalmente tratado para facilitar la fijación de dichas sondas al soporte. Dicho soporte sólido que comprende, al menos, una sonda útil para identificar un gen, en el que dicho gen se selecciona entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, puede ser utilizado en la identificación de los productos de transcripción de dichos genes (o de sus ADNc correspondientes) mediante la tecnología de arrays, y constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho soporte sólido comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 de dichas sondas.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM. En una realización particular, la invención proporciona 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 anticuerpos útiles para identificar dichas 7 proteínas, estando dichos anticuerpos fijados a un soporte sólido, tal como una membrana, un plástico o un vidrio, opcionalmente tratado para facilitar la fijación de dichos anticuerpos al soporte. Dicho soporte sólido que comprende, al menos, un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína e identificarla, en la que dicha proteína se selecciona entre las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM, puede ser utilizado en la identificación de proteínas mediante la tecnología de arrays, y constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho soporte sólido comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 de dichos anticuerpos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit útil para la puesta en práctica de un método in vitro para identificar un estadio previo al desarrollo de HCC previamente descrito. Dicho kit puede contener los reactivos necesarios para la detección de los niveles de expresión de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, o de las proteínas ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y/o PGM, entre los que se incluyen:

-: una o más parejas de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar específicamente fragmentos de los ARNm (o de sus correspondientes ADNc) de los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP o PGM; y/o

-: una o más sondas útiles para identificar uno o más genes seleccionados entre los genes ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM; y/o

-: uno o más anticuerpos con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre ADH, AOP2, SMP30, NSLT, SDH, SAP y PGM, o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos.

El kit de la invención puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 parejas de oligonucleótidos iniciadores, siendo cada una de ellas específica de uno de dichos genes. Alternativamente, el kit de la invención puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 sondas, siendo cada una de ellas específica para la identificación de uno de dichos genes. En otra realización alternativa, el kit de la invención puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 anticuerpos, teniendo cada uno de ellos capacidad para unirse a una de dichas proteínas, o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos.

El siguiente ejemplo ilustra la invención aunque no debe ser considerado en sentido limitativo de la misma.

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Ejemplo I

Material y métodos Animales de experimentación

Se han utilizado ratones MAT1A-/- criados en nuestra propia colonia y desarrollados en nuestro laboratorio (Lu SC, Alvarez L, Huang ZZ, Chen L, An W, Corrales FJ, Avila MA, Kane] G, Mato JM. Methionine adenosyltransferase 1 A knockout mice are predisposed to liver injury and exhibit increased expression of genes involved in proliferation. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5560-65). Tras el sacrificio y extracción del hígado de los ratones Wild-type (WT) y MAT1A-/-, se han medido el tamaño de los tumores presentes en el hígado MAT1A-/-. Las muestras hepáticas se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaron a -80ºC. Todos los procedimientos experimentales realizados, se han llevado a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Navarra para el uso y el trabajo con animales de experimentación.

Pacientes

Se han obtenido muestras hepáticas de varios grupos:

a) Muestras de individuos control (n=10). Las muestras del grupo control, se han obtenido de pacientes a los que se les ha realizado una colecistectomía para el tratamiento de una colelitiasis asintomática que han dado su consentimiento para que se les hiciera una biopsia hepática. Estos pacientes han presentado una histología hepática normal y sus funciones hepáticas han sido normales.

b) Muestras de pacientes que presentan cirrosis alcohólica (n=5).

c) Pacientes que presentan cirrosis viral (n=5).

d) Pacientes con HCC de diferente etiología (n=10).

e) Muestras hepáticas de la zona no tumoral de pacientes con HCC procedente de hígado sano (n=7).

f) Muestras hepáticas de la zona no tumoral de pacientes con HCC de diferente etiología: 3 procedentes de Hepatitis C y 5 procedente de cirrosis vírica (n=8).

Las muestras patológicas se han obtenido durante alguna intervención o en el momento de realizar el transplante hepático.

Todos los tejidos se han congelado inmediatamente en nitrógeno líquido para, posteriormente, realizar extracción de ARN. Este estudio ha sido aprobado por el comité de investigación de la Universidad de Navarra. Los estudios realizados han sido realizados de acuerdo con los estándar éticos formulados en la Declaración de Helsinki de 1975 (revisada en 1983).

Análisis proteómico

La caracterización del proteoma hepático y las alteraciones asociadas al modelo experimental, se realizaron combinando la resolución de la mezcla de proteínas de las muestras biológicas mediante electroforesis bidimensional y la posterior identificación de las proteínas de interés por espectrometría de masas de acuerdo con la aproximación proteómica que se recoge en el siguiente esquema:

A): FASE PREPARATIVA

: Homogeneización/Solubilización de las proteínas

: Isoelectroenfoque (1ªD)

: Reducción/alquilación

: SDS-PAGE (2ªD)

: Tinción/distinción

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B): FASE PREPARATIVA

: Análisis de imagen

: Escisión de las bandas diferenciales

: Digestión enzimática

: Identificación mediante Espectrometría de Masas (EM)

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Se homogeneizaron piezas de tejido hepático tanto de ratones WT como de ratones MAT1A-/- de 50 mg en 20 volúmenes de tampón de lisis cuya composición era: urea 7 M, tiourea 2 M, 4% (v/v) de 3-[(3-cloramidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 1% (v/v) de ditiotreitol (DTT) y 0,5% de anfólitos 3-10 (BioRad). Los extractos se centrifugaron a 100.000 x g durante 1 hora a 15ºC. Se determinó la concentración de proteína en los sobrenadantes obtenidos mediante el método de Bradford (BioRad) utilizando como patrón albúmina bovina.

La 1ª dimensión se llevó a cabo en fuentes de isoelectroenfoque (Protean IEF cell de BioRad) utilizando geles de 17 cm (ReadyStrips IPG strips de BioRad) con distintos rangos de pH. La muestra (150-1.000 \mug) se cargó mediante un proceso de rehidratación activa durante 12 horas a 50 V y a 20ºC. Tras la rehidratación, los geles se sometieron a un aumento progresivo del voltaje hasta alcanzar los 60.000 V x hora utilizando el protocolo aconsejado por el fabricante. Las tiras se equilibraron en un tampón cuya composición era: Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, urea 6 M, 30% (v/v) de glicerol, 2% (v/v) de dodecilsulfato sódico (SDS), 2% (v/v) de DTT y trazas de azul de bromofenol y después se incubaron en el mismo tampón conteniendo 2,5% de iodoacetamida en ausencia de DTT. Las tiras se colocaron directamente en geles de poliacrilamida al 12,5% (18 cm x 20 cm x 1 mm) y se sellaron con agarosa de bajo punto de fusión al 1% para fijar su posición. Los geles SDS-PAGE (2ª dimensión) se corrieron durante 14 horas a 90 V y se tiñeron con Coomassie We Stain (Invitrogen). Alternativamente, se utilizaron tinción de plata (Amersham Biosciences) y tinción fluorescente Sypro Ruby (BioRad). Los geles teñidos con Coomassie o con plata, se digitalizaron en un densitómetro calibrado GS-800 (Bio-Rad). Los geles teñidos con fluorescencia se escanearon con el densitómetro Molecular Imager FX (Bio-Rad). Las imágenes obtenidas, se analizaron con el software PDQuest 7.1 de BioRad. Sólo se aceptaron como válidas aquellas diferencias cuya variación en niveles de expresión eran superiores a 3 veces y que se confirmaban en al menos 3 experimentos independientes. Todas las muestras se procesaron por duplicado. Las bandas correspondientes a las proteínas diferencialmente expresadas se extrajeron manualmente del gel y se procesaron automáticamente en un robot (MassPrep station de Micromass). Las bandas de interés teñidas con Coomassie o con fluorescencia se destiñeron con bicarbonato amónico 50 mM y 50% (v/v) de acetonitrilo, mientras que las bandas teñidas con plata, se destiñeron con ferricianuro de potasio 15 mM y tiosulfato sódico 50 mM. Las proteínas fueron reducidas con DTT 10 mM en bicarbonato sódico 100 mM y alquiladas con iodoacetamida 55 mM en el mismo tampón. Posteriormente, la digestión se realizó con 6 ng/\mul de tripsina en bicarbonato amónico 50 mM durante 5 horas a 37ºC. Alternativamente, se utilizó el procedimiento desarrollado por Sigma. El hidrolizado peptídico obtenido, se extrajo con 1% (v/v) de ácido fórmico y 2% (v/v) de acetonitrilo. A continuación, se mezclaron 1,2 \mul de cada digerido con 1,2 \mul de una solución saturada de ácido \alpha-ciano-4-hidroxi-transcinamínico en 0,1% de ácido trifluoroacético y 50% (v/v) de acetonitrilo. Las mezclas se depositaron en placas compatibles con espectrometría de masas MALDI-TOF. Los digeridos se analizaron mediante espectrometría de masas utilizando el espectrómetro MALDI-TOF GL-REF de Waters. La secuenciación y caracterización de los péptidos se realizó en un espectrómetro Q-TOF micro de Waters. La nano-cromatografía líquida se realizó con un sistema CapLC^{TM} de Waters. La separación del digerido tríptico mediante cromatografía en fase reversa se realizó en una columna Atlantis C-18, 3 \mum, 75 \mum x 10 cm, Nano Ease^{TM} de Waters. La columna se equilibró en 5% de acetonitrilo y 0,2% de ácido fórmico. Tras la inyección de 6 \mul de muestra, la columna se lavó durante 5 minutos con el mismo tampón, y los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de 5-50% de acetonitrilo en 30 minutos con un flujo constante de 0,2 \mul/min. La columna se conectó al espectrómetro de masas utilizando una fuente de ionización nano-electroespray PicoTip (Waters). La temperatura capilar fue de 80ºC y el voltaje de 1,8-2,2 Kv. Los datos de fragmentación obtenidos se recogieron de modo automático utilizando el programa establecido. Los 3 iones más intensos de cada tiempo de retención fueron fragmentados por colisión inducida (CID) con una ventana de 2,5 y una energía de colisión relativa del 35%. Los datos de espectrometría de masas se procesaron con el software Masslynx 4.0 (Waters). Para la identificación de las proteínas, se utilizó el software Proteinlynx Global Server 2.0 (Waters). Las bases de datos empleadas para las búsquedas fueron SwissProt (Swiss-Prot Release 46.3 con 176.469 entradas) y Ensembl (Ensembl Mouse Release 29.33 con 31535 entradas). Finalmente, la clasificación e interpretación funcional de las proteínas identificadas se realizó con el software GARBAN (Luis A, Martinez-Cruz, Angel rubio, María L. Martinez-Chantar, Alberto Labarga, Isabel Barrio, Adam Podhorski, Victor segura, José 1. Sevilla Campo, Matías A. Avila and Jose M. Mato. GARBAN: A new tool for Genomic Analysis and Rapid Biological Annotation of cDNA microarray and proteomic data. Bioinformatics 2003;19:2158-60).

Aislamiento de ARN, RT-PCR y PCR a tiempo real

En la extracción de ARN presente en las muestras humanas se ha utilizado el reactivo TRI de Sigma. El ARN (2 \mug) se ha tratado con DNAsa I (Invitrogen) antes de realizar la transcripción reversa con la Transcriptasa Reversa M-MLV (Invitrogen) en presencia de RNAse OUT (Invitrogen). Todos los oligonucleótidos iniciadores utilizados se han diseñado para distinguir entre la amplificación del ADN genómico y del ADNc. Todos los productos de PCR se han secuenciado para confirmar la especificidad. La PCR a tiempo real se ha realizado con 1/20 de la reacción de RT utilizando un iCycler (Bio-Rad) y la mezcla iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Los oligonucleótidos iniciadores utilizados han sido:

Ornitina aminotransferasa: 5'-TGTGTCTGCAGTGCTGTGTG-3' [SEQ ID NO: 1] y 5'-AGACACACCTTC
CAAGCATC-3' [SEQ ID NO: 2];

Malato deshidrogenasa: 5'-GGAGCAGCTGGTCAAATTGC-3' [SEQ ID NO: 3] y 5'-TCCATGCCTTCCCTTC
TTGG-3 ' [SEQ ID NO: 4];

Proteína Antioxidante 2: 5'-CAACTTTGAGGCCAATACCAC-3' [SEQ ID NO: 5] y 5'-TCCTTGCTCCAGG
CAAGATG-3' [SEQ ID NO: 6];

Aldehído deshidrogenasa mitochondrial: 5'-GAGCAGCAACCTCAAGAGAG-3' [SEQ ID NO: 7] y 5'-CGAG
GATCTTCTTAAACTGAG-3' [SEQ ID NO: 8];

Glicina N-metiltransferasa: 5'-GCTGGTGGAAGAGGGCTTC-3' [SEQ ID NO: 9] y 5'-CCTTTGCAGTCTGG
CAAGTG-3 ' [SEQ ID NO: 10];

Sorbitol deshidrogenasa: 5'-ATCTTCTTCTGTGCCACGCC-3' [SEQ ID NO: 11] y 5'-GCTCCCATTGCTTTGG
CCAC-3 ' [SEQ ID NO: 12];

Apolipoproteína E: 5'-GTTGCTGGTCACATTCCTGG-3' [SEQ ID NO: 13] y 5'-TAGGCCTTCAACTCCTT
CATG-3' [SEQ ID NO: 14];

Albúmina sérica: 5'-ATGCCTGCTGACTTGCCTTC-3' [SEQ ID NO: 15] y 5'-CTGAGGCTCTTCCACAAGA
G-3' [SEQ ID NO: 16];

Apolipoproteína A1: 5'-GACAGCGGCAGAGACTATG-3' [SEQ ID NO: 17] y 5'-CCACCTTCTGGCGGTA
GAG-3' [SEQ ID NO: 18];

Glutatión S transferasa P2: 5'-AGTTCCAGGACGGAGACCTC-3' [SEQ ID NO: 19] y 5 '-CAGGGTCTCAAAA
GGCTTCAG-3 ' [SEQ ID NO: 20];

Metionina adenosiltransferasa I: 5'-AGTCATCCCTGTGCGCATC-3' [SEQ ID NO: 21] y 5'-GGTCCACCTTGG
TGTAGTC-3' [SEQ ID NO: 22];

Anhidrasa carbónica III: 5'-TCCTGACCACTGGCATGAAC-3' [SEQ ID NO: 23] y 5 '-TGCTCAGAGCCAT
GATCATC-3 ' [SEQ ID NO: 24];

Proteína disulfuro isomerasa: 5'-TCTCCAAATACCAGCTCGAC-3' [SEQ ID NO: 25] y 5'-CAGGATCTTGCCC
TTGAAGC-3' [SEQ ID NO: 26];

Adenosilhomocisteinasa: 5'-GTCCAGCTGCAACATCTTCTC-3' [SEQ ID NO: 27] y 5'-CAGTCGTGGTCTCC
TCAGAG-3' [SEQ ID NO: 28];

Proteína de choque térmico de 71 kDa: 5'-GATGAAGGAAATTGCAGAAGC-3' [SEQ ID NO: 29] y 5'-CAA
TAGTGAGGATTGACACATC-3' [SEQ ID NO: 30];

Proteína de transferencia de lípidos no específica: 5'-TGGCTCTTGGGTTTGAGAAG-3' [SEQ ID NO: 31] y
5'-CATCTTGGAACTGGGAATACG-3' [SEQ ID NO: 32];

Fenilalanina 4-hidroxilasa: 5'-GGTGCCACTGTCCATGAGC-3' [SEQ ID NO: 33] y 5'-GGCGGTAGTTG
TAGGCAATG-3' [SEQ ID NO: 34];

Alcohol deshidrogenasa: 5'-GATGCCTCTGATTGGTCTGG-3' [SEQ ID NO: 35] y 5'-CTTGGATGTCACAAA
CAGCTC-3' [SEQ ID NO: 36];

Arginasa 1: 5'-CAGGATTCTCCTGGGTGAC-3' [SEQ ID NO: 37] y 5'-GATGTAGAGACCTTCTCTG-3' [SEQ ID NO: 38];

Proteínas de unión a selenio: 5'-CTTCAGCAACTGGCTTGCATG-3' [SEQ ID NO: 39] y 5'-GCTGAGCTG
GATCATCTGAG-3' [SEQ ID NO: 40];

Glutamina sintasa: 5'-AGCCCAAGTGTGTGGAAGAG-3' [SEQ ID NO: 41] y 5'-TGCTGGTTGCTCACCATG
TC-3' [SEQ ID NO: 42];

Fosfoglucomutasa: 5'-AAGAAGATCCTCTGTGAAGAAC-3' [SEQ ID NO: 43] y 5'-GAATGCTGAAGATGTT
GGCAG-3' [SEQ ID NO: 44];

Proteína marcadora de senescencia 30: 5'-TCAATGATGGGAAGGTGGATC-3' [SEQ ID NO: 45] y 5'-AGGT
CATAGTCAAAGGCATCC-3' [SEQ ID NO: 46];

Ornitina carbamoiltransferasa: 5'-GGAACAATATCCTGCACTCC-3' [SEQ ID NO: 47] y 5'-CTGTAATTAATA
CATTGCCTCC-3' [SEQ ID NO: 48];

Glutatión S-transferasa Mu1: 5'-CCTGGAATACACAGACTCAAG-3' [SEQ ID NO: 49] y 5'-TCTTCTCCTCT
TCTGTCTCC-3' [SEQ ID NO: 50].

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La especificidad de los productos de PCR se ha analizado mediante curvas de desnaturalización y electroforesis. La cantidad de transcritos se ha calculado y expresado como la diferencia relativa respecto al gen control de la Histona H3F3A (2^{\Delta Ct}, donde \DeltaCt representa la diferencia en número de ciclos entre el gen diana y el gen control) tal y como se ha descrito anteriormente (K.J. Livak, T.D. Schmittgen. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^{\Delta CT} method. Methods 2001;25:402-408). Como control positivo de la reacción, se ha utilizado una mezcla de ARN procedente de 5 individuos control y como control negativo agua milliQ.

Análisis bioestadístico

Para comparar los niveles de ARNm entre individuos control y pacientes con enfermedad hepática, el test estadístico aplicado fue el test de U de Mann-Whitney con un valor de significación de p<0,05.

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Resultados 1.1 Perfil proteómico de HCC en el hígado del ratón MAT1A-/-

El 100% de los ratones MAT1A-/- desarrollan HCC a la edad de 18 meses. Los hepatocitos transformados se caracterizan por presentar un núcleo oval y un nucleolo prominente. Estos hepatocitos forman cordones trabeculares revestidos por células endoteliales. El análisis macroscópico de los nódulos tumorales presentes en distintos ratones MAT1A-/- reveló heterogeneidad en el tamaño de los mismos (Figura 1).

La homogeneidad del proteoma que se observó en cada uno de los grupos analizados, es uno de los parámetros clave en estudios de proteómica diferencial. En este estudio, la variabilidad (definida como el porcentaje de bandas diferenciales respecto al número total de bandas analizadas) medida entre hígados de ratones WT, fue del 1% (p<0,01). Sin embargo, al comparar nódulos tumorales de un mismo hígado MAT1A-/-, la variabilidad del proteoma alcanzó el 3% (p<0,01) en lesiones de más de 10 mm y aumentó hasta el 10% cuando se compararon nódulos de diferentes ratones, independientemente del tamaño del tumor (p<0,05). Estos datos sugieren que el crecimiento tumoral así como factores individuo-específicos pueden contribuir a la inestabilidad del proteoma tras la transformación neoplásica (Figura 2).

Para definir cambios en el proteoma hepático asociados a la hepato-carcinogénesis, se analizaron muestras de hígado procedentes de ratones MAT1A-/- y WT de 18 meses de edad mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Todos los análisis se realizaron por duplicado y solamente se consideraron como diferencias aquellas proteínas que presentaron una diferencia de expresión de, al menos, 3 veces en ambas réplicas. Se compararon 6 nódulos tumorales de diferentes ratones con muestras de hígado WT. De todas las alteraciones detectadas en los nódulos tumorales, se lograron identificar 151 proteínas. Para comprobar las identificaciones obtenidas, se representaron el Pm y el pI teóricos calculados a partir de la secuencia de las proteínas, frente a la Rf experimental de las bandas correspondientes calculada a partir de los geles 2D. Como se puede observar en la Figura 3, se obtuvo una buena correlación entre los parámetros teóricos y experimentales con algunas desviaciones tanto en el Pm como en el pI experimental, probablemente, consecuencia de modificaciones post-traduccionales o de un procesamiento alternativo de las especies proteicas. Algunos ejemplos de comportamiento electroforético anómalo observado en algunos tumores son: aldehído deshidrogenasa (clase 2), albúmina y la transferasa de glutation Mu 1. Para confirmar la correcta identificación de estas proteínas, se secuenciaron parcialmente mediante espectrometría de masas
ESI/MS/MS.

Las proteínas identificadas se clasificaron según su localización subcelular y el proceso biológico en el que están implicadas de acuerdo con el criterio de Gene Ontology (Ashburner M, Ball CA, Blake JA y col. Gene ontology: Tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000; 25: 25-9) utilizando el programa bioinformático GARBAN. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4, en donde puede apreciarse que las proteínas identificadas se localizan en mitocondrias (mayoritariamente), citosol, citoesqueleto, retículo endoplásmico, núcleo y otras localizaciones subcelulares. Los procesos biológicos en los que están implicadas las proteínas identificadas comprenden la respuesta a estímulos externos, transducción de señales, organización celular y biogénesis, metabolismo (mayoritariamente) y transporte.

De las 151 proteínas identificadas, el 61,3% de las alteraciones correspondieron a proteínas cuyos niveles estaban reducidos en el tumor, consecuencia, probablemente, de la progresiva desdiferenciación de los hepatocitos durante el proceso de transformación. A pesar de la disparidad observada entre los diferentes análisis,. señalización, organización celular, metabolismo y transporte fueron las funciones biológicas comúnmente afectadas. Los análisis indicaron que el citoesqueleto y el retículo endoplasmático se encontraban dañados, aunque la mitocondria era el orgánulo subcelular que acumulaba un mayor número de alteraciones. El estudio de las alteraciones metabólicas sufridas en el hígado MAT1A-/-, indicó que, al igual que sucedía en la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), la mayoría de ellas pertenecían al metabolismo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos. Además, se observó un incremento en la expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo de purinas y pirimidinas. Esta observación podría reflejar la necesidad de síntesis de material genético de células en proliferación.

Con el objetivo de identificar proteínas asociadas a HCC humano, se decidió centrar el estudio, únicamente, en las 27 proteínas cuya expresión se vio alterada en, al menos, el 50% de los tumores MAT1A-/- analizados (Tabla 1).

TABLA 1 Alteraciones asociadas a HCC en al menos el 50% de los nódulos tumorales analizados

2

De las 27 proteínas, 19 disminuyeron su expresión en el hígado MAT1A-/- (metionina adenosiltransferasa, carbónico anhidrasa III, proteína Rik 1300018L09, glutamina sintetasa, proteína de unión a Selenio 2, adenosilhomocisteinasa, proteína antioxidante 2, Regucalcina, Sorbitol deshidrogenasa, Fenilalanina 4 hidroxilasa, malato deshidrogenasa, arginasa 1, fosfoglucomutasa, ornitina aminotransferasa, ornitina carbamoiltransferasa, proteína transportadora de estero] 2, glicina N-metiltransferasa, alcohol deshidrogenasa y proteína Rik 2810435D12) (Figura 5). Las 8 proteínas restantes (transferasa de glutation P2, proteína de choque térmico de 71 KDa, apolipoproteína A1 y E, albúmina, aldehído deshidrogenasa clase 2, transferasa de glutation Mu1 y proteína disulfuro isomerasa), se encontraban aumentadas en los tumores analizados. Cuatro de ellas, se identificaron a partir de bandas de nueva aparición, que presentaban un comportamiento electroforético anómalo debido a cambios observados tanto en pI como en Pm. No se puede concluir que estas proteínas se encuentren sobreexpresadas ya que estas isoformas anómalas posiblemente se produzcan como consecuencia de modificaciones post-traduccionales (Figura 6).

1.2 Análisis de expresión génica en HCC humano

Para investigar si las alteraciones previamente observadas en el ratón MAT1A-/- pueden considerarse como potenciales biomarcadores de HCC en humanos, se analizaron los niveles de 23 de las 27 proteínas en diez HCC de diversa etiología, mediante la técnica de PCR cuantitativa. La disminución de la expresión de metionina adenosiltransferasa y la glicina N-metiltransferasa ya se había demostrado previamente en el laboratorio de los inventores (Avila MA, Berasain C, Torres L, Martin-Duce A, Corrales FJ, Yang H, Prieto J, Lu SC, Caballeria J, Rodes J, Mato JM. Reduced ARNm abundance of the main enzymes involved in methionine metabolism in human liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2000; 33: 907-914). Las proteínas Rik 1300018L09 y Rik 2810435D12 no se incluyeron en este estudio ya que su asignación en las bases de datos se debe a homología de secuencia con otras proteínas, y, por lo tanto, su función está aún por demostrar experimentalmente. Para verificar los oligonucleótidos iniciadores diseñados, se realizaron 23 reacciones de RT-PCR sobre una mezcla de líneas celulares tumorales humanas y se comprobó que la expresión de todas ellas disminuía respecto a hígados control. La cantidad de transcritos se expresó como la diferencia relativa respecto al gen control de la Histona H3F3A (2^{\Delta Ct}, donde \DeltaCt representa la diferencia en número de ciclos entre el gen diana y el gen control). En todos los análisis realizados, se aplicó el test estadístico de U de Mann-Whitney, con un valor de significación de p<0,05. Los análisis de expresión mediante RT-PCR mostraron que 13 de las 23 proteínas mostraban alteraciones significativas con respecto al grupo control. Estas proteínas fueron: alcohol deshidrogenasa, proteína antioxidante 2, regucalcina, proteína transportadora de esterol 2, sorbito] deshidrogenasa, albúmina, fosfoglucomutasa, fenilalanina 4 hidroxilasa, apolipoproteína A1, carbónico anhidrasa III, aldehído deshidrogenasa de clase 2, Ornitina aminotransferasa y ornitina carbamoiltransferasa. Con el fin de investigar si las alteraciones observadas eran exclusivas de HCC o estaban presentes en un estadio pre-tumoral como es la cirrosis, se analizaron mediante RT-PCR los niveles de expresión de las 13 proteínas alteradas en muestras procedentes de pacientes cirróticos tanto de etiología alcohólica (n=5), como de etiología vírica (n=5) que no habían desarrollado un tumor. Los análisis de expresión reflejaron que la expresión de 7 de las 13 proteínas (alcohol deshidrogenasa, proteína antioxidante 2, regucalcina, proteína transportadora de esterol 2, sorbitol deshidrogenasa, albúmina y fosfoglucomutasa) estaba significativamente alterada, en los pacientes con cirrosis respecto al grupo control. Estas alteraciones también se detectaron en 5 muestras de tejido peritumoral procedentes de individuos que presentaban cirrosis viral y HCC. Independientemente de que el tejido analizado estuviera asociado o no a un tumor, no se vieron diferencias significativas, por lo que para posteriores estudios, se decidió agrupar los pacientes con cirrosis viral (n=10). Posteriormente, se analizó la expresión de las 13 proteínas en muestras de tejido peritumoral procedente de individuos con HCC sin cirrosis. Para ello y mediante RT-PCR, se midieron los niveles de expresión en muestras procedentes de pacientes con hepatitis (n=3) y en muestras procedentes de pacientes que habían desarrollado HCC sobre un hígado sano (n=7). La alcohol deshidrogenasa fue la única proteína en la que se observó diferencias de expresión significativas respecto al grupo control
(n=6).

En resumen, el análisis proteómico de HCC en el ratón MAT1A-/- permitió identificar 27 proteínas alteradas en, al menos, el 50% de los casos estudiados. Entre ellas, 13 fueron detectadas en hepatocarcinomas humanos mediante PCR cuantitativa. Finalmente, la identificación de 7 de las 13 alteraciones en cirrosis peritumoral o no asociada a HCC, sugiere la utilidad de este panel de potenciales biomarcadores (Figura 7), no sólo en la diagnosis sino además en la detección precoz de estadios pre-tumoral es.

Discusión

La comparación de los proteomas de hígado WT y nódulos tumorales del ratón MAT1A-/- ha permitido identificar 151 proteínas diferenciales que proporcionan una huella proteómica de HCC estableciendo una base molecular para algunas de las alteraciones que caracterizan la biología del tumor. La variabilidad en el grupo de proteínas diferenciales identificadas, es un reflejo de la heterogeneidad proteómica de los nódulos tumorales. Asimismo, se observó que el 61,3% de las alteraciones corresponden a proteínas cuyos niveles están reducidos en el tumor, consecuencia, probablemente, de la progresiva desdiferenciación de los hepatocitos durante el proceso de transformación. El análisis funcional de las alteraciones observadas indica que en los hepatocitos transformados se produce una disminución de la actividad metabólica así como un incremento en proteínas asociadas a respuesta a estrés que podría considerarse como una adaptación a la presión impuesta por el déficit de AdoMet. Las proteínas diferenciales se localizan preferentemente en la mitocondria, citoplasma, retículo endoplásmico y citoesqueleto. A pesar del bajo nivel de coincidencia observado al comparar las proteínas o genes diferenciales, el déficit metabólico y respiratorio así como la respuesta a estrés constituyen un perfil funcional de HCC común en diferentes estudios en los que se utiliza una aproximación genómica o proteómica (Xu XR, Huang J, Xu ZG, Qian BZ y col. Insight into hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing gene expression profiles of hepatocellular carcinoma with those of corresponding noncancerous liver. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15089-94; Cynthia RM Yliang, Chon Kar Leow y col. Proteome analysis of human hepatocellular carcinoma tissues by two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2005; 5: 2258-2271) y, por lo tanto, se puede descartar que se produzcan de manera específica en el modelo experimental utilizado. Aún está por resolver si estos cambios representan simplemente la alteración funcional del hígado una vez establecida la lesión o si realmente participan en la patogénesis del HCC humano. Sin embargo, las alteraciones del metabolismo hepático y la disminución de la actividad mitocondrial, que se ha propuesto como uno de los factores que participan en la patogénesis de varios tipos de cáncer se producen en el hígado del ratón MAT1A-/- desde su nacimiento, mucho antes de detectar a nivel histológico ninguna manifestación de la enfermedad, lo que sugiere su participación en el desarrollo de HCC.

De las 151 proteínas alteradas en el hígado del ratón MAT1A-/-, 27 fueron detectadas como diferencias en, al menos, el 50% de lo tumores analizados y, por ello, fueron consideradas potenciales marcadores de HCC. Es interesante resaltar que este grupo de alteraciones seleccionadas por su alta incidencia reproducen el fenotipo funcional de los tumores descrito anteriormente: enzimas metabólicas cuya alteración supone un deficiente metabolismo de carbohidratos (fosfoglucomutasa), aminoácidos (arginasa 1, ornitina carbamoiltransferasa), metabolismo de grupos metilo (Metionina adenosiltransferasa, Adenosilhomocisteinasa, Glicina N-metiltransferasa), metabolismo y transporte de lípidos (Proteína transportadora de Esterol 2, Apolipoproteínas Al y E) e incremento en proteínas implicadas en detoxificación y respuesta a estrés (Proteína de choque térmico de 71 kDa, Proteína disulfuro isomerasa, isoformas de las transferasas de glutation Mu1 y P2). Además, la Proteína de unión a Selenio se ha relacionado con fibrosis y con envejecimiento, por lo que su disminución podría favorecer el desarrollo del tumor. La alteración de la actividad Sorbitol deshidrogenasa (SDH) ha sido utilizada como parámetro indicativo de daño hepático. El descenso en SDH en los nódulos tumorales del ratón MAT1A-/- se correlaciona con la pérdida de la capacidad de metabolizar sorbitol en las células transformadas. La Regucalcina (también denominada proteína marcadora de envejecimiento) es una proteína de unión a calcio que juega un papel decisivo en el mantenimiento de la homeostasis y función celular en el hígado. Finalmente, la glutamina sintetasa y la omitina aminotransferasa, son enzimas implicadas en el metabolismo de la glutamina cuya sobreexpresión, en parte a través de la ruta Wnt/\beta-catenina, está asociada con la carcinogénesis hepática. En roedores, se ha demostrado que un fenotipo Glutamina sintetasa positivo favorece el crecimiento tumoral, aunque no todas las lesiones presentan esta alteración. La disminución de los niveles de glutamina sintetasa en los tumores del ratón MAT1A-/- podría ser un rasgo característico de este modelo experimental de deficiencia de AdoMet en hígado. Sin embargo, los resultados obtenidos por los inventores no permiten descartar posibles modificaciones post-traduccionales que den lugar a una nueva especie no detectable en las condiciones de análisis utilizadas.

Existen estudios tanto genómicos como proteómicos en los que se utiliza tejido peritumoral como referencia para detectar cambios de expresión asociados al HCC (Kim JW, Ye Q, Forgues M, Chen Y y col. Cancer-associated molecular signature in the tissue samples of patients with cirrhosis. Hepatology 2004; 39: 518-27; Xu XR, Huang J, Xu ZG, Qian BZ y col. Insight into hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing gene expression profiles of hepatocellular carcinoma with those of corresponding noncancerous liver. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15089-94; Lim SO, Park SJ, Kim W, Park SG, Kim HJ y col. Proteome analysis of hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun 2002; 291: 1031-37; Kim J, Kim SH, Lee SU, Ha GH, Kang DG et al. Proteome analysis of human liver tumor tissue by two dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry for identification of disease-related proteins. Electrphoresis 2002; 23: 4142-4156; Kim W, Lim SO, Ryu YH, Byeon JY y col. Comparison of proteome between Hepatitis B virus and Hepatitis C virus associated hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res 2003; 9: 5493-5500; Li C, Hong Y, Tan YX, Zhou H, Ai JH y col. Acurate quality and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular Carcinoma using laser capture microdissection coupled with Isotope-coded affinity tag and two dimensional Liquid Chromatography Mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 2004; 3: 399-409; Li C, Tan YX, Zhou H, Ding SJ, Li SJ y col. Proteomic analysis of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma: Identification of potential tumor markers. Proteomics 2005; 5: 1125-1135). Esta estrategia no permitiria la detección de alteraciones comunes a la parte no tumoral y al tumor, impidiendo la identificación de proteínas cuya expresión cambia inicialmente en hepatitis o en cirrosis, estadios previos al desarrollo de HCC.

La utilización del ratón MAT1A-/- como sistema de filtrado previo al análisis de muestras humanas, ha demostrado ser eficaz en la identificación de marcadores de HCC. La complejidad proteómica se ve reducida a 27 potenciales marcadores deducidos de los análisis con el ratón MAT1A-/-, de los que 13 han sido validados en HCC humano mediante estudios de PCR cuantitativa. La disminución de ornitina carbamoil-transferasa, ornitina aminotransferasa, aldehído deshidrogenasa mitocondrial clase 2, carbónico anhidrasa III, apolipoproteína A1 y fenilalanina 4 hidroxilasa, únicamente se observó en tumores y, por ello, podrían considerarse marcadores de transformación neoplásica. Sin embargo, las alteraciones en alcohol deshidrogenasa, proteína antioxidante 2, regucalcina, proteína transportadora de esterol 2, sorbitol deshidrogenasa, albúmina y fosfoglucomutasa, así como en metionina adenosiltransferasa y glicina N-metiltransferasa fueron detectadas en hígado cirrótico, independientemente de que el tejido analizado estuviera asociado o no a un tumor. La cirrosis se considera una situación de alto riesgo para el desarrollo de HCC y, por ello, estas alteraciones, que permanecen en el tumor, podrían representar marcadores precoces que permitirían la definición de un estadio preneoplásico. El análisis de estos marcadores en muestras de tejido sano o infectado por virus C o B procedentes de hígados con HCC resultó negativo con la única excepción de la alcohol deshidrogenasa, que previamente se ha asociado a procesos de lesión hepática de muy diversa etiología. En resumen, se describe un repertorio de potenciales marcadores de HCC, algunos precoces y otros específicos de tumor, que podría resultar de gran utilidad en el seguimiento de la población de riesgo y en la detección precoz de esta enfermedad.

<110> Proyecto de Biomedicina CIMA, S.L.

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<120> Método para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular mediante el empleo de marcadores moleculares

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<130> P1672ES

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<140> ES P200502369

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<141> 2005-09-29

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<160> 50

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<170> PatentIn version 3.5

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Ornitina aminotransferasa

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Ornitina aminotransferasa

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Malato deshidrogenasa

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Malato deshidrogenasa

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Proteína antioxidante

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Proteína antioxidante

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Aldheído deshidrogenasa mitocondrial

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Aldheído deshidrogenasa mitocondrial

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Glicina N-metiltransferasa

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Glicina N-metiltransferasa

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Sorbitol deshidrogenasa

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<223> Oligonucleótido 2 empelado para amplificar el ADN de la Sorbitol deshidrogenasa

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Apolipoproteina E

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Apolipoproteina E

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Albúmina sérica

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Albúmina sérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaggctct tccacaagag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Apolipoproteina A1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacagcggca gagactatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Apolipoproteina Al

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccttctg gcggtagag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Glutatión S-transferasa P2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttccagga cggagacctc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Glutatión S-transferasa P2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagggtctca aaaggcttca g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Metiotina adenosiltransferasa I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtcatccct gtgcgcatc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Metionina Adenosiltransferasa I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtccacctt ggtgtagtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Anhidrasa carbónica III

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctgaccac tggcatgaac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Anhidrasa carbónica III

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctcagagc catgatcatc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empelado para amplificar el ADN de la Proteína disulfuro isomerasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctccaaata ccagctcgac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Proteína disulfuro isomerasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccagctgc aacatcttct c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Adenosilhomocisteinasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccagctgc aacatcttct c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Adenosilhomocisteinasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtcgtggt ctcctcagag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Proteína de choque térmico de 71 kDa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgaaggaa attgcagaag c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la proteína de choque térmico de 71 kDa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caatagtgag gattgacaca tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Proteína de transferencia de lípidos no específica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggctcttgg gtttgagaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la proteína de transferencia de lípidos no específica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcttggaa ctgggaatac g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Fenilalanina 4-hidrolasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgccactg tccatgagc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Fenilalanina 4-hidroxilasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggtagtt gtaggcaatg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Alcohol deshidrogenasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcctctg attggtctgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Alcohol deshidrogenasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttggatgtc acaaacagct c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Arginasa 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggattctc ctgggtgac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Arginasa 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgtagaga ccttctctg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la proteína de unión a selenio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcagcaac tggcttgcat g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótiso 2 empleado para amplificar el ADN de la Proteína de unión a selenio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgagctgg atcatctgag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Glutamina sintasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcccaagtg tgtggaagag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Glutamina sintasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctggttgc tcaccatgtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Fosfoglucomutasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaagatcc tctgtgaaga ac

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Fosfoglucomutasa

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<400> 44

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaatgctgaa gatgttggca g

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21

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<210> 45

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la proteína marcadora de senescencia

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<400> 45

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tcaatgatgg gaaggtggat c

\hfill

21

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<210> 46

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la proteína marcadora de senescencia

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<400> 46

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggtcatagt caaaggcatc c

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21

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<210> 47

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Ornitina carbamoiltransferasa

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<400> 47

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaacaatat cctgcactcc

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20

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<210> 48

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Ornitina carbamoiltransferasa

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<400> 48

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtaattaa tacattgcct cc

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Oligonucleótido 1 empleado para amplificar el ADN de la Glutatión S-transferasa Mu1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctggaatac acagactcaa g

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21

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<210> 50

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 2 empleado para amplificar el ADN de la Glutatión S-transferasa Mu1

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<400> 50

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcttctcctc ttctgtctcc

\hfill

20

Claims

1. Un método in vitro para diagnosticar carcinoma hepatocelular (HCC) en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha patología en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, que comprende:

a): cuantificar el nivel de expresión del gen que codifica para la fosfoglucomutasa (PGM) [gen PGM] en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

o, alternativamente,

a): cuantificar el nivel de la proteína fosfoglucomutasa (PGM) en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

2. Un método in vitro para la identificación y evaluación de la eficacia de los tratamientos de HCC que comprende la cuantificación de los niveles de proteína PGM y/o de los niveles de expresión del gen PGM en un mismo sujeto a lo largo de las distintas fases o etapas de la enfermedad, o durante los periodos de tratamiento y de ausencia del mismo, y su comparación con valores control considerados normales o con valores previos del mismo sujeto, en el que cuando un agente terapéutico aumenta la expresión del gen PGM o de la proteína PGM, dicho agente se convierte en un candidato para el tratamiento de HCC.

3. Empleo de una secuencia nucleotídica del gen PGM o de una pareja de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar un fragmento específico de dicho gen, o de una sonda útil para identificar dicho gen, para diagnosticar in vitro HCC en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC.

4. Empleo de la proteína PGM para diagnosticar in vitro HCC en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC.

5. Empleo de un anticuerpo con capacidad para unirse a la proteína PGM para diagnosticar in vitro HCC en un sujeto, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC.

6. Empleo del gen PGM y/o de la proteína PGM en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de HCC.

7. Un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de HCC que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un nivel reducido del gen PGM con un compuesto candidato para el tratamiento de HCC, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si la expresión de dicho gen aumenta, el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de HCC.

8. Un método in vitro para identificar un estadio previo al desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC) en un sujeto, que comprende:

a): cuantificar el nivel de expresión del gen PGM en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

o, alternativamente,

a): cuantificar el nivel de la proteína PGM en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto; y

b): comparar dicho nivel con el de una muestra de control;

9. Empleo de una secuencia nucleotídica del gen PGM o de una pareja de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar un fragmento específico de dicho gen, o de una sonda útil para identificar dicho gen, para identificar in vitro un estadio previo al desarrollo de HCC.

10. Empleo de la proteína PGM para identificar in vitro un estadio previo al desarrollo de HCC.

11. Empleo de un anticuerpo con capacidad para unirse a la proteína PGM para identificar in vitro un estadio previo al desarrollo de HCC.

12. Empleo del gen PGM y/o de la proteína PGM en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de un estadio previo al desarrollo de HCC.

13. Un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de un estadio previo al desarrollo de HCC que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un nivel reducido del gen PGM con un compuesto candidato para el tratamiento de un estadio previo al desarrollo de HCC, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si la expresión de dicho gen aumenta, el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de un estadio previo al desarrollo de HCC.

14. Una pareja de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar específicamente un fragmento de ARNm o ADNc del gen PGM.

15. Una sonda útil para identificar el gen PGM.

16. Un anticuerpo con capacidad para unirse a la proteína PGM.

17. Un soporte sólido seleccionado entre (i) un soporte sólido que comprende una o más sondas útiles para identificar el gen PGM y (ii) un soporte sólido que comprende uno o más anticuerpos con capacidad para unirse a la proteína PGM.

18. Un kit que comprende reactivos para la detección de los niveles de expresión del gen PGM.

19. Kit según la reivindicación 18, que comprende:

-: una o más parejas de oligonucleótidos iniciadores útiles para amplificar específicamente fragmentos de los ARNm (o de sus correspondientes ADNc) del gen PGM; y/o

-: una o más sondas útiles para identificar el gen PGM.

20. Kit según la reivindicación 18 ó 19, en el que dichas sondas están fijadas sobre un soporte sólido.

21. Un kit que comprende reactivos para la detección de los niveles de expresión de la proteína PGM.

22. Kit según la reivindicación 21, que comprende uno o más anticuerpos con capacidad para unirse a la proteína PGM o a fragmentos de la misma que contienen determinantes antigénicos.

23. Kit según la reivindicación 21 ó 22, en el que dichos anticuerpos están fijados sobre un soporte sólido.

24. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, para diagnosticar in vitro HCC, o para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar HCC, o para evaluar la progresión de dicha enfermedad en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para identificar y evaluar la eficacia de un tratamiento de HCC.

25. Un kit para la puesta en práctica de un método in vitro para identificar un estadio previo al desarrollo de HCC que comprende los reactivos necesarios para la detección de los niveles de expresión del gen PGM.

26. Kit según la reivindicación 25, que comprende:

-: una o más sondas útiles para identificar el gen PGM.

27. Kit según la reivindicación 25 ó 26, en el que dichas sondas están fijadas sobre un soporte sólido.

28. Un kit para la puesta en práctica de un método in vitro para identificar un estadio previo al desarrollo de HCC que comprende los reactivos necesarios para la detección de los niveles de expresión de la proteína PGM.

29. Kit según la reivindicación 28, que comprende uno o más anticuerpos con capacidad para unirse a la proteína PGM o a fragmentos de la misma que contienen determinantes antigénicos.

30. Kit según la reivindicación 28 ó 29, en el que dichos anticuerpos están fijados sobre un soporte sólido.