JP2002355046A - ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びソルビトールデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコ
ードするソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、(ａ)特
定の配列で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)アミノ酸配列(ａ)において、1もしくは複数のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なり、かつソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する
タンパク質 上記のソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な
組み換え体ＤＮＡ、上記の組み換え体ＤＮＡを含む形質
転換体又は形質導入体及び上記の形質転換体又は形質導
入体を培地に培養し、培養物からソルビトールデヒドロ
ゲナーゼを採取することを特徴とするソルビトールデヒ
ドロゲナーゼの製造法。 【効果】 本発明によれば、ソルビトールデヒドロゲナ
ーゼを効率よく生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＮＡＤ+ の存在下
でＤ−ソルビトールを酸化してＤ−フルクトースを生成
し、又本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下でＤ
−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールを生成させ
るソルビトールデヒドロゲナーゼの遺伝子、新規な組み
換え体ＤＮＡ及びソルビトールデヒドロゲナーゼの製造
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｄ−ソルビトールは、ヒトの血清中ある
いは尿中等に微量に存在し、病気、例えば、糖尿病等の
診断において、その含有量が重要な指標となることが知
られており、現在、研究機関等では酵素法を用いて、血
清中のＤ−ソルビトールが測定されている。又、粉末又
は粒状のＤ−ソルビトールは、ブドウ糖を高温高圧のも
とで水素添加することにより、Ｄ−ソルビトール液が得
られ、この液をイオン交換樹脂等により精製することに
より得られる。Ｄ−ソルビトールは、臭いがなく、爽快
な甘味を有し、舌に寒冷感を与えることあるいは、吸湿
性に優れていること等から、チューインガム、キャンデ
ィー、その他製菓類等の甘味料として、又、合成酒のコ
ク付けあるいはタバコの甘味保湿剤等に、広く用いられ
ている。そして又、Ｄ−フルクトースは、イヌリンを多
量に含有する植物、例えば、きくいも等を加水分解する
方法、ショ糖にインベルターゼを作用させて転化する方
法等によって得られる。このＤ−フルクトースは、上品
で強い甘味を有し、かつ、湿潤性を与えること等から、
食品業界では甘味料等として広範囲にわたり用いられて
いる。

【０００３】このようなことから、血清中あるいは尿中
等に微量に存在するＤ−ソルビトール、そして食品中に
含有するＤ−ソルビトール又はＤ−フルクトースを測定
するのに利用可能な酵素を得ることは産業上極めて重要
な意義を有する。ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造
は、従来より、例えば、シュードモナス属（Pseudomona
s sp.）を培地に接種、培養し培養物を採取することに
より行なわれていた（特許第3152855公報参照） 。しか
しながら上記ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造法で
は収率が不十分である等の問題点があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来技術の問題を解決すべくなされたものであり、その
目的とするところは、ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺
伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びソルビトールデヒド
ロゲナーゼの製造法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、上
記課題に鑑み種々検討した結果、シュードモナス（Pseu
domonas）sp. KS-E1806由来のソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を単離及び構造決定することに成功し、ま
た、ソルビトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、こ
の組み換え体をエッシェリシア（Escherichia）属に属
する菌株に含ませたソルビトールデヒドロゲナーゼ生産
能を有する菌株を培地に培養すると、効率よくソルビト
ールデヒドロゲナーゼが生産されること等を見出し、こ
れらの知見に基づき、本発明を完成した。即ち、第１の
発明は、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする
ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子である。(ａ)配列
番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ｂ)
アミノ酸配列(ａ)において、1もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタ
ンパク質第２の発明は、以下の(ａ)又は(ｂ)のＤＮＡか
らなるソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子である。 (ａ)配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ (ｂ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつソルビトールデヒド
ロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ 第３の発明は、 上記のソルビトールデヒドロゲナーゼ
遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新
規な組み換え体ＤＮＡである。第４の発明は、上記の組
み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体であ
る。第５の発明は、上記形質転換体又は形質導入体を培
地に培養し、培養物からソルビトールデヒドロゲナーゼ
を採取することを特徴とするソルビトールデヒドロゲナ
ーゼの製造法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、例え
ば、次のようにして単離することができる。先ず、シュ
ードモナス（Pseudomonas） sp. KS-E1806を、例えば、
特許第3152855号公報記載の方法等により培養し、得ら
れた菌株から染色体ＤＮＡを抽出する。菌体からの染色
体ＤＮＡの調製は、例えば、Current Protocols in Mol
ecular Biology（WILEY Intersciense, 1989）記載の方
法等により行なうことができる。次いで、上記微生物
を、例えば、特許第3152855号公報記載の方法等により
培養し、ソルビトールデヒドロゲナーゼを精製すること
により、ソルビトールデヒドロゲナーゼを得ることがで
きる。得られたソルビトールデヒドロゲナーゼを、変性
条件下でリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社
製）処理し、断片化する。上記断片を、例えば、カプセ
ルパックC18UG300カラム（資生堂社製）等を用いた逆相
高速液体クロマトグラフィーにより分取し、数種の断片
ペプチドについてアミノ酸配列を、例えば、Procise 49
2プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム
ズジャパン社製）等を用いて決定する。

【０００７】上記アミノ酸配列をもとにポリメラーゼ連
鎖反応（以下ＰＣＲと略す）用プライマーを作製する。
この際コドンの縮重を考慮し、２種以下の塩基が縮重し
ている箇所は混合塩基を、３〜４種の塩基が縮重してい
る個所についてはイノシンを使用し、40 mer以上、好ま
しくは42-44 merの長いプライマーを作製する。作製し
たプライマーを用いて、先に取得したシュードモナス
（Pseudomonas）sp. KS-E1806の染色体ＤＮＡを鋳型と
したＰＣＲを行なう。増幅されたＤＮＡ断片を、ベクタ
ーＤＮＡ、例えば、pCR2.1ベクター（インビトロジェン
社製）等に組み込み、組み換え体プラスミドを得る。該
プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を、例えば、マル
チキャピラリーＤＮＡ解析システムCEQ2000（ベックマ
ン・コールター社製）等を用いて決定し、ＰＣＲのプラ
イマー設計に用いたペプチドのアミノ酸配列を正しくコ
ードする塩基配列を両端に有するものを選択する。上記
の如くして得られた増幅ＤＮＡ断片は、本発明のソルビ
トールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部分（部分遺伝子）
である。

【０００８】上記部分遺伝子を標識し、シュードモナス
（Pseudomonas）sp. KS-E1806の染色体断片を含むライ
ブラリーから、ハイブリダイゼーションにより目的遺伝
子を含むクローンを単離する。ＤＮＡ断片の標識と、ハ
イブリダイゼーションの検出は、例えば、DIGシステム
（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）等を用いて行な
うことができる。ライブラリーの作製は、例えば、以下
のようにして行なうことができる。先ず、染色体ＤＮＡ
を制限酵素、例えば、EcoRIにより完全消化した後、通
常のアガロースゲル電気泳動法に供し、上記のＰＣＲ産
物をプローブとしたサザンブロット分析を行なう。その
結果、ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片の鎖長が決定できる。次いで、染色体ＤＮＡ
を先の制限酵素、例えば、EcoRIにより完全消化し、ア
ガロースゲル電気泳動に供し、決定した鎖長のＤＮＡ断
片を含有するゲルを切り出す。そして、切り出したゲル
中のＤＮＡ を、例えば、GENE CLEAN II（フナコシ社
製）により回収し、常法に従いベクターＤＮＡに組み込
む。用いられるベクターＤＮＡとしては、例えば、pUC1
19（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）等のプラスミ
ドＤＮＡ、λENBL3 （Stratagene社製）、λDASH II
（フナコシ社製）等のバクテリオファージＤＮＡ等が挙
げられる。

【０００９】得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例え
ば、大腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109（宝酒造社
製）、DH5α（宝酒造社製）等を形質転換又はそれらに
形質導入して夫々の形質転換体又は形質導入体を得る。
宿種細胞としては、大腸菌等の細菌の他、酵母、かび、
放線菌、動物細胞等が用いられる。この形質転換は、例
えば、D.M.Morrisonの方法（Method in Enzymology, 6
8,326-331, 1979）に行なうことができる。また、形質
導入は、例えば、B.Hohnの方法（Method in Enzymolog
y, 68, 299-309, 1979）により行なうことができる。単
離された形質転換体（その中にソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を含有している）より、純化された組み換
え体プラスミドＤＮＡを得るには、例えばQIAGEN Plasm
id Midi Kit（キアゲン社製）を用いることができる。
純化された組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて、実施
例の項目（５）に示すような方法によって、ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を行な
い、次いで、前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳
されるポリペプチドのアミノ酸配列を確定する。

【００１０】このアミノ酸配列は、配列番号１に示され
る通りである。このようにして確定されたアミノ酸配列
をコードする遺伝子が本発明のソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子である。なお、配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列において、１もしくは複数、好ましくは、数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、か
つ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性をもたらすアミ
ノ酸配列をコードするソルビトールデヒドロゲナーゼ遺
伝子は、全て本発明に含まれる。そして、配列番号１に
示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつソルビ
トールデヒドロゲナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列を
コードするソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を得る
には、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異
または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位
特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選
択されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連
結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げら
れる。これらのＤＮＡは、ソルビトールデヒドロゲナー
ゼ活性をもたらすポリペプチドをコードしている蓋然性
が高く、形質転換体を作製し、活性を持つものを選択す
ることができる。本発明のソルビトールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子と実質的に同一な遺伝子を取得するためには、
配列番号２の塩基配列を持つＤＮＡ又はその相補鎖、又
はそれらの一部を含むプローブによりストリンジェント
な条件でハイブリダイゼーションし、ソルビトールデヒ
ドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするも
のを選択することができる。ここでいうストリンジェン
トな条件とは、特異的なハイブリッドのみが選択的に形
成され、シグナルが検出されるが、非特異的なハイブリ
ッドは形成されない条件である。この様な条件は個々の
生物種により若干異なるが、常法によりハイブリダイゼ
ーションと洗いの際の塩濃度又は温度をいくつか検討す
るのみで容易に決定することができる。このような条件
としては、例えば、後記実施例の項目（３）及び（４）
において特異的なシグナルが観察できることから、ハイ
ブリダイゼーションは、DIG Easy Hyb試薬（ロシュ・ダ
イアグノスティクス社製）を用いて37℃〜42℃で一晩で
行なう。洗いは、0.5× SSC 、0.1% SDSを用い、15分
間、2 回行なう。洗いの温度は、45℃以上、好ましくは
52℃以上、更に好ましくは57℃以上である。このような
条件でハイブリダイズするようなＤＮＡは、ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチドをコードして
いる蓋然性が高いが、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活
性を失うような変異を有するものも含まれる。しかし、
それらについては、形質転換を行なった後に、形質転換
体のソルビトールデヒドロゲナーゼ産生能を測定するこ
とにより容易に取り除くことが可能である。

【００１１】上記のようにして得られたソルビトールデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡは、大腸
菌で高発現するためのプロモーターを有しないので、組
み換え体ＤＮＡを保有する形質転換株のソルビトールデ
ヒドロゲナーゼ生産性は低い。そこで、以下の操作によ
りソルビトールデヒドロゲナーゼ高生産株を得る。先
ず、上記の操作で得られた塩基配列に基づき、ソルビト
ールデヒドロゲナーゼ遺伝子のＮ末端あるいはＣ末端を
含み、その前後夫々約12塩基のオリゴヌクレオチド（計
30塩基のオリゴヌクレオチド、Ｃ末端側は相補鎖）を合
成し、これをプライマーとする。この合成プライマー中
にNdeI部位を組み込んでおき、ＰＣＲで増幅した産物
を、NdeI（宝酒造社製）を作用させて消化することによ
り、コーディング領域が得られるようにしておく。すな
わち、上記で得られた純化した組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを鋳型とし、合成プライマーを用いてＰＣＲを行な
い、得られた産物をNdeIで消化すれば、ソルビトールデ
ヒドロゲナーゼをコードする領域のＤＮＡのみを得るこ
とができる。得られたＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペ
ロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボ
ゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（The Op
eron, p.227, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980を
参照）を保有するベクターＤＮＡに挿入する。用いられ
るベクターＤＮＡは、プラスミドＤＮＡでもバクテリオ
ファージＤＮＡでもよい。例えば、実施例の項目（６）
に示されるベクターpUTE500K'（特開平08-205861 公報
記載）を用いることができる。得られた組み換え体ＤＮ
Ａを用いて、例えば大腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM10
9（宝酒造社製）、DH5α（宝酒造社製）等を形質転換又
はそれらに形質導入して夫々の菌株を得る。

【００１２】上記のようにして得られたソルビトールデ
ヒドロゲナーゼ生産能を有する形質転換体又は形質導入
体、例えば、エッシェリシア属に属する菌株を用いてソ
ルビトールデヒドロゲナーゼを生産するには、下記のよ
うにして行なうことができる。上記微生物を培養するに
は、通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液
体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、上記
微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカーあるいは
大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、
リン酸２水素カリウム，リン酸水素２カリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マン
ガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により
糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられ
る。なお、培地の初発pHは、7〜9に調整するのが適当で
ある。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃前後で6
〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等
により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物よ
りソルビトールデヒドロゲナーゼを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いることができる。培養物から、例
えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗
菌する。この菌体からソルビトールデヒドロゲナーゼを
採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用
いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、
ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する
方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細
胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を
用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から
ソルビトールデヒドロゲナーゼを採取するのが好まし
い。

【００１３】このようにして得られた粗酵素液からソル
ビトールデヒドロゲナーゼを単離するには、通常の酵素
精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析
法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲ
ル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気
泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。得ら
れたソルビトールデヒドロゲナーゼの理化学的性質は、
以下に示す通りである。 （１）作用：ＮＡＤ+ の存在下で、Ｄ−ソルビトールを
酸化してＤ−フルクトース及びＮＡＤＨを生成し、又本
反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下で、Ｄ−フル
クトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ+ を生成
する。 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール及びガラクチトー
ルに特異的に作用する。 （３）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは、10近辺であ
り、安定pH範囲は、30℃、4時間処理で、pH 5.5〜10.5
である。 （４）作用適温の範囲：100 mMトリス−塩酸緩衝液（pH
9.0）で作用適温の範囲は、50℃近辺である。 （５）pH、温度等による失活の条件：30℃、4時間処理
で、pH 5.5〜10.5で安定あり、pH 5.0以下及びpH 11.0
以上で完全に失活する。pH 7.0において、30分間処理
で、40℃近辺まで安定であり、又pH 7.0で40℃の条件に
おいて24時間で完全に失活する。 （６）阻害：HgCl₂ によって強く阻害される。 （７）分子量：約64,500±5,000（ゲルろ過法）。 （８）力価の測定法：本酵素の力価の測定は、下記の方
法で行ない、1分間に1μmolのＮＡＤＨを生成する酵素
量を1Ｕとした。

【００１４】（試薬調製） １液；基質液 Ｄ−ソルビトール20ｇを蒸留水に溶解し
100 mlとする。 ２液；基質液 ＮＡＤ+ 86 mgを蒸留水に溶解し、4 ml
とする。 ３液；緩衝液 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン6.05 ｇを蒸留水に溶解した後、4規定塩酸でpHを9.0
に調整した後、500 mlにする。 （測定手順）１）１液 0.5 ml、２液 0.05 ml、３液 2.
4 mlを混合し37℃にて5分間プレインキュベーションす
る。 ２）前記5分間プレインキュベーションした液と0.1〜0.
8 U/mlに調整した酵素液0.05 mlを混合し、37℃におい
て340 nmにおける1分間あたりのサンプル吸光度増加量
を測定する。 ３）ブランク値の測定は１液の代わりに蒸留水0.5 mlを
加え、２液0.05 ml、３液2.4 mlを混合し37℃にて5分間
プレインキュベーションし、0.1〜0.8 U/mlに調整した
酵素液0.05 mlを混合し、37℃において340 nmにおける1
分間あたりのブランク吸光度増加量を測定する。（力価
の計算）

【数１】

【００１５】本酵素は、Ｄ−ソルビトールに作用し、し
かも通常の酵素法による測定で多く用いられる条件（pH
9.0、37℃、30分間の反応）においても酵素活性が安定
な酵素であり、本酵素を用いれば、例えば、食品中ある
いはヒトの血清中又は尿中に存在するＤ−ソルビトール
量を精度よく測定することが可能である。また、本酵素
の逆反応によって、例えば、食品中Ｄ−フルクトースを
測定することも可能である。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。 （実施例） （１）シュードモナス（Pseudomonas）sp. KS-E1806染
色体ＤＮＡの調製 シュードモナス（Pseudomonas）sp. KS-E1806（FERM B
P−７６１６）（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２９９号より移
管）を酵素生産培地〔Ｄ−ソルビトール0.5%、ポリペプ
トン2.0%、酵母エキス0.5%、ＫＨ2PO4 0.01%、K2HPO4
0.01%、MgSO4・7H2O 0.01%、及び水道水からなる培地
（pH 7.2）〕100 mlに接種して、30℃で約20時間振とう
培養し、遠心分離より集菌した。この菌体よりG NOME D
NA IsolationKit（フナコシ社）を用いて、染色体ＤＮ
Ａ1.2 mgを得た。

【００１７】（２）部分遺伝子の取得 次いで、上記微生物を特許第3152855号公報記載の方法
によりソルビトールデヒドロゲナーゼを精製し、得られ
たソルビトールデヒドロゲナーゼ50 μgを、変性条件下
でリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）処理
し、断片化した。上記断片を、Waters μBondapak C18
（ミリポア社製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフ
ィーにより分取し、数種の断片ペプチドについてアミノ
酸配列を、Procise 492プロテインシーケンサー（アプ
ライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて決定し
た。上記内部アミノ酸配列をもとに、複数個のＰＣＲ用
プライマーを作製し、項目（１）で調製した染色体ＤＮ
Ａ を鋳型とし、ExTaq ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社
製）を用いたＰＣＲを行なった。先ず、コドンが縮重し
ている箇所は混合塩基で合成した15-26 merのプライマ
ーを複数作製した。これらを様々な組み合わせで、アニ
ールの温度も種々検討してＰＣＲを行なったが、目的の
部分遺伝子は取得できなかった。そこで、次に、２種以
下の塩基が縮重している箇所は、混合塩基を、３〜4種
の塩基が縮重している個所についてはイノシンを使用
し、センスプライマーは42 mer〔得られたタンパク質内
部のアミノ酸配列：Val Asn GlyIle Ala Pro Gly Val V
al Asp Thr Pro Met Trpに対応するポリヌクレオチド：
5'-GTIAAYGGIATIGCICCIGGIGTIGTITGYACICCIATGTGG-3'
（Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミ
ン、Iはイノシン、Yはチミン又はシトシンを示す）〕、
アンチセンスプライマーは44 mer〔得られたタンパク質
内部のアミノ酸配列：Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Gl
n Thr Leu Asn Val Asp Gly Glyに対応するポリヌクレ
オチド：5'-CCICCRTCIACRTTIAIIGTYTGIGCIGTIATRTARTCI
GCRTC-3'（Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、T
はチミン、Iはイノシン、Rはアデニン又はグアニン、Y
はチミン又はシトシンを示す）〕の長いプライマーを作
製した。作製したプライマーを用い、アニールは64℃、
60サイクルのＰＣＲ反応を行なったところ、複数の遺伝
子断片が増幅された。

【００１８】それらのうちメジャーな4つのＤＮＡ断片
を、pCR2.1ベクター（インビトロジェン社製）に組み込
み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿
入ＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析
システムCEQ2000（ベックマン・コールター社製）を用
いて決定した。その結果、4つのＤＮＡ断片のうちもっ
とも長いＤＮＡ断片（227 bp）が、ＰＣＲのプライマー
設計に用いたペプチドのアミノ酸配列を正しくコードす
る塩基配列を両端に有していた。又、決定した塩基配列
から推定されるアミノ酸配列中には、プロテインシーク
エンサーで決定した内部アミノ酸配列が存在した。従っ
て、得られた増幅ＤＮＡ断片は、本発明のソルビトール
デヒドロゲナーゼ遺伝子の一部分（部分遺伝子）である
ことが判明した。

【００１９】（３） 染色体ＤＮＡライブラリーの作製 先ず、染色体ＤＮＡ 2 μgをEcoRIにより完全消化した
後、通常のアガロースゲル電気泳動法に供し、上記の22
7 bpのＰＣＲ産物をプローブとしたサザンブロット分析
を行なった。なお、プローブは、DIG-ハイプライム（ロ
シュ・ダイアグノスティクス社）を用いてジゴキシゲニ
ンで標識した。その結果、ソルビトールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子を含有するEcoRI断片の鎖長は、1.3 kb程度で
あることが確認された。そこで、10 μｇの染色体ＤＮ
Ａ を、制限酵素EcoRIにより完全消化した後、アガロー
スゲル電気泳動に供した。次いで、1.3 kbの鎖長のEcoR
I断片を含有するゲルを切り出した後、ゲル中のＤＮＡ
を、GENE CLEAN II（フナコシ社製）により回収した。
このＤＮＡと、プラスミドベクターＤＮＡ pUC19（宝酒
造社製）100ngのEcoRI消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）１ユニットで連
結し、得られた組み換え体プラスミドＤＮＡを用いてD.
M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, p.326
-331, 1979) に従って大腸菌DH5α株（宝酒造社製）を
形質転換した結果、2000 のコロニーを得、アマシャム
ファルマシアバイオテク社のプロトコールに従ってナイ
ロンメンブレンフィルターHybond-N+（アマシャムファ
ルマシアバイオテク社製）へブロッティングした。

【００２０】（４） コロニーハイブリダイゼーション
によるソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離 ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、項目（３）で
作製した染色体ＤＮＡライブラリーを、項目（２）で得
られた227 bpのＰＣＲ産物をプローブとしてスクリーニ
ングして得た。プローブの標識には、DIG-ハイプライム
（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いてジゴキ
シゲニンで標識した。スクリーニングは、Current Prot
ocols in Molecular Biology(WILEY Interscience, 198
8)記載の方法に従ってコロニーハイブダイゼーションを
行なったところ、４個の陽性コロニー得た。４個の陽性
コロニーよりプラスミドＤＮＡをQIAGEN Plasmid Midi
Kit（キアゲン社製）にて調製した。

【００２１】（５） ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺
伝子の解析 ４個の陽性コロニーより得られたプラスミドＤＮＡに挿
入されているEcoRI断片について、それらの両側から約2
00 bpの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析シ
ステムCEQ2000（ベックマン・コールター社製）を用い
て解析したところ、全て同じクローンと思われた。挿入
断片の全塩基配列を決定した結果、ソルビトールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子の全長を含んでいた。決定したソルビ
トールデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号２
に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドの
アミノ酸配列を配列番号１に夫々示した。ソルビトール
デヒドロゲナーゼ遺伝子のＯＲＦは、774 bp、258アミ
ノ酸からなっていることが判明した。

【００２２】（６）大腸菌DH5α(pSDH1)の作製 ソルビトールデヒドロゲナーゼのコーディング領域のみ
からなるＤＮＡを以下の方法により作製した。ソルビト
ールデヒドロゲナーゼ遺伝子のＮ末端を含む、その前後
約12塩基ずつのオリゴヌクレオチド（配列番号３）及び
遺伝子のＣ末端を含む、その前後約12塩基ずつのオリゴ
ヌクレオチド（配列番号４）を作製し、ＰＣＲ用プライ
マーとした。これらのプライマーは、その配列中にNdeI
部位が組み込んであり、ＰＣＲ法で増幅した産物をNdeI
で消化することにより、コーディング領域が得られるよ
うにデザインした。これらのプライマーを用い、陽性コ
ロニーより得られたプラスミドＤＮＡを鋳型にしてＰＣ
Ｒを行ない、ソルビトールデヒドロゲナーゼをコードす
る領域を含むＤＮＡを増幅した。このＤＮＡをNdeIで消
化後、大腸菌ラクトースオペロン等に由来するプロモー
ター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領
域を含むＤＮＡ配列（The Operon, p.227, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1980を参照）を保有する発現プラ
スミドベクター、pUTE500K'（特開平08-205861 公報記
載）のNdeI部位に挿入し、組み換え体プラスミドpSDH1
ＤＮＡを得た。D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzym
ology, 68, p.326-331, 1979) に従い、組み換え体プラ
スミドＤＮＡpSDH1を用いて大腸菌（E.coli）DH5α（宝
酒造社製）を形質転換し、形質転換株、大腸菌（E.col
i）DH5α(pSDH1)を得た。なお、大腸菌（E.coli）DH5α
(pSDH1)は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生
物寄託センターにFERM BP−７６１５として寄託されて
いる。得られた大腸菌（E.coli）DH5α(pSDH1)を、１mM
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む
TY培地（１％バクト・トリプトン、0.5％バクト・イー
スト・エクストラクト、0.5％NaCl、pH 7.0）にて16時
間振とう培養した後、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活
性を測定したところ、11.4 U/mlであった。

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、ソルビトールデヒドロ
ゲナーゼを効率よく生産することができる。

【００２４】 SEQUENCE LISTING 〈110〉KIKKOMAN CORPORATION 〈120〉A SORBITOL DEHYDROGENASE GENE,A NOVEL RECOMBINANT DNA,AND A PROCE SS FOR PRODUCING SORBITOL DEHYDROGENASE 〈130〉P2212 〈160〉4 〈210〉1 〈211〉258 〈212〉PRT 〈213〉Pseudomonas sp. KS-E1806 〈400〉1 Met Arg Leu Glu Asp Lys Val Ala Ile Leu Thr Gly Ala Ala Ser Gly 1 5 10 15 Ile Gly Glu Ala Val Ala Gln Arg Tyr Leu Asp Glu Gly Ala Arg Cys 20 25 30 Val Leu Val Asp Val Lys Pro Ala Gly Gly Ser Leu Ala Arg Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Asn Pro Gly Arg Ala Val Ala Val Thr Ala Asp Val Thr Arg 50 55 60 Arg Asp Asp Ile Thr Arg Ile Val Ala Thr Ala Val Glu Arg Phe Gly 65 70 75 80 Gly Val Asp Ile Leu Phe Asn Asn Ala Ala Leu Phe Asp Met Arg Pro 85 90 95 Leu Leu Asp Glu Ser Trp Asp Val Phe Asp Arg Leu Phe Ser Val Asn 100 105 110 Val Lys Gly Leu Phe Phe Leu Met Gln Ala Val Ala Gln Arg Met Val 115 120 125 Glu Gln Gly Arg Gly Gly Lys Ile Val Asn Met Ser Ser Gln Ala Gly 130 135 140 Arg Arg Gly Glu Ala Leu Val Ser His Tyr Cys Ala Thr Lys Ala Ala 145 150 155 160 Val Ile Ser Tyr Thr Gln Ser Ala Ala Leu Ala Leu Ala Pro His Arg 165 170 175 Ile Asn Val Asn Gly Ile Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Pro Met Trp 180 185 190 Glu Gln Val Asp Ala Leu Phe Ala Arg Tyr Glu Asn Arg Pro Leu Gly 195 200 205 Glu Lys Lys Arg Leu Val Gly Glu Ala Val Pro Leu Gly Arg Met Gly 210 215 220 Val Pro Gly Asp Leu Thr Gly Ala Ala Leu Phe Leu Ala Ser Ala Asp 225 230 235 240 Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Gln Thr Leu Asn Val Asp Gly Gly Asn Trp 245 250 255 Met Ser 258

【００２５】 〈210〉2 〈211〉774 〈212〉DNA 〈213〉Pseudomonas sp. KS-E1806 〈400〉2 gtg aga ctg gaa gac aag gtc gcg atc ctg acg ggc gcc gca agc ggc 48 atc ggc gag gcg gtc gca caa cgc tat ctg gac gag ggc gcg cgc tgc 96 gtg ctc gtc gac gtg aag ccg gca ggc ggc tcg ctc gcg cgg ctg atc 144 gag gcc aac ccg ggc cgc gcg gtg gcc gtc acg gcc gac gtc acg cgt 192 cgc gac gac atc acg cgg atc gtc gcc acg gcg gtc gag cgc ttc ggc 240 ggc gtc gac att ctg ttc aac aac gcg gcg ctg ttc gac atg cgt ccg 288 ctc ctc gat gaa tcc tgg gac gtg ttc gac cgg ctg ttc tcg gtc aac 336 gtg aaa ggg ctg ttc ttc ctg atg cag gcg gtt gcg caa cgg atg gtc 384 gag cag ggg cgc ggc ggc aag atc gtc aac atg tcg tcg cag gcc ggc 432 cgt cgc ggc gag gcg ctc gtt tcg cac tac tgc gcg acc aag gcc gcg 480 gtg atc agc tat acg cag tcg gcc gcg ctc gcg ctc gcg ccg cac cgg 528 atc aac gtg aac ggc atc gcg ccg ggc gtg gtc gac acg ccg atg tgg 576 gag cag gtc gat gcg ctg ttc gcg cgc tac gag aac cgg ccg ctc ggc 624 gag aag aag cgg ctc gtc ggt gaa gcc gtg ccg ctc ggc cgc atg ggc 672 gtg ccg ggc gac ctg acg ggc gcc gcg ctg ttc ctc gcg tcg gcc gat 720 gcc gac tac atc acc gcc cag acg ttg aac gtc gat ggc ggc aac tgg 768 atg agc 774

【００２６】 〈210〉3 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉3 aac cgg aga cag cat atg aga ctg gaa gac 30

【００２７】 〈210〉4 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉4 ctt gcg agc ggc cat atg tca gct cat cca 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA11 4B050 CC03 DD02 LL03 4B065 AA01X AA26X AA41Y AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA46

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコ
   ードするソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子。 (ａ)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (ｂ)アミノ酸配列(ａ)において、1もしくは複数のアミ
   ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
   なり、かつソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する
   タンパク質
2. 【請求項２】 以下の(ａ)又は(ｂ)のＤＮＡからな
   るソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子。 (ａ)配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ (ｂ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズし、かつソルビトールデヒド
   ロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のソルビトールデ
   ヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したこと
   を特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含
   む形質転換体又は形質導入体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体又は形質導
   入体を培地に培養し、培養物からソルビトールデヒドロ
   ゲナーゼを採取することを特徴とするソルビトールデヒ
   ドロゲナーゼの製造法。