JPH0880196A - タンナーゼ遺伝子を含有するｄｎａ断片、新規な組み換え体プラスミド、タンナーゼの製造方法およびプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アスペルギルス属に属する微生物に由来し、
塩基長が3,563bpであって下記の制限酵素地図を有する
ことを特徴とする、タンナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片、 【化１】 配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするタンナ
ーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片、前記タンナーゼ遺伝
子を含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入し
たことを特徴とする新規な組み換え体プラスミド、前記
組み換え体プラスミドを含み、タンナーゼ生産能を有す
るアスペルギルス属に属する微生物を培地に培養し、培
養物からタンナーゼを採取することを特徴とするタンナ
ーゼの製造方法および配列番号１に記載の塩基配列で表
されるプロモーター。 【効果】 タンナーゼを効率よく提供することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、タンナーゼ遺伝子を含
有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片をプラスミドベクター
に連結した組み換え体プラスミド、タンナーゼの製造方
法及びプロモーターに関する。

【０００２】

【従来の技術】タンナーゼは、例えば、紅茶のクリーム
ダウンの防止剤、あるいはビール製造の際、清澄化に使
用される等極めて有用な酵素である。従来、タンナーゼ
は、例えば、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus o
ryzae)に属しタンナーゼ生産能を有する菌を、タンニン
酸等を含有させた特殊な培地に培養することにより生産
されている（特公昭 56-8584号公報）。しかしながら、
上記のタンナーゼの製造方法によるときには、タンナー
ゼの収率等において充分満足すべきものではなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、タン
ナーゼを遺伝子工学的手法により製造し、その収率を向
上させることにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、上
記課題を解決すべく、鋭意研究した結果、タンナーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をプラスミドベ
クターに挿入して組み換え体プラスミドを得、該組み換
え体プラスミドを含み、アスペルギルス属に属する微生
物を培地に培養すれば、培養物から効率よくタンナーゼ
を採取することができることの知見を得、本発明を完成
した。

【０００５】すなわち本発明は、アスペルギルス属に属
する微生物に由来し、塩基長が3,563bpであって下記の
制限酵素地図を有することを特徴とする、タンナーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片である。

【０００６】

【化２】

【０００７】また本発明は、実質的に配列番号４で表さ
れるアミノ酸配列をコードするタンナーゼ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片である。「実質的に配列番号４で表され
るアミノ酸配列」とは、タンナーゼ活性を有する限りに
おいてそのアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付
加等の変化があってもよい。

【０００８】尚、タンナーゼ遺伝子は、配列番号４に示
したアミノ酸配列をコードする塩基配列をもつものの他
に、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチド
をコードする縮重異性体をも包含するものであることは
いうまでもない。更にまた本発明は、前記タンナーゼ遺
伝子を含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入
したことを特徴とする新規な組み換え体プラスミドであ
る。

【０００９】更にまた本発明は、前記組み換え体プラス
ミドを含み、タンナーゼ生産能を有するアスペルギルス
属に属する微生物を培地に培養し、培養物からタンナー
ゼを採取することを特徴とするタンナーゼの製造方法で
ある。最後にまた本発明は、後記配列番号１に記載の塩
基配列で表されるプロモーターである。

【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。 (Ｉ) タンナーゼ遺伝子のクローニング用プローブの調
製 先ず、以下の方法によりタンナーゼ遺伝子のクローニン
グに用いるプローブを調製する。タンナーゼ生産菌とし
ては、アスペルギルス属に属する菌株であれば如何なる
ものでもよく、例えば、アスペルギルス・オリゼーＩＡ
Ｍ２６３６、アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２７０４
等が挙げられる。

【００１１】上記タンナーゼ生産菌を培養する際の培地
としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類等を配合
したものが挙げられる。炭素源としては、例えば、グル
コース、フラクトース、ガラクトース、マンノース、キ
シロース、グリセリン、サッカロース、デキストリン、
マンニット、マンノース、糖蜜等が挙げられる。

【００１２】窒素源としては、例えば、ポリペプトン、
NaNO₃、NaNO₂、(NH₄)₂HPO₄、NH₄H₂PO₄等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaNO₃、M
gSO₄、CaCl₂、FeSO₄、ZnSO₄、KCl等が挙げられる。培養
条件及び方法としては、例えば、温度25〜35℃好ましく
は28〜32℃、40〜60時間程度で振盪、通気攪拌培養等適
宜の方法が挙げられる。また、タンナーゼ誘導条件下で
は培地に、例えば、0.1〜6%のタンニン酸を添加する。

【００１３】なお、培地の初発pHは、例えば、5.0〜6.5
であり、培養中pHの調製の必要はない。そして、培養物
から純化されたタンナーゼ標品を得るには、例えば、培
養物を濾過して菌体を除去し、得られた濾液よりアセト
ン、アルコール、硫安等を用いる溶剤沈殿又は塩析等の
方法を採用することによりタンナーゼの粗酵素粉末を
得、更に、例えば、DEAE(ジエチルアミノエチル)−セル
ロース、DEAE−セファデックス等のイオン交換物質を用
いる吸着溶出法、セファデックスG-100等を用いるゲル
濾過法、その他の担体を用いる吸着溶出法、電気泳動法
等を適宜組み合せて実施すればよい。

【００１４】得られた純化タンナーゼ標品を、例えば、
E.Gross, "Methods in Enzymology", Vol.11， p.238記
載の方法により、シアノジェンブロマイドを用いて加水
分解した後、P.Edman, Acta.Chem.Scand., 4, p.283(19
50) 又は、M.W.Hunkapiller,L.E.Hood, Science 219,
p.650(1983)等記載の方法によりタンナーゼの部分アミ
ノ酸配列を決定することができ、更に、決定したタンナ
ーゼの部分アミノ酸配列を基に、ＤＮＡ合成機(アプラ
イド・バイオシステムズ社製)を用い同社のマニュアル
に従って約20bpのプローブを作製することができる。

【００１５】(II) タンナーゼ遺伝子のクローニング タンナーゼをコードする遺伝子の供与菌としては、アス
ペルギルス属に属する微生物であれば如何なるものでも
よく、その例としては、例えばアスペルギルス・オリゼ
ーＩＡＭ２６３６、アスペルギルス・オリゼーＩＡＭ２
７０４等が挙げられる。アスペルギルス属に属する菌株
染色体ＤＮＡ上のタンナーゼ遺伝子のクローニングは、
例えば、以下に述べるMolecular Cloning A LABORATORY
MANUAL SECOND EDITIONVol.1，p1.85〜1.104及びp7.19
〜7.22の変法により行なうことができる。

【００１６】先ず、上記供与菌を上述の培養条件で培養
して菌体を分離し、後述の実施例１項目(2)記載の方法
により染色体ＤＮＡを得、該染色体ＤＮＡを各種制限酵
素で消化してＤＮＡ断片混合物とする。このようにして
得られたＤＮＡ断片混合物中のいずれのＤＮＡ断片にタ
ンナーゼをコードする遺伝子が含有されているかは、標
識を付した上述のプローブを用いたサザンハイブリダイ
ゼーションにて判定できる。このとき、各標識プローブ
に共通に強いシグナルを示した断片を切出し、精製す
る。

【００１７】次いで、上記で単離したＤＮＡ断片を、プ
ラスミドベクターに組み込んで組み換え体プラスミドを
得、該組み換え体プラスミドを用いてたとえば大腸菌JM
109(TaKaRa社製)を形質転換し種々の菌株を得る。形質
転換は、例えば塩化カルシウム法により行なうことがで
きる。ここで用いることのできるプラスミドベクターと
しては、例えば、プラスミドpUC18、pUC19、pUC118、pU
C119、pBR322ＤＮＡ等が挙げられる。さらに、目的とす
る遺伝子が組み込まれた組み換え体プラスミドを、上述
のプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションに
より検出する。陽性のコロニーの細胞を拾いあげ培養す
ることにより、大量の目的とする組み換えＤＮＡ断片を
得ることができる。

【００１８】次に、上記のコロニーハイブリダイゼーシ
ョンで強いシグナルが得られた形質転換体から組み換え
体プラスミドを取り出し、これよりベクターＤＮＡを除
去することによってタンナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ
断片を得る。該断片を種々の制限酵素で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動等により解析することにより、タンナ
ーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の制限酵素地図が得ら
れる。また、当該ＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば、ア
プライド・バイオシステムズ社製Taq Dye Primer Cycle
Sequencing Kit又はTaq DyeDeoxyTM Terminator Cycle
Sequencing Kit等を用い、同社のマニュアルに従って
決定することができる。

【００１９】そして、上記供与菌を上述のタンナーゼ誘
導培養条件下で培養して菌体を分離し、後述の実施例１
項目(7)記載の方法により、mRNAを得る。この様にして
得られたmRNAを用い、例えば、RNA PCR Kit(TaKaRa社
製)を用いて、タンナーゼｍＲＮＡの逆転写産物である
タンナーゼをコードする目的のＤＮＡ断片が得られる。
さらには、このＤＮＡ断片を上述のＤＮＡ断片と同様
に、プラスミドベクターに組み込み、得られた組み換え
体プラスミドを用いることによりタンナーゼmRNAの逆転
写により得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定すること
ができる。このようにして得られたタンナーゼmRNA由来
のＤＮＡ断片の塩基配列と、染色体ＤＮＡを用いて得ら
れたタンナーゼ遺伝子の塩基配列とを比較することによ
りタンナーゼ遺伝子中のイントロンの配列及びタンナー
ゼ遺伝子にコードされているタンナーゼのアミノ酸配列
とを決定することができる。

【００２０】(III) 形質転換株の取得及びタンナーゼ
の発現 本発明において、タンナーゼの発現に用いられる宿主と
しては、アスペルギルス属に属する菌株であれば如何な
るものでもよく、例えば、アスペルギルス・オリゼーTL
株のNiaD^-(nitrate reductase欠損株)変異株であるアス
ペルギルス・オリーゼTL-1(FERM BP-4720)が好適に使用
される。上記の組み換え体プラスミドを用いて上記宿主
を形質転換するには、例えば、Curr.Genet., Vol.16,
p.53 〜56 (1989) 記載の方法により行なうことができ
る。

【００２１】そして、上記形質転換株よりタンナーゼ高
生産能を有する微生物をスクリーニングすることにより
アスペルギルス属に属し、組み換え体プラスミドを含
み、タンナーゼ生産能を有する微生物を得ることができ
る。以下の如くして得られたアスペルギルス属に属し、
組み換え体プラスミドを含み、タンナーゼ生産能を有す
る微生物を上記培地にタンニン酸を0.1〜6%となる如く
添加したものを用い上述したと全く同様の条件により培
養して精製し純化されたタンナーゼ標品を得ることがで
きる。このようにして得られたタンナーゼの理化学的性
質は、例えば、S.Iibuchi,Y.Minoda and K.Yamada, Ag
r.Biol.Chem., 32, p803(1968) に記載されているもの
と全く同様である。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、タンナーゼをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片をプラスミ
ドベクターに挿入した新規な組み換え体プラスミドが提
供される。また、該組み換え体プラスミドを含み、タン
ナーゼ生産能を有するアスペルギルス属に属する微生物
を培地に培養すれば、培養物からタンナーゼを効率よく
採取することができる。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、これらにより本発明の範囲が限定されるものでは
ない。 ［参考例１］ 部分アミノ酸配列決定のためのタンナー
ゼ標品の取得 タンニン酸2%、グルコース1%、リン酸一アンモン1.4%、
KH₂PO₄ 0.2%、MgSO₄・7H₂O 0.05%、pH5.5(5N-NaOHにて調
整)の組成をもつ改良培地〔この培地においてグルコー
ス（％）／タンニン酸（％）＝0.5, C/N=8.6〕20Lを30L
容発酵槽に入れ、殺菌せずにそのままこれに黄麹菌アス
ペルギルス・オリゼーTH株(IAM2636)の胞子を接種し、3
0℃で48時間、400r.p.m.の攪拌速度、20L/min.の通気量
で培養した。この時の培養濾液のタンナーゼ活性は12単
位/mlであった。次いでこのようにして48時間培養して
得た培養液を、セライトを濾過助剤として用いて菌体を
濾別し、15Lの濾液を得た。該濾液を減圧濃縮（温度25
℃）して3Lとし、これに3倍容量の冷アセトン（0℃）を
添加して酵素を沈殿させ、さらに該沈殿を遠心分離して
集め真空乾燥した。このようにして培養濾液15Lより19.
0gのタンナーゼの粗酵素粉末が得られた。この時の培養
濾液からのタンナーゼの回収率は７２％であり、その原
末の比活性は6,800 単位/gであった。

【００２４】次に、この粗酵素粉末を2gとり、20mlの0.
01M 酢酸ナトリウム・酢酸緩衝液(pH5.5)に溶解し、不
溶物を遠心除去した後、同じ緩衝液で緩衝化したDEAE-
セルロースカラムに通した。吸着した酵素は食塩の濃度
を徐々に上げて溶出させた（0〜1M-NaClを用いての濃度
勾配溶出法）。タンナーゼ区分(220ml)は上記と同様の
緩衝液に透析脱塩した後、凍結乾燥した。得られた標品
は次に3mlの0.01M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.5)に溶
解し、同じ緩衝液で緩衝化したセファデックスG-100の
カラムに通してゲル濾過を行なった。溶出液のタンナー
ゼ区分(30ml)を凍結乾燥した結果、80.6mgの精製酵素標
品を得た（比活性77,000単位/g,回収率45%）。

【００２５】［実施例１］ 黄麹菌アスペルギルス・オリゼーTH株由来のタンナーゼ
染色体ＤＮＡのクローニング (1)菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼーTH株(IAM2636)の胞子
（1.2×10⁵個）を、生育用培地〔2%(W/V)デキストリ
ン、1%(W/V)ポリペプトン、0.5%(W/V)KH₂PO₄、0.1%(W/
V)NaNO₃、0.05%(W/V)MgSO₄、pH5.7〕200mlに接種し、12
0r.p.m.、温度30℃で40時間振盪培養を行ない培養物を
得た。常法によりこの培養物を濾過して菌体10gを得
た。

【００２６】(2)染色体ＤＮＡの取得 この菌体を、0.1gのNovozyme 234(Novo Nordisk社製)を
含むプロトプラスト調製用緩衝液(0.6M KCl、0.093M Na
H₂PO₄、0.007M Na₂HPO₄、pH5.5)20mlに懸濁し、75r.p.
m.、温度30℃で2時間振盪しプロトプラスト溶液を得
た。この溶液を、滅菌したキムワイプ（十条キンバリー
社製）で濾過し菌体残渣を除いた後、1,000r.p.m.で10
分間、常法により遠心分離処理した。得られた沈殿物を
プロトプラスト調製用緩衝液20mlに懸濁し、1,000r.p.
m.で10分間、常法により遠心分離処理した。得られた沈
殿物をプロトプラスト破砕用緩衝液〔50mM Tris・HCl、
0.15MNaCl、100mM EDTA、2%(W/V) Sodium Laurylsulfat
e、pH7.5〕5mlに懸濁し、温度37℃で１時間静置後、プ
ロテアーゼ溶液〔1%(W/V) Proteinase K(和光純薬工業
株式会社製)〕50μlを加え、温度37℃で18時間静置し
た。

【００２７】得られた溶液に、TE緩衝液（10mM Tris・HC
l、1mM EDTA、pH7.5）で飽和したフェノール溶液5mlを
加え懸濁した後、12,000r.p.m.で10分間、常法により遠
心分離処理した。上層の水層を取り、クロロホルム及び
イソアミルアルコールを24対1(V/V)となる如く混合した
溶液5mlを加え懸濁した後、12,000r.p.m.で10分間、常
法により遠心分離処理した。上層の水層を取り、ジエチ
ルエーテル5mlを加え懸濁した後、12,000r.p.m.で10分
間、常法により遠心分離処理した。下層の水層を取り、
温度68℃で10分間静置した。

【００２８】この様にして得られたＤＮＡ溶液に、ポリ
エチレングリコール溶液〔20%(W/V)ポリエチレングリコ
ール3000、2M NaCl〕5mlを加え、氷中で1時間静置した
後、12,000r.p.m.で10分間、常法により遠心分離処理し
た。得られた沈殿物を、冷70%(V/V)エタノールを用いて
洗浄、蒸発乾固したものを、1mlのTE緩衝液に懸濁した
ものに、温度100℃で10分間加熱処理したRNase溶液〔0.
1%(W/V)RNase〕10μlを加え、37℃で1時間静置した。得
られたＤＮＡ溶液に、TE緩衝液で飽和したフェノール溶
液1mlを加え懸濁した後、12,000r.p.m.で10分間、常法
により遠心分離処理した。上層の水層を取り、クロロホ
ルム及びイソアミルアルコールを24対1(V/V)となる如く
混合した溶液1mlを加え懸濁した後、12,000r.p.m.で10
分間、常法により遠心分離処理した。上層の水層を取
り、ジエチルエーテル1mlを加え懸濁した後、12,000r.
p.m.で10分間、常法により遠心分離処理した。下層の水
層を取り、温度68℃で10分間静置した。得られた溶液
に、1/10量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)及び2倍量の冷エ
タノールを添加し、温度-80℃で30分静置した後、12,00
0r.p.m.で10分間、常法により遠心分離処理し、得られ
た沈殿を冷70%(V/V)エタノールを用いて洗浄、蒸発乾固
したものをTE緩衝液1mlに懸濁する事により染色体ＤＮ
Ａ溶液を得た。

【００２９】(3)タンナーゼ部分アミノ酸配列の決定 参考例１により得られたタンナーゼ1mg、CNBr30mg及び
ギ酸2.1mlに滅菌水を加え3mlとしたものを、なす型フラ
スコに入れパラフィルムで密封した後、40r.p.m.、温度
25℃で24時間振盪した。次いで、このサンプルを蒸発乾
固した後、0.2N酢酸200μlに懸濁し、12,000r.p.m.で10
分間、常法により遠心し上澄をHPLCにかけた。緩衝液と
しては、0.1%TFAと0.1%TFA，80%アセトニトリルを用
い、0.1%TFA＝100%、0.1%TFA，80%アセトニトリル＝0%
から、0.1%TFA＝0%、0.1%TFA，80%アセトニトリル＝100
%へ、40分間のグラジエントをかけ、夫々のピークを分
取した。分取した各ピークのサンプルを蒸発乾固し、滅
菌水20μlに溶解し、プロテインシークエンサー(アプラ
イド・バイオシステムズ社製)にかけタンナーゼの部分
アミノ酸配列を決定した（配列番号２）。また、同様に
タンナーゼ20μgをプロテインシークエンサーにかけタ
ンナーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定した（配列番号
３）。

【００３０】(4)プローブの作製 この様にして得られたタンナーゼのアミノ酸配列を参考
に、コロニーハイブリダイゼーションにプローブとして
用いるＤＮＡとして、次に示す3種のＤＮＡをＤＮＡ合
成機(アプライド・バイオシステムス社製)にて合成し
た。 プローブ１： 5'GGI A(AG)I GCI GCC TTI ACG TTI GA
3' プローブ２: 5'ACI GT(AG) CAI AC(AG) TCI GTG AA 3' プローブ３： 5'CGI ACI GCC TGC CA(AG) TA(AG) TGI A
C 3'

【００３１】得られた夫々のＤＮＡ1pmolを含むカイネ
ーション緩衝液(50mM Tris・HCl、10mM MgCl₂、10mM 2-
メルカプトエタノール、100μM [γ-³²P]ATP、pH7.6)19
μlに1μlのT4 Polynucleotide Kinase(10U/μl)を加
え、温度37℃で30分間静置した。次いで、NENSORB20核
酸精製用カートリッジ(第一化学薬品株式会社製)を用い
てこれらプローブＤＮＡの精製を行ない、夫々100μlの
標識ＤＮＡ溶液を得た。

【００３２】(5)サザンハイブリダイゼーション 上記の方法で得られた黄麹菌アスペルギルス・オリゼー
TH株の染色体ＤＮＡ20μgを含むＤＮＡ溶液50μlをEcoR
I、BamHI、HindIII 及びPstIの夫々の制限酵素で処理
後、各ＤＮＡ溶液10μlをアガロースゲル電気泳動にか
けた。0.4M NaOHを入れたトレイにガラスシャーレを置
き、その上にガラス板を乗せ、更にガラス板を覆うよう
に濾紙を置いた上にゲルを置き、ゲル以外の部分をラッ
プ用フィルムで覆った。次いで、ゲルの上にゲルと同じ
大きさのナイロンフィルターメンブラン(アマシャム社
製)を乗せ、更にその上にゲルと同じ大きさの３枚の濾
紙、ペーパータオル、ガラス板及び0.5kgの荷重を乗
せ、2時間ブロッティングを行なった。ブロッティング
終了後メンブランを5×SSC緩衝液(0.75M NaCl、75mMク
エン酸ナトリウム)で洗浄した後、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液〔0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、0.1%
(W/V)BSA、0.1%(W/V)フィコール、0.1%(W/V)ポリビニル
ピロリドン、0.5%(W/V)SDS、0.5mg sssDNA(超音波処理
後、沸騰水中で5分間加熱した後、急冷したもの)〕に浸
し、振盪させながら、温度42℃で1時間プレハイブリダ
イゼーションを行なった。次いで、メンブランを、熱変
性した20μlの標識プローブ１を加えたハイブリダイゼ
ーション溶液に浸し、温度42℃で16時間ハイブリダイゼ
ーションを行なった。ハイブリダイゼーションを行なっ
たメンブランを、洗浄溶液１(0.75M NaCl、75mMクエン
酸ナトリウム、1% SDS)に浸し、温度42℃で10分間振盪
した。メンブランを取り出し、再度洗浄溶液１に浸し、
温度42℃で10分間振盪した。次いで、メンブランを洗浄
溶液２(0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム)に浸し、
温度37℃で10分間振盪した。メンブランを取り出し、再
度洗浄溶液２に浸し、温度37℃で10分間振盪した。洗浄
後のメンブランを取り出し、濾紙上で余分な水分を拭っ
た後、ラップ用フィルムで包み、温度-70℃で16時間オ
ートラジオグラフィーを行なった。標識プローブ２、標
識プローブ３についても同様にオートラジオグラフィー
を行なった。制限酵素EcoRIで処理した染色体ＤＮＡ4μ
gを含むＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動にかけエ
チジウム・ブロマイドで染色後、オートラジオグラフィ
ーで、標識プローブ１、標識プローブ２、標識プローブ
３に夫々共通に強いシグナルを示した3.3kbpから3.6kbp
のＤＮＡ断片を切り出し、Prep A Gene DNA Purificati
on Matrix Kit(Bio Rad社製)を用いて精製した。

【００３３】(6)コロニーハイブリダイゼーション この精製したＤＮＡ断片を含む溶液に、0.1μgのプラス
ミドpUC19を制限酵素EcoRIで処理後脱リン酸化したもの
を加え、ＤＮＡライゲーションキット(TaKaRa社製)を用
いて連結させ組み換え体プラスミドＤＮＡを得た。次い
で、ディー・エム・モーリソン(D.M.Morrison)の方法
〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymo
logy)、第68巻、第326〜331 頁(1979年)〕で、塩化カル
シウム処理した大腸菌JM109(TaKaRa社製)を、上記のよ
うにして得た組み換え体プラスミドＤＮＡで形質転換し
た。

【００３４】この様にして得られた形質転換体の生育す
る培地プレートにナイロンフィルターメンブラン(アマ
シャム社製)を置き、約1分静置後メンブランをはがし、
コロニー側を上にして、滅菌濾紙上に置いた。次いで、
このメンブランをコロニー側を上にして、変性溶液(1.5
M NaCl、0.5M NaOH)に浸した濾紙上に置き7分間放置し
た。更にこのメンブランをコロニーのある面を上にし
て、中和溶液(1.5M NaCl、0.5M Tris・HCl、1mM EDTA、p
H7.2)を含む濾紙上に置いた。3分間放置後、新たに中和
溶液でしめらせた新しい濾紙を用い、この操作を繰返し
た。次いでこのメンブランを2×SSC緩衝液(0.3M NaCl、
0.03M クエン酸ナトリウム)中で1分間洗浄しコロニー側
を上にし、乾いた濾紙上に置き風乾した。更に乾いたメ
ンブランを0.4M NaOHをしみ込ませた濾紙の上に置き20
分間放置後、5×SSC緩衝液中で1分間振盪した。

【００３５】次いで、メンブランをハイブリダイゼーシ
ョン溶液に浸し、振盪させながら、温度42℃で1時間プ
レハイブリダイゼーションを行なった。更に、メンブラ
ンを、熱変性した20μlの標識プローブ１を加えたハイ
ブリダイゼーション溶液に浸し、温度42℃で16時間ハイ
ブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーショ
ンを行なったメンブランを洗浄溶液１に浸し、温度42℃
で10分間振盪した後、メンブランを取り出し、再度洗浄
溶液１に浸し、温度42℃で10分間振盪した。次いで、メ
ンブランを洗浄溶液２に浸し、温度37℃で10分間振盪し
た後、メンブランを取り出し、再度洗浄溶液２に浸し、
温度37℃で10分間振盪した。洗浄後のメンブランを取り
出し、濾紙上で余分な水分を拭った後、ラップ用フィル
ムで包み、温度-70℃で16時間オートラジオグラフィー
を行なった。

【００３６】(7)タンナーゼ遺伝子の塩基配列の決定 オートラジオグラフィーの結果、強いシグナルが得られ
た形質転換体を、12.5mgのアンピシリンを含む250mlのT
Y培地〔1%(W/V)バクトトリプトン、0.5%(W/V)バクトイ
ーストエキストラクト、0.5%(W/V) NaCl、pH7.2〕に接
種した後、温度37℃で20時間振盪培養を行ない培養液を
得た。次いで、この培養液を、5,000r.p.m.で10分間、
常法により遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを5ml
のSTET緩衝液〔10mM Tris・HCl、50mM EDTA、8%(W/V)Suc
rose、0.5%(W/V)TritonX-100、pH8.0〕に懸濁した後、
更に、これにリゾチーム25mgを添加し、室温で5分間溶
菌して溶菌液を得た。

【００３７】この溶菌液に、1%(W/V)SDSを含む0.2N NaO
H溶液10mlを添加し、温度0℃で10分間放置してＤＮＡを
変性させた。更に、これに、5M酢酸カリウム-酢酸緩衝
液(pH4.8) 7.5mlを加え、温度0℃で20分間放置してプラ
スミドＤＮＡのみを再生させ、9,000r.p.m.で20分間、
常法により遠心分離処理して抽出液を得、常法によりク
ロロホルム抽出処理した後、常法によりエタノール沈殿
処理し、沈殿物を得た。

【００３８】次いで、この沈殿物を通常の減圧乾燥処理
したものを6mlのTE緩衝液に溶解し、これに塩化セシウ
ム6gおよび10mg/mlエチジウム・ブロマイド0.3mlを添加
したものを、50,000r.p.m.で20時間、常法により超遠心
分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理を行ない、組み換
え体プラスミドを単離し、更に、n-ブタノールを使用し
てエチジウム・ブロマイドを抽出除去した後、TE緩衝液
に対して透析を行ない、純化された組み換え体プラスミ
ドpT1 100μgを得た。

【００３９】この様にして得られた、プラスミドpT1上
のプラスミドpUC19の配列を除いた約3.5kbpのタンナー
ゼ遺伝子をコードしていると考えられるＤＮＡ断片内の
種々の制限酵素切断部位を利用し、得られたＤＮＡ断片
の塩基配列の解析を行なった。図１にその制限酵素地図
を示す。また、得られたＤＮＡ断片より、種々の制限酵
素にて切り出した各種ＤＮＡ断片を、プラスミドpUC118
またはpUC119のマルチクローニングサイトにサブクロー
ニングし、得られた組み換え体プラスミドＤＮＡを用い
て大腸菌JM109(TaKaRa社製)を形質転換し、各々の形質
転換株を得た。

【００４０】この様にして得られた各形質転換株に、ヘ
ルパーファージM13K07(TaKaRa社製)を感染させ、メッシ
ング(Messing)の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジ
ー(Methods in Enzymology）、第101巻、第20〜78頁 (1
983年)〕に従い一本鎖ＤＮＡを調製した。得られた一本
鎖ＤＮＡによるシーケエンシングは、Taq Dye Primer C
ycle Sequencing Kit(アプライド・バイオシステムズ社
製)を用い、上記メッシングの方法に従って行なった。
更に、塩基配列の解析の為のゲル電気泳動は、50%(W/V)
の尿素を含む、6%(W/V)ポリアクリルアミドゲル(Nation
al Diagnostics社製)を用い、ＤＮＡシーケンサー370A
(アプライド・バイオシステムズ社製)にて行なった。

【００４１】得られた塩基配列の解析の結果、取得した
ＤＮＡ断片上には、上記項目(3)で決定した、Ｎ末端ア
ミノ酸配列及び部分アミノ酸配列より予想される塩基配
列を含む、タンナーゼをコードすると考えられる１つの
オープンリーディングフレーム、プロモーター及びター
ミネーターと考えられる領域が存在した。プロモーター
領域に相当する塩基配列を後記配列表の配列番号１に示
す。

【００４２】次いで、タンナーゼ誘導条件下で培養した
アスペルギルス・オリゼーTH株(IAM2636)より単離したm
RNAを用いてRT-PCR法を行ない、得られたＤＮＡ断片の
塩基配列と、染色体ＤＮＡより単離したタンナーゼ遺伝
子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を比較し、タンナーゼ遺
伝子中のイントロンの配列及びタンナーゼ遺伝子にコー
ドされているタンナーゼのアミノ酸配列を決定した。先
ず、アスペルギルス・オリゼーTH株(IAM2636)の胞子(1.
2×10⁵)を、生育用培地〔2%(W/V)デキストリン、1%(W/
V)ポリペプトン、0.5%(W/V)KH₂PO₄、0.1%(W/V)NaNO₃、
0.05%(W/V)MgSO₄、pH5.7〕200mlに接種し、120r.p.m.、
温度30℃で40時間振盪培養を行ない培養物を得、常法に
よりこの培養物を濾過して菌体10gを得た。

【００４３】得られた菌体を、タンニン酸液体培地 [2.5
%(W/V) タンニン酸、5.3%(W/V) glucose、1.2%(W/V)(NH
₄)₂HPO₄、0.2%(W/V)KH₂PO₄、0.1%(W/V)MgSO₄、pH6.8]に
植菌し、温度30℃で5 時間盪培養を行ない培養物を得
た。常法により得られた培養物を濾過して菌体10gを得
た。得られた菌体を、20mlのグアニジンイソチオシアネ
ート溶液〔6Mグアニジンイソチオシアネート、37.5mMク
エン酸ナトリウム(pH7.0)、0.75%(W/V)Ｎ-ラウロイルザ
ルコシンナトリウム、0.15Mβ-メルカプトエタノール〕
に添加したものを、カップ型ブレンダー（日本精機製作
所社製）に入れ、更に、10gのガラスビ

【００４４】得られた菌体を、20mlのグアニジンイソチ
オシアネート溶液〔6Mグアニジンイソチオシアネート、
37.5mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、0.75%(W/V)Ｎ-ラウ
ロイルザルコシンナトリウム、0.15Mβ-メルカプトエタ
ノール〕に添加したものを、カップ型ブレンダー（日本
精機製作所社製）に入れ、更に、10gのガラスビーズ
（直径0.5mm）を添加し、10,000r.p.m.で5分間処理した
後、また更に、10mlの水飽和フェノールを添加し、10,000
r.p.m.で10分間処理して菌体を破砕処理し、破砕物を得
た。この様にして得られた破砕物を冷却遠心機（日立工
機社製）を用いて5,000r.p.m.で10分間遠心処理して、
菌体破砕液20mlを得た。

【００４５】次いで、超遠心分離機用チューブ4本に、
予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を入れ、その上
に、上記菌体破砕液を重層するように夫々分注し、超遠
心分離機（日立工機社製）を用いて温度15℃、30,000r.
p.m.で16時間遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿
物を、冷70%(W/V)エタノールを用いて洗浄したものを、
10mMトリス緩衝液〔10mM Tris・HCl(pH7.4)、5mM EDTA、
1%SDS〕4mlに懸濁したものに、同量のn-ブタノール及び
クロロホルムを4対1（容量比）となる如く混合したもの
を添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.で10分間遠
心分離した。下層の水層を取り、1/10量の3M酢酸ナトリ
ウム(pH5.2)及び2倍量の冷エタノールを添加したものを
−20℃で2時間放置した後、常法により8,000r.p.m.で20
分間遠心分離し、RNAを沈殿させ、得られたRNAを4mlの
水に溶解し上記エタノール沈殿操作を再度行なった後、
得られたRNAを1mlの水に溶解し、12mgのRNAを得た。

【００４６】この様にして得られたRNAから、Oligotex
^TM-dT30<Super>（TaKaRa社製）を用いてmRNAの精製を行
ない、更には、得られたmRNA、RNA PCR Kit（TaKaRa社
製）及びLA PCR Kit（TaKaRa社製）を用いてタンナーゼ
遺伝子を含む2060bpのDNA断片を得た。RT反応の反応条
件は、42℃45分、99℃5分、5℃5分、１サイクルで行な
った。また、RT反応には下記のOligo(dT)₂₀-M4Adaptor
primerを用いた。PCR反応の反応条件は、94℃0.5分、60
℃1分、72℃3.5分、30サイクルで行なった。また、PCR反
応にはセンスプライマーとしてタンナーゼ遺伝子の翻訳
開始点上流23bpにある下記の配列をもつプライマーを、
アンチセンスプライマーとしてはOligo(dT)₂₀-M4Adapto
r primerを用いた。

【００４７】 sense primer: 5'CTG CCA TTC TTT TGG TTC GA 3' Oligo(dT)₂₀-M4Adaptor primer: 5'GTT TTC CCA GTC ACG ACT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T 3'

【００４８】この様にして得られたＤＮＡ断片を含む溶
液に、0.1μgのプラスミドpUC19を制限酵素SmaIで処理
後脱リン酸化したものを加え、DNAライゲーションキッ
ト(TaKaRa社製)を用いて連結させ、組み換え体プラスミ
ドを得た。次いで、ディー・エム・モーリソン(D.M.Mor
rison)の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Metho
ds in Enzymology)、第68巻、第326〜331頁、(1979)〕
で、塩化カルシウム処理した大腸菌JM109(TaKaRa社製)
を、上記の方法で得た組み換え体プラスミドを用いて形
質転換した。更に、得られた形質転換体を用いて、上述
と同様の方法で、RT-PCR法で得られた2060bpのＤＮＡ断
片の塩基配列を決定した。その結果、タンナーゼ遺伝子
は、イントロンを有さず、また、配列番号４に示される
アミノ酸配列を有するタンナーゼをコードする遺伝子で
あり、さらに、タンナーゼ遺伝子は、配列番号５に示さ
れる塩基配列であった。

【００４９】［実施例２］（形質転換株の取得及びタン
ナーゼの発現） (1)形質転換に用いる宿主の取得 形質転換の宿主として用いる為、アスペルギルス・オリ
ゼーTL株〔アスペルギルス・オリゼーTH株(IAM2636)よ
り自然変異により誘導された菌株〕のNiaD-(nitrate re
ductase 欠損株)変異株の取得を行なった。

【００５０】アスペルギルス・オリゼーTL株を、マルツ
培地プレート〔8%(W/V)マルツエキストラクト、2%(W/V)
agar、pH6.5〕に植菌し、温度30℃で4日間培養した。胞
子の着生を確認後、5mlの滅菌した0.01%ソルゲン溶液を
シャーレに加え、胞子を掻き取り、3G-2フィルター(PYR
EX社製)で濾過を行ない、胞子懸濁液を得た。この胞子
懸濁液100μlを、470mM KClO₃、10mMグルタミン酸ナト
リウム、2%(W/V)agarを含む、最小培地〔1%(W/V)glucos
e、0.05%(W/V)KCl、0.05%(W/V)MgSO₄・7H₂O、0.15%(W/V)
KH₂PO₄、0.000004%(W/V)Na₂B₄O₇・10H₂O、0.00004%(W/V)
CuSO₄・5H₂O、0.00008%(W/V)FePO₄・2H₂O、0.00008%(W/V)
MnSO₄・2H₂O、0.00008%(W/V)Na₂MoO₄・2H ₂O、0.0008%(W/
V)ZnSO₄・7H₂O〕に植菌後、温度30℃で4日間培養した。
次いで、得られた変異株を、2%(W/V)agarと、10mM NaNO
₃、10mM NaNO₂、10mMグルタミン酸、10mM NH₄Cl、10mM
ヒポキサンチンを夫々含む最小培地5種類に植菌し、硝
酸ナトリウムを含む培地でのみ生育できない変異株を選
択し、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)
TL-1株と命名した。本変異株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にFERM BP-4720として寄託されている。

【００５１】(2)タンナーゼの発現 アスペルギルス・オリゼーTL-1株の胞子(1.2×10⁵個)
を、200mlの生育用培地に植菌し、120r.p.m.、温度30℃
で40時間振盪培養を行ない培養物を得た。常法によりこ
の培養物を濾過して菌体10gを得た。この菌体を50mlの
プロトプラスト調製用緩衝液に懸濁後再度常法により濾
過を行なった。次いで、得られた菌体を0.1gのNovozyme
234(Novo Nordisk社製)を含む20mlのプロトプラスト調
製用緩衝液に懸濁し、75r.p.m.、温度30℃で2時間振盪
した。更にこの菌体溶液を、滅菌したキムワイプ(十条
キンバリー社製)にて濾過しプロトプラスト溶液を得
た。

【００５２】次いで得られたプロトプラスト溶液に、４
倍量の形質転換溶液１(1.2M ソルビトール、50mM CaC
l₂、10mM Tris・HCl pH7.5)を加え、2,000r.p.m.、室温
で5分間、常法により遠心分離処理した。得られた沈殿
物を20mlの形質転換溶液１に懸濁後、2,000r.p.m.、室
温で5分間、常法により遠心分離処理した後、沈殿物を1
00μlの形質転換溶液１に懸濁した。得られたプロトプ
ラスト溶液に、プラスミドpT1 10μgおよび、nitrate r
eductaseをコードするNiaD遺伝子を含むプラスミドpMD4
10μgを含むＤＮＡ溶液10μlを加え撹拌後、12.5μlの
形質転換溶液２〔50%(W/V)PEG4000、50mM CaCl₂、10mM
Tris・HCl pH7.5〕を加え氷上で、20分間放置した。次い
で、プロトプラスト-ＤＮＡ混合液に1mlの形質転換溶液
２を加え軽く混合した後、2mlの形質転換溶液１を加え
再度軽く混合し、予め55℃に温めておいた、0.5% aga
r、1.2Mソルビトール、10mM NaNO₃を含む100mlの最小培
地に添加し、充分混合した後、2% agar、1.2Mソルビト
ール、10mM NaNO₃を含む最小培地プレートに5mlずつ重
層し、温度30℃で5日間培養した。

【００５３】この様にして得られた形質転換体の胞子
を、タンニン酸培地プレート〔0.2%(W/V)(NH₄)₂HPO₄、
0.2%(W/V)KH₂PO₄、0.1%(W/V)MgSO₄・7H₂O、1%(W/V)gluco
se、1%(W/V)タンニン酸、2%(W/V)agar、pH7.5〕及びマ
ルツ培地プレートに点植し、温度30℃で40時間培養し
た。タンニン酸培地プレートに点植した各形質転換体の
中で、生じたハローの大きなものについてのみ点植した
マルツ培地プレートをさらに温度30℃で80時間培養し
た。この様にして得られた各形質転換体の胞子をつまよ
うじを用いて掻き取り、滅菌した0.01%ソルゲン溶液に
懸濁後、１プレートあたり5-10コロニー生じるように稀
釈し、マルツ培地プレートに植菌した。さらに、シング
ルコロニーアイソレーションの結果得られた各形質転換
体について、同様の操作を5回繰り返しタンニン酸培地
で大きなハローを作る形質転換体アスペルギルス・オリ
ゼーTL+8(pT1)を選択した。なお、得られたアスペルギ
ルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)TL+8(pT1)は、工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4719として
寄託されている。

【００５４】(3)形質転換体の解析 プラスミドpT1 2μgを含むＤＮＡ溶液10μlを制限酵素H
indIII で処理後、アガロースゲル電気泳動にかけ、エ
チジウム・ブロマイドで染色後、オープンリーディング
フレーム上にある約1kbpの断片を切りだし、Prep A Gen
e DNA Purification Matrix Kit(Bio Rad社製)を用いて
精製した。更に、この精製したDNA断片を、DIG DNA Lab
eling Kit(Boehringer Mannheim社製)を用いて標識し
た。

【００５５】次いで、得られた形質転換体アスペルギル
ス・オリゼーTL+8(pT1)及び親株アスペルギルス・オリ
ゼーTL-1より実施例１(2)と同様の方法で染色体ＤＮＡ
を調製し、各染色体ＤＮＡ4μgを含むＤＮＡ溶液10μl
を制限酵素BamHIで処理後、アガロースゲル電気泳動に
かけた。0.4M NaOHを入れたトレイにガラスシャーレを
置き、その上にガラス板を乗せ、更にガラス板を覆うよ
うに濾紙を置いた上にゲルを置き、ゲル以外の部分をラ
ップ用フィルムで覆った。次いで、ゲル上に、ゲルと同
じ大きさの、ナイロンフィルターメンブラン(アマシャ
ム社製)を乗せ、更にその上にゲルと同じ大きさの３枚
の濾紙、ペーパータオル、ガラス板及び0.5kgの荷重を
乗せ、2時間ブロッティングを行なった。ブロッティン
グ終了後メンブランを5×SSC緩衝液で洗浄した後、ハイ
ブリダイゼーション溶液に浸し振盪させながら、42℃で
1時間プレハイブリダイゼーションを行なった。次い
で、メンブランを、熱変性した100ngの標識したDNAを含
む10mlのハイブリダイゼーション溶液に浸し、42℃で16
時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイ
ゼーションを行なったメンブランを、洗浄溶液３〔0.3M
NaCl、30mMクエン酸ナトリウム、0.1%(W/V)SDS〕に浸
し、室温で5分間振盪した。メンブランを取り出し、再
度洗浄溶液３に浸し、室温で5分間振盪した。更にメン
ブランを、洗浄溶液４〔15mM NaCl、1.5mM クエン酸ナ
トリウム、0.1%(W/V)SDS〕に浸し、温度68℃で15分間振
盪した。メンブランを取り出し再度洗浄溶液４に浸し、
温度68℃で15分間振盪した。この様にして得られたメン
ブランを用い、DIG Luminescent Detection Kit(Boehri
nger Mannheim社製)によりシグナルの検出を行ない、ア
スペルギルス・オリゼーTL+8(pT1)株の染色体上にプラ
スミドpT1由来のＤＮＡ配列が挿入されていることが確
認された。

【００５６】(4)形質転換体のタンナーゼ活性の測定 形質転換体アスペルギルス・オリゼーTL+8(pT1)株及び
その親株アスペルギルス・オリゼーTL-1の胞子(1.2×10
⁵個)を、生育用培地200mlに植菌し、120r.p.m.、温度30
℃で40時間振盪培養を行ない培養物を得た。常法により
この培養物を濾過して得られた菌体2gを40mlのタンニン
酸液体培地〔2.5%(W/V)タンニン酸、5.3%(W/V)glucos
e、1.2%(W/V)(NH₄)₂HPO₄、0.2%(W/V)KH₂PO₄、0.1%(W/V)
MgSO₄、pH6.8〕に夫々植菌し、温度30℃で16時間振盪培
養を行ない培養物を得た。常法により得られた培養物を
濾過し、濾液を酵素として用いた。

【００５７】得られた酵素液をクエン酸緩衝液(0.05Mク
エン酸、pH6.0)で10倍（アスペルギルス・オリゼーTL-1
株）及び20倍〔アスペルギルス・オリゼーTL+8(pT1)
株〕に希釈した。次いで、希釈酵素液0.25mlと予め30℃
に加温した反応液〔0.35%(W/V)タンニン酸、0.05Mクエ
ン酸、pH6.0〕1mlを混合し、温度30℃で15分間加温した
後、5mlの90%エタノールを加え反応を停止させた。反応
停止液0.25mlに更に5mlの90%エタノールを加え反応停止
液の希釈を行なった後、310nmの吸光度を測定した。酵
素液の代りにクエン酸緩衝液を用いたものを基質ブラン
クとして用い同様に310nmの吸光度を測定し、次式によ
り各酵素液の活性値を算出した。結果を表１に示す。

【００５８】

【式１】酵素活性（u/ml)＝△310nm × 7.6 × 各酵
素液の希釈倍率 △310nm＝基質ブランクの吸光度−酵素反応液の吸光度

【００５９】

【表１】

【００６０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ： 967 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAAGTCTAGT CAGGGGGAGC CGGGTATATA CTCTTCCGTA ACTCTGAGTA TAATGTTTGG 60 TACTCGTCAA TTGTCCCTAT CGTTCGTTGT TCAAATGTTG AACGACCTTC GTTAACAGTC 120 CATAATCGGT TGCCCTGTTC TGTAAACGTA TTTGGGAGCC GCTCAGCATT TTCCGCCTTG 180 GTATAGGTCT TCTTGTTGTA GGTATACAAT GCTACGATGT TGAGGCTGAT GGTACCTGAT 240 GCTCGGAGAT AAAAAATTAA ACACAACACG TTAGGTAACG TTTGATGCAA TTTGCCCCTG 300 ATCAACGATT GGAACTGGAG GTGATTGGAG ACCAAATTCT TCAGCATCTT ATCTTTGATT 360 GTTAACTCCG AGGGCTCGGG AATAGTTACC CGTTTCCTCT TAGCGGATGC AATAGAGCAA 420 GAAAACGTGC CAAAATACTC AAGAAAGACC GCGTCAGACA AGATGAGTGC CAAGAGAGAG 480 CCAAATCTCG GTCATTGTAT CTCCCTTGAA TGTTGCTGAC ATGGTGGCTC GATCATGGAT 540 AGCTTTGCAC GCGCAAGGGT CAGGGCTGCA TGGAGAGATC AGATAAGGCC GGATCTCAGC 600 CGAACCGGAA CATCAGATAA CAAAAATTCA TCGTCGGACG ACCGGAGACT ACTACTACTA 660 CTAGTATCAA CTCCGCGGGT CGAGCCTCGA GGAAGACCTT TTGACTTGGC ATCTTGCCAC 720 GCAACCCGGT GACGACAGCC TGAGTAGAAT TAAGGATGGC AAAGCGTTGA TCTGCCGTTT 780 GGTCCACAAG CTTGTTACGA ATCCCGAACC TTATGATGCC GAAGACGGTG GTCTCTCAGC 840 CCTAGCCTTG CAATAAATAG GACGATAGTT TCCCTATGGC TCCTCCTAGA TACGACCTCA 900 TCATTCGTTT ATTCCTTTCG TATCCTTTGA ACACTCCTTG ACCTCTGCCA TTCTTTTGGT 960 TCGAAAG

【００６１】配列番号：２ 配列の長さ： 16 配列の型：アミノ酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Ser Ile Pro Ala Ala Ser Ser Val His Tyr Trp Gln Ala Val Arg 5 10 15

【００６２】配列番号：３ 配列の長さ： 16 配列の型：アミノ酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ser Phe Thr Asp Val Cys Thr Val Ser Asn Val Lys Ala Ala Leu 5 10 15

【００６３】配列番号：４ 配列の長さ：588 配列の型：アミノ酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Arg Gln His Ser Arg Met Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Ala 5 10 15 Asn Ala Ala Ser Phe Thr Asp Val Cys Thr Val Ser Asn Val Lys Ala 20 25 30 Ala Leu Pro Ala Asn Gly Thr Leu Leu Gly Ile Ser Met Leu Pro Ser 35 40 45 Ala Val Thr Ala Asn Pro Leu Tyr Asn Gln Ser Ala Gly Met Gly Ser 50 55 60 Thr Thr Thr Tyr Asp Tyr Cys Asn Val Thr Val Ala Tyr Thr His Thr 65 70 75 80 Gly Lys Gly Asp Lys Val Val Ile Lys Tyr Ala Phe Pro Lys Pro Ser 85 90 95 Asp Tyr Glu Asn Arg Phe Tyr Val Ala Gly Gly Gly Gly Phe Ser Leu 100 105 110 Ser Ser Asp Ala Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Gly Ala Val Gly Gly Ala 115 120 125 Thr Asp Ala Gly Tyr Asp Ala Phe Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Val Val 130 135 140 Leu Tyr Gly Asn Gly Thr Ile Asn Trp Asp Ala Thr Tyr Met Phe Ala 145 150 155 160 Tyr Gln Ala Leu Gly Glu Met Thr Arg Ile Gly Lys Tyr Ile Thr Lys 165 170 175 Gly Phe Tyr Gly Gln Ser Ser Asp Ser Lys Val Tyr Thr Tyr Tyr Glu 180 185 190 Gly Cys Ser Asp Gly Gly Arg Glu Gly Met Ser Gln Val Gln Arg Trp 195 200 205 Gly Glu Glu Tyr Asp Gly Ala Ile Thr Gly Ala Pro Ala Phe Arg Phe 210 215 220 Ala Gln Gln Gln Val His His Val Phe Ser Ser Glu Val Glu Gln Thr 225 230 235 240 Leu Asp Tyr Tyr Pro Pro Pro Cys Glu Leu Lys Lys Ile Val Asn Ala 245 250 255 Thr Ile Ala Ala Cys Asp Pro Leu Asp Gly Arg Thr Asp Gly Val Val 260 265 270 Ser Arg Thr Asp Leu-Cys Lys Leu Asn Phe Asn Leu Thr Ser Ile Ile 275 280 285 Gly Glu Pro Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Ser Thr Ser Leu Gly Phe 290 295 300 Gly Phe Ser Asn Gly Lys Arg Ser Asn Val Lys Arg Gln Ala Glu Gly 305 310 315 320 Ser Thr Thr Ser Tyr Gln Pro Ala Gln Asn Gly Thr val Thr Ala Arg 325 330 335 Gly Val Ala Val Ala Gln Ala Ile Tyr Asp Gly Leu His Asn Ser Lys 340 345 350 Gly Glu Arg Ala Tyr Leu Ser Trp Gln Ile Ala Ser Glu Leu Ser Asp 355 360 365 Ala Glu Thr Glu Tyr Asn Ser Asp Thr Gly Lys Trp Glu Leu Asn Ile 370 375 380 Pro Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Val Thr Lys Phe Ile Gln Leu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Asp Asn Leu Ser Asp Leu Asn Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Val 405 410 415 Asp Trp Met Asn Thr Gly Met Val Arg Tyr Met Asp Ser Leu Gln Thr 420 425 430 Thr Leu Pro Asp Leu Thr Pro Phe Gln Ser Ser Gly Gly Lys Leu Leu 435 440 445 His Tyr His Gly Glu Ser Asp Pro Ser Ile Pro Ala Ala Ser Ser Val 450 455 460 His Tyr Trp Gln Ala Val Arg Ser Val Met Tyr Gly Asp Lys Thr Glu 465 470 475 480 Glu Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Asp Trp Tyr Gln Phe Tyr Leu Ile 485 490 495 Pro Gly Ala Ala His Cys Gly Thr Asn Ser Leu Gln Pro Gly Pro Tyr 500 505 510 Pro Glu Asn Asn Met Glu Ile Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly Asn 515 520 525 Lys Pro Ser Arg Leu Asn Ala Thr Val Ser Ser Gly Thr Tyr Ala Gly 530 535 540 Glu Thr Gln Met Leu Cys Gln Trp Pro Lys Arg Pro Leu Trp Arg Gly 545 550 555 560 Asn Ser Ser Phe Asp Cys Val Asn Asp Glu Lys Ser Ile Asp Ser Trp 565 570 575 Thr Tyr Glu Phe Pro Ala Phe Lys Val Pro Val Tyr 580 585

【００６４】配列番号：５ 配列の長さ：1767 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryza
e) 株名：ＩＡＭ２６３６ 配列 ATGCGCCAAC ACTCGCGCAT GGCCGTTGCT GCTTTGGCAG CAGGAGCGAA CGCAGCTTCT 60 TTTACCGATG TGTGCACCGT GTCTAACGTG AAGGCTGCAT TGCCTGCCAA CGGAACTCTG 120 CTCGGAATCA GCATGCTTCC GTCCGCCGTC ACGGCCAACC CTCTCTACAA CCAGTCGGCT 180 GGCATGGGTA GCACCACTAC CTATGACTAC TGCAATGTGA CTGTCGCCTA CACGCATACC 240 GGCAAGGGTG ATAAAGTGGT CATCAAGTAC GCATTCCCCA AGCCCTCCGA CTACGAGAAC 300 CGTTTCTACG TTGCTGGTGG TGGTGGCTTT TCCCTCTCTA GCGATGCTAC CGGAGGTCTC 360 GCCTATGGCG CTGTGGGAGG TGCCACCGAT GCTGGATACG ACGCATTCGA TAACAGCTAC 420 GACGAGGTAG TCCTCTACGG AAACGGAACC ATTAACTGGG ACGCCACATA CATGTTCGCA 480 TACCAGGCAC TGGGAGAGAT GACCCGGATC GGAAAGTACA TCACCAAGGG CTTTTATGGC 540 CAGTCCAGCG ACAGCAAGGT CTACACCTAC TACGAGGGTT GCTCCGATGG AGGACGTGAG 600 GGTATGAGTC AAGTCCAGCG CTGGGGTGAG GAGTATGACG GTGCGATTAC TGGTGCCCCG 660 GCTTTCCGTT TCGCTCAGCA ACAGGTTCAC CATGTGTTCT CGTCCGAAGT GGAGCAAACT 720 CTGGACTACT ACCCGCCTCC ATGTGAGTTG AAGAAGATCG TGAACGCCAC CATTGCTGCT 780 TGCGACCCGC TTGATGGAAG AACCGACGGT GTTGTGTCCC GGACGGATCT TTGCAAGCTT 840 AACTTCAATT TGACCTCTAT CATCGGTGAG CCTTACTACT GTGCTGCGGG AACTAGCACT 900 TCGCTTGGTT TCGGCTTCAG CAATGGCAAG CGCAGCAATG TCAAGCGTCA GGCCGAGGGC 960 AGCACCACCA GCTACCAGCC CGCCCAGAAC GGCACGGTCA CCGCACGTGG TGTAGCTGTC 1020 GCCCAGGCCA TCTACGATGG TCTCCACAAC AGCAAGGGCG AGCGCGCGTA CCTCTCCTGG 1080 CAGATTGCCT CTGAGCTGAG CGATGCTGAG ACCGAGTACA ACTCTGACAC TGGCAAGTGG 1140 GAGCTCAACA TCCCGTCGAC CGGTGGTGAG TACGTCACCA AGTTCATTCA GCTCCTGAAC 1200 CTCGACAACC TTTCGGATCT GAACAACGTG ACCTACGACA CCCTGGTCGA CTGGATGAAC 1260 ACTGGTATGG TGCGCTACAT GGACAGCCTT CAGACCACCC TTCCCGATCT GACTCCCTTC 1320 CAATCGTCCG GCGGAAAGCT GCTGCACTAC CACGGTGAAT CTGACCCCAG TATCCCCGCT 1380 GCCTCCTCGG TCCACTACTG GCAGGCGGTT CGTTCCGTCA TGTACGGCGA CAAGACGGAA 1440 GAGGAGGCCC TGGAGGCTCT CGAGGACTGG TACCAGTTCT ACCTAATCCC CGGTGCCGCC 1500 CACTGCGGAA CCAACTCTCT CCAGCCCGGA CCTTACCCTG AGAACAACAT GGAGATTATG 1560 ATCGACTGGG TCGAGAACGG CAACAAGCCG TCCCGTCTCA ATGCCACTGT TTCTTCGGGT 1620 ACCTACGCCG GCGAGACCCA GATGCTTTGC CAGTGGCCCA AGCGTCCTCT CTGGCGCGGC 1680 AACTCCAGCT TCGACTGTGT CAACGACGAG AAGTCGATTG ACAGCTGGAC CTACGAGTTC 1740 CCAGCCTTCA AGGTCCCTGT ATACTAG 1767

【図面の簡単な説明】

【図１】タンナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 水澤 清 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アスペルギルス属に属する微生物に由来
   し、塩基長が3,563bpであって下記の制限酵素地図を有
   することを特徴とする、タンナーゼをコードする遺伝子
   を含有するＤＮＡ断片。 【化１】
2. 【請求項２】 アスペルギルス属に属する微生物が、ア
   スペルギルス・オリゼーＩＡＭ２６３６である、請求項
   １記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 実質的に配列番号４で表されるアミノ酸
   配列をコードするタンナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断
   片。
4. 【請求項４】 請求項１、２又は３記載のタンナーゼ遺
   伝子を含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入
   したことを特徴とする新規な組み換え体プラスミド。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組み換え体プラスミドを
   含み、タンナーゼ生産能を有するアスペルギルス属に属
   する微生物を培地に培養し、培養物からタンナーゼを採
   取することを特徴とするタンナーゼの製造方法。
6. 【請求項６】 配列番号１に記載の塩基配列で表される
   プロモーター。