JP2000069976A - メタノール脱水素酵素の新規活性促進因子及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 メタノール脱水素酵素の新規活性促進因子、
それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを発現する細胞、及
び、該活性促進因子を製造する方法を提供する。 【解決手段】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするタンパク
質が発現可能な形態で導入された細胞を培地で培養し、
メタノール脱水素酵素活性を促進する活性を有するタン
パク質を培養物中に生成蓄積させ、該培養物より該タン
パク質を採取する。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、メタ
ノール脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク
質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、メタノール脱水素
酵素の新規活性促進因子、それをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを発現する細胞、及び、該活性促進因子を製造す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】メタノール資化性バチルス属細菌である
バチルス メタノリカス（Bacillus methanolicus）C1
株は、炭素源となるメタノールをホルムアルデヒドへ酸
化するメタノール脱水素酵素(以下「MDH」ともいう)を
持つことが知られている(Arch.Microbiol., 152巻, 280
-288頁, 1989年)。MDHは、試料中のメタノールの含量の
測定に用いられることがある。その際、酵素の比活性を
高めることは重要であり、その手段が待ち望まれてい
た。

【０００３】最近、Arfmanらは、このMDHの酵素活性を
促進する因子が、バチルス メタノリカスC1株にあるこ
とを報告した。彼らは、この因子であるタンパク質を精
製し、該タンパク質のN末端の一部のアミノ酸配列を決
定している（The Journal ofBiological Chemistry, 26
6巻, 3955-3960頁, 1991年）。しかしながら、この因子
の全体の構造については、全く知られていないし、また
遺伝子構造についても全く知られていない。

【０００４】ところで、バチルス ズブチリス（Bacill
us subtilis）はメタノールを唯一の炭素源として生育
することはできず、従って、この微生物がメタノール資
化の最初の反応であるメタノール脱水素酵素を保持して
いるとは到底考えられなかった。確かに、本発明者ら
は、バチルス メタノリカスC1株のMDHのアミノ酸配列
および塩基配列との有意な相同性を有する遺伝子産物や
遺伝子を、公知のバチルス ズブチリスの染色体ＤＮＡ
配列に対して検索したところ、そのような遺伝子産物や
遺伝子は見い出されなかった。したがって、メタノール
を資化しないバチルス ズブチリスのような微生物にお
いて、MDHの活性化因子は知られておらず、その存在も
予想されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、MDH活性を
促進する新規な手段を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、メタノー
ル資化菌ではないバチルス ズブチリスのゲノム上の各
種遺伝子配列について研究していたところ、偶然にもこ
の菌が、メタノール脱水素酵素活性促進因子に相同なタ
ンパク質をコードし得る遺伝子を持っていることを見出
し、そして、その遺伝子をエシェリヒア コリ（Escher
ichia coli）内で強制発現させたところ、メタノール脱
水素酵素活性を促進する活性を検出することに成功し、
本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）
に示すタンパク質である。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、メタ
ノール脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク
質。

【０００８】本発明はまた、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示
すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、メタ
ノール脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク
質。

【０００９】前記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）
又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられ （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メタノー
ル脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡ。

【００１０】また本発明は、前記ＤＮＡが、該ＤＮＡが
コードするタンパク質が発現可能な形態で導入された細
胞を提供する。

【００１１】本発明はさらに、前記細胞を培地で培養
し、メタノール脱水素酵素活性を促進する活性を有する
タンパク質を培養物中に生成蓄積させ、該培養物より該
タンパク質を採取することを特徴とする、メタノール脱
水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク質の製造
法を提供する。

【００１２】尚、本発明において、「メタノール脱水素
酵素活性」とはメタノールを酸化し、ホルムアルデヒド
を生成させる反応を触媒する活性をいう。また、「メタ
ノール脱水素酵素活性を促進する活性」とは、この活性
を有する因子をメタノール脱水素酵素と共存させたとき
に、該メタノール脱水素酵素の比活性を有意に高める活
性をいう。

【００１３】以下、本発明のメタノール脱水素酵素活性
を促進する活性を有するタンパク質を、「MDH活性促進
因子」ともいう。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、詳細に説
明する。本発明のＤＮＡは、バチルス ズブチリス、例
えばバチルス ズブチリス168株の染色体ＤＮＡから、
該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号５に示す
塩基配列を有するプライマー（BsYqk-G1）及び配列表の
配列番号６に示す塩基配列を有するプライマー（BsYqk-
G2）を用いたPCR（ポリメラーゼ・チェイン・リアクシ
ョン）により取得することができる。これらのプライマ
ーは、それぞれ5'端近くに、制限酵素ClaI又はBamHIの
認識配列が組み込まれているので、増幅産物をこれらの
制限酵素で消化すれば、ClaI及びBamHI切断末端を有す
るベクターに挿入することができる。

【００１５】上記プライマーの塩基配列は、既知のメタ
ノール資化性バチルス メタノリカスC1株のMDH活性促
進因子の部分アミノ酸配列情報（配列番号７）を基に、
該アミノ酸配列と相同性のあるものをデータベース検索
を行ったところ、高い相同性を有しているものの一つと
して見い出されたバチルス ズブチリスの機能未知遺伝
子yqkG（配列番号２）及びその遺伝子産物（配列番号
１）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて設計したも
のである。これらのプライマーを用いれば、yqkG遺伝子
のコード領域及び隣接領域（約３９０塩基の３’非翻訳
領域）を含むＤＮＡ断片が得られる。

【００１６】上記のようにして得られる本発明のＤＮＡ
のコード領域の塩基配列及びこの配列がコードし得るア
ミノ酸配列を配列番号１に示す。また、アミノ酸配列の
みを配列番号２に示す。これらの配列は、公知のyqkGの
配列と同一であった。

【００１７】メタノールを資化しないバチルス ズブチ
リスが、MDH活性促進因子のようなメタノール資化代謝
に関与する酵素の遺伝子をゲノム上に保持し、しかも、
そこから活性を持つ酵素を発現し得る形で保持し、現在
まで進化してきているとは、当初、全く考えられなかっ
た。仮に、そのような遺伝子を保持していたとしても、
バチルス ズブチリスにとって生育上、不要になった酵
素の遺伝子は、その微生物の進化の過程で無秩序な変異
の導入を受け、活性のないものに変化してしまうと考え
るのが一般的であるからである。

【００１８】本発明者らは、しかしながら、この機能未
知遺伝子yqkGが、実際に酵素活性を発揮しうるアルコー
ル脱水素酵素活性促進因子をコードしているか否かを敢
えて検証する目的で、このオープンリーディングフレー
ム（以下、ORFともいう。）領域をクローニングし、エ
シェリヒア コリを宿主とする強制発現系にて発現させ
た。その結果、発現産物には、後記実施例に示すように
MDH活性を促進する活性が認められた。そこで、本発明
のMDH活性促進因子をコードするＤＮＡは、amd(Activat
or of Methanol dehydrogenase)と命名された。※

【００１９】本発明のＤＮＡは、上記のようにしてＰＣ
Ｒにより取得されたものであるが、本発明のＤＮＡの塩
基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプロー
ブとするハイブリダイゼーションによって、バチルス
ズブチリスの染色体ＤＮＡリブラリーから取得すること
もできる。

【００２０】ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブ
リダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、
ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambroo
k,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, C
old Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)に記
載されている。

【００２１】本発明のＤＮＡは、コードされるMDH活性
促進因子の活性が損なわれない限り、１若しくは複数の
位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むMDH活性促進因子をコードす
るものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ
酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によ
っても異なる。それは、イソロイシンとバリンのよう
に、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在
し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構造に
大きな影響を与えないことに由来する。従って、MDH活
性促進因子を構成するアミノ酸配列全体に対し、３０か
ら４０％以上、好ましくは６０〜８０％以上の相同性を
有し、MDH活性促進因子活性を有するものであってもよ
い。具体的には、前記「数個」は、２から１３０個、好
ましくは、２から５０個、より好ましくは２から２０個
である。

【００２２】上記のようなMDH活性促進因子と実質的に
同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特
異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置
換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列
を改変することによって得られる。また、上記のような
改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっ
ても取得され得る。変異処理としては、MDH活性促進因
子をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビ
トロ処理する方法、及びMDH活性促進因子をコードする
ＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌
を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニト
ロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処
理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げ
られる。

【００２３】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、MDH活性促進因子を保持す
る微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天
然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。

【００２４】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のMDH活性促進因子活性を
調べることにより、MDH活性促進因子と実質的に同一の
タンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異
を有するMDH活性促進因子をコードするＤＮＡまたはこ
れを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記
載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、MDH活性促進因子活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することに
よっても、MDH活性促進因子と実質的に同一のタンパク
質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリ
ンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッ
ドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない
条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難で
あるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例え
ば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダ
イズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダ
イズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ
ーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．
１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げ
られる。

【００２５】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎMDH
活性促進因子活性を前記の方法で測定することによって
容易に取り除くことができる。

【００２６】本発明のMDH活性促進因子をコードするＤ
ＮＡ（amd遺伝子）を、適当な宿主−ベクター系を用い
て発現させることにより、MDH活性促進因子を製造する
ことができる。

【００２７】amd遺伝子を発現させるための宿主として
は、エシェリヒアコリ、バチルスズブチリスをはじめと
する種々の原核細胞、サッカロマイセスセレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）をはじめとする種々の真核細
胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中で
は原核細胞、特にエシェリヒア コリ及びバチルスズブ
チリスが好ましい。尚、バチルス ズブチリスは元々am
d遺伝子を保持しているが、amd遺伝子を強制発現させる
ことによって、MDH活性促進因子を蓄積させることが可
能となる。

【００２８】上記の宿主にamd遺伝子を導入するための
ベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG
299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、p
MW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファー
ジＤＮＡのベクターも利用できる。これらのベクターに
amd遺伝子を連結して得られる組換えベクターで上記宿
主を形質転換することによって、amd遺伝子を導入する
ことができる。また、amd遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０
９９８５号）または相同性組換え（Experiments in Mol
ecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を
用いた方法で宿主のゲノムに組み込んでもよい。

【００２９】また、amd遺伝子の発現を効率的に実施す
るために、MDH活性促進因子をコードするＤＮＡ配列の
上流に、宿主細胞内で働くｌａｃ、ｔｒｐ、Ｐ_L等のプ
ロモーターを連結してもよい。ベクターとして、プロモ
ーターを含むベクターを用いると、amd遺伝子と、ベク
ター及びプロモーターとの連結を一度に行うことができ
る。このようなベクターとしては、ｔｒｐプロモーター
を含むpT13sNco（J. Biochem. 104, 30-34 (1988)に記
載）が挙げられる。

【００３０】形質転換は、例えば、エシェリヒア コリ
K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（ M
andel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）
や、バチルス ズブチリスについて報告されているよう
な、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤ
ＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Yo
ung,F.E.,Gene,1,153(1977)）を用いることができる。
あるいは、バチルス ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、
組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはス
フェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容
菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Ge
n.,Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.
B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929(197
8)）も応用できる。これらの方法は、宿主として用いる
細胞に応じて適宜選択すればよい。

【００３１】上記のようにしてamd遺伝子を導入された
細胞を培地で培養し、MDH活性促進因子を培養物中に生
成蓄積させ、該培養物よりMDH活性促進因子を採取する
ことにより、MDH活性促進因子を製造することができ
る。培養に用いる培地は、用いる宿主に応じて適宜選択
すればよい。宿主としてエシェリヒア コリを用い、MD
H活性促進因子をｔｒｐプロモーターで発現させる場合
には、M9−カザミノ酸−グルコース培地が好ましい。培
養は、37℃で行い、培養開始後数時間後に、ｔｒｐプロ
モーターの誘導剤であるインドールアクリル酸（IAA）
を終濃度25μg/mlになるよう添加し、更に培養を続ける
と、菌体内にMDH活性促進因子が蓄積する。また、適当
な分泌系を用いてMDH活性促進因子を細胞外に分泌生産
させる場合には、MDH活性促進因子は培地中に蓄積す
る。

【００３２】上記のようにして製造されるMDH活性促進
因子は、必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の酵素
の精製法を用いて精製することができる。

【００３３】本発明のMDH活性促進因子をMDH反応液に加
えると、MDHの比活性を高めることができる。したがっ
て、例えば、MDHを用いて試料中のメタノールの含量を
測定する際に利用することができる。本発明のMDH活性
促進因子を用いて酵素活性を促進する対象としては、MD
Hであれば特に制限されないが、例えばバチルス ブレ
ビス、バチルス メタノリカス等が産生するMDHが挙げ
られる。MDH反応液に加えるMDH活性促進因子の量は特に
制限されないが、例えば、MDHとMDH活性促進因子との分
子数比としては、２：１から１：５が使用量の目安であ
る。

【００３４】尚、バチルス ブレビスのMDHは、該MDHを
コードする遺伝子（mdh）をエシェリヒア コリで発現
させることによって取得することができる。バチルス
ブレビスのmdhは、バチルス ブレビス、例えばバチル
ス ブレビスS1株(NCIMB No.12524)株の染色体ＤＮＡか
ら、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号３に
示す塩基配列を有するプライマー（MDH-BM-1）及び配列
表の配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー（MD
H-BM-2）を用いたPCR（ポリメラーゼ・チェイン・リア
クション）により取得することができる。

【００３５】MDH活性は、実施例に示したメタノールか
らホルムアルデヒドへの酸化に伴う、NAD⁺（ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド）の還元化を、波長340nm
光の吸光度を測定する方法によって測定することができ
る。本発明のMDH活性促進因子がMDHの比活性を高める程
度は、反応条件及びMDH活性促進因子の濃度等によって
異なるが、通常、好適な条件下では、比活性を８倍以上
高めることができる。

【００３６】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。

【００３７】＜１＞メタノール資化性バチルス属細菌の
アルコール脱水素酵素活性促進因子とアミノ酸配列の相
同性を有するタンパク質をコードする遺伝子の検索 バチルス メタノリカスC1株のメタノール脱水素酵素活
性促進因子の構造について、ごく一部のアミノ酸配列、
即ちN末端から３６アミノ酸については既に公知である
（The Journal of Biological Chemistry, 266巻, 3955
-3960頁, 1991年）。また、最近、いくつかの微生物ゲ
ノムの全塩基配列が決定され、発表されている。そこ
で、前記アミノ酸配列を基に、タンパク質データベース
であるSWISS-PROT (European Bioinformatics Institut
e (EBI)) Release 34.0 に対して、Genetyx-Macシステ
ム(ソフトウエア開発株式会社）を用いて、アミノ酸配
列の相同性検索を行ったところ、バチルス ズブチリス
の機能未知遺伝子yqkGが高いスコアーで、相同性がある
ものとして呈示された。そこで、このyqkGを、エシェリ
ヒア コリを宿主にして強制発現させ、本当にyqkGがア
ルコール脱水素酵素活性促進因子として機能を有するタ
ンパク質をコードしているかどうかを検証することとし
た。

【００３８】＜２＞バチルス ズブチリスyqkGのクロー
ニングとエシェリヒア コリでのyqkGの強制発現 既に報告されているバチルス ズブチリス168株のゲノ
ム塩基配列の情報を基に、yqkGのオープンリーディング
フレーム(ORF)を含む領域を、PCR法にて増幅した。用い
たDNAプライマーは、BsYqk-G1（配列表の配列番号５）
及びBsYqk-G2（配列表の配列番号６）であった。BsYqk-
G1はその5'端近くに制限酵素ClaIの認識配列を組み込ん
でいる。またBsYqk-G2はその5’端近くに制限酵素BamHI
の認識配列を組み込んでいる。

【００３９】一方、ゲノムは常法（Biochim. Biophy. A
cta, 72, 619-629 (1963))によりバチルス ズブチリス
168株より調製した。また、PCR反応はLA-Taq（宝酒造
（株）製)を用い、94℃、90秒の熱処理の後、98℃-10
秒、58℃-20秒、70℃-1分を28サイクル行い、その後73
℃で3分間保温するというものであった。この反応によ
り目的の大きさのDNA断片を取得した。このDNA断片を精
製後、制限酵素ClaI及びBamHIにて処理し、それらの切
断端を両端に持つyqkG断片を得た。

【００４０】一方、上記DNA断片を発現させる為の高発
現用プラスミドとして、トリプトファンプロモーター(P
trp)を有するプラスミドpT13sNco (J. Biochem., 104,
30-34 (1988)に記載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素Cl
aI及びBamHIにて切断し、得られる大きいDNA断片（ベク
ター部分）を調製した。これに上記yqkG断片をT4-DNAリ
ガーゼにて連結することで、yqkGの発現プラスミドpT-B
sb-yqkG1を構築した。

【００４１】このpT-Bsb-yqkG1を用いてエシェリヒア
コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM10
9/pT-Bsb-yqkG1を得た。この形質転換体JM109/pT-Bsb-y
qkG1はプライベートナンバーAJ13484が付与され、平成1
0年８年12日より、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所(郵便番号305-8566、日本国茨城県つくば市
東一丁目１番３号)に寄託されており、受託番号FERM P-
16938が付与されている。一方、対照株としては、pT13s
Ncoのベクター部分であるpTTNcoを保持するエシェリヒ
ア コリ JM109株(JM109/pTTNco)を用いた。

【００４２】これらの形質転換体を、抗生物質アンピシ
リン100mg/Lを含むM9-カザミノ酸-グルコース培地(M9-C
A-Glc培地)で、37℃にて培養し、約２時間後に、Ptrpか
らの転写の誘導剤であるインドールアクリル酸(IAA)を
終濃度25μg/mlになるように添加し、更に培養を６時間
続け、その後、培養液４mlを集菌した。この菌体へ、懸
濁用の緩衝液（50mMリン酸カリウム(pH7.6)、 3mM塩化
マグネシウム、1mMジチオスレイトール）を1ml添加して
菌体を懸濁した。次に、菌体を超音波破砕後、遠心分離
（15000rpm、30分）し、可溶性画分を被検標品とした。

【００４３】＜３＞バチルス ブレビスmdhのクローニ
ングとエシェリヒア コリでのmdhの強制発現 上記被検標品についてMDH活性促進活性を検証するため
に、メタノール脱水素酵素を以下のようにして調製し
た。メタノール資化性の高温耐性バチルスであるバチル
ス ブレビスS1株(NCIMB No.12524)（NCIMBより入手）
より、常法に従って染色体DNAを調製した。そしてこのD
NAを鋳型として、PCR法によりMDH遺伝子をクローニング
した。

【００４４】用いたDNAプライマーは、MDH-BM-1（配列
表の配列番号３）及びMDH-BM-2（配列表の配列番号４）
であった。これは、既に公知のバチルス メタノリカス
C1株のMDH遺伝子の塩基配列（GenBankに、エントリーネ
ーム BACMDHとして登録されている）を参考に作製され
たものである。またPCR反応は、LA-Taq（宝酒造（株）
製)を用い、94℃、90秒の熱処理の後、98℃-10秒、55℃
-30秒、70℃-4分を30サイクル行い、その後72℃で10分
間保温するというものであった。この反応により目的の
大きさのDNA断片を取得した。このDNA断片を精製後、市
販のベクターpCR2.1へクローニングし、pCP-mdh24-1を
得た。更に、これをエシェリヒア コリJM109株へ導入
し、形質転換体pCR-mdh24-1/JM109を作成した。

【００４５】形質転換体pCR-mdh24-1/JM109を、抗生物
質アンピシリン100mg/Lを含むLB培地25mlで37℃下、一
晩振とう培養した。その後、上記のyqkG遺伝子産物の調
製時と同様に、菌体を遠心分離により集菌し、これに緩
衝液を加え懸濁後、超音波により菌体破砕を行った、そ
して再び遠心分離し、メタノール脱水素酵素を含む可溶
性画分を調製した。

【００４６】上記MDH酵素標品について、MDH活性を測定
した。活性測定法はメタノールからホルムアルデヒドへ
の酸化に伴う、NAD⁺（ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド）の還元化を、波長340nm光の吸光度を測定する
という方法を用いた。

【００４７】具体的には、反応液〔50mMグリシン／水酸
化カリウム緩衝液(pH9.5)、2mM硫酸マグネシウム、0.1m
M ジチオスレイトール、1mM NAD⁺〕を、0.9mlずつ分光
光度計用のキュベット（目的標品用と対照用）に入れ、
50℃で５分間保温した。その後、標品用のキュベットに
菌体可溶性画分を0.05ml添加、混合し、吸光度の上昇を
測定し、反応のバックグラウンドを確認した。つづい
て、対照用のキュベットに水0.1mlを、標品用のキュベ
ットには12Mメタノールを0.05ml加えることで反応を開
始し、NAD⁺の還元に伴う340nm波長光の吸光度上昇を指
標にメタノール脱水素酵素活性を測定した。

【００４８】その結果、形質転換体pCR-mdh24-1/JM109
から得られた細胞抽出液を用いた場合は、対照株JM109/
pTTNcoの場合と比較して、有意なメタノール脱水素酵素
活性を検出した。

【００４９】＜４＞YqKGによるMDH酵素活性の促進作用 次に、上記＜２＞のごとく調製した形質転換体JM109/pT
-Bsb-yqkG1由来の可溶性酵素画分が、MDHの酵素活性を
促進できるかどうかを検定した。

【００５０】JM109/pTTNcoの可溶性画分（対照）又はJM
109/pT-Bsb-yqkG1（目的標品）の可溶性画分0.04mlと、
pCR-mdh24-1/JM109の可溶性画分（MDH酵素標品）0.04ml
を事前に混合し、これらの混合液0.08mlを活性測定用の
キュベット中の反応液〔50mMグリシン／水酸化カリウム
緩衝液(pH9.5)、2mM硫酸マグネシウム、0.1mM ジチオス
レイトール、1mM NAD⁺〕0.9mlへ添加し、メタノール脱
水素酵素活性を測定した。

【００５１】その結果、JM109/pT-Bsb-yqkG1の可溶性画
分中には、JM109/pTTNcoの可溶性画分に比べてMDH活性
を２倍以上に促進できる活性があることが判明した（表
１）。

【００５２】

【表１】 表１アルコール脱水素酵素の活性促進因子による酵素反応の促進 ────────────────────────────────── 添加した試料¹⁾ ΔOD340nm ／分 活性化率(%)²⁾ ────────────────────────────────── JM109/pT-Bsb-yqkG1 0.792 250 JM109/pTTNco (対照) 0.318 100 ────────────────────────────────── 1)：アルコール脱水素酵素を含む粗酵素画分に添加した試料 2)：対照試料でのアルコール脱水素酵素活性を100％とした時の値

【００５３】＜５＞配列表の説明 配列番号１：活性化因子YqkGのアミノ酸配列 配列番号２：yqkGのコード領域の塩基配列 配列番号３：MDHのPCRクローニング用の上流プライマー
MDH-BM-1 配列番号４：MDHのPCRクローニング用の下流プライマー
MDH-BM-2 配列番号５：yqkGのPCRクローニング用の上流プライマ
ーBS-YQKG1-1 配列番号６：yqkGのPCRクローニング用の下流プライマ
ーBs-YqkG2-2 配列番号７：バチルス メタノリカスC1株のMDH活性化
因子のアミノ末端配列

【００５４】

【発明の効果】本発明によりメタノール脱水素酵素の新
規な活性促進因子が提供される。このMDH活性促進因子
は、メタノール脱水素酵素の反応メカニズム解析の基礎
研究から、目的試料中のアルコール濃度の検出といった
産業上重要な工程に利用可能である。また、本発明によ
れば、アルコール脱水素酵素活性促進因子をコードする
DNAが得られ、該因子を効率よく生産することが可能と
なり、従って、本因子を大量に安価に提供することがで
きる。

【００５５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING

【００５６】 <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> アルコール脱水素酵素の新規活性促進因子及びその遺伝子 <130> P-5916 <141> 1998-09-02 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００５７】 <210> 1 <211> 555 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(555) <400> 1 atg aaa tca tta gaa gaa aaa aca att gcc aaa gaa cag att ttt tcg 48 Met Lys Ser Leu Glu Glu Lys Thr Ile Ala Lys Glu Gln Ile Phe Ser 1 5 10 15 ggt aaa gtc att gat ctt tat gtc gag gat gta gag ctg cca aac ggc 96 Gly Lys Val Ile Asp Leu Tyr Val Glu Asp Val Glu Leu Pro Asn Gly 20 25 30 aaa gcc agt aaa cgt gaa att gtg aaa cac cct gga gct gta gcg gta 144 Lys Ala Ser Lys Arg Glu Ile Val Lys His Pro Gly Ala Val Ala Val 35 40 45 cta gcc gtc aca gat gaa ggg aaa atc atc atg gtc aaa caa ttc cgt 192 Leu Ala Val Thr Asp Glu Gly Lys Ile Ile Met Val Lys Gln Phe Arg 50 55 60 aag ccg ctt gag cgg acg atc gtt gaa att ccg gcc ggt aag ctt gaa 240 Lys Pro Leu Glu Arg Thr Ile Val Glu Ile Pro Ala Gly Lys Leu Glu 65 70 75 80 aaa ggt gag gag ccg gag tat acg gca ctt cgg gaa ctt gaa gag gaa 288 Lys Gly Glu Glu Pro Glu Tyr Thr Ala Leu Arg Glu Leu Glu Glu Glu 85 90 95 acc ggt tat aca gca aaa aaa ctg aca aaa ata act gcg ttt tat aca 336 Thr Gly Tyr Thr Ala Lys Lys Leu Thr Lys Ile Thr Ala Phe Tyr Thr 100 105 110 tca ccc gga ttt gca gat gaa atc gtt cac gtt ttt ctt gct gag gag 384 Ser Pro Gly Phe Ala Asp Glu Ile Val His Val Phe Leu Ala Glu Glu 115 120 125 ctt tct gtg ctt gaa gaa aaa cgg gag ctt gat gag gac gag ttt gtt 432 Leu Ser Val Leu Glu Glu Lys Arg Glu Leu Asp Glu Asp Glu Phe Val 130 135 140 gaa gtg atg gag gtg acg ctt gaa gat gcg cta aag ctg gtt gaa tcg 480 Glu Val Met Glu Val Thr Leu Glu Asp Ala Leu Lys Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 cgt gaa gta tat gat gct aaa aca gcc tac gcg att cag tat ctt cag 528 Arg Glu Val Tyr Asp Ala Lys Thr Ala Tyr Ala Ile Gln Tyr Leu Gln 165 170 175 ctg aaa gaa gcg ctc caa gca caa aaa 555 Leu Lys Glu Ala Leu Gln Ala Gln Lys 180 185

【００５８】 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Lys Ser Leu Glu Glu Lys Thr Ile Ala Lys Glu Gln Ile Phe Ser 1 5 10 15 Gly Lys Val Ile Asp Leu Tyr Val Glu Asp Val Glu Leu Pro Asn Gly 20 25 30 Lys Ala Ser Lys Arg Glu Ile Val Lys His Pro Gly Ala Val Ala Val 35 40 45 Leu Ala Val Thr Asp Glu Gly Lys Ile Ile Met Val Lys Gln Phe Arg 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Arg Thr Ile Val Glu Ile Pro Ala Gly Lys Leu Glu 65 70 75 80 Lys Gly Glu Glu Pro Glu Tyr Thr Ala Leu Arg Glu Leu Glu Glu Glu 85 90 95 Thr Gly Tyr Thr Ala Lys Lys Leu Thr Lys Ile Thr Ala Phe Tyr Thr 100 105 110 Ser Pro Gly Phe Ala Asp Glu Ile Val His Val Phe Leu Ala Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Val Leu Glu Glu Lys Arg Glu Leu Asp Glu Asp Glu Phe Val 130 135 140 Glu Val Met Glu Val Thr Leu Glu Asp Ala Leu Lys Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 Arg Glu Val Tyr Asp Ala Lys Thr Ala Tyr Ala Ile Gln Tyr Leu Gln 165 170 175 Leu Lys Glu Ala Leu Gln Ala Gln Lys 180 185

【００５９】 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer MDH-BM-1

【００６０】 <400> 3 taaaaaggat ccccgatgat acaacaccaa acgg 34

【００６１】 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer MDH-BM-2 <400> 4 gaccgaattc catgtagttt ttcctcattc acc 33

【００６２】 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer BS-YQKG1-1 <400> 5 gggaatcgat aaaatgaaat cattagaaga aaaaacaatt gcc 43

【００６３】 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer Bs-YqkG2-2 <400> 6 taaatggatc cttttcagcc gggctgacag ccagtttg 38

【００６４】 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Bacillus methanolicus <400> 7 Gly Lys Leu Phe Glu Glu Lys Thr Ile Lys Thr Glu Gln Ile Phe Ser 1 5 10 15 Gly Arg Val Val Lys Leu Gln Val Asp Asp Arg Glu Tyr Pro Asn Gly 20 25 30 Gln Thr Val Lys 35

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 BA80 CA03 DA01 DA02 DA06 DA07 DA12 EA03 EA04 FA17 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA13 4B065 AA19X AA19Y AA26X AA57X AA87X AB01 AC14 BA01 BA02 BA17 BA18 CA24 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 CA11 EA50 FA72 FA74

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
   質。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
   るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
   加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、メタ
   ノール脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク
   質。
2. 【請求項２】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
   るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
   加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、メタ
   ノール脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク
   質。
3. 【請求項３】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項２記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
   Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
   ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メタノー
   ル脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパク質を
   コードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載のＤＮＡが、該ＤＮ
   Ａがコードするタンパク質が発現可能な形態で導入され
   た細胞。
5. 【請求項５】 請求項４記載の細胞を培地で培養し、メ
   タノール脱水素酵素活性を促進する活性を有するタンパ
   ク質を培養物中に生成蓄積させ、該培養物より該タンパ
   ク質を採取することを特徴とする、メタノール脱水素酵
   素活性を促進する活性を有するタンパク質の製造法。