JPH0614780A

JPH0614780A - α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング方法

Info

Publication number: JPH0614780A
Application number: JP19471392A
Authority: JP
Inventors: Yuki Taguchi; 由紀田口; Yoshizumi Ishino; 良純石野; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1992-06-30
Filing date: 1992-06-30
Publication date: 1994-01-25

Abstract

(57)【要約】【目的】 α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（以下、α遺
伝子と略記する）をクローニングする方法、及び新規な
α遺伝子を提供する。【構成】（ａ）α遺伝子を、配列表の配列番号１又は
２で表されるプライマーを用いて増幅させる工程、
（ｂ）増幅ＤＮＡをプローブとし、それにハイブリダイ
ズするα遺伝子をクローニングする工程、を包含するα
遺伝子のクローニング方法。図４で表される制限酵素地
図を有し、その長さが約２．６kbであるＤＮＡを含有す
る単離された、あるいは該遺伝子にハイブリダイズ可能
なα遺伝子。【効果】該α遺伝子を用い、遺伝子工学研究用試薬と
して有用なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造が可
能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学研究用試薬
として有用なα型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝
子のクローニング方法、及びクローニングされたα型Ｄ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡポリメラーゼは、そのアミノ酸配
列からヒトＤＮＡポリメラーゼαを代表とするα型ＤＮ
Ａポリメラーゼと、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを代表す
るポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼとに大きく分類すること
ができる。これらは、種々の阻害剤に対する感受性でも
区別でき、α型ＤＮＡポリメラーゼは、例えばアフィジ
コリン（ aphidicolin )やブチルアニリノウラシル（ b
utylanilinouracil ) によって選択的に阻害される。α
型ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの複製において主要な
役割を果たす酵素で、ヒト由来ＤＮＡポリメラーゼα、
酵母由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、単純ヘルペスウイルス
由来ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトサイトメガロウイルス由
来ＤＮＡポリメラーゼ、エプスタイン−バーウイルス由
来ＤＮＡポリメラーゼ、ワクチニアウイルス由来ＤＮＡ
ポリメラーゼ、大腸菌由来のポリメラーゼII、アデノウ
イルス２型由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＤ１ファージ
由来ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９ファージ由来ＤＮＡポ
リメラーゼ等が知られている。しかし、一般的にα型Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、存在量が少ない上に不安定であ
り、構造的にも他のタンパク質と複合体を形成している
ため、高度に純化した精製標品を得ることは難しく、そ
の詳細な解析はなされていない。一般にＤＮＡポリメラ
ーゼはその起源による酵素特異性を有しており、その性
質を生かした利用法がある。例えば、スルホロバスソ
ルファタリカス（ Sulfolobus solfataricus )は生育至
適温度が８０℃である高熱性古細菌であり、この細菌由
来のα型ＤＮＡポリメラーゼは高温で安定であることが
予想され、遺伝子工学研究用試薬として有用な用途が期
待される。

【０００３】しかしながら、該ＤＮＡポリメラーゼは、
菌体内にごく微量しか存在しないためこれまで単離され
た該酵素に関する報告はその活性の測定にとどまり〔ロ
ッシＭ.( Rossi, Ｍ.)ら、システマティックアンド
アプライドマイクロバイオロジー（ Systematic and
Applied Microbiology )、第７巻、第３３７〜３４１頁
（１９８６）〕、詳細については明らかでない。また、
この酵素の遺伝子構造やアミノ酸配列についても不明で
あり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベクターに結合し
て遺伝子工学的に発現させる方法についても明らかにさ
れていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
なα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、該遺伝子を
簡便に効率よくクローニングする方法、及び該方法によ
り単離された新規α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を提供
することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、α型ＤＮＡポリメラーゼのクロー
ニング方法に関し、α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をク
ローニングする方法において、下記工程：（ａ）α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、配列表の配列
番号１〜６で表されるプライマーから選択されるプライ
マーを用い、増幅させる工程、（ｂ）増幅ＤＮＡをプロ
ーブとして用い、該プローブにハイブリダイズするα型
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする工程、を
包含することを特徴とする。本発明の第２の発明は、単
離されたα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関し、図面の
図４で表される制限酵素地図を有し、その長さが約２．
６kbであるＤＮＡを含有することを特徴とする。また、
本発明の第３の発明は、第２の発明のα型ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子にハイブリダイズ可能なα型ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子に関する。

【０００６】本発明者らは、目的のα型ＤＮＡポリメラ
ーゼの遺伝子構造やアミノ酸配列を解析することなく、
短時間に効率よく、α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のク
ローニングを行う方法として、α型ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子の増幅に使用可能なプライマーを創製することに
成功し、該プライマーを用いることによって、未知のα
型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部を増幅できること、
及び該増幅遺伝子をプローブとして用いることによって
目的のα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が効率よくクロー
ニングできること、及びクローニングした遺伝子を用い
α型ＤＮＡポリメラーゼを遺伝子工学的に効率よく得る
ことができることを見出し、本発明を完成させた。

【０００７】以下、本発明を具体的に説明する。まず、
公知のα型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較
し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてミックス
プライマーを合成する。α型ＤＮＡポリメラーゼのアミ
ノ酸配列については例えば、ジエンボジャーナル
( The EMBOJournal ) 、第７巻、第３７〜４７頁（１９
８８）、プロシーディングズオブザナショナルア
カデミーオブサイエンシーズオブザＵＳＡ
（ Proceedings of the National Academy of Sciences
of the ＵＳＡ）、第８５巻、第３７７２〜３７７６
頁（１９８８）、プロシーディングズオブザナシ
ョナルアカデミーオブサイエンシーズオブザ
ＵＳＡ、第８２巻、第７９６９〜７９７３頁（１９８
５）、ジャーナルオブヴィロロジー（ Journal of
Virology )、第６１巻、第１２５〜１３３頁（１９８
７）、ジエンボジャーナル、第６巻、第１６９〜１７
５頁（１９８７）にそれぞれ記載されている、ヒト由来
ＤＮＡポリメラーゼα、酵母由来ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、単純ヘルペスウイルス由来ＤＮＡポリメラーゼ、ヒ
トサイトメガロウイルス由来ＤＮＡポリメラーゼ、エプ
スタイン−バーウイルス由来ＤＮＡポリメラーゼのアミ
ノ酸配列、またウォン T. S. -F.らによって報告され
た、これらに共通のアミノ酸配列〔ウォン T. S. -F.(
Wang T. S. -F.) ら、ザファーセブジャーナル（ T
heFASEB Journal )、第３巻、第１４〜２１頁（１９８
９）〕等より、本発明において使用するミックスプライ
マー作製用のα型ＤＮＡポリメラーゼの共通アミノ酸配
列を選定する。

【０００８】配列表の配列番号１に、ヒト由来ＤＮＡポ
リメラーゼα、酵母由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、由来ヘ
ルペスウイルス由来ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトサイトメ
ガロウイルス由来ＤＮＡポリメラーゼ、エプスタイン−
バーウイルス由来ＤＮＡポリメラーゼに共通の配列表の
配列番号７で表されるアミノ酸配列より作製されたミッ
クスプライマーの配列を示す。次に該配列を基に、ＧＣ
含量の低い、例えば配列表の配列番号２で表すＡＴ型の
ミックスプライマーを、またＧＣ含量の高い、例えば配
列表の配列番号３で表すＧＣ型のミックスプライマーを
それぞれ作製することができる。このＡＴ型のミックス
プライマーはＧＣ含量の低いα型ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子の増幅に、ＧＣ型のミックスプライマーはＧＣ含量
の高いα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の増幅に適してい
る。

【０００９】配列表の配列番号４に、ヒト由来ＤＮＡポ
リメラーゼα、ヒトサイトメガロウイルス由来ＤＮＡポ
リメラーゼ、エプスタイン−バーウイルス由来ＤＮＡポ
リメラーゼに共通の配列表の配列番号８で表されるアミ
ノ酸配列より作製されたミックスプライマーの配列を示
す。該配列を基に、ＧＣ含量の少ない、例えば配列表の
配列番号５で表すＡＴ型のミックスプライマーを、また
ＧＣ含量の多い、例えば配列表の配列番号６で表すＧＣ
型のミックスプライマーをそれぞれ作製することができ
る。この場合もＡＴ型のミックスプライマーはＧＣ含量
の低いα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の増幅に、ＧＣ型
のミックスプライマーはＧＣ含量の高いＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子の増幅に適している。

【００１０】なお、本発明で使用できるα型ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとしては、該遺伝子
の共通配列にハイブリダイズし、該遺伝子を効率よく増
幅できるものであれば良く、上記ミックスプライマーを
改変したものでも良く、また、他の共通配列より構築し
たものでも良い。また、該プライマーを用い、α型ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を増幅する方法としては、該遺伝
子を効率よく増幅できる方法であれば良く、例えば、ポ
リメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法又は
その改良法を用いればよい。ＰＣＲ法に使用するプライ
マー対としては上記ミックスプライマーを組合せて用い
ても良く、また該プライマーを他の遺伝子構造、例えば
ベクター由来のプライマーと組合せ用いても良い。例え
ば、配列番号２及び５で示すＡＴ型のミックスプライマ
ーは、ＧＣ含量の低い染色体ＤＮＡからα型ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子をクローニングする際に選択すればよ
く、また、配列番号３及び６で示すＧＣ型のミックスプ
ライマーは、ＧＣ含量の高い染色体ＤＮＡからα型ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子をクローニングする際に選択すれ
ばよい。また、ＧＣ含量が中程度若しくはＧＣ含量につ
いての情報が得られない場合は、配列番号１及び４で示
す中間型のミックスプライマーを用いればよい。

【００１１】例えば、上述のＡＴ型のミックスプライマ
ーの組合せでスルホロバスソルファタリカス由来の、
ＧＣ型のミックスプライマーの組合せでバチルスカル
ドテナックス（ Bacillus caldotenax )由来の、中間型
のミックスプライマーの組合せで大腸菌、バチルスカ
ルドリティカス（Ｂ．caldolyticus )、バチルスズブ
チリス（Ｂ．subtilis )、ラクトバチルスブルガリカ
ス（ Lactobacillus bulgaricus ) 、ラクトバチルス
カゼイ（Ｌ．casei ) 由来のα型ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子又は該遺伝子と推定される遺伝子をＰＣＲ法にて効
率よく増幅することができ、これらのプライマー対はα
型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングに有用なＰ
ＣＲ用プライマー対として使用することができる。

【００１２】α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニ
ング、及び該遺伝子を含む形質転換体、α型ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子の取得は、次に例示する工程により行う
ことができる。（１）α型ＤＮＡポリメラーゼ産生能を有する細胞、ウ
イルス、あるいはファージから染色体ＤＮＡを抽出す
る。（２）α型ＤＮＡポリメラーゼに共通な領域の情報を基
に作成した、配列表の配列番号１〜６で表されるプライ
マーから選択されるプライマーを用い、（１）で得たＤ
ＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。（３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得たＤＮＡ断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするＤＮＡ断片を回収す
る。（４）ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
（３）で得たＤＮＡ断片を結合させる。（５）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。（６）（５）で得た形質転換体からプラスミドを取り出
し、目的のＤＮＡ断片を切り出して制限酵素地図を作成
し、これを基に必要に応じ目的の遺伝子全体を含む連続
した一本の断片に再編成し、（４）と同様の要領で発現
ベクターに結合させる。（７）（６）で得た目的のＤＮＡ断片を含む発現ベクタ
ーを（５）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。（８）（７）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
ＤＮＡポリメラーゼを生産する。

【００１３】本発明に使用する菌株、ウイルス、ファー
ジとしては、α型ＤＮＡポリメラーゼを産生するもので
あれば何でもよく、例として、スルホロバスソルファ
タリカスＰ１株〔ドイッチェザムルンクフォンミ
クロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von Mikroorg
anismen ) の保存菌株：ＤＳＭ１６１６^T〕、バチルス
カルドテナックスＹＴ−Ｇ株〔ドイッチェザムルン
クフォンミクロオルガニスメンの保存菌株：ＤＳＭ
４０６〕、大腸菌ＨＢ１０１株がある。

【００１４】以下、該菌株を例として説明する。上記Ｄ
ＮＡ供与体であるスルホロバスソルファタリカスＰ１
株（ＤＳＭ１６１６^T）由来ＤＮＡは、８０℃で静置培
養した該培養菌体より抽出し、バチルスカルドテナック
スＹＴ−Ｇ株〔ＤＳＭ４０６）由来ＤＮＡは、７０℃で
振とう培養した該培養菌体より抽出し、大腸菌ＨＢ１０
１株由来ＤＮＡは、３７℃で振とう培養した該培養菌体
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は、
例えば、１９８２年コールドスプリングハーバー
ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Maniatis )
ほか著、モレキュラークローニング、アラボラトリ
ーマニュアル（ Molecular Cloning, Ａ Laboratory
Manual )、第７５〜１７８頁に記載されている方法を用
いることができる。

【００１５】本発明者らは、ＧＣ含量の低いスルホロバ
スソルファタリカスＰ１株（約３６％）には配列表の
配列番号２及び５に示す２種のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとし、ＧＣ含量の高いバチルスカルドテナッ
クスＹＴ−Ｇ株（約６５％）には配列表の配列番号３及
び６に示す２種のオリゴヌクレオチドをプライマーと
し、大腸菌ＨＢ１０１株（約４９％）には配列表の配列
番号１及び４に示す２種のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとし、それぞれの染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、Ｐ
ＣＲ法により特異的なＤＮＡ断片が増幅することを見出
した。得られた断片の塩基配列から推定されるアミノ酸
配列は、公知の他のα型ＤＮＡポリメラーゼと類似して
いた。したがって、該ＤＮＡ断片をプローブに用いてハ
イブリダイゼーションを行うことにより目的のＤＮＡを
選択することができる。

【００１６】以下には、スルホロバスソルファタリカ
スについて述べる。まず、サザンハイブリダイゼーショ
ンを行い、目的のα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がスル
ホロバスソルファタリカスＤＮＡのどの制限酵素断片
上に存在するかを分析し、次に選択した制限酵素例えば
EcoRＩ、Hind III等を用いて分解したスルホロバスソ
ルファタリカスＤＮＡをプラスミドベクターにＤＮＡリ
ガーゼを用いて組込む。プラスミドベクターとしては公
知のものが使用でき、例えばpUC18 、pUC19 、pTV118N
、pTV119N 等が挙げられるがこれらに限定されるもの
ではない。

【００１７】次いで、これら組換えプラスミドを宿主大
腸菌に導入させる。宿主大腸菌としては、形質転換能を
有するものであれば野生株、変異株のいずれも使用でき
るが、制限系変異株で修飾系野生株（ｒ^-、ｍ⁺）であ
ることが望ましい。形質転換体をプラスミドベクターの
特性、例えばｐＵＣ系ベクターの場合アンピシリン耐性
を有するコロニーを選択することにより、クローン化さ
れたＤＮＡの集団を調製することができる。次に、上記
集団の中から目的の断片を有するクローンを選択する。
選択の方法はベクターの種類によってコロニーハイブリ
ダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーショ
ンを用いればよい。

【００１８】以上の操作によりα型ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子を含む約７kbのHind III断片がpTV119N に組込ま
れたクローン体を得た。サブクローニングされたＤＮＡ
断片の制限酵素地図を図２に示す。次に、このクローン
体の部分的なシークエンス結果を基にα型ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子を含む約３．８kbの領域をこのクローン体
から切り出し、発現ベクターpTV118N に組込んだ。該プ
ラスミドをpSPA101 と命名した。

【００１９】プラスミドpSPA101 を有する大腸菌を培養
し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液は７５℃、３０分
処理後も十分量のＤＮＡポリメラーゼ活性を示し、発現
ベクターのみを有する大腸菌粗抽出液ではこのような活
性を有しないことより、pSPA101 上に耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ産生情報が存在し、かつ、大腸菌内で該情報を
有する遺伝子が発現していると結論した。また、該ＤＮ
Ａポリメラーゼの活性がアフィジコリンにより阻害され
ることにより、α型のＤＮＡポリメラーゼであることを
確認した。

【００２０】プラスミドpSPA101 の構築工程を図１に示
す。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、プラスミドpSPA101
上の約３．８kbのＤＮＡ断片中にコードされており、該
断片の制限酵素地図を図３に示す。

【００２１】プラスミドpSPA101 を保有する大腸菌を培
養し、耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼを発現させた培養
菌体より、耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼの採取を行う
ことができる。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱
処理、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカ
ラムクロマトグラフィー、ヘパリン−トヨパール（ Hep
arin−TOYOPEARL ) カラムクロマトグラフィーの各処理
を行い、α型ＤＮＡポリメラーゼをＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でほぼ単一
のバンドとなるまで精製することができる。得られたＤ
ＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成活性を有し、その活性
はアフィジコリンにより阻害される。

【００２２】精製タンパク質のアミノ酸分析を行い、そ
のＮ末端のアミノ酸配列を決定することができる。その
配列を配列表の配列番号９に示す。このアミノ酸配列、
分子量等より前述３．８kb断片中の翻訳可能領域を、本
発明のα型ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子と決定し、
該ＤＮＡポリメラーゼの全アミノ酸配列を明らかにし
た。その塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１
０に示す。

【００２３】部位特異的変異の手法により、プラスミド
pSPA101 から約３．８kbの断片中の５′側非翻訳領域を
すべて除いた発現プラスミドを構築し、該プラスミドを
pSPA102 と命名した。図４にpSPA102 にクローニングさ
れている約２．６kbのＤＮＡ断片の制限酵素地図を、図
５にプラスミドpSPA102 の構築工程を示す。

【００２４】以上、詳細に説明した様に、本発明によれ
ば、従来のα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニン
グに必要であった、被検物α型ＤＮＡポリメラーゼ活性
の確認、該ポリメラーゼの生産、精製、単離、部分アミ
ノ酸配列の決定、プローブの作製等の工程が不要であ
り、被検物遺伝子より、目的のα型ＤＮＡポリメラーゼ
を効率よく、簡便に単離することができる。

【００２５】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。

【００２６】実施例１ α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子クローニング用プローブ
の調製（１）プライマーの調製配列表の配列番号１〜６に示した６種類のミックスプラ
イマーをＤＮＡ合成機で合成し、精製した。次に、これ
らのプライマーのうち配列表の配列番号１及び配列番号
４に示したプライマーをそれぞれ１００pmolとバチルス
カルドリティカス、バチルスズブチリス、ラクトバ
チルスブルガリカス、ラクトバチルスカゼイからそ
れぞれ調製したＤＮＡ０．５μｇを用いて全量１００μ
ｌで９４℃３０秒、４０℃２分、７２℃１分のＰＣＲを
３５サイクル行った。５μｌをとりアガロースゲル電気
泳動で分析した結果、いずれもＤＮＡ断片が特異的に増
幅していた。

【００２７】（２）スルホロバスソルファタリカス染
色体ＤＮＡの調製スルホロバスソルファタリカスＰ１株を４００mlの培
地（酵母エキス１．０ｇ／ｌ、カザミノ酸１．０ｇ／
ｌ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ３．１ｇ／ｌ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄
２．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．２０ｇ／
ｌ、ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ ₂ Ｏ０．２５ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ
₂ ・４Ｈ₂ Ｏ１．８mg／ｌ、Ｎａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇・１０Ｈ₂
Ｏ４．５mg／ｌ、ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．２２m
g／ｌ、ＣｕＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ０．０５０mg／ｌ、Ｎ
ａ₂ ＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ０．０３０mg／ｌ、ＶＯＳＯ
₄ ・２Ｈ₂ Ｏ０．０３０mg／ｌ、ＣｏＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ０．０１０mg／ｌ、ｐＨ４．１）で８０℃一夜静置
培養し、集菌した菌体を４mlの２５％ショ糖、０．０５
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム
（５mg／ml）を８００μｌ加えて２０℃、１時間放置し
た。ＳＥＴ溶液〔２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ〕を２４ml
加えた後、５％ＳＤＳ溶液を４mlとプロティナーゼＫ
（１０mg／ml）を４００μｌ加えて３７℃、１時間放置
した。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノ
ールを加えて長鎖ＤＮＡを不溶化し、滅菌したつまよう
じで巻取って回収した。以上の操作により、約１８５μ
ｇのＤＮＡが得られた。

【００２８】（３）バチルスカルドテナックス染色体
ＤＮＡの調製バチルスカルドテナックスＹＴ−Ｇ株を１２５mlのＬ
培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で６５℃一夜振
とう培養し、集菌した菌体から（１）と同様の操作によ
り、約３．１mgのＤＮＡを回収した。

【００２９】（４）大腸菌染色体ＤＮＡの調製大腸菌ＨＢ１０１株を１００mlのＬ培地で３７℃一夜振
とう培養し、集菌した菌体から（１）と同様の操作によ
り、約５mgのＤＮＡを回収した。

【００３０】（５）ＰＣＲを用いた特異的ＤＮＡ断片の
増幅配列表の配列番号２及び配列番号５に示した２種類のミ
ックスプライマーをそれぞれ１００pmolと（２）で調製
したスルホロバスソルファタリカスＤＮＡ０．５μｇ
を用いて全量１００μｌで９４℃３０秒、４０℃２分、
７２℃１分のＰＣＲを３５サイクル行った。５μｌをと
りアガロースゲル電気泳動で分析した結果、約４００塩
基対のＤＮＡ断片が特異的に増幅していた。同様にして
配列表の配列番号３及び配列番号６に示した２種類のミ
ックスプライマーを用いた場合は非特異的な増幅のみが
認められた。

【００３１】次に、配列表の配列番号３及び配列番号６
に示した２種類のミックスプライマーをそれぞれ１００
pmolと（３）で調製したバチルスカルドテナックスＤ
ＮＡ０．５μｇを用いて同様にＰＣＲを行ったところ、
約３００塩基対のＤＮＡ断片が特異的に増幅していた。
同様にして配列表の配列番号２及び配列番号５に示した
２種類のミックスプライマーを用いた場合は非特異的な
増幅のみが認められた。

【００３２】次に配列表の配列番号１及び配列番号４に
示した２種類のミックスプライマーをそれぞれ１００pm
olと（４）で調製した大腸菌ＤＮＡ０．５μｇを用いて
同様にＰＣＲを行ったところ、約４００塩基対のＤＮＡ
断片が特異的に増幅していた。

【００３３】これらのＤＮＡ断片をHindIIで開裂したpU
C118に組込みジデオキシ法により塩基配列を分析した。
得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、公知
の他のα型ＤＮＡポリメラーゼと類似していた。したが
って、該ＤＮＡ断片をプローブとして用いることができ
る。

【００３４】実施例２スルホロバスソルファタリカス由来α型ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子のクローニング（１）ゲノミックサザン法による目的遺伝子の検索スルホロバスソルファタリカスＤＮＡを１つの酵素に
つき４μｇを用いてBamHＩ、EcoRＩ、Hind III、 PstＩ
で分解し、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中の
ＤＮＡをナイロン膜に移し、実施例１−（５）で得た約
４００塩基のＤＮＡをプローブに用いてハイブリダイゼ
ーションを行った。プローブはランダムプライミング法
により放射性標識した。ハイブリダイゼーションは、６
×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５×デンハーツ溶液、１００μ
ｇ／mlの子牛胸腺ＤＮＡ中で６５℃５時間行った。１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で１時間洗浄した後、Ｘ
線フィルムに感光し、オートラジオグラムをとった。約
９kbのBamHＩ断片、約８kbのEcoRＩ断片、約６．５kbの
Hind III断片、約９kbの PstＩ断片が陽性を示した。

【００３５】（２）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローン化（１）で陽性を示したＤＮＡ断片のうち、EcoRＩ（約８
kb）及びHind III（約６．５kb）の断片をプラスミドベ
クターにクローン化するため、スルホロバスソルファ
タリカスＤＮＡをそれぞれ５μｇずつ各酵素で分解し、
目的の大きさのＤＮＡをアガロースゲルより回収した。
回収は、ガラスビーズ吸着法を用いた。pTV119N プラス
ミドをそれぞれ同じ酵素で開環し、アルカリ性ホスファ
ターゼ（ＢＡＰ）で末端のリン酸基を除去した。回収し
たＤＮＡをこのベクターにＤＮＡリガーゼを用いて結合
した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転
換体の集団の中からコロニーハイブリダイゼーションに
よって目的のクローンを選択した。ナイロン膜上に生育
させた形質転換体のコロニーを０．５Ｎ水酸化ナトリウ
ム、１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で変性させた後、１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液で中和し、紫外線照射でＤＮＡを膜上に固定し
た。プローブ調製及びハイブリダイゼーションの条件は
（１）に準じた。HindIII の８６個のコロニーより、１
個の陽性コロニーを得た。

【００３６】（３）クローン化断片の制限酵素分析、部
分シークエンス、及びＤＮＡポリメラーゼ遺伝子発現用
プラスミドの再構築（２）で得た陽性クローンのＤＮＡ断片について、制限
酵素地図を作製し、一部の塩基配列を決定した結果、上
記クローンには目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をコー
ドする領域がすべて含まれ、更に制限酵素部位をうまく
選択することにより５′及び３′側の非翻訳領域の一部
を除けることが判明した。図１に示すように、（２）で
得た陽性クローンから切り出したＤＮＡ断片とpTV118N
ベクターを連結させ、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
約３．８kbのＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを構築
し、pSPA101 と命名した。

【００３７】なお、図１はpSPA101 の構築を示す工程図
である。また、図３は、pSPA101 にクローニングされて
いるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む SmaＩ− PstＩ断
片の制限酵素地図を示す図である。

【００３８】次に、該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換し、形質転換体Escherichia coli JM109／pS
PA101 を得た。

【００３９】（４）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製上記組換えプラスミドを有する大腸菌 JM109／pSPA101
をアンピシリンが５０μｇ／mlの濃度で存在するＬ培地
５mlに植菌し、３７℃で培養した。培養液の濁度が０．
６（Ａ₆₆₀ ）のとき、誘導物質であるイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１
５時間培養を行った。培養液を集菌し、５０mMトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、４μＭパラア
ミジノフェニルメタンスルホニルフルオライド（ｐ−Ａ
ＰＭＳＦ）、０．５μｇ／mlロイペプチン（ leupeptin
e ) に懸濁し、超音波処理を行った。遠心分離して上清
を回収し、これに１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１mMＥＤＴＡ、５０mM塩化カリウム、０．５％ト
ライトンＸ100 (Triton Ｘ100)を加え、７５℃で３０分
間静置した後再度遠心分離して上清を回収し、粗抽出液
とした。

【００４０】（５）ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定反応液として６７mMリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、３
mM塩化マグネシウム、１mM ２−メルカプトエタノー
ル、２０μＭ活性化ＤＮＡ、２００μＭｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ、１００μＭＴＴＰ、１００μＭ
〔 ³Ｈ〕ＴＴＰを用意し、この溶液１００μｌに対して
適当量の（４）で得た粗抽出液を加え、７０℃で１０分
間反応させた後、氷中に静置した。この反応液から５０
μｌをＤＥＡＥフィルター上に移し、５％リン酸水素二
ナトリウムで数回洗浄した後、７０％エタノールで置換
し、フィルターを乾燥して液体シンチレーションカウン
ターでフィルター上の放射活性を測定した。１mlの培養
液から約１単位のＤＮＡポリメラーゼが得られた。

【００４１】（６）アフィジコリン感受性の測定（５）の方法に準じてＤＮＡポリメラーゼ活性を測定す
る際に、０〜２００μｇ／mlのアフィジコリンを加え、
活性に及ぼす影響を調べた。図６に示すように、アフィ
ジコリン濃度に依存してポリメラーゼ活性の減少がみら
れた。

【００４２】（７）プラスミドpSPA101 を導入した大腸
菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産大腸菌 JM109／pSPA101 の３０リットルの培養液より精
製を開始し、（４）で示した方法により、２５０mlの粗
抽出液を得た。これをＤＥ緩衝液〔５０mMトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、４μＭのｐ−ＡＰ
ＭＳＦ、０．５μｇ／mlロイペプチン、０．０２％トラ
イトンＸ100 〕で平衡化したＤＥ５３−（ワットマン
社）カラム１００mlに添加し、非吸着画分を集めた。こ
れを更に同緩衝液で平衡化したヘパリン−トヨパールカ
ラム（東ソー）に添加し、０Ｍ〜１ＭＮａＣｌの直線濃
度勾配で溶出し活性画分を集めた。このようにして得た
酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、分子量
約９万ダルトンのほぼ単一なバンドを与えた。

【００４３】（８）アミノ酸シークエンサーによるＮ末
端アミノ酸配列の決定（７）で得られた酵素標品をアミノ酸シークエンサーに
かけ、配列表の配列番号９に示すＮ末端アミノ酸配列を
決定した。

【００４４】（９）発現プラスミドpSPA102 の構築上記プラスミドpSPA101 から３．８kb断片中の５′側非
翻訳領域を部位特異的変異の手法により除去した。図５
にその工程を示す。まず、配列表の配列番号１１に示す
オリゴヌクレオチドを合成し、サイト−ダイレクテッド
ミュータジェネシスシステムミュータン−Ｋ〔宝酒
造（株）〕を用いて、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の開始
コドン（ＡＴＧ）の部位に NcoＩサイトを導入した。得
られたプラスミドを NcoＩ消化して連結することによ
り、５′側非翻訳領域を欠失したプラスミドを得た。こ
のプラスミドには、開始コドンと第２番目のコドン（Ａ
ＣＴ）の間に余分な塩基（Ｇ）が付加されているので、
配列表の配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドを用い
て上記の部位特異的変異の手法でこれを除去し、翻訳の
フレームの合ったプラスミドを構築した。該プラスミド
をpSPA102 を命名した。該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換し、形質転換体Escherichia coli JM109
／pSPA102 を得た。

【００４５】（10）ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を
含むスルホロバスソルファタリカス染色体ＤＮＡ断片
の塩基配列の決定プラスミドpSPA101 から種々の大きさの欠失変異体ある
いは適当な制限酵素断片を調製し、それらを鋳型にして
ジデオキシ法により塩基配列を解読していった。得られ
たデータをつなぎ合せ、最終的に配列表の配列番号１０
に示す全長の塩基配列を決定した。（８）で決定したＮ
末端アミノ酸配列と本塩基配列より、本発明のＤＮＡポ
リメラーゼの構造遺伝子及びアミノ酸配列を明らかにす
ることができた。

【００４６】

【発明の効果】以上、詳細に説明したように本発明によ
り新規なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の簡便で効率のよい
クローニング方法、及び該遺伝子が提供される。また、
単離された遺伝子を用い、遺伝子工学研究用試薬として
有用なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法も提供
される。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：NO 配列： WSNYTNTAYC CNWSNATHAT 20 配列番号：２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：NO 配列： WSHYTDTAYC CDWSDATHAT 20 配列番号：３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：NO 配列： WSSYTSTACC CSWSSATCAT 20 配列番号：４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：YES 配列： TCNGTRTCNC CRTARATNAC 20 配列番号：５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：YES 配列： TCDGTATCDC CRTARATNAC 20 配列番号：６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：YES 配列： TCSGTRTCSC CGTAGATVAC 20 配列番号：７配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列番号：８配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列番号：９配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列番号：10 配列の長さ：2649 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源：生物名：スルホロバスソルファタリカス(Sulofolobus
solfataricus) 配列： ATG ACT AAG CAA CTT ACC TTA TTT GAT ATT CCT TCA TCT AAA CCC 45 Met Thr Lys Gln Leu Thr Leu Phe Asp Ile Pro Ser Ser Lys Pro 1 5 10 15 GCT AAG AGT GAA CAA AAT ACT CAA CAA TCG CAA CAG AGT GCT CCC 90 Ala Lys Ser Glu Gln Asn Thr Gln Gln Ser Gln Gln Ser Ala Pro 20 25 30 GTT GAG GAA AAA AAG GTA GTT AGG AGG GAA TGG CTT GAA GAG GCT 135 Val Glu Glu Lys Lys Val Val Arg Arg Glu Trp Leu Glu Glu Ala 35 40 45 CAG GAA AAT AAG ATA TAC TTC CTA TTG CAA GTA GAT TAT GAT GGT 180 Gln Glu Asn Lys Ile Tyr Phe Leu Leu Gln Val Asp Tyr Asp Gly 50 55 60 AAG AAA GGT AAG GCT GTA TGT AAG CTA TTC GAT AAA GAA ACT CAA 225 Lys Lys Gly Lys Ala Val Cys Lys Leu Phe Asp Lys Glu Thr Gln 65 70 75 AAG ATC TAT GCC CTA TAT GAT AAT ACT GGA CAT AAG CCC TAC TTT 270 Lys Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Asn Thr Gly His Lys Pro Tyr Phe 80 85 90 CTA GTA GAT CTT GAA CCT GAT AAA GTA GGT AAA ATA CCT AAG ATT 315 Leu Val Asp Leu Glu Pro Asp Lys Val Gly Lys Ile Pro Lys Ile 95 100 105 GTT AGA GAT CCA TCT TTT GAT CAC ATA GAG ACT GTG AGT AAG ATA 360 Val Arg Asp Pro Ser Phe Asp His Ile Glu Thr Val Ser Lys Ile 110 115 120 GAC CCG TAT ACT TGG AAT AAA TTC AAA TTA ACT AAA ATC GTT GTT 405 Asp Pro Tyr Thr Trp Asn Lys Phe Lys Leu Thr Lys Ile Val Val 125 130 135 AGA GAT CCC CTA GCA GTG AGA AGA TTA AGG AAT GAT GTT CCA AAA 450 Arg Asp Pro Leu Ala Val Arg Arg Leu Arg Asn Asp Val Pro Lys 140 145 150 GCG TAT GAG GCT CAC ATA AAA TAT TTT AAC AAC TAC ATG TAT GAC 495 Ala Tyr Glu Ala His Ile Lys Tyr Phe Asn Asn Tyr Met Tyr Asp 155 160 165 ATA GGT CTA ATC CCC GGT ATG CCT TAT GTT GTT AAG AAT GGG AAG 540 Ile Gly Leu Ile Pro Gly Met Pro Tyr Val Val Lys Asn Gly Lys 170 175 180 TTA GAA AGT GTC TAT TTG TCT TTG GAC GAG AAA GAT GTT GAG GAG 585 Leu Glu Ser Val Tyr Leu Ser Leu Asp Glu Lys Asp Val Glu Glu 185 190 195 ATT AAG AAA GCC TTC GCT GAT TCA GAT GAA ATG ACT AGA CAA ATG 630 Ile Lys Lys Ala Phe Ala Asp Ser Asp Glu Met Thr Arg Gln Met 200 205 210 GCA GTC GAT TGG CTT CCC ATA TTT GAA ACT GAA ATA CCT AAA ATA 675 Ala Val Asp Trp Leu Pro Ile Phe Glu Thr Glu Ile Pro Lys Ile 215 220 225 AAA AGG GTT GCG ATA GAT ATT GAG GTA TAT ACA CCA GTT AAG GGT 720 Lys Arg Val Ala Ile Asp Ile Glu Val Tyr Thr Pro Val Lys Gly 230 235 240 AGA ATC CCA GAC TCT CAG AAG GCT GAG TTT CCA ATT ATA AGT ATA 765 Arg Ile Pro Asp Ser Gln Lys Ala Glu Phe Pro Ile Ile Ser Ile 245 250 255 GCA TTA GCG GGG AGT GAT GGA TTA AAG AAG GTT CTT GTA TTA AAT 810 Ala Leu Ala Gly Ser Asp Gly Leu Lys Lys Val Leu Val Leu Asn 260 265 270 AGG AAT GAT GTC AAT GAA GGG AGT GTA AAA CTT GAT GGA ATA TCG 855 Arg Asn Asp Val Asn Glu Gly Ser Val Lys Leu Asp Gly Ile Ser 275 280 285 GTT GAG AGA TTT AAT ACA GAG TAC GAA CTG TTA GGG AGA TTT TTT 900 Val Glu Arg Phe Asn Thr Glu Tyr Glu Leu Leu Gly Arg Phe Phe 290 295 300 GAT ATA CTG TTA GAA TAT CCG ATA GTT CTT ACA TTC AAT GGA GAC 945 Asp Ile Leu Leu Glu Tyr Pro Ile Val Leu Thr Phe Asn Gly Asp 305 310 315 GAT TTT GAT TTA CCT TAC ATT TAC TTT AGG GCG TTA AAG TTA GGT 990 Asp Phe Asp Leu Pro Tyr Ile Tyr Phe Arg Ala Leu Lys Leu Gly 320 325 330 TAT TTT CCA GAG GAA ATT CCC ATA GAT GTA GCT GGT AAG GAT GAA 1035 Tyr Phe Pro Glu Glu Ile Pro Ile Asp Val Ala Gly Lys Asp Glu 335 340 345 GCC AAG TAT CTA GCT GGT CTT CAT ATA GAC TTG TAC AAA TTC TTC 1080 Ala Lys Tyr Leu Ala Gly Leu His Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Phe 350 355 360 TTT AAT AAG GCA GTG AGG AAT TAT GCA TTT GAG GGA AAG TAT AAT 1125 Phe Asn Lys Ala Val Arg Asn Tyr Ala Phe Glu Gly Lys Tyr Asn 365 370 375 GAA TAC AAT TTA GAT GCA GTT GCA AAG GCC TTA TTA GGG ACA TCA 1170 Glu Tyr Asn Leu Asp Ala Val Ala Lys Ala Leu Leu Gly Thr Ser 380 385 390 AAA GTT AAG GTA GAT ACG CTA ATA TCT TTC TTA GAT GTA GAA AAA 1215 Lys Val Lys Val Asp Thr Leu Ile Ser Phe Leu Asp Val Glu Lys 395 400 405 TTA ATA GAA TAT AAC TTT AGG GAT GCC GAA ATC ACA CTT CAG CTT 1260 Leu Ile Glu Tyr Asn Phe Arg Asp Ala Glu Ile Thr Leu Gln Leu 410 415 420 ACT ACA TTT AAT AAC GAC CTA ACT ATG AAG TTA ATT GTA TTG TTT 1305 Thr Thr Phe Asn Asn Asp Leu Thr Met Lys Leu Ile Val Leu Phe 425 430 435 TCT AGA ATT TCT AGA CTA GGA ATT GAG GAA TTA ACT CGG ACA GAA 1350 Ser Arg Ile Ser Arg Leu Gly Ile Glu Glu Leu Thr Arg Thr Glu 440 445 450 ATA TCT ACT TGG GTA AAG AAT TTA TAT TAT TGG GAA CAT AGA AAA 1395 Ile Ser Thr Trp Val Lys Asn Leu Tyr Tyr Trp Glu His Arg Lys 455 460 465 AGA AAT TGG TTA ATT CCT CTT AAG GAA GAA ATC TTA GCG AAA TCC 1440 Arg Asn Trp Leu Ile Pro Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Lys Ser 470 475 480 TCT AAT ATA AGA ACT TCT GCT CTA ATA AAG GGA AAA GGA TAT AAA 1485 Ser Asn Ile Arg Thr Ser Ala Leu Ile Lys Gly Lys Gly Tyr Lys 485 490 495 GGC GCA GTA GTT ATA GAC CCA CCT GCT GGA ATA TTC TTT AAC ATA 1530 Gly Ala Val Val Ile Asp Pro Pro Ala Gly Ile Phe Phe Asn Ile 500 505 510 ACT GTT TTA GAT TTT GCA TCA CTA TAT CCT TCA ATA ATT AGA ACG 1575 Thr Val Leu Asp Phe Ala Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Arg Thr 515 520 525 TGG AAT CTT AGT TAC GAG ACT GTA GAC ATT CAA CAA TGT AAG AAG 1620 Trp Asn Leu Ser Tyr Glu Thr Val Asp Ile Gln Gln Cys Lys Lys 530 535 540 CCC TAT GAA GTA AAG GAT GAG ACA GGG GAG GTG CTA CAT ATA GTT 1665 Pro Tyr Glu Val Lys Asp Glu Thr Gly Glu Val Leu His Ile Val 545 550 555 TGC ATG GAT AGG CCA GGT ATA ACA GCA GTA ATA ACT GGG TTA CTA 1710 Cys Met Asp Arg Pro Gly Ile Thr Ala Val Ile Thr Gly Leu Leu 560 565 570 AGA GAC TTC AGA GTA AAG ATA TAC AAA AAG AAA GCG AAG AAC CCT 1755 Arg Asp Phe Arg Val Lys Ile Tyr Lys Lys Lys Ala Lys Asn Pro 575 580 585 AAT AAT AGT GAG GAA CAA AAA CTA CTC TAT GAC GTA GTA CAG AGA 1800 Asn Asn Ser Glu Glu Gln Lys Leu Leu Tyr Asp Val Val Gln Arg 590 595 600 GCA ATG AAA GTA TTC ATA AAT GCT ACT TAC GGT GTA TTT GGA GCT 1845 Ala Met Lys Val Phe Ile Asn Ala Thr Tyr Gly Val Phe Gly Ala 605 610 615 GAA ACA TTT CCG TTA TAT GCG CCA GCT GTA GCG GAG AGT GTT ACT 1890 Glu Thr Phe Pro Leu Tyr Ala Pro Ala Val Ala Glu Ser Val Thr 620 625 630 GCA CTG GGG AGA TAC GTT ATT ACC AGT ACC GTA AAG AAA GCT AGG 1935 Ala Leu Gly Arg Tyr Val Ile Thr Ser Thr Val Lys Lys Ala Arg 635 640 645 GAA GAA GGT TTA ACT GTA TTA TAC GGT GAT ACT GAT TCT TTA TTC 1980 Glu Glu Gly Leu Thr Val Leu Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe 650 655 660 CTC CTT AAT CCT CCC AAG AAT AGT TTA GAA AAT ATT ATA AAA TGG 2025 Leu Leu Asn Pro Pro Lys Asn Ser Leu Glu Asn Ile Ile Lys Trp 665 670 675 GTT AAA ACT ACT TTC AAT TTA GAT TTG GAA GTT GAT AAA ACC TAC 2070 Val Lys Thr Thr Phe Asn Leu Asp Leu Glu Val Asp Lys Thr Tyr 680 685 690 AAG TTT GTG GCT TTT TCT GGA TTG AAG AAG AAT TAC TTT GGA GTA 2115 Lys Phe Val Ala Phe Ser Gly Leu Lys Lys Asn Tyr Phe Gly Val 695 700 705 TAC CAA GAC GGG AAG GTT GAT ATA AAG GGG ATG TTA GTG AAG AAG 2160 Tyr Gln Asp Gly Lys Val Asp Ile Lys Gly Met Leu Val Lys Lys 710 715 720 AGA AAC ACG CCG GAA TTT GTA AAG AAG GTA TTT AAC GAG GTA AAG 2205 Arg Asn Thr Pro Glu Phe Val Lys Lys Val Phe Asn Glu Val Lys 725 730 735 GAG CTA ATG ATC TCC ATA AAC TCG CCA AAC GAT GTG AAG GAG ATT 2250 Glu Leu Met Ile Ser Ile Asn Ser Pro Asn Asp Val Lys Glu Ile 740 745 750 AAA AGA AAA ATT GTA GAC GTA GTT AAA GGA TCA TAT GAA AAA CTA 2295 Lys Arg Lys Ile Val Asp Val Val Lys Gly Ser Tyr Glu Lys Leu 755 760 765 AAA AAC AAA GGA TAC AAT CTG GAC GAA TTA GCG TTT AAA GTA ATG 2340 Lys Asn Lys Gly Tyr Asn Leu Asp Glu Leu Ala Phe Lys Val Met 770 775 780 CTA TCG AAG CCT TTA GAT GCG TAC AAA AAG AAC ACT CCC CAA CAC 2385 Leu Ser Lys Pro Leu Asp Ala Tyr Lys Lys Asn Thr Pro Gln His 785 790 795 GTA AAG GCA GCT CTA CAA CTT AGA CCA TTT GGA GTT AAC GTA TTA 2430 Val Lys Ala Ala Leu Gln Leu Arg Pro Phe Gly Val Asn Val Leu 800 815 820 CCA CGA GAT ATA ATA TAC TAT GTT AAG GTT AGA TCT AAA GAT GGA 2475 Pro Arg Asp Ile Ile Tyr Tyr Val Lys Val Arg Ser Lys Asp Gly 825 830 835 GTG AAA CCA GTA CAA CTA GCT AAA GTT ACT GAA ATA GAC GCA GAG 2520 Val Lys Pro Val Gln Leu Ala Lys Val Thr Glu Ile Asp Ala Glu 840 845 850 AAA TAT TTA GAA GCG TTA AGA AGT ACG TTT GAG CAA ATC TTA AGG 2565 Lys Tyr Leu Glu Ala Leu Arg Ser Thr Phe Glu Gln Ile Leu Arg 855 860 865 GCA TTC GGA GTC TCT TGG GAT GAG ATA GCA GCC ACA ATG TCG ATA 2610 Ala Phe Gly Val Ser Trp Asp Glu Ile Ala Ala Thr Met Ser Ile 870 875 880 GAT TCG TTC TTT TCA TAC CCA AGT AAA GGA AAT AGT TAA 2649 Asp Ser Phe Phe Ser Tyr Pro Ser Lys Gly Asn Ser 885 890 配列番号：11 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：NO 配列： ATATGTTAGA AACCATGGAC TAAGCAACTT 30 配列番号：12 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）アンチセンス：NO 配列： AAACAGACCA TGACTAAGCA ACTT 24

【図面の簡単な説明】

【図１】pSPA101 の構築を示す工程図である。

【図２】クローニングされた約７kbのＤＮＡ断片の制限
酵素地図を示す図である。

【図３】pSPA101 にクローニングされている約３．８kb
のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。

【図４】pSPA102 にクローニングされている約２．６kb
のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。

【図５】pSPA102 の構築を示す工程図である。

【図６】クローニングされたＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
のアフィジコリンに対する感受性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクロー
ニングする方法において、下記工程：（ａ）α型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、配列表の配列
番号１〜６で表されるプライマーから選択されるプライ
マーを用い、増幅させる工程、（ｂ）増幅ＤＮＡをプロ
ーブとして用い、該プローブにハイブリダイズするα型
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする工程、を
包含することを特徴とするα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子のクローニング方法。
【請求項２】図面の図４で表される制限酵素地図を有
し、その長さが約２．６kbであるＤＮＡを含有すること
を特徴とする単離されたα型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子。
【請求項３】請求項２記載のα型ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子にハイブリダイズ可能なα型ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子。