JP2729628B2 - 巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼの調製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルコース・デヒドロゲナーゼの遺伝子工
学的製造方法に関する。この方法は宿主を予め適切な組
換えDNAで形質転換した後培養された微生物宿主生物か
ら酵素グルコース・デヒドロゲナーゼを単離することに
より成る。その組換えDNAは巨大菌（Bacillus megateri
um）ゲノムを起源としまたグルコース・デヒドロゲナー
ゼの生物活性を有するポリペプチドをコードする配列を
含んでいる。

本発明は、更に、酵素グルコース・デヒドロゲナーゼ
の生物活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列
の提供に関する。

更に本発明は、酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの
生物活性を有するポリペプチドを製造するのに用いるた
めのクローニング・発現ベクター、およびかかるベクタ
ーで形質転換された宿主生物、例えば細菌、酵母、他の
真菌、動物またはヒト細胞など、に関する。

最後に、本発明は、発現により産生された相当するポ
リペプチドをグルコース測定に用いることに関する、
「酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの生物活性を有す
るポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列が巨大菌株か
らの天然グルコース・デヒドロゲナーゼに相当し、この
配列に類似し、あるいは酵母活性断片を含むポリペプチ
ドまたはタンパクを意味する。同様のことが、天然配列
がほんの一断片しか現出しない本発明のポリペプチドに
もいえる。

NAD/NADP−依存性グルコース・デヒドロゲナーゼ（E.
C.1.1.1.47）（以下グルコースDHと称する）はβ−グル
コースからグルコノラクトンへの転化を触媒するが、そ
の間にコフアクターNADがNADH₂に還元される。この酵素
はβ−Ｄ−グルコースに対する高い基質特異性を特徴と
している。エピマー糖類は転化されない。この酵素は医
学的診断技術に主に用いられている。

NAD依存性グルコースDHはある範囲のバチルス属菌種
に存在する。この酵素の産生は発生生理学的な制御を受
ける、すなわち、それは短い胞子形成期の間だけ合成さ
れる。更に、グルコースDHは、大抵の場合、前記グルコ
ースDH法によるグルコース測定をひどく妨害するNADH₂
オキシダーゼを伴い、そして更に、その除去は極めて困
難である。以上の結果、慣用の古典的方法および野生バ
ルチス属株を用いて得られた酵素の収率は極めて僅少で
ある（0.01〜最大0.1単位/ml（培養液））。既知の菌株
改良法を用いることにより、胞子形成期にかかわらずグ
ルコースDH産生をなお検出できる（平均酵素活性１〜10
単位/ml（培養液））菌株を選抜することはできるが、
かかる「非共役的（decoupled）」菌株は容易に復帰す
る、すなわちもとの胞子形成挙動に戻つてしまい、その
ため胞子形成とグルコースDH産生とをそれぞれ別個に維
持するための連続的、かつしばしば長時にわたる、努力
が払わねばならない。最近に至って、枯草菌（Bacillus
subtilis）からそのポロモーターを含むグルコースDH
をコードする遺伝子を単離しそれを大腸菌（E.coli）内
で胞子形成から独立的に発現させることに成功している
（Vasanthaet al.,1983、Proc.Natl.Acad.Science,USA,
vol.80,785−789）が、驚くべきことに、この酵素は商
業的に入手し得るグルコースDHとは対照的に、比較的不
安定であることがわかつた（Ramaley,Vasantha 1983、
J.Biol.Chem.,vol.258,20,12558−12565）。しかしなが
ら、迅速かつ再現性あるグルコース測定アツセイの実施
を可能にするには高い酵素安定性が特に必要である。

そこで、本発明の目的は大量かつ改良された品質の安
定なグルコース・デヒドロゲナーゼの工業的生産を可能
にする遺伝子工学的方法を提供することにある。この目
的は以下記載の如く達成される。

驚くべきことに、フアージ・ベクター、好ましくはλ
−EMEL−３、で巨大菌のジーンバンクを作り、構造遺伝
子を有するDNA領域の大きさを順次縮小し、そしてその
都度宿主生物を形質転換することにより、少くとも二つ
の異なる構造遺伝子が別個に得られ、そしてそれらは最
終的に量的および質的にも向上した少くとも二つの異な
るグルコースDHイソ酵素を発現することが見出された。

グルコースDHをコードしそして2100塩基対（bp）の大
きさの一方の同定されたDNA領域は、商業的に入手し得
るグルコースDHの既知配列（Jany et al.,1984,FEBS Le
tt.165;6−10）にDNA配列およびアミノ酸配列上全面的
に対応するのに対し、1100bpの大きさの他方のDNA断片
は第１図に示された新規配列を有する。そこから導か
れ、かつ精製酵素のタンパク配列決定により確認された
新規アミノ酸配列を第２図に示す。既知配列との相違度
はほぼ20％に達する。最初の45アミノ酸の相違を第７図
に示す。これらの各種DNA断片をこの目的に適したプラ
スミド・ベクター（例えばpJH111およびpJH211）中に組
み入れ、そして適当な宿主生物、好ましくは大腸菌菌
体、を形質転換すれば、バチルス属に固有であつてかつ
大腸菌内において有効なプロモーターを用いるだけで得
られるグルコースDH酵素活性はいずれの場合も0.05〜0.
5単位/ml（培養液）、好ましくは0.09〜0.2単位/ml（培
養液）、となる。これは既に、バチルス属野生株に対す
る古典的方法により得られる数値を少くとも５倍は超え
ている。特定の構造遺伝子の上流に既知の調節可能なλ
P_Lプロモーターを組み入れると酵素活性測定値は驚くほ
どに高くなる：第２図に示された新規ポリペプチドを大
腸菌N100/pRK248/pJH115と共に用いるときは30〜65単位
/ml（培養液）、好ましくは40〜50単位/ml（培養液）、
であり、また既知配列のポリペプチドを大腸菌N100/pRK
248/pJH215と共に用いるときは20〜40単位/ml（培養
液）である。これらの数値はバルチス属野生株を用いた
ときのグルコースDH収率よりも約500倍高く、またその
開発に手のかかる胞子形成−非共役バチルス属菌株を用
いた場合よりも約５〜10倍高い。例えば大腸菌N100/pRK
248/pJH115についての、典型的な増殖および発現曲線を
第８図に示す。

ところで、本発明の方法は、相当な活性増加のほかに
更なる長所をも有するものである。すなわち、大腸菌に
おけるすべての胞子形成問題が解消してしまうのであ
る。従つてこの新しい方法により調製された宿主株はよ
り一段と簡単にかつ経済的に用いることができる。更
に、本発明におけるグルコースDH産生大腸菌宿主菌体の
粗抽出液は色素形成を全く示さない（透明無色の液体で
ある）のに対し、定法により調製された粗抽出液は極め
て暗い緑乃至黒色を呈し、更なる精製を必要とする。更
にこの新しい遺伝子工学的方法により調製された粗抽出
液中の障害となるNADH₂オキシダーゼの含量は無視でき
る。外来タンパク含量で示した純度は第９図から明らか
である。組換えDNAを含む宿主菌体も驚くほど高いプラ
スミド安定性を示す。更にまた、関連の発現産生物は、
診断目的に対し保証されなければならない良好な酵素安
定性を示す。このことは既知の枯草菌／大腸菌系と比較
した場合明らかにもう一つの顕著な長所である。

このように本発明の方法は、従来技術に比し、重要な
長所を有している。

従って、本発明は、組換えDNAで形質転換された微生
物宿主生物を栄養培地中で培養しそしてその発現によつ
て産生された各種ポリペプチドを単離することによりグ
ルコースDHを製造する方法であつて、巨大菌のゲノムか
ら単離されそして酵素グルコースDHの生物活性を有する
一種以上のポリペプチドをコードするDNA領域を含む宿
主生物を用いることを特徴とする方法に関する。

同様に、本発明は、グルコース・デヒドロゲナーゼの
生物活性を有するポリペプチドをコードする第１図に示
されたDNA配列に関する。

本発明は、更に、グルコースDHポリペプチドをコード
する本発明によるDNA配列を含むプラスミドpJH111に関
する。

本発明は、更に、グルコースDH遺伝子の全コーテイン
グ領域がλP_Lプロモーターの調節下にあり、かつグルコ
ースDH遺伝子の全DNA配列を決定する組換え発現プラス
ミドに関する。λP_Lプロモーターに代えて、発現調節配
列として、大腸菌プロモーター系、例えば大腸菌lac
系、大腸菌ラクタマーゼ系、大腸菌trp系または大腸菌
リポタンパクプロモーター、酵母発現調節配列またはそ
の他の真核発現調節配列なども等しく本発明に用いるこ
とができる。ここで重要な点は、遺伝子と発現調節配列
を機能的に連結すること、そして特定の宿主生物に適し
た発現調節配列を選択することだけである。

本発明は、特に、グルコースDHパリペプチドをコード
し、そしてλP_Lプロモーターを含む本発明のDNA配列を
含む発現プラスミドpJH115に関する。

本発明は、更に、グルコースDHの生物活性を有し、そ
して第２図に示され前述の条件下に発現させることによ
り合成され得るアミノ酸配列を有するポリぺプチドに関
する。本発明は、更に、本発明によるDNAを含む宿主生
物、特にプラスミドpJH115で形質転換されている大腸菌
N100/pRK248/pJH115に関する。

最後に、本発明は、本発明のポリペプチドをグルコー
ス測定、特に血糖測定に用いることに関する。

本発明によれば、グルコースDHをコードしそして巨大
菌から単離されたDNA配列をプローブ分子としてグルコ
ースDH産生微生物のジーンバンクに用いることにより対
応する遺伝子を同定しそしてそれをジーンバンクから単
離することができる。この方法により、他の微生物、例
えば枯草菌、から酵素グルコースDHの生物活性を有する
ポリペプチドを任意の所望量だけ製造することもでき
る。

グルコースDHの提供に用いられる生物種は適切な遺伝
情報を有する菌種巨大菌およびその突然変異体または変
異体といつた微生物である。この生物種の株は知られて
おり、また権限ある寄託機関に寄託されている（例えば
DSM321、DSM322、DSM333またはDSM3377）。グルコースD
HをコードするDNAで形質転換され得る適切な宿主生物は
主に微生物であるが、植物、動物または人間の細胞も適
している。しかしながら、微生物例えば細菌、酵母およ
び他の真菌、特に大腸菌を用いることが好ましい。

本発明の方法は次のようにして行うのが好ましい。

まず第一に、巨大菌菌体（その培養については実施例
１参照）の染色体DNAを文献に知られた方法を用いて単
離し精製する（実施例４参照）。巨大菌から単離された
この目的に適していることが知られまた一般に商業的に
入手可能な慣用されている制限エンドヌクレアーゼを用
いて自体既知の方法で部分加水分解する。制限酵素Sau
3Aをこの目的に用いるのが好ましい。加水分解は主とし
て９〜22キロベース（kb）、好ましくは14kb以上の、長
さの断片が得られるように調節される。何故ならばこれ
らはフアージ・ベクターのDNA中に組み入れるのに特に
適しかつ有利だからである。その目的は、グルコースDH
の構造遺伝子をクローン代するために適当なフアージ・
ベクターを用いて適当なバルチス属菌株のジーンバンク
を作ることにある。既知のフアージ・ベクターであるλ
−EMBL3（Frischauff et al.,1983,J.Mol.Biol.170,827
−842）をこの目的に用いるのが好ましい。フアージDNA
は実施例３に詳記される如くに調製され、そして既知の
方法により、慣用の制限エンドヌクレアーゼ、好ましく
はBam H I、を用いて切断される。各場合に得られるDNA
断片の大きさをゲル電気泳動により測定する。

フアージDNAの切断部位に嵌合するバチルスゲノムのD
NA断片を今度は商業的に入手し得る連結酵素、好ましく
は、T₄DNAリガーゼ、を用いて自体既知の方法で組み込
む（実施例５参照）。このようにして得られた様々な組
換えフアージ分子をそれらを増殖させることのできる宿
主生物、好ましくは大腸菌、特に大腸菌NM 539（SupF h
ad R lac Y P₂CO×３）（ATCC 35 639）、に形質導入
し、そして既知の方法によりクローン化する（Arber et
al.1983,「Lambda II」、Cold Spring Harbor Monogra
phs,433−465）。大腸菌株の形質転換は一般に例えば塩
化カルシウム法によって行われ、また実施例６に詳述さ
れている。グルコースDH遺伝子は、導入部に記載された
グルコースDH検出反応に基づく特異的フイルター・アツ
セイを用いて、新たに形成されたフアージ・クローンの
溶解液（リゼイト）中の酵素活性を検出することにより
同定される。グルコースDH産生（陽性反応）を伴うNADH
₂の形成は、紙に適用されフアージにより溶解された
菌体（プラーク）から螢光信号が現れることにより検出
される（実施例９参照）。これらのアツセイ（それらは
適切な場合には反復されるべきであり、また以後の作業
工程において用いられる）に基づいて最終的に、再現性
ある陽性反応を示すフアージ・クローンを同定すること
ができる。この結果を確認するために、単離されたクロ
ーンの液体リゼイトを分光光度測定法（334、340または
365nm）により検査し、そして基質特異性を試験する。
これにより文献に知られたデータが得られる（Pauly et
al.,1975;Hoppe−Seyler's Z.Physiol.Chem.356;1613
−1623）。

組換えフアージDNA内のグルコースDH DNAを濃縮する
ために、後の手順においてサブクローニングを好ましく
はプラスミドで行う。このためには、組換えフアージDN
Aを今度は、常法により制限エンドヌクレアーゼ、好ま
しくはSau 3A、を用いて部分加水分解し、それによつて
約４〜9kbの大きさの断片を生成させる。原則として、
出発プラスミドとしては、前記の大きさのDNA断片を取
り込んでも不安定にならないあらゆるプラスミドを用い
ることができる。この目的に特に適しているのは、既知
のプラスミドpBR322（出典:Bolivar et al.,1977,Gene
2,95−113）であり、これを、好ましくは、制限エンド
ヌクレアーゼBam H Iを用いて部分消化する。前記フア
ージ断片を切断開環済みのプラスミド・ベクターに自体
既知の方法により連結する（実施例５参照）。その連結
生成物を用いて形質転換に適しそして認定された寄託機
関から入手し得る任意の所望の宿主生物、好ましくは大
腸菌、を常法により形質転換する（実施例６参照）。こ
のようにして得られたコロニーをグルコースDH酵素アツ
セイにかける（実施例９参照）。これにより陽性グルコ
ースDH反応を示すいくつかのクローンが得られる。基礎
適な（underlying）プラスミドの一つは10.2kbの大きさ
をもち、そしてpJH107と称される。制限分析を行うため
に、プラスミドを制限エンドヌクレアーゼEcoR I、Sal
I、Sph I、Hind IIIおよびCla Iにより自体既知の方法
で完全加水分解し、そしてDNA断片を自体既知の方法で
アガロースゲル電気泳動により分画する。グルコースDH
配列を含む断片の大きさは580bpであることが分る。第
３図は本発明によるプラスミドpJH107の制限地図を示
す。

組換えプラスミド上で遺伝子を更に局在下させるため
の手順は次のとおりであり、処理方法は以上において、
そしてまた実施例に記載されているか、または一般的な
従来技術に従う。

高確率で構造遺伝子を切断しない制限エンドヌクレア
ーゼでpJH107を消化する。Sph Iをこの目的に用いるの
が好ましい。

プラスミド・ベクターpBR 322中に組み入れ、そして
宿主生物、好ましくは大腸菌RR 1を形質転換してクロー
ン化する。本発明による組換えプラスミド・ベクターpJ
H108は約3000pbの大きさのパツセンジヤーDNA断片を含
む（第４図参照）。制限分析にはエンドヌクレアーゼSp
h I、Cla I、EcoR IおよびHind IIIを用いるのが好まし
い。

pJH108を好ましくはHind IIIで消化する。

プラスミド・ベクターpBR 322取り込みそして宿主、
好ましくは大腸菌を形質転換しクローン化する。本発明
による組換えプラスミド・ベクター:pJH111（第５
図）。

プラスミド・ベクターpJH111はこの段階で、制限分析
により示されるように、5500bpの大きさの残余プラスミ
ドのほかには1100bpの大きさのパツセンジヤーDNA断片
を含むだけである。対応する大腸菌クローンはグルコー
スDH酵素活性を有する。DNA断片の大きさを更に小さく
すると酵素活性が完全に失われる。従つて、グルコース
・デヒドロゲナーゼの遺伝子は1100bp断片に位置してい
る。

グルコースDH遺伝子のヌクレオチド配列は、例えばMa
xamおよびGilbert（1980,Methods Enzymol.,65,499−58
0）の方法により測定される。この方法では、放射性標
識DNAを四つの異なる塩基特異的反応で部分的に切断
し、切断生成物を変性ポリアクリルアミドゲルで分離
し、そして引き続きオートラジオグラフイにかけた後、
自体既知の方法により配列を確定する（実施例７参
照）。

配列決定手法を第５図に示す。構造遺伝子に帰属され
るべき本発明による新規ヌクレオチド配列を第１図に示
す。

第２図は、DNA配列から導かれる新規アミノ酸配列で
ある。それは精製酵素のタンパク配列決定により得られ
るものと符合する。

プラスミド・ベクターpJH111を用いるのが特異的大腸
菌プロモーターを用いないで、第２図に示される本発明
によるポリペプチドを大腸菌宿主で発現させると、その
結果、前述の如く、平均約0.1単位/ml（培養液）の酵素
活性が得られる。所望の過剰産生を得るには発現ベクタ
ーが用いられる。適当な発現ベクターの一例はpMR1（出
典:Rimmler,1985,学位論文、TH Darmstadt）である。こ
のプラスミドは文献に知られたプラスミドpDS26tおよび
pPlc28から構築することができ、効率的なλP_Lプロモー
ターを含有する。プラスミドpPLc28、およびクローニン
グに用いられる宿主細菌の大腸菌は、欧州特許出願EP00
41767号明細書に開示されている。大腸菌W6において
は、λP_Lプロモーターは染色体によりコードされたc I
リプレツサーにより抑制される。pJH111をHind IIIで切
断し、そして本発明の1100bp断片を低融点アガロースで
の調製用ゲル電気泳動にかけた後、自体感知の方法で単
離する。pMR1を同様に好ましくはHind IIIで加水分解
し、そして切断生成物を連結しそして常法により大腸菌
W6に形質転換する（Remaut et al.,1981,Gene 15,81−9
3）。プラスミドDNAを記載の如く（実施例３参照）単離
し、そして形質転換に適し、認定された寄託機関から入
手できかつプラスミドpRK248（出典:Bernard et al.,19
79,Gene ５,59−76）が既知の方法でクローン化されて
いる任意の所望の大腸菌株を形質転換する。後者のプラ
スミドは熱感受性λリプレツサーに対する遺伝子および
テトラサイクリン抵抗性に対する遺伝子を有している。
本発明により新たに構築されたプラスミドはpJH115と称
される。その構築法を第６図に示す。本発明による宿主
生物は大腸菌n110/pRK248/pJH115と称される。本発明に
よれば、λリプレツサーが染色体によりコードされてい
る宿主生物（例えば大腸菌W6）を用いることができれば
pRK248を共存させずにすませることができる。本発明に
よる宿主生物は前述の如く、また第８図に示されるよう
に驚く程高い発現を示す。典型的な発現実験を実施例10
に示す。

グルコースDHをコードする本発明のDNAおよびそれに
より導かれるアミノ酸配列が既知のグルコースDHと異な
ることは、本発明による新規酵素のほかに第二の酵素ま
たは遺伝子が巨大菌中に存在することを示唆している。
グルコースDHのイソ酵素の同定は、巨大菌のフイルター
結合DNAを遺伝子の放射性標識1127bp Hind III断片でハ
イブリダイズすることにより行われる（実施例７および
８参照）。このために、自体既知の方法で、染色体DNA
を制限エンドヌクレアーゼHind IIIで加水分解し、DNA
鎖長標準と共に１％アガロースゲルに適用し、そしてニ
トロセルロースに移す。鎖長標準としてはEcoR Iにより
加水分解されたSPP1 DNAのみならずpJH108（Sal I−Sph
Iにより加水分解）およびpJH111（Hind IIIにより加水
分解）の混合物も用いられ、それによつてオートラジオ
グラフイの後に加水分解断片の大きさの測定が可能とな
る。ハイブリダイゼーシヨン技術およびオートラジオグ
ラフイは、実施例に詳述されていない場合には、従来技
術であるかまたは当業者により従来技術から簡単に演繹
され得る。そのオートラジオグラフ（第10図）から使用
遺伝子プローブに相当する強い1100bpバンドのみなら
ず、より弱いバンドを2100および5000bpに確認すること
ができる。このことは、巨大菌が一種よりも多いグルコ
ース・デヒドロゲナーゼを含んでいることを示してい
る。

1300bp〜5000bpの断片に相当するもう一つのグルコー
スDHのクローニングは原則として1100bp断片について既
に詳述したとおりに行うことができる。使用ベクターは
大腸菌プラスミドpUC18（出典:Viera et al.,1982,Gene
19,259）である。最終的に得られる新規プラスミドpJH
211（第11図）は2100bp DNA断片を含み、大腸菌でグル
コースDHを発現する（同じく遺伝子プローブとハイブリ
ダイズする5000bp断片はこの方法によつては得ることが
できない）。第二のグルコースDH遺伝子のDNAおよびタ
ンパク配列を自体既知の方法で、または前記1100bp断片
と同様にして確定する。この配列はグルコースDHについ
て知られているものと完全に符合する。グルコースDHを
産生する本発明の大腸菌株大腸菌N100/pRK248/pJH155と
同様にして第二のグルコースDHについての相当する過剰
産生株を構築することができる。すなわち大腸菌N100/p
RK248/pJH215は本発明によれば多量の高品質グルコース
DHを与えるが、その酵素活性は大腸菌N100/pRK248/pJH1
15系の場合よりも約20〜30％低い。それら二つのイソ酵
素の安定性は20〜50゜（プレインキユベーシヨン）では
略同等である。

説明中、実施例中、および図面中では、そこで詳述さ
れているもののほか次の省略形を用いる： A アデニン A₅₇₈ 578nmにおける吸収 A₅₇₈−Ｕ 578nnmにおける吸収−単位 Ap^R アンピシリン抵抗性 APS アンモニウムペルオキソジサルフエート b 塩基 Bis N,N,N′,N′−メチレンビスアクリルアミド bp 塩基対 BSA 牛血清アルブミン C シトシン Ci キユリー（2.22×10¹²崩壊／分） cpm 計数／分 Da ダルトン（g/モル） DNA デオキシリボ核酸 DTT ジチオトレイトール EDTA エチレンジアミン四酢酸 E.coli 大腸菌（Escherichia coli） G グアニン galK ガラクトキナーゼ k ×10³ l リットル NAD ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド NADP ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドホ
スフエート PEG ポリエチレングリコール rpm 回転／分 s 秒 SDS ドデシル硫酸ナトリウム T チミン T4 バクテリオフアージT4 Ic^R テトラサイクリン抵抗性 TEMED N,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミ
ン Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン tRNA 転移リボ核酸 U 酵素活性の単位 本発明の個々の切り口を示す図面を以下に説明する： 第１図：巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼ
遺伝子のDNA配列。

第２図:pJH111およびpJH115の発現産生物のアミノ酸
配列。

第３図：プラスミド・ベクターpJH107の制限地図。明
確に帰属され得る制限切断部位が示されている。パツセ
ンジヤーDNAの大きさは約5800bpである。プラスミドpJH
107は、Bam H I消化pBR322と、染色体DNAおよびλEMBL
−３フアージDNAのSau3A加水分解構築物から構築され
る。

第４図：プラスミド・ベクターpJH108の制限地図。明
確に帰属され得る切断部位のみが示されている。パツセ
ンジヤーDNAの大きさは約3000bpである。プラスミドpJH
108はpJH107（Sph Iにより加水分解）およびpBR322の断
片から構築される。

第５図:pJH111からの1127bp断片の配列決定を行うた
めの手法。矢印は、各場合に同定される配列の大きさを
示す。プラスミドpJH111はpJH108およびpBR322のHind I
II消化断片から構築される。

第６図：プラスミド・ベクターpJH115の構築。これは
pMR1およびpJH111をHind III加水分解後連結することに
より構築される。

bla:β−ラクタマーゼ； gdh:グルコースDH; to:ターミネーター； galk:ガラクトキナーゼ； O_LP_L:プロモーター／オペレーター領域（λP_Lプロモー
ター） Ori:複製開始点 第７図:1100bp断片に基づくグルコースDH（ａ）と210
0bp断片に基づくグルコースDH（b;既知配列）の間のタ
ンパク配列比較。最初の45アミノ酸が示されている。

第８図：大腸菌N100/pRK248/pJH115の増殖・発現曲線
（いずれも時間（時間単位）の関数としての578nmにお
ける吸収および段位/ml）。細菌の増殖は20mlのLB培地
（実施例１参照）中28゜で行なわれる。0.5A₅₇₈−Ｕの
光学密度で培養液を42゜の水浴に移し、1A₅₇₈−Ｕ菌体
試料を取り出しそして酵素活性を測定した。

第９図：大腸菌N100/pRK248/pJH115におけるグルコー
ス・デヒドロゲナーゼの過剰産生。12.5％SDS−ポリア
クリルアミドゲルでのタンパク分離。

トラツク1:誘導前の菌体タンパク トラツク２〜8:誘導後0.5、１〜５および10時間 トラツク9:サイズ標準 第10図：巨大菌の染色体DNAをpJH111またはpJH115の
放射性標識1100bp DNA断片でハイブリダイズしたものの
12時間曝露後のオートラジオグラフ。

トラツク1:染色体DNA（巨大菌）をHind III加水分解し
たもの。

トラツク2:染色体DNA（巨大菌）の未加水分解物。

トラツク3:SPP1鎖長標準。

トラツク4:次のものを各10ng含む混合物： pIH108をSal I加水分解したもの。

pJH108をSph I加水分解したもの。

pJH111をHind III加水分解したもの。

第11図:pJH211の制限地図。制限分析に用いられる切
断部位のみ示されている。プラスミドpJH211は、pUC18
とHind III加水分解染色体DNAから構築される。

第12図:pJH215の制限地図。プラスミドpJH215はpJH21
1（Hind III加水分解物）とpMR1から構築される。諸記
号は第６図と同様である。

以下実施例を挙げて本発明を詳述する。全体にわたり
温度は摂氏温度である。

実施例1:大腸菌の培養 ａ） mg量のプラスミドを調製するために、大腸菌を１
スケールで完全（LB）または最小（M9）培地で培養す
る。このために１の培地に5mlの定常期予備培養液を
接種し、そして37℃で連続的に振盪しながら、約18時
間、定常増殖期に達するまで培養する。

ｂ） グルコース・デヒドロゲナーゼを過剰発現させる
ために、200mlのLB培地に28゜で増殖させた一夜培養液2
mlを接種する。次にその細菌懸濁液を0.5A₅₇₈−Ｕの光
学密度に達するまで28゜および160r.p.m.で培養する。
次にその培養容器を42゜で更に16時間インキユベートす
る。

ａ） LB培地： カゼイン（酵素的に加水分解したもの） 10g 酵母エキス 5g NaCl 5g 寒天（固体寒天） 15g （軟寒天） 7.5g 二回蒸留水 ad 1000ml pHは1.0N NaOHで7.4に調節する。

抗生物質を次の濃度で添加する： アンピシリン： 50μg/ml テトラサイクリン： 20μg/ml ｂ） 改変M9培地： M9塩（10倍濃縮液） 10ml 20％グルコース溶液 5ml 1M MgSO₄ 1ml 10％カゼイン加水分解物 5ml チアミン溶液（2mg/ml） 0.1ml 二回蒸溜水 ad 1000ml ｃ） M9塩（10倍濃縮液）： Na₂HPO₄×2H₂O 75g/ KH₂PO₄ 30g/ NH₄Cl 10g/ NaCl 5g/ 実施例2:λフアージの調製 ａ） プレート・リゼート 比較的多数の組換えフアージを低力価のフアージ懸濁
液から調製するためにまずプレート・リゼートを調製す
る。

このために、100μ容中の10⁵〜10⁶フアージを宿主
株大腸菌NM539の一夜培養液100μと混合し、そして37
゜で撹拌を施さずにインキユベートしフアージを吸着さ
せる。次いで3mlの47〜50゜の軟寒天を添加し、混合し
そしてその混合物を固体寒天プレート上に広げる。37゜
で16時間インキユベートした後、軟寒天層を掻き取る。
次いで菌体破砕片を10,000r.p.m.および４゜で遠心分離
する（10分間）ことにより除去する。上清を滅菌容器に
移し、数滴のクロロホルムと混合しそして４゜で保存す
る。

ｂ） 液体リゼート 液体リゼートにより調製スケールでフアージが得られ
る。

10mM MgSO₄および0.4％マルトースを含有する25mlのL
B液体培地に宿主株大腸菌NM539の一夜培養液を接種す
る。その懸濁液を37゜で通気しながら約1.3A₅₇₈−Ｕに
達するまでインキユベートする。次に細菌に10⁶フアー
ジ/mlを感染させ、そして37℃で撹拌を施すことなく15
分間吸着のために放置する。次いで１の37℃のLB培地
に感染した細菌を接種し、そしてその混合物をこの温度
で通気しながら溶菌が起こるまでインキユベートする。
溶菌が生起すると578nmにおける吸光度が急速に低下す
るのでそれは分光光度法により追跡することができる。
5000r.p.m.および４゜で15分間遠心分離することにより
細胞破砕片を除去後、フアージは水性上清中に得ること
ができる。

実施例3:ベクターDNAの単離 ａ） フアージDNAの単離 超遠心分離により精製されたフアージの懸濁液を20mM
EDTA、0.5％SDSに調整し、そして50μg/mlのプロテイ
ナーゼＫを添加後、50゜で１時間インキユベートする。
次にそれを等容のフエノールで数回抽出し、そしてクロ
ロホルム／イソアミルアルコール（24:1）で数回抽出す
る。DNAを既知の方法でエタノールを用いて沈殿させ、
そして5,000r.p.m.で10分間遠心分離することにより沈
降させる。次いでそれを70％エタノールで洗浄し、乾燥
し、そして緩衝液中にとる。

ｂ） プラスミドの小規模（ミニ）調製 多数のプラスミドの分析を可能とするためにBirnboim
（BirnboimおよびDoly、1979:Nucl.acid Res.７,1513）
の迅速溶菌法を用いる。

一夜培養液の菌体懸濁液サンプル1.5mlを15,000r.p.
m.で１分間遠心分離することにより沈降させる。100μ
の溶液Ａ（下記参照）を添加後、その混合物を20゜で
５分間インキユベートする。次に200μの溶液Ｂ（下
記参照）を添加し、そして容器を氷中に入れる。更に５
分後、溶液Ｃ（下記参照）を添加し、そしてそれらサン
プルを、染色体DNA、RNAおよびタンパクの不溶性コンプ
レツクスが析出するまで（２〜５分）氷中に放置する。
遠心分離（15分間）後、プラスミド含有上清を新しい1.
5ml容プラスチツク製エツペンドルフ管に移す。

DNAを−20゜で10分間エタノールを用いて沈殿させ、
そして15分間遠心分離して沈降させる。次にそれを70％
エタノールで２回洗浄しそして（デシケータ内で）乾燥
する。

40μのTE緩衝液（下記参照）にとつた後、それは形
質転換または制限分析に直接使用できる。

Birnboim溶液A: 25mM Tris−HCl、pH8.0 50mM グルコース 10mM EDTA Birnboim溶液B: 0.2M NaOH １％ SDS Birnboim溶液C: 3M NaOAc/HOAc、pH4.8 TE緩衝液： 10mM Tris塩基 1mM HCl pH:8.0 ｃ） プラスミドの単離調製 洗剤による限局プロトプラスト溶解によりmg量のプラ
スミドを調製する（Hardies et al.,1979,J.Biol.Chem.
254,5527−5534）。

実施例１で得られた細菌の懸濁液を5,000r.p.m.およ
び４゜で20分間遠心分離する。沈降物を15mlのスクロー
ス溶液（50mM Tris−HCl、pH8.0中25％スクロース）に
とる。3mlの0.5M EDTAおよび3mlのリソチーム溶液（50m
M Tris−HCl、pH8.0、中20mg/mlリソチーム）を添加
後、その混合物を30〜40分間氷中でインキユベートす
る。次に10％ポリエチレングリコールモノラウリルエー
テル/10％デオキシコレートの2:1（v/v）混合物を2ml添
加する。菌体消化液を40,000r.p.m.および４゜で遠心分
離（30分間）することにより清澄化する。清澄上清を傾
瀉し、100μg/ml RNase Aを添加し、そしてその混合物
を45分間氷中でインキユベートする。DNAを沈殿させる
ために、RNase−処理上清を1/2容の1.5M NaCl中30％PEG
6,000と混合し、そして更に30分間氷中に放置する。遠
心分離を４゜で20分間、8,000r.p.mで行う。その沈殿を
5mlのTE緩衝液にとり、50μg/mlプロテナーゼＫを添加
し、そしてその混合物37゜で60分間インキユベートす
る。次にそれをTE飽和フエノールで数回、そしてクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（24:1）で数回抽出す
る。DNAをエタノールで沈殿し、洗浄しそして乾燥す
る。その沈降物を１〜2mlのTE緩衝液に溶解し、そして
プラスミド収率を260nmで分光光度測定法により測定す
る。

実施例4:グルコースDH産生巨大菌からの染色体DNAの調
製 完全培地中で増殖させた定常期培養液100mlからの細
菌菌体を5,000r.p.m.、４゜で10分間沈降させる。次に
沈降物を10mlの溶菌緩衝液（50mM NaCl、50mM EDTA、30
mM Tris−HCl、pH7.9）にとり、40mgのリソチームを添
加し、そしてその混合物を37゜で45分間インキユベート
する。その懸濁液をSDS濃度が１％となるよう調整し、5
mgのプロテイナーゼＫを添加し、そしてその混合物を差
挙に30分間37゜に放置する。次にそれをTE飽和フエノー
ルで数回、そしてクロロホルム／イソアミルアルコール
（24:1）で数回抽出する。常法により、核酸を沈殿さ
せ、洗浄しそして乾燥する。

なおも存在するRNAを加水分解するために、沈降物を5
mlのTE緩衝液中に注意深く再懸濁し、10μg/mlのRNase
を添加し、そしてその混合物を37゜で30分間インキユベ
ートする。

次にその溶液をSDS濃度が１％、プロテイナーゼＫ濃
度が50μg/mlとなるように調節し、そして37゜で更に30
分間処理する。次に、それを前述の如くフエノール、お
よびクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、そ
してTE緩衝液に対して透析する。この方法による染色体
収量は２〜4mgである。

実施例5:DNAの連結 隣接３′−ヒドロキシルおよび５′−ホスフエート基
間のホスホジエステル結合の形成はT4 DNAリガーゼによ
り触媒される。

反応はT4 DNAリガーゼ緩衝液中、挿入されるべきDNA
をベクターDNAに対して５倍過剰に用いて行う。容量は2
0μである。

突出一本鎖端を有するDNA断片に対しては、連結を４
゜でDNA 1μｇあたり1Uの酵素を用いて４〜16時間行
う。二本端末端の結合は20゜でDNA 1μｇあたり10Uの酵
素を用いて４時間行う。

次にその反応混合物を直接形質転換に用いる（実施例
６参照）。

T4 DNAリガーゼ緩衝液:0.4mM ATP 66mM Tris−HCl pH7.6 6.6mM MgCl₂ 10mM DTT 実施例6:大腸菌の形質転換（塩化カルシウム法） ａ） 能力大腸菌菌体の調製 大腸菌菌体を光学密度が約0.5A₅₇₈−Ｕに達するまで2
0mlのLB培地で培養する。その懸濁液を予冷された遠沈
管に移し、次いで氷中に10分間入れる。細菌を8,000r.
p.m.、４゜で10分間沈降させる。上清を傾瀉後、菌体を
20mlの氷冷0.1M MgCl₂溶液で洗浄しそして前述の如く遠
心分離する。次にそれらを1mlの氷冷0.1M CaCl₂溶液に
とり、そして少くとも２時間氷中に放置する。

ｂ） 能力大腸菌菌体の形質転換 形質転換を行うために、200μの有能菌体を50ngの
プラスミドDNAと混合し、そして30分間氷中に置く。次
いでその混合物を水浴（42゜）で２分間加熱する（ヒー
トパルス）。1mlのLB培地添加後、その混合物を37゜で
１時間インキユベートする（リカバリー・フエーズ）。

この細菌懸濁液の200μサンプルを次に選択栄養培
地にプレート・アウトする。それらプレートを37℃に16
〜24時間インキユベートする。

感熱性大腸菌株N100pRK248cItsの形質転換には、すべ
てのインキユベーシヨン工程を28゜に行う。ヒートパル
スは34゜、５分間で有効である。

実施例7:DNAの放射性標識 10⁸cpm/μｇより大きい比活性を有する放射性標識DNA
断片を大腸菌DNAポリメラーゼＩを用いてα³²P−デオキ
シヌクレオチドの存在下に修復合成（ニツクトランスレ
ーシヨン）により調製する。

混合物： 1.2μｇのDNA ２μの10×DNAポリメラーゼ緩衝液 各１μの1.2mM dNTP類（ヌクレオチド１〜３） ５μのα³²P−dNTP（3,000Ci/ミリモル、10μCi/μ
）（ヌクレオチド４） 0.5μのDNase I（60pg/入） 20゜で１分間反応させ、そして10UのDNAポリメラーゼ
Ｉを添加する。

10×DNAポリメラーゼ緩衝液： 500mM Tris−HCl、pH7.8 50mM MgCl₂ 100mM β−メルカプトエタノール 0.05％ BSA 反応は、DNAポリメラーゼＩを添加後14゜で２〜４時
間行い、そして20μの60mM EDTA、pH8.0で止める。容
量を次いでH₂Oを用いて100μまで増量する。

未反応ヌクレオチドを除去するために、サンプルを10
0μの5M酢酸アンモニウム溶液および400μの無水エ
タノールと混合し、そして液体窒素中で２分間凍結す
る。次に放射性標識DNA断片をベンチ遠心分離器で15分
間沈降させ、70％エタノールで洗浄しそして乾燥する。
未反応ヌクレオチドは上清に残る。

DNAを100μのH₂Oにとり、次いでハイブリダイゼー
シヨン実験に用いる。

実施例8:フイルター結合DNAのハイブリダイゼーシヨン フイルター結合DNAのハイブリダイゼーシヨンを50％
ホルムアミド含有溶液中で行う。非特異的結合部位をブ
ロツクするために、DNA断片で被覆されたニトロセルロ
ースフイルターをそれらを覆うプレハイブリダイゼーシ
ヨン溶液と共に気泡を入れずにプラスチツクフイルム中
にシールし、そして42゜で３時間インキユベートする。

プレハイブリダイゼーシヨン溶液： 50％ ホルムアミド ５× 濃デンハルト（Denhardt）溶液 ５× 濃SSC（下記参照） 0.5％ SDS 100μg/ml 酵母tRNA デンハルト溶液： 0.02％ BSA 0.02％ ポリビニルピロリドン 0.02％ フイコール（ポリスクロース） SSC: 150mM NaCl 15mM クエン酸ナトリウム、pH7.2 ハイブリダイゼーシヨンには、まず、放射性標識二本
鎖DNAプローブを80゜で10分間加熱することにより変性
し、次いで直ちに氷冷する。

次いで核酸（この段階では一本鎖の形になつている）
を20〜20mlに移す。これを用いてプレハイブリダイゼー
シヨン溶液と差し換え、そして更に20時間42゜でインキ
ユベートする。

ハイブリダイゼーシヨン溶液： 50％ ホルムアミド ５× 濃デンハルト溶液 ５× 濃SSC 0.5％ SDS 10mM EDTA 100μg/ml 酵母tRNA 10⁶cpm/ml 放射性標識DNA 非特異的に結合したDNAを除去するために、ハイブリ
ダイゼーシヨン後、フイルターをまず200mlの２×濃SS
C、0.1％SDSを用いて20゜で数回、次いで10％SSC、0.1
％SDSを用いて42゜で数回洗浄する。

実施例9:グルコースDHの酵素アツセイ このアツセイのために、非螢光性クロマトグラフイ紙
に92mlのインジケーター溶液を一様に噴霧し、次いで20
゜で乾燥する。

インジケーター溶液： 60.5mlの燐酸ナトリウム緩衝液（0.12M;pH7.6） 30mlのＤ−グルコース溶液（10％w/v） 1.5mlのNAD⁺溶液（70mg/ml） 酵素アツセイを行う前に、調製されたクロマトグラフ
イ紙をを栄養培地プレート（直径約8cm）の正しいサイ
ズに合わせて切断する。

フアージ溶菌液に対するアツセイを行うために、容易
に肉視できるプラーク（600〜800/プレート）の形成直
後に、プレートをインキユベーターから取り出す。まず
ペトリ皿をラベルし、そして同様にマークされたアツセ
イ・フイルターを置いてきちつとカバーする。２分後そ
れらを取り出し、熱空気流中で乾燥し、次いで波長366n
mの光の下で検査する。活性グルコースDHがアツセイ・
フイルター上に移つていれば、その場合にはこれらの場
所でNAD⁺は螢光により明確に検出され得るNADHに還元す
ることができる。次にフイルター・ラベルを用いて栄養
培地プレート上の陽性フアージ・クローンを同定し単離
する。

細菌クローンに対するアツセイを行うために、菌体を
同じ方法で２個の栄養培地プレートに移す（100〜200コ
ロニー／プレート）。それらプレートのうちの一つを基
準プレート（「マスタープレート」）とし、他を酵素ア
ツセイに用いる。これは細菌をアルミ箔に移し、そして
約５μの消化溶液を各コロニーにピペツトで注ぐこと
により行われる。溶菌されるために、菌体をモイスチヤ
ー・チエンバー（moisture chamber）内で20゜で30分間
インキユベートする。次いで前述の如く、テスト・フイ
ルターを載せ、乾燥し、そして酵素反応の位置を同定す
る。基準プレート上での対応する陽性細菌は次いでプラ
スミド単離に用いることができる（実施例３参照）。

消化溶液： 100mM 燐酸ナトリウム緩衝液、pH6.5 20mM EDTA 5mg/ml リソチーム 活性は分光光度計で25゜で測定する。

アツセイ溶液： 120mM 燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.6 100mM グルコース 2mM NAD⁺ 酵素活性（U/ml）は１分間あたり転化される基質量
（μモル）として報告される。

実施例10:大腸菌N100/pRK248/pJH115で発現されたグル
コースDHの調製 10実験室用発酵槽に7.5のLB培地を装填し、滅菌
後、過剰生産株の定常期培養液200mlで接種する。菌体
を28゜で通気しながら培養する。光学密度が約0.5A₅₇₈
−Ｕに達した後、温度を42゜に上げ、そして培養液を更
に５時間通気しながらインキユベートする。

グルコースDHを調製するために、細菌（湿潤量約10
g）を沈降させた後、４゜で等量のアルミナと共に、乳
鉢内で磨砕することにより破砕する。12.5mlのP₅₀緩衝
液（50mM燐酸カリウム、pH6.5;0.1mM2−メルカプトエタ
ノール;2μｇのフエニルメチルスルホニルフルオライ
ド）および50μｇのDNase Iを添加後、その混合物を４
゜で１時間インキユベートする。アルミナを8,000r.p.
m.および４゜で遠心分離することにより除去する。水性
上清を次いで15,000r.p.m.および４゜で30分間遠心分離
することにより清澄化する。

その菌体破砕溶液を次いで100mlのP₅₀緩衝液と混合
し、そしてDE−52カラムに吸着する。100mlのP₅₀緩衝液
で洗浄後、P₅₀緩衝液中0.05〜0.5M KClの直線濃度勾配
を用いてタンパクを溶出し、そして各5ml画分として集
める。溶出量は１である。溶出プロフイールを作るた
めに、個々の画分中の280nmにおける吸収およびグルコ
ースDH活性を測定する。

タンパク精製結果を次表にまとめる。

酵素の均質度をチエツクするために、サンプルを12.5
％SDSポリアクリルアミドゲルで分析する。

【図面の簡単な説明】

第１図は巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼ遺
伝子のDNA配列である。 第２図はpJH111およびpJH115の発現産生物のアミノ酸配
列である。 第３図はプラスミド・ベクターpJH107の制限地図であ
る。 第４図はプラスミド・ベクターpJH108の制限地図であ
る。 第５図はpJH111からの1127bp断片の配列決定を行うため
の手法を示す図である。 第６図はプラスミド・ベクターpJH115の構築を示す図で
ある。 第７図は1100bp断片に基づくグルコースDH（ａ）と2100
bp断片に基づくグルコースDH（b;既知配列）の間のタン
パク配列比較を示す図である。 第８図は大腸菌N100/pRK248/pJH115の増殖・発現曲線で
ある。 第９図は大腸菌N100/pRK248/pJH115におけるグルコース
・デヒドロゲナーゼの過剰産生を示す図面に代る写真で
ある。 第10図は巨大菌の染色体DNAをpJH111またはpJH115の放
射性標識1100bp DNA断片でハイブリダイズしたものの12
時間曝露後のオートラジオグラフを表わす図面に代る写
真である。 第11図はpJH211の制限地図である。 第12図はpJH215の制限地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:11） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 フリードヘルム・マインハルト ドイツ連邦共和国Ｄ‐6100ダルムシユタ ツト、フランクフルテル、シユトラーセ 250

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの生物
   活性を有するポリペプチドをコードする下記に示す配列
   を有するDNA。
2. 【請求項２】微生物、特に巨大菌、のゲノムを起源とす
   る請求項１記載のDNA。
3. 【請求項３】大腸菌および／または巨大菌からのプロモ
   ーターを含むことを特徴とする、請求項１又は２記載の
   DNA。
4. 【請求項４】pJH111の呼称およびDSM4052Pの受託番号を
   有する、請求項１に記載のDNAおよび巨大菌プロモータ
   ー系を含むプラスミド。
5. 【請求項５】pJH115の呼称およびDSM4051Pの受託番号を
   有する、請求項１に記載のDNAおよび大腸菌プロモータ
   ー系を含むプラスミド。
6. 【請求項６】請求項３〜５のいずれかに記載の少くとも
   一つの組換えDNAまたはプラスミドを含む、形質転換バ
   クテリア宿主生物。
7. 【請求項７】大腸菌である請求項６記載の宿主生物。
8. 【請求項８】大腸菌N100/pRK248/pJH115の呼称およびDS
   M4047の受託番号を有し、請求項５記載のプラスミドを
   含む、請求項７記載の宿主生物。
9. 【請求項９】酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの生物
   活性を有し、下記に示すアミノ酸配列 を有するポリペプチド。
10. 【請求項１０】請求項２に記載のDNAによりコードされ
    ることを特徴とする酵素グルコース・デヒドロゲナーゼ
    の生物活性を有するポリペプチド。
11. 【請求項１１】組換えDNAで形質転換された微生物宿主
    生物を栄養培地中で培養しそしてその発現によって産生
    されたポリペプチドを単離することによってグルコース
    ・デヒドロゲナーゼを製造する方法であつて、請求項６
    〜８のいずれかに記載の宿主生物を用いることを特徴と
    する前記方法。
12. 【請求項１２】請求項９又は10記載のポリペプチドを用
    いることを特徴とするグルコースの酵素的測定方法。