JP3197355B2 - アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アスパラギニルエンド
ペプチダーゼをコードする遺伝子、該遺伝子からの形質
転換体、及び該形質転換体を用いるアスパラギニルエン
ドペプチダーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アスパラギン残基のＣ末端アミド結
合のみを選択的に水解するプロテアーゼ（以下、アスパ
ラギニルエンドペプチダーゼと称する）は、本発明者ら
が見出し（特開平３−１６０９９７号公報）、また、強
いトランスペプチデーション活性を有することを明らか
にした酵素である（特開平４−２３９９５号公報）。本
酵素はタチナタマメ（ Canavalia ensiformis ) 種子中
より発見されたプロテアーゼであり、本酵素の基質特異
性は厳密であり、アスパラギン残基のＣ末端のみを選択
的に切断することが、各種の合成ペプチド、蛋白質を基
質として確かめられている〔前出特開平３−１６０９９
７号、あるいは松下ら、蛋白質核酸酵素、第３６巻、第
７３０頁（１９９１年）参照〕。また、本酵素は２Ｍ尿
素、０．８Ｍ塩酸グアニジン、０．０１％ラウリル硫酸
ナトリウム等の変性剤存在下で、３０℃、２０分間放置
しても活性の減少は見られない（前出蛋白質核酸酵
素）。これらの性質により本酵素は、蛋白質の断片化に
非常に有用であることが明らかである。また本酵素は、
強いトランスペプチデーション活性を有し、下記式（化
１）で示される反応を触媒する（前出特開平４−２３９
９５号）。

【０００３】

【化１】 Ａ−Ａｓｎ−Ｂ ＋ Ｃ → Ａ−Ａｓｎ−Ｃ ＋ Ｂ

【０００４】式中Ａはアミノ酸若しくはペプチド又はそ
れらの誘導体あるいは水素を表し、Ａｓｎはアスパラギ
ン残基を表し、Ｂはアミノ酸若しくはペプチド又はそれ
らの誘導体あるいはＮＨ₂ を表し、Ｃはアミノ酸若しく
はペプチド又はそれらの誘導体を表す。本酵素は、この
性質を利用した酵素的ペプチド合成に有用であることが
明らかである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】アスパラギニルエンド
ペプチダーゼは、タチナタマメ種子より精製され市販も
されている。しかし、その遺伝子構造やアミノ酸配列は
依然として不明である。また、アスパラギニルエンドペ
プチダーゼの工業的に有利な製造方法についても開示さ
れていない。アスパラギニルエンドペプチダーゼの遺伝
子は、該酵素の遺伝子工学的製造に利用することが可能
であるし、生体内での発現の程度を測定するのに用いら
れる。また、そのＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は
抗体を作成することに用いるのに有用である。本発明の
目的は、アスパラギニルエンドペプチダーゼの遺伝子、
そのＤＮＡ配列、及びそのアミノ酸配列を提供すること
にある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記(a)〜(d)に記載の遺伝子から
選択され、かつ、アスパラギニルエンドペプチダーゼ活
性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする
アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺伝子。 (a)配列表の配列番号８に示されるＤＮＡ配列にコード
されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする
遺伝子。 (b)配列表の配列番号８に示されるＤＮＡ配列にコード
されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のア
ミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１
つがなされているアミノ酸配列からなるポリペプチドを
コードする遺伝子、 (c)配列表の配列番号８に示されるＤＮＡ配列に厳密な
条件下でハイブリダイズする遺伝子、 (d)上記(a)〜(c)のいずれかに記載の遺伝子の配列を含
むことを特徴とする遺伝子。また、本発明の第２の発明
は第１の発明の遺伝子を含有する組換えベクターを導入
した形質転換体に関する。また本発明の第３の発明は第
２の発明の形質転換体を培養し、該培養物からアスパラ
ギニルエンドペプチダーゼを採取することを特徴とする
アスパラギニルエンドペプチダーゼの製造方法に関す
る。

【０００７】以下本発明を具体的に説明する。アスパラ
ギニルエンドペプチダーゼをコードするｃＤＮＡのクロ
ーニングの方法は例えば次の方法が用いられる。まず精
製アスパラギニルエンドペプチダーゼを高度に精製し、
その部分アミノ酸配列を決定する。これは、直接蛋白質
のＮ末端よりエドマン分解法により決定しても良いし、
あるいは蛋白質をプロテアーゼを用いて断片化した後分
離精製し、それぞれ配列決定しても良い。この部分アミ
ノ酸配列より、適当な長さの合成ＤＮＡをその配列のゆ
らぎに合せて作成しプライマー、あるいはプローブとし
て用いる。次にアスパラギニルエンドペプチダーゼが多
く存在する組織、例えばタチナタマメ種子からＲＮＡを
抽出し、ここから例えばオリゴ（ｄＴ）を結合させたセ
ルロース担体等を用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを精製する。
これをテンプレート（鋳型）として逆転写酵素を作用さ
せてｃＤＮＡ合成を行い、岡山−バーグ法あるいはガブ
ラー−ホフマン法( Gubler-Hoffmann 法）等の方法によ
り、プラスミドやファージベクターに接続して宿主に導
入し、ｃＤＮＡライブラリーを作成する。

【０００８】目的のアスパラギニルエンドペプチダーゼ
をコードするｃＤＮＡを得る方法としては、例えば以下
の２つの方法が適用できる。その一つは、先に合成した
ＤＮＡをプローブとして直接ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングする方法である。また、目的のｃＤＮＡの
一部が得られている場合にはそのＤＮＡフラグメントを
プローブとして用いると効果的である。すなわち、まず
ライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー
又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し
取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を
あらかじめ³²Ｐ等で標識したプローブＤＮＡを含む溶液
中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブＤＮＡとの間でハ
イブリッドを形成させる（以下、この操作をハイブリダ
イゼーションと略す）。保温する温度は用いるプローブ
のＴｍ（融解温度）を目安として、それよりもやや低め
に設定する。ハイブリダイゼーション後非特異的吸着を
洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブと
ハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作
をクローンが単一になるまで繰返す。こうして得られた
クローンの中には、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡ
が挿入されている。

【０００９】もう一つの方法は、タチナタマメ種子ポリ
（Ａ）ＲＮＡより合成したｃＤＮＡをテンプレートとし
て、ＰＣＲ法( polymerase-chain-reaction 法）により
目的のアスパラギニルエンドペプチダーゼをコードする
ｃＤＮＡを増幅する方法である。このとき用いるプライ
マーはアスパラギニルエンドペプチダーゼ部分アミノ酸
配列より推定した合成ＤＮＡ同志、あるいは該合成ＤＮ
Ａとランダムプライマー（すべての配列の混合物）又
は、該合成ＤＮＡと配列が既知の共通プライマー等が考
えられる。ただし、共通プライマーを用いるためには共
通プライマーがアニールする領域を目的ＤＮＡの端に付
加することが必要である。これは、ＤＮＡリガーゼを用
いた公知の方法を用いればよい。また、目的のＤＮＡを
効率よく増幅するためには２段階ＰＣＲを行うのが効果
的である。すなわち、まず適当なプライマー同志でＰＣ
Ｒを行い、次にその増幅物をテンプレートとして１回目
に用いたプライマーより更に内側の配列をコードするプ
ライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う方法である。Ｐ
ＣＲ法については、タックポリメラーゼを含む遺伝子増
幅キット及び自動遺伝子増幅装置が宝酒造社から市販さ
れており、これらを用いて目的のＤＮＡ領域の増幅を行
えばよい。

【００１０】得られたｃＤＮＡは塩基配列を決定し、目
的のｃＤＮＡであるかを確認する。ハイブリダイゼーシ
ョンにより得られたクローンの場合、組換体が大腸菌で
あれば、試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従
い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を取
り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニング
し、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体が
ファージの場合も基本的に同様のステップにより塩基配
列を決定することができる。また、ＰＣＲ法により得ら
れたｃＤＮＡの場合、増幅したＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動等により精製し、末端を平滑化する。これをＭ
１３ファージベクター等に導入し塩基配列の決定を行
う。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法
については、例えば、モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリー・マニュアル（ Molecular Cloning A L
aboratory Manual )〔１９８２年、コールド スプリン
グハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（ T.
Maniatis )ほか著〕等に記載されている。

【００１１】決定された塩基配列を、アスパラギニルエ
ンドペプチダーゼの部分アミノ酸配列や分子量、Ｎ末端
分析等と比較してその遺伝子構造及びアミノ酸配列を知
ることができる。得られたｃＤＮＡがアスパラギニルエ
ンドペプチダーゼコード領域のすべてを含まない場合に
は、得られた塩基配列を基にして合成ＤＮＡプライマー
を作成してＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得
られたｃＤＮＡの断片をプローブとして更にｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングすることにより、全コード
領域の塩基配列を決定することができる。

【００１２】また得られたアスパラギニルエンドペプチ
ダーゼ遺伝子を適当な宿主細胞、例えば大腸菌において
発現できるように発現ベクターに接続して、該宿主細胞
に導入し、これを培養することにより、アスパラギニル
エンドペプチダーゼ活性を持つポリペプチドを生産させ
ることができる。用いる発現系によっては、形質転換体
中で発現されたポリペプチドが不溶物〔封入体( inclus
ion body )〕として蓄積される場合がある。この場合
は、この不溶物を回収し、温和な条件、例えば尿素など
で可溶化した後に、変性剤を除き活性を回復させること
ができる。

【００１３】発現の確認は、アスパラギニルエンドペプ
チダーゼ活性を測定することにより行うことができる。
例えば特開平３−１６０９９７号公報に記載のごとく、
基質として配列表の配列番号９に示される式（化２）：
ＤＮＰ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａ
ｓｎ−ＮＨ₂ （ＤＮＰは２，４−ジニトロフェニル）を
含み、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡなどを含むアスパ
ラギニルエンドペプチダーゼの活性測定系に、例えば組
換体大腸菌の細胞抽出液あるいは封入体の可溶化物を加
え３７℃で保温する。このとき基質が加水分解されて生
じる配列表の配列番号１０に示される式（化３）：ＤＮ
Ｐ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ
の量を測定することによりアスパラギニルエンドペプチ
ダーゼ活性を測定することができる。

【００１４】形質転換体の培養物からのアスパラギニル
エンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの精製に
は通常のクロマトグラフィーの手法が用いられる。例え
ば培養菌体を破砕し、目的のポリペプチドが可溶化して
いればその上清を、疎水、イオン交換、ゲルろ過、アフ
ィニティー等のクロマトグラフィーによって所望のポリ
ペプチドを得ることができる。発現産物が不溶物として
蓄積されている場合は、細胞を破砕後沈殿を回収し、尿
素などの変性剤で可溶化する。その後変性剤を除きリホ
ールディングさせた後、前述のようなクロマトグラフィ
ーによって所望のポリペプチドを得ることができる。

【００１５】以下にアスパラギニルエンドペプチダーゼ
の遺伝子の構造決定の例について述べる。決定されたア
スパラギニルエンドペプチダーゼのＮ末端アミノ酸配列
を、配列表の配列番号１１に示す。該配列のアミノ酸番
号７〜１４の部分に対応するポリペプチドをコードする
ｍＲＮＡの５′→３′の向きに相当する、配列表の配列
番号１２で示す合成ＤＮＡ（ＨＡＳＮ−１）、及び同ア
ミノ酸番号１５〜２２の部分に対応するポリペプチドを
コードするｍＲＮＡの５′→３′の向きに相当する、配
列表の配列番号１３で示す合成ＤＮＡ（ＨＡＳＮ−２）
を、それぞれＤＮＡ合成機で合成、精製する。次にｃＤ
ＮＡをテンプレートとし、ＨＡＳＮ−１及びランダム８
mer プライマーを用い、１次ＰＣＲを行い、ＤＮＡを増
幅する。次に該増幅ＤＮＡをテンプレートとし、ＨＡＳ
Ｎ−２及びランダム８mer プライマーを用い、２次ＰＣ
Ｒを行い、特異的に増幅された、アスパラギニルエンド
ペプチダーゼのＮ末端側約８００bpのＤＮＡフラグメン
ト（Ｒｎ８−６３）を調製する。該フラグメントの塩基
配列を配列表の配列番号１４に示す。

【００１６】ｃＤＮＡよりｃＤＮＡライブラリーを作成
し、上記Ｒｎ８−６３をプローブとして、ｃＤＮＡライ
ブラリーより、ポジティブのプラークを単離する。単離
プラークはλ_AEP １０１、λ_AEP １０２、λ_AEP １０
３、λ_AEP １０４、λ_AEP １０７とそれぞれ命名され、
λ_AEP １０１には１．７kbのＤＮＡ断片（１０１）、λ
_AEP １０２には１．３kbのＤＮＡ断片（１０２）、λ
_AEP １０３には１．８kbのＤＮＡ断片（１０３）、λ
_AEP １０４には１．４kbのＤＮＡ断片（１０４）、λ
_AEP １０７には１．８kbのＤＮＡ断片（１０７）が挿入
されている。１０１、１０２、１０３、１０４、１０７
の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号１５〜１９に
示す。それぞれの制限酵素地図及び前出プローブのＲｎ
８−６３の制限酵素地図を図１、図２に示す。これら６
種のＤＮＡ断片中、図１に示す様に１０２、１０４、Ｒ
ｎ８−６３のＤＮＡ配列の重なり合う部分はよく一致す
る。これらの配列をつなぎ合せたＤＮＡ配列（ＡＳＮ−
１）を配列表の配列番号２０に示す。

【００１７】次に、ｃＤＮＡをアマシャム社製のｃＤＮ
Ａクローニングシステムλｇｔ１０を用い、λｇｔ１０
のEcoRＩサイトに導入し、ＰＣＲ用テンプレートとす
る。前出Ｒｎ８−６３の塩基番号７３〜９２、４０〜５
９に相補的なＰＣＲ用プライマー、ＡＳＮＮ−１、ＡＳ
ＮＮ−２をそれぞれ合成する。ＡＳＮＮ−１、ＡＳＮＮ
−２のＤＮＡ配列を配列表の配列番号２１、２２にそれ
ぞれ示す。

【００１８】次にＡＳＮＮ−１及びλｇｔ１０プライマ
ー（ Foward ) （宝酒造社製）を用い１次ＰＣＲを行
い、次にＡＳＮＮ−２及び上記λｇｔ１０プライマーを
用い２次ＰＣＲを行い、アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼのＮ末端部分をコードするｃＤＮＡを増幅する。該
増幅ＤＮＡ（ＡＳＮ−Ｎ）の配列を配列表の配列番号２
３に示す。前出ＡＳＮ−１とＡＳＮ−ＮのＤＮＡ配列を
解析することにより、アスパラギニルエンドペプチダー
ゼをコードする遺伝子を含む配列表の配列番号２４で示
すｃＤＮＡ（ＡＳＮ）の全塩基配列が決定される。ＡＳ
Ｎの制限酵素地図も図１中に示す。アスパラギニルエン
ドペプチダーゼのＮ末端分析の結果を合せ、ＡＳＮ中の
アスパラギニルエンドペプチダーゼをコードする領域が
決定される。

【００１９】該領域を配列表の配列番号１に示す。配列
番号１のＤＮＡ配列に近似のＤＮＡ配列は、前出の１０
１、１０３、１０７中にも存在し、配列番号１のＤＮＡ
配列に相当する配列を、それぞれ配列表の配列番号２〜
４に示す。これらの配列番号１〜４で表されるＤＮＡ配
列は、アスパラギニルエンドペプチダーゼの活性発現に
十分な領域である。

【００２０】得られたｃＤＮＡ断片よりアスパラギニル
エンドペプチダーゼ遺伝子全長をコードするプラスミド
を構築できる。例えば、ＡＳＮ−Ｎ ＤＮＡ断片とそれ
に相同する部分を持つＲｎ８−６３ＤＮＡ断片の一部を
混合し、熱変性後ＤＮＡポリメラーゼで伸長反応を行い
ＡＳＮ−Ｎ、Ｒｎ８−６３ＤＮＡ断片をつなぐことがで
きる。また同様にして、できたＤＮＡ断片の３′側にλ
_AEP １０２EcoRＩ断片をつなぐことができる。これを鋳
型にして、例えば配列表の配列番号２９、３０でそれぞ
れ示されるＡＳＮＦw 、ＡＳＮＲv プライマーでＰＣＲ
反応を行うことにより全長をコードするＤＮＡを増幅す
ることができる（図３）。

【００２１】このＤＮＡ断片を例えば、プラスミドpTV1
18N に組込み、アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺伝
子全長をコードするプラスミドASN-ful-pTV118N を得る
ことができる（図４）。

【００２２】このASN-ful-pTV118N を用い、シグナル様
配列を除いたアスパラギニルエンドペプチダーゼポリペ
プチドを発現するプラスミドを構築することができる。
例えば、配列表の配列番号３１、３２でそれぞれ示され
るＡＳＮＭＮＦ、ＡＳＮＭＮＲプライマーで、ASN-ful-
pTV118N をテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、シグ
ナル配列と成熟蛋白質Ｎ末端との間にＮｃｏＩサイトを
導入した後、NcoI-AccIII 断片を調製し、このフラグメ
ントをλ_AEP １０４のEcoRＩ断片のＡｃｃIIIサイトの
部分につなぐことにより、成熟蛋白質のＮ末端より全長
をコードするＤＮＡを調製することができる（図５〜
７）。該ＤＮＡは例えばＡＳＮＭＮＦプライマーと配列
表の配列番号３０で示されるＡＳＮＲv プライマーの組
でASN-ful-pTV118N をテンプレートとしてＰＣＲを行う
ことによっても得られる。このＮ末端より全長をコード
するＤＮＡを含むプラスミドをpUC18-ASN と命名した。

【００２３】このＮ末端より全長をコードするＤＮＡを
含むＤＮＡ断片をpUC18-ASN より切り出し、プラスミド
ｐＥＴ３ｂ〔ノバジェン( Novagen ) 社〕に組込み発現
用プラスミドを構築し、該プラスミドをpEASN201と命名
した（図８）。

【００２４】pEASN201は配列表の配列番号５で示される
ＤＮＡを含み、該ＤＮＡは配列表の配列番号２４で示さ
れるＡＳＮの塩基番号２２９〜１５５１に相当し、アス
パラギニルエンドペプチダーゼの全長をコードする。

【００２５】pUC18-ASN を用い種々の長さのポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを調製することができる。例えば
該プラスミドのアスパラギニルエンドペプチダーゼをコ
ードする領域の終止コドンの少し下流で適当な制限酵素
で切断した後、エキソヌクレアーゼを作用させてＣ末端
側のポリペプチドをコードする塩基を除くことができ、
これを発現プラスミドに組込めば、アスパラギニルエン
ドペプチダーゼのＣ末端領域を欠失させた種々のポリペ
プチドをコードする発現プラスミドを調製することがで
きる。この欠失体ポリペプチドをコードする発現ベクタ
ーの構築には、他に、ＰＣＲを用いて欠失体をコードす
るＤＮＡを増幅し発現用プラスミドに導入したり、アス
パラギニルエンドペプチダーゼをコードする領域内にあ
る適当な制限酵素サイトで切断して欠失させ、発現用プ
ラスミドに導入したりして構築することができる。

【００２６】例えば、pUC18-ASN をNsp7524VとＸｂａＩ
で切断して得られるＤＮＡ断片をｐＥＴ３ｂに導入し、
pEASN305を構築することができる（図９）。

【００２７】pEASN305は配列表の配列番号６に示される
ＤＮＡを含み、該ＤＮＡは配列表の配列番号２４で示さ
れるＡＳＮの塩基番号２２９〜１３８０の部分に相当
し、配列番号２４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番
号１〜３８４に相当する３８４残基のポリペプチドをコ
ードする。同様にして、pUC18-ASN をHincII、HincIIと
SnaBＩ、HincIIとＳｓｐＩ、HincIIとHind IIIで切り出
したＤＮＡ断片をそれぞれｐＥＴ３ｄ（ノバジェン社）
に導入し、pEASN304（図１０）、pEASN303、pEASN302、
pEASN301を構築することができる。

【００２８】pEASN304は配列表の配列番号７に示される
ＤＮＡを含み、該ＤＮＡは配列表の配列番号２４に示さ
れるＡＳＮの塩基番号２２９〜１１２２の部分に相当
し、配列番号２４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番
号１〜２９８に相当する２９８残基のポリペプチドをコ
ードする。pEASN303は配列表の配列番号２４に示される
ＡＳＮの塩基番号２２９〜８５５の部分に相当するＤＮ
Ａを含み、該ＤＮＡは配列番号２４に示されるアミノ酸
配列のアミノ酸番号１〜２０９に相当する２０９残基の
ポリペプチドをコードする。pEASN302は配列表の配列番
号２４に示されるＡＳＮの塩基番号２２９〜７６８の部
分に相当するＤＮＡを含み、該ＤＮＡは配列番号２４の
アミノ酸配列の１〜１８０に相当する１８０残基のポリ
ペプチドをコードする。pEASN301は配列表の配列番号２
４に示されるＡＳＮの塩基番号２２９〜７２０の部分に
相当するＤＮＡを含み、該ＤＮＡは配列番号２４に示さ
れるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜１６４に相当する
１６４残基のポリペプチドをコードする。

【００２９】また、配列表の配列番号３３、３４で示し
たプライマーの組と、配列番号３５、３６で示したプラ
イマーの組とでpUC18-ASN をテンプレートとしてＰＣＲ
を行った後、増幅されてくるＤＮＡ断片を回収し、これ
らを混合後熱変性し、徐冷することによりアニーリング
させた後、配列表の配列番号３４、３６で示したプライ
マーの組で再度ＰＣＲを行い、適当な制限酵素で消化す
ることにより、部異特異的変異を導入したＤＮＡ断片を
得ることができる。この操作により、配列表の配列番号
２４に示されるアミノ酸配列中の２７２番目のＴｙｒ残
基に対応するコドンを終止コドンに変えることができ
る。この変異させたＤＮＡ断片をＡＳＮ遺伝子に移植し
た後、ｐＥＴ３ｄに導入し、pEASN404を構築することが
できる（図１１〜１３）。pEASN404は配列表の配列番号
８に示されるＤＮＡを含み、該ＤＮＡは配列表の配列番
号２４で示されるＡＳＮの塩基番号２２９〜１０４１の
部分に相当し、配列番号２４で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号１〜２７１に相当する２７１残基のポリペ
プチドをコードする。

【００３０】また、得られたこれらの遺伝子をプローブ
として厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行え
ば、本酵素と配列は少し異なるが同様の酵素活性を持つ
と期待されるすべての本酵素類似の遺伝子を得ることが
期待できる。ここで言う厳密な条件下とは、以下の条件
下のことを言う。すなわち、ＤＮＡを固定したナイロン
膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７
６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水
に溶かしたもの）、１％ラウリン硫酸ナトリウム、１０
０μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ( Denhar
dt^' s ) （ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリド
ン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含
む溶液中で６５℃で２０時間プローブとハイブリダイゼ
ーションを行うことを言う。

【００３１】これらのプラスミドで発現用の大腸菌、例
えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換
体を適当な条件下で培養することにより大腸菌内にポリ
ペプチドが封入体の形で蓄積される。ポリペプチドの精
製は、例えば次のように行う。組換え大腸菌をＬ−培地
等の培地で培養し、集菌した後、超音波処理により菌体
破砕液を得る。この菌体破砕液を遠心分離し沈殿を回収
し、適当な界面活性剤を含む溶液で沈殿を洗浄した後、
例えば尿素などの変性剤で可溶化し、適当な条件下で変
性剤を除くことにより目的ポリペプチドの封入体を可溶
化、リホールディングさせることができる。

【００３２】このようにして、７種類のポリペプチドを
得ることができる。すなわちポリペプチド２１０は発現
プラスミドpEASN201を含む組換体大腸菌より得られた４
４０残基のアスパラギニルエンドペプチダーゼのアミノ
酸配列を含む。

【００３３】同様にポリペプチド３０５は３８４残基
の、ポリペプチド３０４は２９８残基の、ポリペプチド
３０３は２０９残基の、ポリペプチド３０２は１８０残
基の、ポリペプチド３０１は１６４残基の、ポリペプチ
ド４０４は２７１残基のアスパラギニルエンドペプチダ
ーゼのアミノ酸配列を含む。

【００３４】図１４に各発現ポリペプチドとアスパラギ
ニルエンドペプチダーゼ活性の関係を示す。すなわち、
ポリペプチド２１０、３０５、３０４、４０４では活性
が認められたが、ポリペプチド３０３、３０２、３０１
では活性は認められなかった。すなわち、ポリペプチド
４０４が活性に必要な最小単位のポリペプチドであり、
該ポリペプチドをコードする配列表の配列番号８に示さ
れるＤＮＡが活性発現に必要な最小単位のＤＮＡであ
る。

【００３５】以上詳細に説明した様に、本発明によりア
スパラギニルエンドペプチダーゼの遺伝子、一次構造が
明らかとなり、その遺伝子工学的製造法を提供すること
が可能となった。

【００３６】

【実施例】次に本発明の実施例を示すが、これらは本発
明を限定するものではない。

【００３７】実施例１ アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼｃＤＮＡクローニング （１−１）アスパラギニルエンドペプチダーゼ部分アミ
ノ酸配列の決定 ＜アスパラギニルエンドペプチダーゼの精製＞市販ジャ
ックビーンミール（シグマ社製）５００ｇを１mMジチオ
スレイトール、１mM ＥＤＴＡを含む２０mM 酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）でホモジナイズし遠心分離により上清
を得た。該上清を上記緩衝液に対して透析後、再び生じ
た沈殿を遠心分離により除去し、ＳＰ−トヨパール６５
０Ｍ（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィ
ーを行った。ＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラムに吸着し
０．５Ｍ塩化ナトリウムにて溶出した活性画分を６０％
飽和硫安沈殿後、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１mMジチオ
スレイトール、１mM ＥＤＴＡを含む２０mM酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に対して透析した。次にパラマーキュリ
安息香酸を固定化したトヨパール（東ソー社製）による
クロマトグラフィーを行い、１Ｍ塩化ナトリウム、５０
mMジチオスレイトール、１mM ＥＤＴＡを含む酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）で溶出した画分を排除分子量１０，０
００の限外ろ過膜にて濃縮した後トヨパールＨＷ−５５
Ｓ（東ソー社製）によるゲルろ過を行った。ゲルろ過は
０．２Ｍ塩化ナトリウム、１mMジチオスレイトール、１
mM ＥＤＴＡを含む２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で
行い、溶出した活性画分を同緩衝液で平衡化した。卵白
シスタチンを固定化したセファロースＣＬ４Ｂ（ファル
マシア社製）に添加した。同緩衝液で充分洗浄した後
に、５mMの配列表の配列番号２５に示すポリペプチド
Ａ、１mMジチオスレイトール、１mM ＥＤＴＡを含む２
０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）により溶出した。溶出し
た活性画分を排除分子量１０，０００の限外ろ過膜にて
ポリペプチドＡを除くと同時に濃縮した。こうして得ら
れた酵素標品はラウリル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法で単一であった。

【００３８】＜Ｎ末端配列分析＞Ｎ末端の配列決定は、
アプライド バイオシステム社製モデル４７７Ａ気相式
ペプチドシークエンサーを用いた。約１００pmolの精製
アスパラギニルエンドペプチダーゼを用いて上記シーク
エンサーによりエドマン分解法でＮ末端より配列を決定
していき、約２５残基のアミノ酸配列を決定することが
できた。その結果を配列表の配列番号１１に示す。

【００３９】（１−２）ＰＣＲ法によるアスパラギニル
エンドペプチダーゼｃＤＮＡの増幅 ＜ｍＲＮＡの抽出精製とｃＤＮＡ合成＞タチナタマメ種
子を収穫し、すぐさま液体窒素で凍結保存していたもの
１０ｇを、３０mlの１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む
５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）と、３０ml水
飽和フェノールと共にウルトラ−ディスパーサー（ ULT
RA-DISPERSER )（ヤマト科学社製）で１０秒間、２０回
抽出した。磨砕液を１０，０００ｇ、５分間遠心し、上
層の水層をとり、これに１０mlの水飽和フェノール、１
０mlのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：
１）を加えよくかくはんして１０，０００ｇ、５分間遠
心して上層の水層を得た。この水層に１／４容量の１０
Ｍ塩化リチウムを加え、０℃で２時間保持後２０，００
０ｇ、２０分間の遠心によりＲＮＡの沈殿を回収した。
このＲＮＡを１０mlの純水（オートクレーブしたもの）
に溶解した後、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと、
２５mlのエタノールを加え、−２０℃で１時間保持後、
２０，０００ｇ、２０分間の遠心によりＲＮＡを回収し
た。このＲＮＡを７０％エタノールに懸濁し、同じ遠心
操作により回収した後に減圧下で乾燥させた（以下この
操作をエタノール沈殿と略す）。これにより１．８mgの
全ＲＮＡを得た。このうち１mgをオリゴテックス−ｄＴ
３０（宝酒造社製）で処理することにより２７μｇのポ
リ（Ａ）ＲＮＡを得た。このポリ（Ａ）ＲＮＡ５μｇよ
りアマシャム社製ｃＤＮＡ合成キットを使って、ランダ
ム ヘキサマー プライマーによりｃＤＮＡ合成を行い
約１μｇを得た。

【００４０】＜プライマーの合成とＰＣＲによる増幅＞
実施例（１−１）で決定したアスパラギニルエンドペプ
チダーゼＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号１１で
表される）より２種類のプライマー（ＨＡＳＮ−１、Ｈ
ＡＳＮ−２）をデザインし合成した。それぞれの配列を
配列表の配列番号１２、１３に示す。ＨＡＳＮ−１はＮ
末端配列中のアミノ酸番号７〜１４の部分に対応するｍ
ＲＮＡの５′→３′の向きに相当する２３mer 、ＨＡＳ
Ｎ−２はＮ末端配列中のＨＡＳＮ−１に相当する部分の
下流のアミノ酸番号１５〜２２の部分に対応するｍＲＮ
Ａの５′→３′の向きに相当する２３mer の合成ＤＮＡ
である。テンプレートとして前述のように調製したｃＤ
ＮＡ約１０ng（１μｌ）を０．５ml用チューブに取り、
ジーンアンプ^TMキット（宝酒造社製）中の１０μｌの１
０倍濃度増幅用緩衝液、１６μｌの１．２５mM ｄＮＴ
Ｐ混合液、２μｌの０．５μｇ／μｌ ＨＡＳＮ−１プ
ライマー、４μｌの０．１μｇ／μｌランダム８mer プ
ライマー、０．５μｌの５ユニット／μｌアンプリタッ
ク^TMを加え、更に滅菌水を加えて１００μｌの溶液にし
た。この反応液に１００μｌのミネラルオイル（シグマ
社製）を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サ
イクラー（宝酒造社製）により増幅反応を行った。反応
条件は、９４℃で３０秒間（変性）→５５℃で２分間
（プライマーのアニーリング）→７２℃で１分間（合成
反応）のサイクルを４０サイクル行った。次に、この反
応液１μｌをテンプレートとして、ＨＡＳＮ−１の代り
に２μｌの０．５μｇ／μｌ ＨＡＳＮ−２プライマー
を用い、先と同じ条件でＰＣＲを再度行った。反応後上
層のミネラルオイルを除去した後、反応液の５μｌをア
ガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロミドでＤ
ＮＡを染色し、特異的に増幅されたＮ末端側約８００bp
のアスパラギニルエンドペプチダーゼｃＤＮＡのバンド
を確認した。このＰＣＲにより増幅したＤＮＡフラグメ
ントをＲｎ８−６３と命名した。

【００４１】＜増幅ＤＮＡ塩基配列の決定＞ＰＣＲ反応
液の残りをエタノール沈殿により濃縮し、全量をアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。エチジウムブロミドによる
染色後、紫外線照射下目的のＲｎ８−６３ＤＮＡ断片を
含む部分をゲルから切り出した。これを宝酒造社製イー
ジートラップ（ＥＡＳＹＴＲＡＰ）キットを用いてゲル
から抽出精製した。このＤＮＡ断片を宝酒造社製ＤＮＡ
ブランティングキットを用いて平滑末端化し、プラスミ
ドｐＵＣ１８の制限酵素HincII消化物と混ぜて、宝酒造
社製ライゲーションキットを用いてライゲーション反応
を行った。このライゲーション反応液の一部を用いて大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＰＣＲにより増幅した
Ｒｎ８−６３ＤＮＡ断片をHincIIサイトにもつｐＵＣ１
８を含む組換体大腸菌を得た。得られた組換体大腸菌を
液体培養により培養し、アルカリ溶菌法によりプラスミ
ドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡをpASN
Rn8-63と命名した。pASNRn8-63プラスミド中の挿入断片
の全塩基配列をジデオキシ法により決定した。該配列を
配列表の配列番号１４に示す。なお該配列中の塩基番号
１〜２３はプライマーＨＡＳＮ−２由来の配列、塩基番
号７３７〜７５３はランダムプライマー由来の配列であ
る。また、このpASNRn8-63プラスミド中にＲｎ８−６３
ＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１８のHincIIサイトにｌａｃＺ遺
伝子の向きと逆向きに挿入されていた。

【００４２】（１−３）ｃＤＮＡライブラリーからのス
クリーニング ＜ハイブリダイゼーションによるスクリーニング＞実施
例（１−２）記載のポリ（Ａ）ＲＮＡ４μｇよりアマシ
ャム社製ｃＤＮＡ合成キットを使って、オリゴ（ｄＴ）
プライマーによりｃＤＮＡを合成した。次に同じくアマ
シャム社製ｃＤＮＡクローニングシステム・λｇｔ１０
を使って、ｃＤＮＡをλｇｔ１０の制限酵素EcoRＩサイ
トに組込んだものを、ラムダーファージにパッケージン
グしてｃＤＮＡライブラリーを作成した。ただし、配列
表の配列番号２６に示すEcoRＩリンカーは宝酒造社製の
ものを、パッケージングにはストラタジーン社製のギガ
パックゴールド（ GIGAPACK GOLD )を用いた。前記ｃＤ
ＮＡライブラリーを、宿主菌として大腸菌Ｃ６００ｈｆ
１株を用い、１４cm×１０cmの角シャーレ１６枚に、１
枚当り約３０，０００個のプラークを形成させた。すな
わち４mg／mlのマルトースを含むＬ培地で３７℃一晩培
養したＣ６００ｈｆ１培養液０．２ｍｌに、ファージ
液０．１mlを混ぜ３７℃で１５分間保温した。これに軟
寒天（Ｌ培地に終濃度０．６％となるようにアガロース
を加え、オートクレーブで処理した後、５０℃に保った
もの）８mlを加え、Ｌ培地−プレート上に広げ、固化後
３７℃で１０時間程度保温してファージのプラークを形
成させた（以下この操作をプレーティングと略す）。

【００４３】次にこのプレートより２枚のハイブリダイ
ゼーション用フィルターを調製した。すなわち、プレー
ト表面にアマシャム社製ナイロン膜〔商品名ハイボンド
−Ｎ（ Hybond-N ) 〕を３０秒間接触させ、これを０．
５Ｍ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムの溶液
に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ塩化ナトリウムの溶
液に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×Ｓ
ＳＣでリンスし、ろ紙上で乾燥させた。２枚目のフィル
ターも同様にして調製した。ただし、プレートとナイロ
ン膜の接触時間を２分間として行った。乾燥させたフィ
ルターはＵＶランプで５分間紫外線を照射してＤＮＡを
膜に固定化した。

【００４４】ハイブリダイゼーションのプローブとして
実施例（１−２）記載のＤＮＡフラグメントＲｎ８−６
３を用いた。約１００ngのＲｎ８−６３ＤＮＡフラグメ
ントを宝酒造社製ランダムプライマーＤＮＡラベリング
キットを用いて³²Ｐで標識した。このプローブの全量と
上記調製したフィルターを用い、６×ＳＳＣ、１％ラウ
リル硫酸ナトリウム、１００μｇ／mlのサケ精子ＤＮ
Ａ、５×デンハルツを含む約１００mlの溶液中で６５℃
で一晩ハイブリダイゼーションを行った。次に室温の６
×ＳＳＣ中で１０分間フィルターを洗浄した。更に室温
の２×ＳＳＣ、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム中で１
０分間を２回、０．２×ＳＳＣ、０．１％ラウリル硫酸
ナトリウム中で１０分間を２回洗浄した後、フィルター
をろ紙上に移し余分な水分を除いた。これをワットマン
３ＭＭろ紙に張り付け、増幅紙を当てて一晩−７０℃で
オートラジオグラフィーを行った。その結果５個のポジ
ティブシグナルを得た。

【００４５】これらのシグナルに相当する位置のプラー
クを寒天ごと０．２mlのＳＭ溶液〔塩化ナトリウム５．
８ｇ、硫酸マグネシウム・７Ｈ₂ Ｏ２ｇ、１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０ml、２％ゼラチン５mlを
水に溶かし全量を１リットルとする〕中に懸濁した。こ
れらファージ液をＳＭ溶液で希釈してプレーティングし
（約３００プラーク／φ９cm丸形シャーレ）上記と同様
にハイブリダイゼーションを行った。その結果、すべて
のクローンに関してシングルプラークを単離することが
できた。これらのクローンをλ_AEP １０１、λ_AEP １０
２、λ_AEP １０３、λ_AEP １０４、λ_AEP １０７と命名
した。

【００４６】＜ポジティブクローン挿入フラグメント塩
基配列の決定＞組換体λファージλ_AEP １０１、λ_AEP
１０２、λ_AEP １０３、λ_AEP １０４、λ_AEP １０７
を、宿主として大腸菌Ｌ８７株を用いて液体培養を行
い、４０mlの培養液から約４０μｇのλＤＮＡをそれぞ
れ調製した。得られたλＤＮＡ２０μｇを制限酵素RcoR
Ｉで消化し、その一部をアガロースゲル電気泳動を行い
挿入断片の大きさを求めた。その結果、λ_AEP １０１に
は１．７kb、λ_AEP １０２には１．３ｋｂ、λ_AEP １０
３には１．８kb、λ_AEP １０４には１．４kb、λ_AEP１
０７には１．８kbの大きさのＤＮＡ断片が挿入されてそ
れぞれのＤＮＡ断片を１０１、１０２、１０３、１０
４、１０７と命名した。

【００４７】次に、先にEcoRＩ消化した残りの反応液を
アガロースゲル電気泳動にかけた。エチジウムブロミド
による染色後、紫外線照射下目的のＤＮＡ断片を含む部
分をゲルから切り出した。これを宝酒造社製イージート
ラップキットを用いてゲルから抽出精製した。これらEc
oRＩ断片をＭ１３ｍｐ１８ファージベクターをEcoRＩ消
化したものと混ぜて、宝酒造社製ライゲーションキット
を用いてライゲーション反応を行った。このライゲーシ
ョン反応液の一部を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、それぞれのEcoRＩ断片が挿入されている組換体を
得た。

【００４８】得られた組換体ファージを大腸菌ＪＭ１０
９株を宿主菌として液体培養を行い、アルカリ溶菌法に
よりＲＦＤＮＡを調製した。このＲＦＤＮＡの一部を制
限酵素EcoRＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い
目的ＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。ま
た、得られたＲＦＤＮＡの一部を数種の制限酵素で切断
し、アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果
を図１、図２に示す。すなわち、図１、図２は１０１、
１０２、１０３、１０４、１０７等の制限酵素地図であ
る。

【００４９】また、Ｍ１３ｍｐ１８ファージのEcoRＩサ
イトに挿入された向きによりそれぞれ２種類のクローン
が得られることも判明した。挿入断片の向きが逆のクロ
ーンをそれぞれＭ_AEP １０１−５とＭ_AEP １０１−２、
Ｍ_AEP １０２−４とＭ_AEP １０２−３、Ｍ_AEP １０３−
３とＭ_AEP １０３−２、Ｍ_AEP １０４−２とＭ_AEP １０
４−２２、Ｍ_AEP １０７−２とＭ_AEP １０７−４と命名
した。

【００５０】これら挿入断片の全塩基配列を決定するた
めに、宝酒造社製タカラキロシークエンス用デレーショ
ンキットを用い、Ｍ_AEP １０１−５とＭ_AEP １０１−２
を除く８クローンについて、シークエンス用プライマー
の側から挿入断片を分解していき、種々の大きさのＤＮ
Ａを欠失させた誘導体を作成した。また、Ｍ_AEP １０１
−５とＭ_AEP １０１−２については、挿入断片中の適当
な制限酵素のサイトとＭ１３ｍｐ１８マルチクローニン
グサイトの中の適当な制限酵素サイトで切断し、種々の
大きさのＤＮＡを欠失させた誘導体を作成した。これら
誘導体の適当なものと、Ｍ_AEP １０１−５、Ｍ_AEP １０
１−２、Ｍ_AEP １０２−４、Ｍ_AEP １０２−３、Ｍ_AEP
１０３−３、Ｍ_AEP １０３−２、Ｍ_AEP １０４−２、Ｍ
_AEP １０４−２２、Ｍ_AEP １０７−２、Ｍ_AEP １０７−
４を大腸菌ＪＭ１０９株に感染させそれぞれ培養してｓ
ｓＤＮＡを調製した。これらをジデオキシ法によりＤＮ
Ａシークエンスを行い、それらをつなぎ合せることによ
りλ_AEP １０１、λ_AEP １０２、λ_AEP １０３、λ_AEP
１０４、λ_AEP １０７のEcoRＩ挿入断片の全塩基配列を
決定した。これらを配列表の配列番号１５〜１９に示
す。なお、これらの配列は、各挿入断片中のEcoRＩリン
カー由来の配列を除去し、示したものである。

【００５１】これら５種類の挿入断片の塩基配列をそれ
ぞれホモロジー検索したところ、λ_AEP １０２とλ_AEP
１０４の挿入断片は重なり合う部分が完全に一致し、ま
た実施例（１−２）のＲｎ８−６３ＤＮＡフラグメント
とも重なり合う部分が一致した。この一群の配列をつな
ぎ合せてアスパラギニルエンドペプチダーゼＡＳＮ−１
と命名した。ＡＳＮ−１の塩基配列を配列表の配列番号
２０に示す。他の３つの挿入断片は、ＡＳＮ−１も含め
て６０〜９０％のホモロジーを有していたが、完全に一
致はしなかった。また、このλ_AEP １０１、λ_AEP １０
３、λ_AEP １０７挿入断片の塩基配列をアミノ酸配列に
翻訳すると、実施例（１−１）で決定したＮ末端配列と
非常によく似ている配列が見出されたが完全には一致し
なかった。また、実施例（１−１）で決定したＮ末端ア
ミノ酸配列に相当する位置からその読み取り枠の終止コ
ドンの位置までのＤＮＡ配列を配列表の配列番号２、
３、４にそれぞれ示す。この部分はアスパラギニルエン
ドペプチダーゼ活性に十分な位置と考えられる部分であ
る。

【００５２】（１−４）アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼＡＳＮ−１のＮ末端部分のクローニング 実施例（１−２）及び（１−３）で決定した塩基配列を
つなぎ合せたＡＳＮ−１は、アスパラギニルエンドペプ
チダーゼのＮ末端部分が欠失しているので、以下に示す
ようにＮ末端部分をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法によ
り増幅しクローニングした。

【００５３】＜テンプレートＤＮＡの調製＞ 実施例（１−２）で調製したｃＤＮＡ約１００ｎｇに、
配列表の配列番号２７、２８でそれぞれ示す、アマシャ
ム社製ＥｃｏＲＩ アダプター２５０ｐｍｏｌを混ぜ
て、宝酒造社製ライゲーションキットを用いてライゲー
ション反応を行った。このライゲーション反応液をエタ
ノール沈殿により精製し、その半量を宝酒造社製メガラ
ベルキットを用いてＤＮＡの５′末端のリン酸化を行っ
た後、ファージベクターλｇｔ１０の制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ消化物０．５μｇと混ぜて、宝酒造社製ライゲーショ
ンキットを用いてライゲーション反応を行いテンプレー
トＤＮＡを調製した。

【００５４】＜Ｎ末端部分増幅用プライマーの合成とＰ
ＣＲによる増幅＞実施例（１−２）で決定し、配列表の
配列番号８で示したＲｎ８−６３ＤＮＡ断片の塩基番号
７３〜９２の位置と塩基番号４０〜５９の位置に存在す
る塩基配列に相補的な、２種類のプライマー（ＡＳＮＮ
−１、ＡＳＮＮ−２）を合成した。それぞれの配列を配
列表の配列番号２１、２２に示す。

【００５５】テンプレートとして前述のように調製した
ＤＮＡの１／１０量（１μｌ）を０．５ml用チューブに
取り、ジーンアンプ^TMキット（宝酒造社製）中の１０μ
ｌの１０倍濃度増幅用緩衝液、１６μｌの１．２５mM
ｄＮＴＰ混合液、１μｌの０．１μｇ／μｌ ＡＳＮＮ
−１プライマー、１μｌの０．１μｇ／μｌλｇｔ１０
プライマー（ Forward )（宝酒造社製）、０．５μｌの
５ユニット／μｌアンプリタック^TMを加え、更に滅菌水
を加えて１００μｌの溶液にした。この反応液に１００
μｌのミネラルオイル（シグマ社製）を重層した後、自
動遺伝子増幅装置サーマル・サイクラー（宝酒造社製）
により増幅反応を行った。反応条件は、９４℃で３０秒
間（変性）→５５℃で２分間（プライマーのアニーリン
グ）→７２℃で１分間（合成反応）のサイクルを２５サ
イクル行った。

【００５６】次に、この反応液１μｌをテンプレートと
して、ＡＳＮＮ−１の代りに１μｌの０．１μｇ／μｌ
ＡＳＮＮ−２プライマーを用い、先と同じ条件でＰＣ
Ｒを再度行った。反応後上層のミネラルオイルを除去し
た後、反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動を行
い、エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、特異的に増
幅されたＮ末端側約３３０bpのアスパラギニルエンドペ
プチダーゼｃＤＮＡのバンドを確認した。このＰＣＲに
より増幅したＤＮＡフラグメントをＡＳＮ−Ｎと命名し
た。

【００５７】＜増幅ＤＮＡ塩基配列の決定＞ＰＣＲ反応
液の残りをエタノール沈殿により濃縮し、全量をアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。エチジウムブロミドによる
染色後、紫外線照射下目的のＡＳＮ−Ｎ ＤＮＡ断片を
含む部分をゲルから切り出した。これを宝酒造社製イー
ジートラップキットを用いてゲルから抽出精製した。こ
のＤＮＡ断片を宝酒造社製ＤＮＡブランティングキット
を用いて平滑末端化し、プラスミドｐＵＣ１８の制限酵
素HincII消化物と混ぜて、宝酒造社製ライゲーションキ
ットを用いてライゲーション反応を行った。このライゲ
ーション反応液の一部を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換し、ＰＣＲにより増幅したＡＳＮ−Ｎ ＤＮＡ断
片をHincIIサイトにもつｐＵＣ１８を含む組換体大腸菌
を得た。

【００５８】得られた組換体大腸菌を液体培養により培
養し、アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し
た。このプラスミドＤＮＡの挿入断片ＡＳＮ−Ｎの全塩
基配列をジデオキシ法により決定した。塩基配列を配列
表の配列番号２３に示す。なお該配列は、挿入断片中の
EcoRＩアダプター由来の配列を除去し、示したものであ
る。得られたＡＳＮ−Ｎの塩基配列とＡＳＮ−１塩基配
列のホモロジー検索をしたところ重なり合う部分がよく
一致した。これらの配列をつなぎ合せてＡＳＮと命名し
た。塩基配列を配列表の配列番号２４に示す。また、こ
れをアミノ酸配列に翻訳すると、実施例（１−１）で決
定したＮ末端配列と完全に一致した配列が認められた。
また、実施例（１−１）で決定したＮ末端アミノ酸配列
に相当する位置からその読み取り枠の終止コドンの位置
までのＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に示す。この部
分がアスパラギニルエンドペプチダーゼをコードするＤ
ＮＡ領域であり、前出配列番号２〜４でそれぞれ表され
るＤＮＡ配列と近似した配列を示す。

【００５９】実施例２ アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼポリペプチドを発現するプラスミドの構築 （２−１）アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺伝子全
長をコードするプラスミドの構築 実施例（１−２）で得られたpASNRn8-63プラスミドＤＮ
ＡをHind IIIで消化し、アガロースゲル電気泳動を行
い、Ｒｎ８−６３を含む約８００bpのHind IIIフラグメ
ントを切り出し抽出精製した。このHind IIIフラグメン
トと、実施例（１−４）で得たＡＳＮ−Ｎ ＤＮＡフラ
グメントそれぞれ約１０ngを、ジーンアンプ^TMキット中
の１０μｌの１０倍濃度増幅用緩衝液と、１６μｌの
１．２５mM ｄＮＴＰ混合液を混合し、水で全量を９
７．５μｌとした。これをサーマル・サイクラーにセッ
トし、９４℃１０分間保温、９４℃から３７℃まで３０
分間で徐冷、３７℃で１５分間保温した後、０．５μｌ
の５ユニット／μｌアンプリタック^TMを加え７２℃で３
分間伸長反応を行った。この反応液に実施例（１−３）
で得たλ_AEP １０２のEcoRＩ断片約１０ngを加え、９４
℃で１０分間保温、９４℃から３７℃まで３０分間で徐
冷、３７℃で１５分間保温した後、７２℃で３分間伸長
反応を行った。この反応液に配列表の配列番号２９に示
すＡＳＮＦ_W プライマーと配列表の配列番号３０に示す
ＡＳＮＲ_v プライマー各２０pmolと０．５μｌの５ユニ
ット／μｌアンプリタック^TMを加え９４℃で３０秒間→
５５℃で１５分間→７２℃で１．５分間のサイクルを２
５サイクル行い、アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺
伝子の全長を含むＤＮＡを増幅した。

【００６０】ＡＳＮＦ_W は実施例（１−４）で決定し、
配列表の配列番号２４に示したＡＳＮの塩基番号１２３
〜１４１の塩基配列を含み、その５′側にBamHＩの認識
配列を持つ２７mer の合成ＤＮＡであり、ＡＳＮＲ_V は
ＡＳＮの塩基番号１６０２〜１６２０の塩基配列に相補
的な配列を含み、その５′側にＳｐｈＩの認識配列を持
つ２８mer の合成ＤＮＡである。このＰＣＲ反応液をエ
タノール沈殿により濃縮し、BamHＩとＳｐｈＩで消化
し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１５００bpの断
片を切り出し抽出精製した（図３）。このＤＮＡ断片を
プラスミド pTV118N（宝酒造）のBamHＩ、ＳｐｈＩサイ
トに導入しプラスミドASN-ful-pTV118N を得た（図
４）。このプラスミドＤＮＡはアスパラギニルエンドペ
プチダーゼ遺伝子の全長をコードする塩基配列を含む。

【００６１】（２−２）アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼ成熟Ｎ末端からのポリペプチドを発現するプラスミ
ドの構築 実施例（２−１）で得られたプラスミドDNAASN-ful-pTV
118N１０ngをテンプレートとして実施例（１−４）と同
じ条件でＰＣＲ反応（２５サイクル）を１回行った。プ
ライマーとしては、配列表の配列番号３１、３２にそれ
ぞれ示したＡＳＮ−ＭＮＦプライマーとＡＳＮ−ＭＮＲ
プライマーを用いた。ＡＳＮ−ＭＮＦプライマーは配列
表の配列番号２４に示したＡＳＮの塩基番号２２９〜２
４７に相当し、２３４番目のＧをＴに、２３７番目のＡ
をＴに変異させた配列を含み、その５′側にＮｃｏＩの
認識配列ができるような配列を含む２５mer の合成ＤＮ
Ａである。ＡＳＮ−ＭＮＲプライマーはＡＳＮの塩基番
号６２８〜６５１の配列の６４２番目のＴをＣに変異さ
せた配列に相補的な配列を含む２４mer の合成ＤＮＡで
ある。このＰＣＲ反応液をエタノール沈殿により濃縮
し、ＮｃｏＩで消化後アガロースゲル電気泳動を行い約
４２０bpの断片を切り出し抽出精製した。このＤＮＡ断
片をプラスミドpTV119N （宝酒造）のＮｃｏＩサイト
に、プラスミド上のｌａｃＺ遺伝子と同じ向きになるよ
うに導入し、プラスミドpTASN-N を得た（図５）。

【００６２】実施例（１−３）で得たλ_AEP １０４のEc
oRＩ断片をプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社）のEcoRＩ
サイトに、プラスミド上ｌａｃＺ遺伝子と逆向きになる
ように導入しプラスミドpUC18-104 を得た（図６）。先
に得たプラスミドpTASN-N をＮｃｏＩで消化した後、ク
レノウフラグメントで平滑末端化し、更にＡｃｃIIIで
消化した反応液をアガロースゲル電気泳動を行い約３４
０bpの断片を切り出し抽出精製した。このＤＮＡ断片を
プラスミドpUC18-104 のＡｃｃIII 、ＳｍａＩサイトに
導入しプラスミドpUC18-ASN を得た（図７）。

【００６３】プラスミドpUC18-ASN をＸｂａＩとApaLＩ
で消化した後、クレノウフラグメントで平滑末端化し、
アガロースゲル電気泳動を行い約１３００bpの断片を切
り出し抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＥ
Ｔ３ｂのBamHＩサイトをクレノウフラグメントで平滑末
端化したところにプラスミド上のＴ₇ プロモーターの向
きと同じ向きに導入しプラスミドpEASN201を構築した
（図８）。このプラスミドは、配列表の配列番号２４に
示したアミノ酸配列の４４０アミノ酸残基のポリペプチ
ドのＮ末端側に配列表の配列番号３７に示す１９アミノ
酸残基が付加したポリペプチドをコードする。pEASN201
を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）／pEASN201と命名した。

【００６４】（２−３）アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼのＣ末端側欠失ポリペプチドを発現するプラスミド
の構築 実施例（２−２）で得られたプラスミドpUC18-ASN よ
り、成熟蛋白質からＮ末端より各種の長さのポリペプチ
ドをコードする遺伝子を切り出し、Ｃ末端側欠失ポリペ
プチドを発現するプラスミドを構築した。

【００６５】＜pEASN305の構築＞プラスミドpUC18-ASN
をＸｂａＩ、Nsp7524Vで消化した後、クレノウフラグメ
ントで平滑末端化し、アガロースゲル電気泳動を行い約
１１２０bpの断片を切り出し抽出精製した。このＤＮＡ
断片を実施例（２−２）でpEASN201を構築したときと同
様にｐＥＴ３ｂに導入しプラスミドpEASN305を構築した
（図９）。このプラスミドは配列表の配列番号２４に示
されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜３８４に相当す
る３８４残基のポリペプチドのＮ末端側に配列表の配列
番号３７に示す１９アミノ酸残基が、Ｃ末端側に配列表
の配列番号３８に示す４残基が付加したポリペプチドを
コードするＤＮＡを含む。

【００６６】＜pEASN304の構築＞プラスミドpUC18-ASN
をHincIIで消化し得られる約９２０bpのＤＮＡ断片を、
プラスミドｐＥＴ３ｄをＮｃｏＩ、BamHＩ消化後、クレ
ノウフラグメントで平滑末端化したところに、フラスミ
ド上のＴ₇ プロモーターの向きと同じ向きに導入しプラ
スミドpEASN304を構築した（図１０）。このプラスミド
は、配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列のア
ミノ酸番号１〜２９８に相当する２９８残基のポリペプ
チドの、Ｎ末端側に配列表の配列番号３９で示す８残基
が、Ｃ末端側に配列表の配列番号４０に示す２０残基が
付加したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。

【００６７】＜pEASN303、pEASN302、pEASN301の構築＞
プラスミドpUC18-ASN を、HincII、Hind III消化後クレ
ノウフラグメントで平滑化して得られる約５１０bpの断
片と、HincII、ＳｓｐＩ消化で得られる約５６０bpの断
片と、HincII、SnaBＩ消化で得られる約６５０bpの断片
を、pEASN304の構築と同じようにｐＥＴ３ｄに導入しそ
れぞれプラスミドpEASN301、pEASN302、pEASN303を構築
した。プラスミドpEASN301は配列表の配列番号２４に示
されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜１６４に、プラ
スミドpEASN302はアミノ酸番号１〜１８０に、プラスミ
ドpEASN303はアミノ酸番号１〜２０９にそれぞれ相当す
るポリペプチドのＮ末端側に配列表の配列番号３９で示
す８残基を、Ｃ末端側に配列表の配列番号４０で示す２
０残基が付加したポリペプチドをコードするＤＮＡを含
む。

【００６８】＜pEASN404の構築＞プラスミドpUC18-ASN
１ngをテンプレートとして実施例（１−４）と同じ条件
で２種類のＰＣＲ反応（２５サイクル）を１回ずつ行っ
た。プライマーとして、配列表の配列番号３３、３４で
示したＭＡＳＮ−Ｐ１プライマーとＭ４プライマー（宝
酒造社製）の組と、配列表の配列番号３５、３６で示し
たＭＵＴＲ１プライマー、ＲＶプライマー（宝酒造社
製）の組とで行った。ここでＭＡＳＮ−Ｐ１プライマー
は、配列表の配列番号２４で示したＡＳＮの塩基配列の
塩基番号１０３０〜１０５１の配列中１０４１番目のＴ
をＣに、１０４４番目のＣをＧに変異させた塩基配列に
相補的な配列であり、他の３種のプライマーは、プラス
ミドｐＵＣ１８の塩基配列あるいは類似した塩基配列で
ある。

【００６９】それぞれのＰＣＲ反応物をアガロースゲル
電気泳動を行い抽出精製した。それぞれの断片５ngずつ
を５０μｌ水中で混合し、９４℃５分間後室温まで徐冷
した。この混合物２μｌをテンプレートとしてＭ４プラ
イマーとＲＶプライマーを用いて再度同じ条件でＰＣＲ
反応を１回行った。このＰＣＲ反応物をエタノール沈殿
で濃縮し、ＳｐｈＩとＨｐａＩで消化後アガロースゲル
電気泳動を行い約９３０bpの断片を切り出し抽出精製し
た。このＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１９（宝酒造社）のＳ
ｐｈＩ、HincIIサイトに導入し、ＭＭＡＳＮ１を得た
（図１１）。このＭＭＡＳＮ１ファージを大腸菌ＪＭ１
０９株を宿主として液体培養を行い、ｓｓＤＮＡを調製
した。これをジデオキシ法によりＤＮＡシークエンシン
グを行い、ＭＡＳＮ１プライマー上の変異が入っている
ことを確認した。

【００７０】得られたＭＭＡＳＮ１ファージＤＮＡをＡ
ｃｃIII 、HincIIで消化し、アガロースゲル電気泳動を
行い約５６０bpの断片を切り出し抽出精製した。このＤ
ＮＡ断片を実施例（２−２）で得たプラスミドpTASN-N
のＡｃｃIII 、HincIIサイトに導入し、プラスミドpTMA
SN204 を得た（図１２）。このpTMASN204 を、ＮｃｏＩ
で部分消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、約８２
０bp断片を切り出し抽出精製した。このＤＮＡ断片をｐ
ＥＴ３ｄのＮｃｏＩサイトに、プラスミド上のＴ₇ プロ
モーターの向きと同じ向きに導入しプラスミドpEASN404
を構築した（図１３）。このプラスミドは配列表の配列
番号２４に示されるＡＳＮのアミノ酸配列のアミノ酸番
号１〜２７１に相当する２７１残基のポリペプチドのＮ
末端側にＭｅｔが付加したポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含む。

【００７１】以上述べてきたごとく構築されたプラスミ
ドpEASN305、pEASN304、pEASN303、pEASN302、pEASN30
1、pEASN404を用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞ
れ形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）／pEASN305、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）／pEASN304、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／pEASN30
3、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／pEASN302、大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）／pEASN301、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
／pEASN404と命名した。

【００７２】実施例３ アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼポリペプチドの大腸菌における発現 実施例２で得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／pEASN2
01、305 、304 、404、303 、302 、301 をそれぞれ１
００μｇ／mlのアンピシリンを含む５００mlＬ−培地に
接種し３７℃で振とう培養した。培養中濁度がＯ．Ｄ．
₆₆₀ ＝０．５となったところで終濃度１mMとなるように
ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラ
ノシド）を加え３７℃で一夜振とう培養した。培養液を
遠心分離して菌体を集め３０mlの０．１Ｍ ＮａＣｌ、
１mM ＥＤＴＡを含む１０mMトリス−ＨＣｌ緩衝液に懸
濁した後、超音波処理で菌体を破砕した。これを遠心分
離し沈殿を回収し３０mlの１Ｍショ糖水溶液に懸濁後１
７，０００ｇ、１５分間の遠心分離により沈殿を回収し
た。これを４０mlの１０mM ＥＤＴＡを含むトライトン
Ｘ−１００( Triton X-100 )に懸濁し、４℃で一夜放置
した。遠心分離により沈殿を回収し、２５mlの８Ｍ尿
素、１０mM ２−メルカプトエタノール、３０mM Ｎａ
Ｃｌを含む３０mMトリス−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、透析
により徐々に尿素と２−メルカプトエタノールを除き、
組換体蛋白質封入体可溶化液とした。

【００７３】得られた組換体蛋白質封入体可溶化液の一
部を、３０mM ＮａＣｌを含む３０mMリン酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ５．９に対し透析し、遠心分離により析出し
た沈殿を除き上清を回収して活性測定用試料液とし以下
のように活性測定を行った。５mM ＥＤＴＡを含む５０
mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）２０μｌ、５０
mM ＤＴＴ５μｌ、０．１mMの式（化２）：ＤＮＰ−Ｌ
−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ−ＮＨ
₂ （配列表の配列番号９で示される）１０μｌ、０．０
１mM ＤＮＰ−Ｓｅｒ １０μｌ（内部標準物質）及び
適当に希釈した試料液５μｌを３７℃で２０分間保温
し、５μｌギ酸を加えることにより反応を停止した。こ
の反応液の一部をＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマ
トグラフィーにより分析し、生成した式（化３）：ＤＮ
Ｐ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｎ
（配列表の配列番号１０で示される）量をＤＮＰ−Ｓｅ
ｒ量と比較定量した。活性測定の結果大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）／pEASN201、pEASN305、pEASN304、pEASN404
の培養物から得たそれぞれの活性測定用試料液中には、
アスパラギニルエンドペプチダーゼ活性が見られたが、
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／pEASN303、302 、301 の培
養物から得たそれぞれの活性測定試料液中には、アスパ
ラギニルエンドペプチダーゼ活性は見出されず、大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）／pEASN404の生産するポリペプチド
が活性の最小単位であった。

【００７４】

【発明の効果】以上の結果から、本発明によりアスパラ
ギニルエンドペプチダーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ
酸配列が明らかとなり、アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼ遺伝子を提供することが可能となり、アスパラギニ
ルエンドペプチダーゼ活性を持ったポリペプチドの工業
的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供された。またこ
の塩基配列を基にしてプローブＤＮＡやＰＣＲ用プライ
マーＤＮＡを合成したり、アミノ酸配列を基にして抗体
を作成することが可能となった。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1323 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GAAGTGGGAA CCCGGTGGGC GGTTCTCGTG GCTGGTTCAA ACGGTTATGG AAATTATAGG 60 CATCAAGCGG ATGTGTGCCA TGCTTACCAG TTGCTGATAA AAGGTGGAGT CAAAGAAGAA 120 AACATTGTGG TGTTTATGTA TGATGATATA GCTTATAACG CCATGAATCC CAGACCCGGA 180 GTCATCATCA ACCATCCTCA GGGGCCAGAC GTGTATGCTG GTGTACCTAA GGATTACACC 240 GGTGAGGACG TAACACCTGA GAACCTATAT GCTGTCATTC TTGGGGACAA GAGTAAAGTT 300 AAAGGTGGAA GTGGCAAGGT GATCAACAGC AATCCGGAGG ATAGGATATT TATATTCTAC 360 TCCGATCATG GAGGTCCCGG AGTTCTTGGG ATGCCAAACG CACCATTCGT TTATGCCATG 420 GATTTTATTG ATGTTTTGAA GAAGAAACAT GCAAGTGGAG GCTACAAGGA GATGGTTATA 480 TACATAGAAG CTTGTGAGAG TGGGAGCATA TTTGAGGGTA TAATGCCCAA GGATCTGAAT 540 ATTTATGTGA CAACTGCGTC AAATGCACAA GAGAACAGTT TTGGAACTTA TTGTCCTGGG 600 ATGAATCCTC CTCCACCAGA AGAGTACGTA ACTTGCCTGG GGGATTTATA CAGCGTTTCT 660 TGGATGGAAG ATAGTGAGAC TCACAATCTA AAAAGGGAAA CGGTACAACA GCAATACCAG 720 TCGGTAAGGA AACGGACTTC AAATTCTAAC AGCTATAGGT TTGGTTCTCA TGTGATGCAA 780 TACGGTGACA CTAACATTAC TGCTGAAAAG CTTTACTTGT ACCATGGTTT TGATCCTGCC 840 ACCGTGAACT TTCCTCCACA CAACGGCAAC CTAGAAGCTA AAATGGAAGT TGTTAACCAG 900 AGAGATGCAG AGCTTTTGTT CATGTGGCAA ATGTATCAGA GATCAAACCA TCAACCGGAA 960 AAGAAGACTC ACATCCTGGA ACAGATTACA GAGACAGTGA AGCATAGGAA TCATTTGGAT 1020 GGCAGTGTGG AATTGATTGG AGTTTTGTTG TATGGACCAG GAAAAAGTTC TTCGGTTCTA 1080 CATTCCGTGA GGGCTCCTGG TCTGCCCCTA GTTGATGATT GGACATGCTT GAAATCTATG 1140 GTTAGAGTGT TCGAAACTCA CTGTGGGTCA CTGACTCAGT ATGGCATGAA ACACATGCGG 1200 GCATTCGGCA ACGTTTGCAA CAGCGGCGTT TCTAAGGCCT CCATGGAGGA GGCTTGTAAG 1260 GCAGCTTGCG GTGGCTATGA CGCTGGGTTA TTATATCCAT CAAACACAGG ATATAGTGCT 1320 TGA 1323 配列番号：２ 配列の長さ：1323 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GACGAGGGGA CCAGGTGGGC CGTTTTAATT GCTGGTTCCA ATGGTTACTG GAATTACAGG 60 CATCAGTCTG ATGTATGCCA TGCGTATCAA GTGCTGAGGA AAGGTGGTCT GAAAGAAGAA 120 AATATTGTTG TGTTTATGTA TGATGACATT GCTTTCCATA AAGAAAACCC ACGGCCTGGA 180 ATCATCCTTA ACAGTCCACA TGGAGATGAT GTTTACAAAG GAGTACCTAA GGATTACGTT 240 GGTAAAGATG TTACTGTTAA CAACTTTTTA GCTGCTATAC TTGGAAATAA GTCAGCTATT 300 ACCGGCGGTA GTGGGAAGGT TGTCAATAGT GGTCCCAATG ATCATATATT TATATTCTAC 360 TCTGATCATG GGGGTCCGGG AGTGCTTGGG ATGCCTACTA GTCCGTTCTT GTATGCATCT 420 GATCTGATTG AAGTCTTGAA GAAGAAGCAT GCTTCTGGAA CATATAAAAG CCTTGTATTT 480 TATCTAGAGG CATGTGAATC TGGGAGTATC TTTGAAGGTC TTCTTCCTGA AGGTCTAAAT 540 ATCTATGCAA CAACAGCTGC AAATGCAAAA GAAAGCAGTT GGGGAACATA TTGTCCTGGG 600 GAGTCTCCTA GTCCTCCCCC AGAATATGAA ACCTGCCTGG GTGACCTGTA CAGTGTTGCT 660 TGGATGGAAG ACAGTGACAT ACACAATTTA CGAACAGAAA CTCTACATCA ACAATACGAA 720 TCGGTCAAAG CAAGGACTAT CAATGGAAAT TCAATTTATG GTTCTCACGT GATGCAGTAT 780 GGTGACATAG AGCTTAGCAA AAATAATCTC TTCCTATATT TGGGTACAAA TCCTGCAAAT 840 GATAATTTTA CTTTTGTGGA TAAAAACTCG TTGGTGCCAC CTTCAAAAGC AGTAAACCAA 900 CGTGATGCTG ATCTCGTCCA TTTCTGGGAT AAGTTCCGCA AAGCTCCTGA GGGTTCTGCT 960 AGGAAAGCTG CAGCCAGGAA ACAAGTTCTG GAAGCAATGT CTCACAGAAT GCATATAGAT 1020 GACAGCATGA AACTTATTGG GAAGCTCTTA TTTGGCATTG AAAAGGGCCC AGAAGTGCTC 1080 AGCAGTGTTA GACCTGCTGG GCAAGCACTT GTTGATGATT GGGACTGCCT TAAAACACTG 1140 GTTAGGACTT TTGAGACACA TTGCGGATCA CTGTCTCAGT ATGGGATGAA GCATATGAGG 1200 TCCTTTGCAA ACTTCTGCAA CGCTGGTATT CAGAAGGAGC AAATGGCTGA GGCCTCAGCA 1260 CAAGCGTGCG TCAGTATTCC TGCAACTCCC TGGAGTTCAT TGCACAGGGG TTTCAGTGCA 1320 TAA 1323 配列番号：３ 配列の長さ：1323 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATTCCCGGTA CCAGATGGGC CATCCTAATC GCCGGCTCCA ATGGCTACTG GAATTACAGG 60 CATCAGGCTG ATATTTGTCA TGCGTATCAA ATACTGAGGA AAGGTGGCCT GAAAGAAGAA 120 AATATTATTG TTTTTATGTA TGATGACATT GCTTTCAATG AGAACAACCC AAAACCTGGA 180 GTCATCATTA ACAAACCAGA TGGGGATGAT GTTTATGAAG GAGTTCCAAA GGATTACACT 240 GGCGACGATG TTACTGCTGA TAACTTCTAT GCTGTTATAC TTGGAAATAA ATCAGCACTT 300 ACAGGTGGCA GTGGGAAGGT TGTGAACAGT GGCCCTGATG ATCGTATATT CATATTCTAT 360 AGTGATCATG GAGGTCCAGG AGTTCTTGGG ATGCCTGCTG GTCCTTTCTT ATATGCATCT 420 GATCTGATTG AAGTCTTGAA GAAAAAACAT GCTTCTGGAA CGTATAAAAG CCTTGTATTT 480 TATCTTGAGG CATGTGAATC TGGGAGTATC TTTGAAGGCC TTCTTCCTGA AGATATCAAT 540 ATTTATGCAA CAACAGCTTC CAATGCAGAA GAAAGCAGCT GGGGAACATA TTGCCCAGGC 600 GAGGATCCCA GTCCTCCCCC AGAATATTCA ACTTGCTTGG GTGACGAGTA CAGTGTTGCT 660 TGGATGGAAG ACAGTGACAG GAAGAATTTG CGAACAGAAA CTTTGCACCA ACAATATGAA 720 TTGGTTAAAG AGAGGACTAT TAACGGAAGT ATATACCATA GCTCTCACGT GATGCAGTAT 780 GGTGATATAA GTCTCAGCGA TGATGTTCTC TTCCTATATT TGGGTACAAA TCCTGCTAAT 840 GATAATTTTA CCTATGTGGA TGAGAACTCC TTGAGGTCAC CTTCAAAAGC AATCAGCCAA 900 CGTGTTGCTG ATCTCATCCA TTTTTGGGAG AAGTTCCGCA AAGCTCCTGA GGGTTCTACC 960 AGGAAAGATG CTGCTCAGAA ACAATTTCTG GAAGTAATGT CTCACAGAAT GCATATAGAC 1020 AACAGTGTGA AAATTATTGG GAGTCTTTTA TTTGGCATTG AAAAGGGTCC AGAAGTACTC 1080 AATGCTGTTA GACCGGCTGG AATGGCACTT GTTGATGACT GGGACTGCCT GAAAAATATG 1140 GTAAGGACTT TTGAGACATA TTGTGGATCC TTGTCTCAGT ATGGGATGAA ATATATGAGG 1200 TCCTTTGCAA ACATCTGCAA TGCAAGAATT AAGAATGACC AAATGGCTGA TGCCTCAGCA 1260 CAAGCTTGTG TCAGTATTCC TGCCAATCCC TGGAGTTCTC TGCAAAGGGG TTTCAGTGCA 1320 TAA 1323 配列番号：４ 配列の長さ：1323 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： CTTCCCGGTA CCAGGTGGGC CATCCTTCTC GCCGGTTCCA ATGGCTACTG GAATTACAGG 60 CATCAGGCTG ATATTTGTCA TGCGTATCAA ACACTGAGGA AAGGTGGCCT GAAAGAAGAA 120 AATATTATTG TTTTTATGTA TGATGACATT GCGTTCAATG AGGAGAACCC AAGACCTGGG 180 GTCATCATTA ACAAACCAGA TGGGACTGAT GTTTATGAAG GAGTTCCAAA GGATTACACT 240 GGCGAAGATG TTACTGCTGA AAACTTCTAC GCTGTTTTAC TTGGAAATAA GTCGGCACTT 300 AGCGGTGGCA GTGGGAAGGT TGTGAACAGT GGCCCCGATG ATCGTATATT TGTATTCTAT 360 AGTGATCATG GAGGTCCAGG AGTTCTCGGG ATGCCTGCCG GTCCTTACTT ATATGCATCT 420 GATCTGAATG ATGTCTTGAA GAAAAAACAT GCTTCCGGAA CATATAAAAG CCTAGTATTT 480 TATCTTGAGG CATGTGAATC TGGGAGTATC TTTGAAGGCC TTCTTCCTGA AGATGTCAAT 540 ATTTATGCAA CAACAGCTTC GAATGCAGAA GAAAGCAGCT GGGGAACATA TTGCCCAGGG 600 GAGTATCCCA GTCCTCCCCC AGAATATTCA ACTTGCTTGG GAGACCTGTA CAGTGTTGCT 660 TGGATGGAAG ACAGTGACAG ACACAATTTG CGAACTGAAA CTTTGAACCA ACAATATAAA 720 TTGGTTAAAG AGAGGACCAT TAGTGGAGGT TCATACTATG GCTCTCACGT GATGCAGTAT 780 GGTGATATAG GGCTCAGCGA TGATGTTCTC TTCCTATATT TGGGTACAAA TCCTGCTAAT 840 GATAATTTTA CCTTTGTCGA TGAAAACTCC TTGAGGTCAC CTTCAAAAGC AGTCAACCAA 900 CGGGATGCTG ATCTCATCCA TTTCTGGGAG AAGTTCCGCA AAGCTCCTGA GGGTTCTCCC 960 GAGAAAAATG CTGCTCAGAA ACAAGTTGTG GAAGTAATGT CTCACAGGAT GCATATAGAC 1020 AACGGTGTGG AACTTATTGG GAAGCTTTTA TTTGGCATTG AAAAGGGTCC AAAAGTACTG 1080 GATGCTGTTA GACCGGCTGG AATGGCACTT GTTGATGACT GGGACTGCCT GAAAACCATG 1140 GTAAGGACAT TTGAGACATA TTGTGGATCC TTGTCTCAGT ATGGGATGAA ACATATGAGG 1200 TCCTTTGCAA ACATCTGCAA CGCAGGAATT AAGAATGACC AAATGGCCGA TGCCTCAGCA 1260 CAAGCTTGTG TCAGTATTCC TGCCAATTCC TGGAGTTCTC TGCAAAGGGG TTTCAGTGCA 1320 TAA 1323 配列番号：５ 配列の長さ：1323 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GAAGTTGGTA CCCGGTGGGC GGTTCTCGTG GCTGGTTCAA ACGGTTATGG AAATTATAGG 60 CATCAAGCGG ATGTGTGCCA TGCTTACCAG TTGCTGATAA AGGGTGGAGT CAAAGAAGAA 120 AACATTGTGG TGTTTATGTA TGATGATATA GCTTATAACG CCATGAATCC CAGACCCGGA 180 GTCATCATCA ACCATCCTCA GGGGCCAGAC GTGTATGCTG GTGTACCTAA GGATTACACC 240 GGTGAGGACG TAACACCTGA GAACCTATAT GCTGTCATTC TTGGGGACAA GAGTAAAGTT 300 AAAGGTGGAA GTGGCAAGGT GATCAACAGC AATCCGGAGG ATAGGATATT TATATTCTAC 360 TCCGATCATG GAGGTCCCGG AGTTCTTGGG ATGCCAAACG CACCATTCGT TTACGCCATG 420 GATTTTATTG ATGTTTTGAA GAAGAAACAT GCAAGTGGAG GCTACAAGGA GATGGTTATA 480 TACATAGAAG CTTGTGAGAG TGGGAGCATA TTTGAGGGTA TAATGCCCAA GGATCTGAAT 540 ATTTATGTGA CAACTGCGTC AAATGCACAA GAGAACAGTT TTGGAACTTA TTGTCCTGGG 600 ATGAATCCTC CTCCACCAGA AGAGTACGTA ACTTGCCTGG GGGATTTATA CAGCGTTTCT 660 TGGATGGAAG ATAGTGAGAC TCACAATCTA AAAAGGGAAA CGGTACAACA GCAATACCAG 720 TCGGTAAGGA AACGGACTTC AAATTCTAAC AGCTATAGGT TTGGTTCTCA TGTGATGCAA 780 TACGGTGACA CTAACATTAC TGCTGAAAAG CTTTACTTGT ACCATGGTTT TGATCCTGCC 840 ACCGTGAACT TTCCTCCACA CAACGGCAAC CTAGAAGCTA AAATGGAAGT TGTTAACCAG 900 AGAGATGCAG AGCTTTTGTT CATGTGGCAA ATGTATCAGA GATCAAACCA TCAACCGGAA 960 AAGAAGACTC ACATCCTGGA ACAGATTACA GAGACAGTGA AGCATAGGAA TCATTTGGAT 1020 GGCAGTGTGG AATTGATTGG AGTTTTGTTG TATGGACCAG GAAAAAGTTC TTCGGTTCTA 1080 CATTCCGTGA GGGCTCCTGG TCTGCCCCTA GTTGATGATT GGACATGCTT GAAATCTATG 1140 GTTAGAGTGT TCGAAACTCA CTGTGGGTCA CTGACTCAGT ATGGCATGAA ACACATGCGG 1200 GCATTCGGCA 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TTG GGT ACA AAT CCT GCA AAT 1046 Ser Lys Asn Asn Leu Phe Leu Tyr Leu Gly Thr Asn Pro Ala Asn 270 275 280 GAT AAT TTT ACT TTT GTG GAT AAA AAC TCG TTG GTG CCA CCT TCA 1091 Asp Asn Phe Thr Phe Val Asp Lys Asn Ser Leu Val Pro Pro Ser 285 290 295 AAA GCA GTA AAC CAA CGT GAT GCT GAT CTC GTC CAT TTC TGG GAT 1136 Lys Ala Val Asn Gln Arg Asp Ala Asp Leu Val His Phe Trp Asp 300 305 310 AAG TTC CGC AAA GCT CCT GAG GGT TCT GCT AGG AAA GCT GCA GCC 1181 Lys Phe Arg Lys Ala Pro Glu Gly Ser Ala Arg Lys Ala Ala Ala 315 320 325 AGG AAA CAA GTT CTG GAA GCA ATG TCT CAC AGA ATG CAT ATA GAT 1226 Arg Lys Gln Val Leu Glu Ala Met Ser His Arg Met His Ile Asp 330 335 340 GAC AGC ATG AAA CTT ATT GGG AAG CTC TTA TTT GGC ATT GAA AAG 1271 Asp Ser Met Lys Leu Ile Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys 345 350 355 GGC CCA GAA GTG CTC AGC AGT GTT AGA CCT GCT GGG CAA GCA CTT 1316 Gly Pro Glu Val Leu Ser Ser Val Arg Pro Ala Gly Gln Ala Leu 360 365 370 GTT GAT GAT TGG GAC TGC CTT AAA ACA CTG GTT AGG ACT TTT GAG 1361 Val Asp 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AGG TTT GGT TCT CAT 405 Arg Lys Arg Thr Ser Asn Ser Asn Ser Tyr Arg Phe Gly Ser His 125 130 135 GTG ATG CAA TAC GGT GAC ACT AAC ATT ACT GCT GAA AAG CTT TAC 450 Val Met Gln Tyr Gly Asp Thr Asn Ile Thr Ala Glu Lys Leu Tyr 140 145 150 TTG TAC CAT GGT TTT GAT CCT GCC ACC GTG AAC TTT CCT CCA CAC 495 Leu Tyr His Gly Phe Asp Pro Ala Thr Val Asn Phe Pro Pro His 155 160 165 AAC GGC AAC CTA GAA GCT AAA ATG GAA GTT GTT AAC CAG AGA GAT 540 Asn Gly Asn Leu Glu Ala Lys Met Glu Val Val Asn Gln Arg Asp 170 175 180 GCA GAG CTT TTG TTC ATG TGG CAA ATG TAT CAG AGA TCA AAC CAT 585 Ala Glu Leu Leu Phe Met Trp Gln Met Tyr Gln Arg Ser Asn His 185 190 195 CAA CCG GAA AAG AAG ACT CAC ATC CTG GAA CAG ATT ACA GAG ACA 630 Gln Pro Glu Lys Lys Thr His Ile Leu Glu Gln Ile Thr Glu Thr 200 205 210 GTG AAG CAT AGG AAT CAT TTG GAT GGC AGT GTG GAA TTG ATT GGA 675 Val Lys His Arg Asn His Leu Asp Gly Ser Val Glu Leu Ile Gly 215 220 225 GTT TTG TTG TAT GGA CCA GGA AAA AGT TCT TCG GTT CTA CAT TCC 720 Val Leu Leu Tyr Gly Pro 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Thr Gly Asp Asp Val Thr 75 80 85 GCT GAT AAC TTC TAT GCT GTT ATA CTT GGA AAT AAA TCA GCA CTT 385 Ala Asp Asn Phe Tyr Ala Val Ile Leu Gly Asn Lys Ser Ala Leu 90 95 100 ACA GGT GGC AGT GGG AAG GTT GTG AAC AGT GGC CCT GAT GAT CGT 430 Thr Gly Gly Ser Gly Lys Val Val Asn Ser Gly Pro Asp Asp Arg 105 110 115 ATA TTC ATA TTC TAT AGT GAT CAT GGA GGT CCA GGA GTT CTT GGG 475 Ile Phe Ile Phe Tyr Ser Asp His Gly Gly Pro Gly Val Leu Gly 120 125 130 ATG CCT GCT GGT CCT TTC TTA TAT GCA TCT GAT CTG ATT GAA GTC 520 Met Pro Ala Gly Pro Phe Leu Tyr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Val 135 140 145 TTG AAG AAA AAA CAT GCT TCT GGA ACG TAT AAA AGC CTT GTA TTT 565 Leu Lys Lys Lys His Ala Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Leu Val Phe 150 155 160 TAT CTT GAG GCA TGT GAA TCT GGG AGT ATC TTT GAA GGC CTT CTT 610 Tyr Leu Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser Ile Phe Glu Gly Leu Leu 165 170 175 CCT GAA GAT ATC AAT ATT TAT GCA ACA ACA GCT TCC AAT GCA GAA 655 Pro Glu Asp Ile Asn Ile Tyr Ala Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu 180 185 190 GAA AGC AGC TGG GGA ACA TAT TGC CCA GGC GAG GAT CCC AGT CCT 700 Glu Ser Ser Trp Gly Thr Tyr Cys Pro Gly Glu Asp Pro Ser Pro 195 200 205 CCC CCA GAA TAT TCA ACT TGC TTG GGT GAC GAG TAC AGT GTT GCT 745 Pro Pro Glu Tyr Ser Thr Cys Leu Gly Asp Glu Tyr Ser Val Ala 210 215 220 TGG ATG GAA GAC AGT GAC AGG AAG AAT TTG CGA ACA GAA ACT TTG 790 Trp Met Glu Asp Ser Asp Arg Lys Asn Leu Arg Thr Glu Thr Leu 225 230 235 CAC CAA CAA TAT GAA TTG GTT AAA GAG AGG ACT ATT AAC GGA AGT 835 His Gln Gln Tyr Glu Leu Val Lys Glu Arg Thr Ile Asn Gly Ser 240 245 250 ATA TAC CAT AGC TCT CAC GTG ATG CAG TAT GGT GAT ATA AGT CTC 880 Ile Tyr His Ser Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asp Ile Ser Leu 255 260 265 AGC GAT GAT GTT CTC TTC CTA TAT TTG GGT ACA AAT CCT GCT AAT 925 Ser Asp Asp Val Leu Phe Leu Tyr Leu Gly Thr Asn Pro Ala Asn 270 275 280 GAT AAT TTT ACC TAT GTG GAT GAG AAC TCC TTG AGG TCA CCT TCA 970 Asp Asn Phe Thr Tyr Val Asp Glu Asn Ser Leu Arg Ser Pro Ser 285 290 295 AAA GCA ATC AGC CAA CGT GTT GCT GAT CTC ATC CAT TTT TGG GAG 1015 Lys Ala Ile Ser Gln Arg Val Ala Asp Leu Ile His Phe Trp Glu 300 305 310 AAG TTC CGC AAA GCT CCT GAG GGT TCT ACC AGG AAA GAT GCT GCT 1060 Lys Phe Arg Lys Ala Pro Glu Gly Ser Thr Arg Lys Asp Ala Ala 315 320 325 CAG AAA CAA TTT CTG GAA GTA ATG TCT CAC AGA ATG CAT ATA GAC 1105 Gln Lys Gln Phe Leu Glu Val Met Ser His Arg Met His Ile Asp 330 335 340 AAC AGT GTG AAA ATT ATT GGG AGT CTT TTA TTT GGC ATT GAA AAG 1150 Asn Ser Val Lys Ile Ile Gly Ser Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys 345 350 355 GGT CCA GAA GTA CTC AAT GCT GTT AGA CCG GCT GGA ATG GCA CTT 1195 Gly Pro Glu Val Leu Asn Ala Val Arg Pro Ala Gly Met Ala Leu 360 365 370 GTT GAT GAC TGG GAC TGC CTG AAA AAT ATG GTA AGG ACT TTT GAG 1240 Val Asp Asp Trp Asp Cys Leu Lys Asn Met Val Arg Thr Phe Glu 375 380 385 ACA TAT TGT GGA TCC TTG TCT CAG TAT GGG ATG AAA TAT ATG AGG 1285 Thr Tyr Cys Gly Ser Leu Ser Gln Tyr Gly Met Lys Tyr Met Arg 390 395 400 TCC TTT GCA AAC ATC TGC AAT GCA AGA ATT AAG AAT GAC CAA ATG 1330 Ser Phe Ala Asn Ile Cys Asn Ala Arg Ile Lys Asn Asp Gln Met 405 410 415 GCT GAT GCC TCA GCA CAA GCT TGT GTC AGT ATT CCT GCC AAT CCC 1375 Ala Asp Ala Ser Ala Gln Ala Cys Val Ser Ile Pro Ala Asn Pro 420 425 430 TGG AGT TCT CTG CAA AGG GGT TTC AGT GCA TAATTCCTGA AAATGCACAC 1425 Trp Ser Ser Leu Gln Arg Gly Phe Ser Ala 435 440 TAATGAACAC CAAAAGTATG ATTACTCTTA CATTATGTTT TATGGCTGTA TGTATATATA 1485 TGTTGTACAA TGGTCATAAT ATTTTGCCCT GCCTTGTAAT TACAATAGGG GCAATACTAG 1545 GAGTCCAAAG GGTCTTTACA TTGTAGTTCC GCACATAGAT ACTTCAACTT CGTTTATATA 1605 ATCCATTTCT TCTGAGGTTG TATATTTGCA ATTTGCAAGA AAAGCAATTA CAGGGGATCG 1665 TGACATTCAC GGCATAAGGT GGGATAATGG ACCAATTGCT TTGGAATGTC TACTATGACA 1725 AGGGCATGAG GTCATGCATG TATGCCAATG CATAGAACTA ATGTGTATTT TTATTCAGTA 1785 GACTATTGCC AGATCGGGTT TTCCCTTAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1830 配列番号：18 配列の長さ：1453 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： AG GAT TAC ACC GGT GAG GAC GTA ACA CCT GAG AAC CTA TAT GCT 44 Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Glu Asn Leu Tyr Ala 1 5 10 GTC ATT CTT GGG GAC AAG AGT AAA GTT AAA 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Glu Thr Leu Asn Gln Gln Tyr Lys 230 235 240 TTG GTT AAA GAG AGG ACC ATT AGT GGA GGT TCA TAC TAT GGC TCT 996 Leu Val Lys Glu Arg Thr Ile Ser Gly Gly Ser Tyr Tyr Gly Ser 245 250 255 CAC GTG ATG CAG TAT GGT GAT ATA GGG CTC AGC GAT GAT GTT CTC 1041 His Val Met Gln Tyr Gly Asp Ile Gly Leu Ser Asp Asp Val Leu 260 265 270 TTC CTA TAT TTG GGT ACA AAT CCT GCT AAT GAT AAT TTT ACC TTT 1086 Phe Leu Tyr Leu Gly Thr Asn Pro Ala Asn Asp Asn Phe Thr Phe 275 280 285 GTC GAT GAA AAC TCC TTG AGG TCA CCT TCA AAA GCA GTC AAC CAA 1131 Val Asp Glu Asn Ser Leu Arg Ser Pro Ser Lys Ala Val Asn Gln 290 295 300 CGG GAT GCT GAT CTC ATC CAT TTC TGG GAG AAG TTC CGC AAA GCT 1176 Arg Asp Ala Asp Leu Ile His Phe Trp Glu Lys Phe Arg Lys Ala 305 310 315 CCT GAG GGT TCT CCC GAG AAA AAT GCT GCT CAG AAA CAA GTT GTG 1221 Pro Glu Gly Ser Pro Glu Lys Asn Ala Ala Gln Lys Gln Val Val 320 325 330 GAA GTA ATG TCT CAC AGG ATG CAT ATA GAC AAC GGT GTG GAA CTT 1266 Glu Val Met Ser His Arg Met His Ile Asp Asn Gly Val Glu Leu 335 340 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GGT CTG CCC CTA GTT GAT GAT TGG ACA TGC TTG AAA 1362 Arg Ala Pro Gly Leu Pro Leu Val Asp Asp Trp Thr Cys Leu Lys 365 370 375 TCT ATG GTT AGA GTG TTC GAA ACT CAC TGT GGG TCA CTG ACT CAG 1407 Ser Met Val Arg Val Phe Glu Thr His Cys Gly Ser Leu Thr Gln 380 385 390 TAT GGC ATG AAA CAC ATG CGG GCA TTC GGC AAC GTT TGC AAC AGC 1452 Tyr Gly Met Lys His Met Arg Ala Phe Gly Asn Val Cys Asn Ser 395 400 405 GGC GTT TCT AAG GCC TCC ATG GAG GAG GCT TGT AAG GCA GCT TGC 1497 Gly Val Ser Lys Ala Ser Met Glu Glu Ala Cys Lys Ala Ala Cys 410 415 420 GGT GGC TAT GAC GCT GGG TTA TTA TAT CCA TCA AAC ACA GGA TAT 1542 Gly Gly Tyr Asp Ala Gly Leu Leu Tyr Pro Ser Asn Thr Gly Tyr 425 430 435 AGT GCT TGATTTTGGG TTGTGCACAC AAATTAAAAG CCTTTAACAA GTTAAACAGC 1598 Ser Ala 440 CAAGTTGATG ATGTGCTGCT TCTGAATTGC GTTCTCCCTT CTGGTTTCTG CTGCTTGTGT 1658 TAAATTTGTT CCCTGTAATT AAATTAGCCA AATAGCACAC GTGTAATCGG GCAGCTAACC 1718 CAGTGCAACA CACTCTATTA TTTCTATTGA GAGTGGTTAG GAGAGAATGC ATATATCGAT 1778 CACGTGTATA TAAATGCAGT GCCTTTTCAT AAAATAAGTA ATTAAGTATT AGTCTATTAA 1838 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1898 AAAAAAAAAA AA 1910 配列番号：25 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 4 E L-asparaginamide 配列番号：26 配列の長さ：10 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCGAATTCGG 10 配列番号：27 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AATTCGAGGA TCCGGGTACC ATGG 24 配列番号：28 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCATGGTACC CGGATCCTCG 20 配列番号：29 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： CCGGATCCTA TGGTCATGAT GTTGGTG 27 配列番号：30 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： CGCGCATGCG AAGCAGCACA TCATCAAC 28 配列番号：31 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： GCCATGGAAG TTGGTACCCG GTGGG 25 配列番号：32 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： ATCCATGGCG TAAACGAATG GTGC 24 配列番号：33 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GGTACAACTA GAGCTTTTCA GC 22 配列番号：34 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTTTCCCAG TCACGAC 17 配列番号：35 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGCCAGTGCC TAGCTTACAT 20 配列番号：36 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGGAAACAG CTATGAC 17 配列番号：37 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ser Pro Met 配列番号：38 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列番号：39 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列番号：40 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列： Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ala Glu Gln 20

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＳＮ、ＡＳＮ−１、Ｒｎ８−６３、１０４、
ＡＳＮ−Ｎ、及び１０２の制限酵素地図、及び各々の関
係を示す図である。

【図２】ＡＳＮ、１０１、１０３、及び１０７の制限酵
素地図、及び各々の関係を示す図である。

【図３】ASN-ful-pTV118N の構築工程の一部を示す図で
ある。

【図４】図３と共にASN-ful-pTV118N の構築を示す図で
ある。

【図５】ｐＴＡＳＮ−Ｎの構築を示す図である。

【図６】ｐＵＣ１８−１０４の構築を示す図である。

【図７】ｐＵＣ１８−ＡＳＮの構築を示す図である。

【図８】ｐＥＡＳＮ２０１の構築を示す図である。

【図９】ｐＥＡＳＮ３０５の構築を示す図である。

【図１０】ｐＥＡＳＮ３０４の構築を示す図である。

【図１１】ＭＭＡＳＮ１の構築を示す図である。

【図１２】ｐＴＭＡＳＮ２０４の構築を示す図である。

【図１３】ｐＥＡＳＮ４０４の構築を示す図である。

【図１４】各発現ポリペプチドと活性の関係を示す図で
ある。

フロントページの続き (72)発明者 石井 信一 千葉県市川市菅野２丁目４−20 (72)発明者 阿部 勇吉 北海道札幌郡広島町字大曲40−48 (56)参考文献 特開 平３−160997（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 9/48 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記(a)〜(d)に記載の遺伝子から選択さ
   れ、かつ、アスパラギニルエンドペプチダーゼ活性を有
   するポリペプチドをコードすることを特徴とするアスパ
   ラギニルエンドペプチダーゼ遺伝子。 (a)配列表の配列番号８に示されるＤＮＡ配列にコード
   されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする
   遺伝子。 (b)配列表の配列番号８に示されるＤＮＡ配列にコード
   されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のア
   ミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１
   つがなされているアミノ酸配列からなるポリペプチドを
   コードする遺伝子、 (c)配列表の配列番号８に示されるＤＮＡ配列に厳密な
   条件下でハイブリダイズする遺伝子、 (d)上記(a)〜(c)のいずれかに記載の遺伝子の配列を含
   むことを特徴とする遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子を含有する組換え
   ベクターを導入した形質転換体。
3. 【請求項３】請求項２記載の形質転換体を培養し、該培
   養物からアスパラギニルエンドペプチダーゼを採取する
   ことを特徴とするアスパラギニルエンドペプチダーゼの
   製造方法。