JPS63269979A - 巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルコース・デヒドロゲナーゼの遺伝子工学
的製造方法に関する。この方法は宿主を予め適切な組換
えＤＮＡで形質転換した後培養された微生物宿主生物か
ら酵素グルコース・デヒドロゲナーゼを単離することに
より成る。

その組換えＤＮＡは巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｌｅ
ｇａｔｅｒｉｕｌ′Ｉ）ゲノムを起源としまたグルコー
ス・デヒドロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチド
をコードする配列を含んでいる。

本発明は、更に、酵素グルコース・デしドロゲナーゼの
生物活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
の提供に関する。

更に本発明は、酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの生
物活性を有するポリペプチドを製造するのに用いるため
のクローニング・発現ベクター、およびかかるベクター
で形質転換された宿主生物、例えば細菌、酵母、他の真
菌、動物またはヒト細胞など、に関する。

最後に、本発明は、発現により産生された相当するポリ
ペプチドをグルコース測定に用いることに関する。「酵
素グルコース・デヒドロゲナーゼの生物活性を有するポ
リペプチド」とは、そのアミノ酸配列が巨大菌株からの
天然グルコース・デヒドロゲナーゼに相当し、この配列
に類似し、あるいは酵素活性断片を含むポリペプチドま
たはタンパクを意味する。同様のことが、天然配列がほ
んの一断片しか現出しない本発明のポリペプチドにもい
える。

ＮＡＩ）　／ＩＩＡＤＰ−依存性グルコース・デヒドロ
ゲナーゼ（Ｅ、　Ｃ，１，１，１，４７）　　（以下グ
ルコースＤＨと称する）はβ−グルコースからグルコノ
ラクトンへの転化を触媒するが、その間にコファクター
ＨＡＤがＮＡＤＨｔに還元される。この酵素はβ−Ｄ−
グルコースに対する高い基質特異性を特徴としている。

エピマー糖類は転化されない、この酵素は医学的診断技
術に主に用いられている。

ＮＡＤ依存性グルコース叶はある範囲のバチルス属菌種
に存在する。この酵素の産生は発生生理学的な制御を受
ける、すなわち、それは短い胞子形成期の間だけ合成さ
れる。更に、グルコースＤＨは、大抵の場合、前記グル
コース測定法によるグルコース測定をひどく妨害するＨ
ＡＤ）１．オキシダーゼを伴い、そして更に、その除去
は極めて困離である０以上の結果、慣用の古典的方法お
よび野生バチルス属株を用いて得られた酵素の収率は極
めて僅少であるＣＧ、０１〜最大０．１単位／ＩＩＪ　
　（培養液））、既知の菌株改良法を用いることにより
、胞子形成期にかかわらずグルコース叶産生をなお検出
できる（平均酵素活性１〜１０単位／ｎＪ　　（培養液
））菌株を選抜することはできるが、かかる「非共役的
（ｄｅｃＯｕＤＩｅｄ）　Ｊ菌株は容易に復帰する、す
なわちもとの胞子形成挙動に戻ってしまい、そのため胞
子形成とグルコース叶産生とをそれぞれ別個に維持する
ための連続的、かつしばしば長時にわたる、努力が払わ
れねばならない、最近に到って、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）からそのボロモーターを含む
グルコースＤＨをコードする遺伝子を単離しそれを大腸
菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）内で胞子形成から独立的に発現さ
せることに成功している（Ｖａｓａｎｔｈａｅｔ　ａｌ
、、　１９８３、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　ＵＳＡ。

ｖｏ　ｌ　、　８０．７８５−７８９）が、驚くべきこ
とに、この酵素は商業的に入手し得るグルコース０■と
は対照的に、比較的不安定であることがわかった（　Ｒ
ａ１１ａｌｅｙ、　Ｖａｓａｎｔｈａ　１９８３、Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ、　。

ｖａｔ、　２５８．２０．１２５５８−１２５６５）、
　Ｌかしながら、迅速かつ再現性あるグルコース測定ア
ッセイの実施を可能にするには高い酵素安定性が特に必
要である。

そこで、本発明の目的は大量かつ改良された品質の安定
なグルコース・デヒドロゲナーゼの工業的生産を可能に
する遺伝子工学的方法を提供することにある。この目的
は以下記載の如く達成される。

驚くべきことに、ファージ・ベクター、好ましくはλ−
ＥＨＢＬ−３、で巨大国のシーンバンクを作り、構造遺
伝子を有するＤＮＡ領域の大きさを順次縮小し、そして
その都度宿主生物を形質転換することにより、少くとも
二つの異なる構造遺伝子が別個に得られ、そしてそれら
は最終的に量的および質的にも向上した少くとも二つの
異なるグルコース叶イソ酵素を発現することが見出され
た。

グルコース叶をコードしそして２１００塩基対（ｂｏ）
の大きさの一方の同定されたＤＮＡ領域は、商業的に入
手し得るグルコース叶の既知配列（Ｊａｎｙ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　１９８４．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１６５　：
　６−１０）にＤＮＡ配列およびアミノ酸配列上全面的
に対応するのに対し、１１００ｂｌ）の大きさの他方の
ＤＮＡ断片は第１図に示された新規配列を有する。そこ
から導かれ、かつ精製酵素のタンパク配列決定により確
認された新規アミノ酸配列を第２図に示す、既知配列と
の相違度はほぼ２０％に達する。

最初の４５アミノ酸の相違を第７図に示す、これらの各
種ＤＮＡ断片をこの目的に適したプラスミド・ベクター
（例えばｐＪＨｌｌｌおよびｐＪＨ２１１）中に組み入
れ、そして適当な宿主生物、好ましくは大腸菌菌体、を
形質転換すれば、バチルス属に固有であってかつ大腸菌
内において有効なプロモーターを用いるだけで得られる
グルコース叶酵素活性はいずれの場合も０．０５〜０．
５単位／ｎｊ　　（培養液）、好ましくは０．０９〜０
．２単位／ｎｊ　　（培養液）、となる、これは既に、
バチルス属野生株に対する古典的方法により得られる数
値を少くとも５倍は超えている。特定の構造遺伝子の上
流に既知の調節可能なλ旺プロモーターを組み入れると
酵素活性測定値は驚くほどに高くなる：第２図に示され
た新規ポリペプチドを大腸菌Ｎ１００／ｐＲＫ２４８／
ｐＪＨ１１５と共に用いるときは３０〜６５単位／ｎｉ
ｌ　　（培養液）、好ましくは４０〜５０単位／１１（
培養液）、であり、また既知配列のポリペプチドを大腸
菌Ｎ１００／ｐＲＫ２４８／ｐＪＨ２１５と共に用いる
ときは２０〜４０単位／ｌｊ　　（培養液）である、こ
れらの数値はバチルス属野生株を用いたときのグルコー
スＯＨ収率よりも約５００倍高く、またその開発に手の
かかる胞子形成−非共役バチルス属菌株を用いた場合よ
りも約５〜１０倍高い０例えば大腸菌８１００／ｐＲＫ
２４８／ｐＪＨ１１５についての、典型的な増殖および
発現曲線を第８図に示す。

ところで、本発明の方法は、相当な活性増加のほかに更
なる長所をも有するのである。すなわち、大腸菌におけ
るすべての胞子形成問題が解消してしまうのである。従
ってこの新しい方法により調製された宿主株はより一段
と簡単にかつ経済的に用いることができる。更に、本発
明におけるグルコース叶産生大腸菌宿主菌体の粗抽出液
は色素形成を全く示さない（透明無色の液体である）の
に対し、常法により調製された粗抽出液は極めて暗い緑
乃至黒色を呈し、更なる精製を必要とする。更にこの新
しい遺伝子工学的方法により調製された粗抽出液中の障
害となるＮＡＤＨ２オキシダーゼの含量は無視できる。

外来タンパク含量で示した純度は第９図から明らかであ
る０組換えＤＮＡを含む宿主菌体も驚くほど高いプラス
ミド安定性を示す、更にまた、関連の発現産生物は、診
断目的に対し保証されなければならない良好な酵素安定
性を示す、このことは既知の枯草菌／大腸菌糸と比教し
た場合明らかにもう一つの顕著な長所である。

このように本発明の方法は、従来技術に比し、重要な長
所を有している。

従って、本発明は、組換えＤＮＡで形質転換された微生
物宿主生物を栄養培地中で培養しそしてその発現によっ
て産生された各種ポリペプチドを単離することによりグ
ルコース叶を製造する方法であって、巨大菌のゲノムか
ら単離されそして酵素グルコース叶の生物活性を有する
一種以上のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む
宿主生物を用いることを特徴とする方法に関する。

同様に、本発明は、グルコース・デヒドロゲナーゼの生
物活性を有するポリペプチドをコードする第１図に示さ
れたＤＮＡ配列に関する。

本発明は、更に、グルコース叶ポリペプチドをコードす
る本発明によるＤＮＡ配列を含むプラスミドＯＪＨ１１
１に関する。

本発明は、更に、グルコース叶遺伝子の全コーティング
領域がλＰＬプロモーターの調節下にあり、かつグルコ
ース叶遺伝子の全ＤＮＡ配列を決定する組換え発現プラ
スミドに関する。ＡＰＬプロモーターに代えて、発現調
節配列として、大腸菌プロモーター系、例えば大腸菌Ｉ
ａｃ系、大腸菌ラクタマーゼ系、大腸菌ｔｒｐ系または
大腸菌リポタンパクプロモーター、酵母発現調節配列ま
たはその他の真核発現調節配列なども等しく本発明に用
いることができる。ここで重要な点は、遺伝子と発現調
節配列を機能的に連結すること、そして特定の宿主生物
に適した発現調節配列を選択することだけである。

本発明は、特に、グルコース叶ポリペプチドをコードし
、そしてλＰＬプロモーターを含む本発明のＤＮＡ配列
を含む発現プラスミドｐＪＨ１１５に関する。

本発明は、更に、グルコースＤＨの生物活性を有し、そ
して第２図に示され前述の条件下に発現させることによ
り合成され得るアミノ酸配列を有するポリペプチドに関
する０本発明は、更に、本発明によるＤＮＡを含む宿主
生物、特にプラスミドｐＪＨ１１５で形質転換されてい
る大腸菌Ｎ１００／ｐＲに２４８／ｐＪＨ１１５に関す
る。

最後に、本発明は、本発明のポリペプチドをグルコース
測定、特に血糖測定に用いることに関する。

本発明によれば、グルコースＤＨをコードしそして巨大
菌から単離されたＤＮＡ　配列をプローブ分子としてグ
ルコース叶産生微生物のシーンバンクに用いることによ
り対応する遺伝子を同定しそしてそれをシーンバンクか
ら単離することができる。この方法により、他の微生物
、例えば枯草菌、から酵素グルコースＤＨの生物活性を
有するポリペプチドを任意の所望量だけ製造することも
できる。

グルコースＤＨの提供に用いられる生物種は適切な遺伝
情報を有する菌種巨大菌およびその突然変異体または変
異体といった微生物である。

この生物種の株は知られており、また権限ある寄託機関
に寄託されている（例えばＤＳＨ３２１、ＤＳＨ３２２
、ＤＳＨ３３３またはＤＳＨ３３７）　、グルコース叶
をコードするＤＮＡで形質転換され得る適切な宿主生物
は主に微生物であるが、植物、動物または人間の細胞も
適している。しかしながら、微生物例えば細菌、酵母お
よび他の真菌、特に大腸菌を用いることが好ましい。

本発明の方法は次のようにして行うのが好ましい。

まず第一に、巨大菌菌体（その培養については実施例１
参照）の染色体ＤＮＡを文献に知られた方法を用いて単
離し精製する（実施例４参照）。

巨大菌から単離されたこの目的に適していることが知ら
れまた一般に商業的に入手可能な慣用されている制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて自体既知の方法で部分加水分
解する。制限酵素Ｓａｕ　３Ａをこの目的に用いるのが
好ましい、加水分解は主として９〜２２キロベース（ｋ
ｂ）　、好ましくは１４ｋｂ以上の、長さの断片が得ら
れるように調節される。何故ならばこれらはファージ・
ベクターのＤＮＡ中に組み入れるのに特に適しがつ有利
だからである。その目的は、グルコースＤＨの構造遺伝
子をクローン化するために適当なファージ・ベクターを
用いて適当なバチルス属菌株のシーンバンクを作ること
にある。既知のファージ・ベクターであるλ−ＥＨＢＬ
３（Ｆ工１ｓｃｈａ−ｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８
３．　Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、　１７０．８２７−８４
２）をこの目的に用いるのが好ましい、ファージＤＮＡ
は実施例３に詳記される如くに調製され、そして既知の
方法により、慣用の制限エンドヌクレアーゼ、好ましく
はＢａｎ　ＨＩ、を用いて切断される。各場合に得られ
るＤＮＡ断片の大きさをゲル電気泳動により測定する。

ファージＤＮＡの切断部位に嵌合するバチルスゲノムの
ＤＮＡ断片を今度は商業的に入手し得る連結酵素、好ま
しくはＴ　、ＤＮＡす灼イ、を用いて自体既知の方法で
組み込む（実施例５参照）。

このようにして得られた様々な組換えファージ分子をそ
れらを増殖させることのできる宿主生物、好ましくは大
腸菌、特に大腸菌ＮＨ５３９（Ｓｕｌ）Ｆ　ｈｓｄ　Ｒ
Ｉａｃ　Ｙ　Ｐ２Ｃｏｘ　３　）　（ＡＴＣＣ３５，６
３９）、に形質導入し、そして既知の方法によりクロー
ン化する（Ａｒｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、１９８３．　ｒ　
Ｌａ１ｂｄａＩＩ　Ｊ　、Ｃｏ１ｄＳｐｒｉｎａ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｈｏｎｏａｒａｐｈｓ、　４３３−４６５　
）　、大腸菌株の形質転換は一般に例えば塩化カルシウ
ム法によって行われ、また実施例６に詳述されている。

グルコースＯＨ遺伝子は、導入部に記載されたグルコー
ス叶検出反応に基づく特異的フィルター・アッセイを用
いて、新たに形成されたファージ・クローンの溶解液（
リゼイト）中の酵素活性を検出することにょ６同定され
る。

グルコース叶産生（陽性反応）を伴うＮＡＤＨ２の形成
は、ｒ紙に適用されファージにより溶解された菌体（プ
ラーク）から螢光信号が現れることにより検出される（
実施例９参照）、これらのアッセイ（それらは適切な場
合には反復されるべきであり、また以後の作業工程にお
いて用いられる）に基づいて最終的に、再現性ある陽性
反応を示すファージ・クローンを同定することができる
。この結果を確認するために、単離されたクローンの液
体リゼイトを分光光度測定法（３３４、３４０または３
６５ｎｒｎ）により検査し、そして基質特異性を試験す
る。これにより文献に知られたデータが得られる（Ｐａ
ｕｌｙ　ｅｔ　ａｔ、。

１９７５　；　Ｈｏｐｐｅ　−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、
Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｎ、　３５６　：１６１３−１
６２３＞　。

組換えファージＤＮＡ内のグルコース叶ＤＮＡを濃縮す
るために、後の手順においてサブクローニングを好まし
くはプラスミドで行う、このためには、組換えファージ
ＤＮＡを今度は、常法により制限エンドヌクレアーゼ、
好ましくは５ａｕ３Ａ、を用いて部分加水分解し、それ
によって約４〜９ｋｂの大きさの断片を生成させる。原
則として、出発プラスミドとしては、前記の大きさのＤ
ＮＡ断片を取り込んでも不安定にならないあらゆるプラ
スミドを用いることができる。この目的に特に適してい
るのは、既知のプラスミドｐＢＲ３２２（出典：　Ｂｏ
ｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７７、　Ｇｅｎｅ２
　。

９５−１１３　’）であり、これを、好ましくは、制限
エンドヌクレアーゼＢａｎ　ＨＩを用いて部分消化する
。前記ファージ断片を切断開環済みのプラスミド・ベク
ターに自体既知の方法により連結する（実施例５参照）
、その連結生成物を用いて形質転換に適しそして認定さ
れた寄託機関から入手し得る任意の所望の宿主生物、好
ましくは大腸菌、を常法により形質転換する（実施例６
参照）、このようにして得られたコロニーをグルコース
叶酵素アッセイにかける（実施例９参照）、これにより
陽性グルコースＤＨ反応を示すいくつかのクローンが得
られる。基礎的な（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎａ　）プラスミ
ドの一つは１０．２ｋｂの大きさをもち、そしてｐＪＨ
１０７と称される。制限分析を行うために、プラスミド
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ　、Ｓａｔ　Ｉ　
、Ｓｐｈ　Ｉ　、ＨｉｎｄｌＩおよびＣｌａ　Ｉにより
自体既知の方法で完全加水分解し、そしてＤＮＡ　ＩＪ
ｒ片を自体既知の方・法でアガロースゲル電気泳動によ
り分画する。グルコース叶配列を含む断片の大きさは５
８００１ｏ＋であることが分る。第３図は本発明による
プラスミドｐＪＨ１０７の制限地図を示す。

組換えプラスミド上で遺伝子を更に局在下させるための
手順は次のとおりであり、処理方法は以上において、そ
してまた実施例に記載されているか、または一般的な従
来技術に従う。

０高確率で構造遺伝子を切断しない制限エンドヌクレア
ーゼでＤＪＨ１０７を消化する。　５ｐｈＩをこの目的
に用いるのが好ましい。

０プラスミド・ベクターｐＢＲ３２２中に組み入れ、そ
して宿主生物、好ましくは大腸菌ＲＲ１を形質転換しそ
してクローン化する。

本発明による組換えプラスミド・ベクターｐＪＨ１０８
は約３０００ｐｂの大きさのバラセンジャ−ＤＮＡ断片
を含む（第４図参照）、制限分析にはエンドヌクレアー
ゼＳｐｈ　Ｉ、　Ｃ１ａ　Ｉ、ＥｃｏＲ■および旧ｎｄ
ｌｌｌを用いるのが好ましい。

ｏ　ｐＪＨｌｏｓを好ましくは旧ｎｄＩ［で消化する。

Ｑプラスミド・ベクターｐ８Ｒ３２２取り込みそして宿
主、好ましくは大腸菌を形質転換しクローン化する０本
発明による組換えプラスミド・ベクター：　ｐＪＨｌｌ
ｌ　（第５図）。

プラスミド・ベクターｐＪＨ１１１はこの段階で、制限
分析により示されるように、５ｓｏｏｂｐの大きさの残
余プラスミドのほかには１１００ｂｐの大きさの八ツセ
ンジャーＤＮＡ断片を含むだけである。

対応する大腸菌クローンはグルコース叶酵素活性を有す
る。　ＤＮＡ断片の大きさを更に小さくすると酵素活性
が完全に失われる。従って、グルコース・デヒドロゲナ
ーゼの遺伝子は１１００ｂｐ断片に位置している。

グルコースＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列は、例えばＨ
ａｘａｉおよびＧ１１ｂｅｒｔ　　（１９８０，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｎｏｌ、、　６５．４９９−５８０　
）の方法により測定される、この方法では、放射性標識
ＤＮＡを四つの異なる塩基特異的反応で部分的に切断し
、切断生成物を変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、
そして引き続きオートラジオグラフィにかけた後、自体
既知の方法により配列を確定する（実施例７参照）。

配列決定手法を第５図に示す、構造遺伝子に帰属される
べき本発明による新規ヌクレオチド配列を第１図に示す
。

第２図は、ＯＮ＾配列から導かれる新規アミノ酸配列で
ある。それは精製酵素のタンパク配列決定により得られ
るものと符合する。

プラスミド・ベクターｐＪＨ１１１を用いるのが特異的
大腸菌プロモーターを用いないで、第２図に示される本
発明によるポリペプチドを大腸菌宿主で発現させると、
その結果、前述の如く、平均的０．１単位／ｌｌ１ｌ　
　（培養液）の酵素活性が得られる。所望の過剰産生を
得るには発現ベクターが用いられる。１！ｉ当な発現ベ
クターの一例はｐＨＲ１（出典：　Ｒ１ｎｎ１ｅｒ、　
１９８５．学位論文、ＴＨＤａｒ−ｎｓｔａｄｔ　）で
ある、このプラスミドは文献に知られたプラスミドｐＤ
Ｓ２６ｔおよびｐＰＩｃ２８から構築することができ、
効率的なＡＰＬプロモーターを含有する。プラスミドＩ
）ＰＬＣ２８、およびクローニングに用いられる宿主細
菌の大腸菌は、欧州特許出願ＥＰＯＯ４１７６７号明細
書に開示されている。大腸菌Ｗ６においては、λＰＬプ
ロモーターは染色体によりコードされたｃＩリプレッサ
ーにより抑制される。　Ｉ）ＪＨｌｌｌを旧ｎｄＩ［［
で切断し、そして本発明の１１００ｂｐ断片を低融点ア
ガロースでの調製用ゲル電気泳動にかけた後、自体既知
の方法で単離する。　ｐＨＲ１を同様に好ましくは旧ｎ
ｄｌ［Ｉで加水分解し、そして切断生成物を連結しそし
て常法により大腸菌Ｗ６に形質転換する（　Ｒｅ１ａｕ
ｔｅｔ　ａｔ、、　１９８１．　Ｇｅｎｅ　１５　、８
ｌ−９３）　、プラスミドＤＮＡを記載の如く（実施例
３参照）単離し、そして形質転換に適し、認定された寄
託機関から入手できかつプラスミドＯＲに２４８（出典
：　Ｂｅ−ｒｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　
Ｇｅｎｅ　５　、５９−７６）が既知の方法でクローン
化されている任意の所望の大腸菌株を形質転換する。後
者のプラスミドは熱感受性λリプレッサーに対する遺伝
子およびテトラサイクリン抵抗性に対する遺伝子を有し
ている０本発明により新たに構築されたプラスミドはＤ
ＪＨ１１５と称される。その構築法を第６図に示す０本
発明による宿主生物は大腸菌８１００／　ｐＲに２４８
／ｐＪＨＩ　１５と称される０本発明によれば、λリプ
レッサーが染色体によりコードされている宿主生物（例
えば大腸菌Ｗ６）を用いることができればｐＲに２４８
を共存させずにすませることができる０本発明による宿
主生物は前述の如く、また第８図に示されるように驚く
程高い発現を示す、典型的な発現実験を実施例１０に示
す。

グルコースＤＨをコードする本発明のＤＮＡおよびそれ
により導かれるアミノ酸配列が既知のグルコース叶と異
なることは、本発明による新規酵素のほかに第二の酵素
または遺伝子が巨大菌中に存在することを示唆している
。グルコース叶のイソ酵素の同定は、巨大菌のフィルタ
ー結合ＤＮＡを遺伝子の放射性標識１１２７ｂｐ旧ｎｄ
　ＩＩＩ断片でハイブリダイズすることにより行われる
（実施例７および８参照）、このなめに、自体既知の方
法で、染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄｌ
ｌ［で加水分解し、ＤＮＡ鎖長標準と共に１％アガロー
スゲルに適用し、そしてニトロセルロースに移す、鎖長
標準としてはＥｃｏＲ１により加水分解された５ＰＰＩ
　ＤＮＡのみならずｐＪＨ１０８（ＳａｌＩ　−３ｐｈ
　Ｉにより加水分解）およびｐＪＨｌｌｌ（ＨｉｎｄＩ
［［により加水分解）の混合物も用いられ、それによっ
てオートラジオグラフィの後に加水分解断片の大きさの
測定が可能となる。ハイブリダイゼーション技術および
オートラジオグラフィは、実施例に詳述されていない場
合には、従来技術であるかまたは当業者により従来技術
から簡単に演鐸され得る。そのオートラジオグラフ（第
１０図）から使用遺伝子プローブに相当する強い１１０
０ｂｐバンドのみならず、より弱いバンドを２１００お
よび５０００ｂｐに確認することができる。このことは
、巨大菌が一種よりも多いグルコース・デヒドロゲナー
ゼを含んでいることを示している。

１３００ｂｐ〜５０００ｂｐの断片に相当するもう一つ
のグルコース叶のクローニングは原則として１１００ｂ
ｐ断片について既に詳述したとおりに行うことができる
。使用ベクターは大腸菌プラスミド１）ＵＣｌ３　　（
出典：　Ｖｉｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｇ
ｅｎｅ　１９゜２５９）である、最終的に得られる新規
プラスミドＤＪＨ２１１（第１１図）は２１００ｂｐ　
ＤＮＡ断片を含み、大腸菌でグルコース叶を発現する（
同じく遺伝子プローブとハイブリダイズする５０００ｂ
ｐ断片はこの方法によっては得ることができない）、第
二のグルコースＤＨ遺伝子のＤＮＡおよびタンパク配列
を自体既知の方法で、または前記１１００ｂｐ断片と同
様にして確定する。この配列はグルコース叶について知
られているものと完全に符合する。グルコース叶を産生
ずる本発明の大腸菌株大腸菌８１００／ｐＲに２４８／
ｐＪＨ１１５と同様にして第二のグルコース叶について
の相当する過剰産生株を構築することができる。すなわ
ち大腸菌Ｎ１００／ｐＲＫ２４８／ｐＪＨ２１５は本発
明によれば多量の高品質グルコース叶を与えるが、その
酵素活性は大腸菌Ｎ１００／ｐＲＫ２４８／口Ｊ旧１５
系の場合よりも約２０〜３０％低い、それら二つのイソ
酵素の安定性は２０〜５０°（ブレインキュベーション
）では略同等である。

説明中、実施例中、および図面中では、そこで詳述され
ているもののほか次の省略形を用いる： Ａ　　　アデニン Ａ５，８５７８ｎｌにおける吸収 八５７８−υ　５７８ｒ＋ｎにおける吸収一単位ＡＤＨ
アンピシリン抵抗性・ ＡＰＳ　　　アンモニウムベルオキソジサルフエート ｂ　　　塩基 Ｂｉｓ　　　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−メチレンビスアクリ
ルアミド ｂｐ　　　　塩基対 ＢＳＡ　　　牛血清アルブミン Ｃシトシン Ｃｉ　　　　キュリー（２，２２Ｘ　１０１２崩壊／分
）Ｃｐｌ　　　計数７分 Ｄａ　　　　ダルトン（ｇ１モル） ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 ＤＴＴ　　　ジチオトレイトール ＥＤＴ＾　　エチレンジアミン四酢酸 Ｅ、ｃｏｌｉ　　　　　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉＧ　　　グアニン ｇａｌに　　ガラクトキナーゼ ｋ　　　　Ｘ１０’ １　　　　リットル ＭＡＤ　　　ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド ＮＡＤＰ　　　ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチ
ドホスフェート ＰＥＧ　　　ポリエチレングリコール ｒｐ１　　　回転７分 ３秒 ＳＯ３ドデシル硫酸ナトリウム ■　　　チミン ■４　　　　バクテリオファージ１４ ■ＣＲテトラサイクリン抵抗性 ＴＥＨＥＤ　　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチ
レンジアミン Ｔｒｉｓ　　　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン ｔＲＮＡ　　　転移リボ核酸 Ｕ　　　酵素活性の単位 本発明の個々の切り口を示す図面を以下に説明する： 第１図：巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼ遺
伝子のＤＮＡ配列。

第２図：　ｐＪＨｌｌｌおよびｐＪＨ１１５の発現産生
物のアミノ酸配列。

第３図ニブラスミド・ベクターｐＪＨ１０７の制限地図
、明確に帰属され得る制限切断部位が示されている。パ
ラセンジャーＤＮＡの大きさは約５ａｏｏｂｐである。

プラスミド１）ＪＨ１０７は、Ｂａｌ′ｌＨＩ消化ＤＢ
Ｒ３２２と、染色体ＤＮＡおよびλＥｌ（ＢＬ−３フア
ージＤＮＡの５ａｕ３Ａ加水分解構築物から構築される
。

第４図ニブラスミド・ベクターｐＪＨ１０８の制限地図
、明確に帰属され得る切断部位のみが示されている。パ
ラセンジャーＤＮＡの大きさは約３０００ｂｐである。

プラスミドｐＪＨ１０８はｐＪＨ１０７（Ｓｐｈ■によ
り加水分解）およびｐＢＲ３２２の断片から構築される
。

第５図：　ｐＪＨｌｌｌからの１１２７ｂｐ断片の配列
決定を行うための手法、矢印は、各場合に同定される配
列の大きさを示す、プラスミドｐＪＨ１１１はｐＪＨ１
０８およびｐＢＲ３２２の旧ｎｄＩ［Ｉ消化断片から構
築される。

第６図ニブラスミド・ベクターｐＪＨ１１５の構築。

これはｐＨＲ１およびｐＪＨｌｌｌを旧ｎｄｌｌ［加水
分解後連結することにより構築される。

ｂｌａ　：β−ラクタマーゼ； ｇｄｈ　ニゲルコースＤＨ。

ｔｏ＝ターミネータ−； ｇａｌｋニガラクトキナーゼ； ０ＬＰＬ：プロモーター／オペレーター領域（λ旺プロ
モーター） Ｏｒｉ　　：複製開始点 第７図：　１１００ｂｐ断片に基づくグルコース叶（ａ
）と２１００ｂｐ断片に基づくグルコース叶（ｂ　。

既知配列）の間のタンパク配列比較、最初の４５アミノ
酸が示されている。

第８図工大腸菌Ｎ１００／ｐＲに２４８／ｐＪＨ１１５
の増殖・発現曲線（いずれも時間（時間単位）の関数と
しての５７８ｒ＋ｎにおける吸収および単位／ｎｊ）　
。

細菌の増殖は２０１」のＬＢ培地（実施例１参照）中２
８°で行われる。　０．５Ａ、７．−　Ｕの光学密度で
培養液を４２°の水浴に移し、ｌＡｓ７ｓ　　Ｕ菌体試
料を取り出しそして酵素活性を測定した。

第９図工大腸菌Ｎ１００／ｐＲに２４８／ｐＪＨ１１５
におけるグルコース・デヒドロゲナーゼの過剰産生。

１２．５％５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲルでのタンパ
ク分離。

トラック１：誘導前の菌体タンパク トラック２〜８：誘導後０．５．１〜５および１０時間 トラック９：サイズ標準 第１０図二巨大菌の染色体ＤＮＡをＤＪＨｌｌｌまたは
ｐＪ旧１５の放射性標識１１００ｂｐ　ＤＮＡ断片でハ
イブリダイズしたものの１２時間曝露後のオートラジオ
グラフ。

トラック１：染色体ＯＮ＾　（巨大筒）を旧ｎｄｎｌ加
水分解したもの。

トラック２：染色体ＤＮＡ　　（巨大筒）の未加水分解
物。

トラック３　：　５ＰＰ１ｆｌ長標準。

トラック４：次のものを各１０ｎｇ含む混合物：ｐＪＨ
１０８をＳａｌ　Ｉ加水分解したもの。

ｐＪＨ１０８をＳｐｈ　Ｉ加水分解したもの。

ｐＪＨｌｌｌを旧ｎｄｌ［加水分解したもの。

第１１図：　ｐＪＨ２１１の制限地図、制限分析に用い
られる切断部位のみ示されている。プラスミド＋）ＪＨ
２１１は、ｐＵｃ１８と旧ｎｄｌｌ（加水分解染色体Ｏ
Ｎ八から構築される。

第１２図：　ｐＪＨ２１５の制限地図、プラスミドＤＪ
Ｈ２１５はｐＪＨ２１１（旧ｎｄｌｌｌ加水分解物）と
１ｌＨ８１から構築される。諸記号は第６図と同様であ
る。

以下実施例を挙げて本発明を詳述する。全体にわたり温
度は摂氏温度である。

実施例１：大腸菌の培養 ａ）■量のプラスミドを調製するなめに、大腸菌を１ｊ
スケールで完全（ＬＢ）または最小（Ｈ９）培地で培養
する。このために１ｊの培地に５　ｎｊの定常期予備培
養液を接種し、そして３７℃で連続的に＠盪しながら、
約１８時間、定常増殖期に達するまで培養する。

ｂ）グルコース・デヒドロゲナーゼを過剰発現させるた
めに、２００　ｎｉｌのＬＢ培地に２８゛で増殖させた
一夜培養液２　Ｉｌｊを接種する０次にその細菌懸濁液
を０．５Ａｓｙｓ　　Ｕの光学密度に達するまで２８°
および１６０　ｒ、ｐ、ｍ、で培養する。

次にその培養容器を４２゛で更に１６時間インキュベー
トする。

ａ）　　ＬＢ培地： カゼイン（酵素的に加水 分解したもの）１０ｇ 酵母エキス　　　　　　　　　　　５ｇＮａＣ，ａ　　
　　　　　　　　　　　　　５　ｇ寒天（固体寒天）１
５ｇ （軟寒天）　　　　　　　　　　７．５ｇ二回蒸溜水　
　　　　　　　ａｄ　　１０００１ＪＩｌｌは１．０Ｎ
ＮａＯＨで７．４　ニｉ節する。

抗生物質を次の濃度で添加する： アンビシリン＝５０μｇ／ｌ」 テトラサイクリン：２０ｇｇ／ＩＪ ｂ）改変Ｍ９培地二 Ｈ９塩（１０倍濃縮液）　　　　　　　１０　ｎ１２０
％グルコース溶液　　　　　　５　ｎｊ１８　ＨＵＳＯ
４１ｒ＃１ １０％カゼイン加水分解物　　　　５　ｎｊチアミン溶
液（２■／　ｉｌｌ　）　　　　０．１　ｎｊ二回蒸溜
水　　　　　　　ａｄ　　１０００　ｎｊＣ）Ｍ９塩（
１０倍濃ｉａり： Ｎａ２ＨＰＯ４Ｘ２　Ｈ２Ｏ７５ｇ／ｊに８２　Ｐ　０
４　　　　　　　　　　　３０　ｇ　／　ｊＮＨ，ＣＩ
　　　　　　　　　　　　１０ｇ／ＪｌＮａＣ１５ｇ／
ｊ 実施例２：λファージの調製 ａ）　プレート・リゼート 比較的多数の組換えファージを低力価のファージ懸濁液
から調製するためにまずプレート・リゼートを調製する
。

このために、１００μｍ容中の１０’〜１０６フアージ
を宿主株大腸菌８１４５３９の一夜培養液１００μ」と
混合し、そして３７°で撹拌を施さずにインキュベート
しファージを吸着させる０次いで３　Ｉｊの４７〜５０
°の軟寒天を添加し、混合しそしてその混合物を固体寒
天プレート上に広げる。

３７°で１６時間インキュベートした後、軟寒天層を掻
き取る０次いで菌体破砕片を１０，０００ｒ、ｐ、ｎ＋
。

および４°で遠心分離する（１０分間）ことにより除去
する。上清を滅菌容器に移し、数滴のクロロホルムと混
合しそして４°で保存する。

ｂ）液体リゼート 液体リゼートにより調製スケールでファージが得られる
。

１０１１８８ｇＳＯ４および０．４％マルトースを含有
する２５　ｎＪの［Ｂ液体培地に宿主株大腸菌８８５３
９の一夜培養液を接種する。その懸濁液を３７°で通気
しながら約１．３Ａ、、　−Ｕに達するまでインキュベ
ートする０次に細菌に１０６フアージ／ｎｊを感染させ
、そして３７℃で撹拌を施すことなく１５分間吸着のな
めに放置する０次いでＩＪの３１℃の［Ｂ培地に感染し
た細菌を接種し、そしてその混合物をこの温度で通気し
ながら溶菌が起こるまでインキュベートする。溶菌が生
起すると５７８ｒ＋ｎにおける吸光度が急速に低下する
のでそれは分光光度法により追跡することができる。

５０００ｒ、ｐ、１．および４°で１５分間遠心分離す
ることにより細胞破砕片を除去後、ファージは水性上清
中に得ることができる。

実施例３：ベクターＤＮＡの単離 ａ）　ファージＤＮＡの単離 超遠心分離により精製されたファージの懸濁液ヲ２０ｎ
ＨＥＤＴＡ　、０．５　％　ＳＤＳニ調整し、そして５
０ｇｇ／ｌ」のプロティナーゼＫを添加後、５０”で１
時間インキュベートする０次にそれを等容のフェノール
で数回抽出し、そしてクロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２４：１）で数回抽出する。ＤＮＡを既知の方法
でエタノールを用いて沈殿させ、そして５，０００　ｒ
、ｐ、ｎ、で１０分間遠心分離することにより沈降させ
る６次いでそれを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、
そしてＷ％液液中とる。

ｂ）プラスミドの小規模（ミニ）調製 多数のプラスミドの分析を可能とするためにＢｉｒｎｂ
ｏｉｌｌ（ＢｉｒｎｂｏｉｎおよびＤｏｌｙ、１９７９
：　Ｎｕｃｌ。

ａｃｉｄ　Ｒｅｓ、ヱ、　１５１３Ｌ（ＩＩ’）迅速溶
菌法を用いる。

−夜培養液の菌体懸濁液サンプル１．５ｒＩｊｌを１５
．０ＯＯｒ、ｌ）、１．で１分間遠心分離することによ
り沈降させる。１００μｍの溶液Ａ（下記参照）を添加
後、その混合物を２０”で５分間インキュベートする０
次に２００μ」の溶液Ｂ（下記参照）を添加し、そして
容器を水中に入れる。更に５分後、溶液Ｃ（下記参照）
を添加し、そしてそれらサンプルを、染色体ＤＮＡ　、
　ＲＮＡおよびタンバクの不溶性コンプレックスが析出
するまで（２〜５分）水中に放置する。遠心分Ｍ（１５
分間）後、プラスミド含有上清を新しい１．５ｎｊ容プ
ラスチツク製エツペンドルフ管に稈す。

ＤＮＡを一２０°で１０分間エタノールを用いて沈殿さ
せ、そして１５分間遠心分離して沈降させる。

次にそれを７０％エタノールで２回洗浄しそして（デシ
ゲータ内で）乾燥する。

４０μ」の■［緩ＷＩ液（下記参照）にとった後、それ
は形質転換または制限分析に直接使用できる。

Ｂｉｒｎｂｏｉｌ溶液Ａ： ２５　ｌｌＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ　、　Ｉ）Ｈ８，０５０
１Ｈグルコース １０　ｒｔＨＥｆｌＴＡ Ｂｉｒｎｂｏｉｌ溶液Ｂ： ０．２　ＨＮａＯＨ １％５Ｏ３ Ｂｉｒｎｂｏｉｔ溶液Ｃ： ３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ／ＨＯＡｃ　、　Ｄｌｌ　４．８Ｔ
Ｅ緩衝液： １０　ｎＨＴｒｉｓ塩基 ｌ　　ｍＨｔｌｃｊ ｐＨ：８．０ Ｃ）プラスミドの単離調製 洗剤による限局プロトプラスト溶解により■量のプラス
ミドを調製する（Ｈａｒｄｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７９、　Ｊ、８ｉｏ１．Ｃｈｅｎ、　２５４．５５
２７−５５３４＞　。

実施例１で得られた細菌の懸濁液を５．００Ｏｒ、　Ｄ
、　１．および４°で２０分間遠心分離する。沈降物を
１５１ｊのスクロース溶液（５０ｎＨＴｒｉｓ−ＨＣＪ
！、ｐＨ８，０、中２５％スクロース）にとる、　３　
ｎｊの０．５ＨＥＤＴＡおよび３　ＩＩｊのリソチーム
溶液（５０１ＨＴｒｉｓ　−ＨＣｆｌ　、　ｐＨ８，０
、中２０ｑ　／ｉＪｌリソチーム〉を添加後、その混合
物を３０〜４０分間水中でインキュベートする０次に１
０％ポリエチレングリコールモノラウリルエーテル／１
０％デオキシコレートの２：１（ｖ／ｖ）混合物を２　
Ｉｊ添加する。菌体消化液を４０，０ＯＯｒ、ｐ、ｎ、
および４゛で遠心分！（３０分□）することにより清澄
化する。

清澄上清を傾瀉し、１００　、ＩＡ　ｇ／ｎＪ　　ＲＮ
ａｓｅ　Ａを添加し、そしてその混合物を４５分間水中
でインキュベートする。ＤＮＡを沈殿させるために、Ｒ
ＮａＳｅ−処理上清を１７２容の１．５ＨＮａｃＪｌ中
３０％ＰＥＧ６，０００と混合し、そして更に３０分間
水中に放置する。遠心分離を４°で２０分間、８．００
０ｒ、　Ｄ、　ＩＩで行う、その沈殿を５１１」のＴＥ
Ｗ衡液にとり、５０μｇ／１１プロテイナーゼＫを添加
し、そしてその混合物を３７°で６０分間インキュベー
トする。

次にそれをＴＥ飽和フェノールで数回、そしてクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２４：１）で数回抽出す
る。　ＤＮＡをエタノールで沈殿し、洗浄しそして乾燥
する。その沈降物を１〜２ｎ＋ｊのＴＥＮ　Ｉ液に溶解
し、そしてプラスミド収率を２６０ｒ＋ｎで分光光度測
定法により測定する。

実施例４ニゲルコース叶産生巨大菌からの染色体ＤＮＡ
の調製 完全培地中で増殖させた定常期培養液１００ｎｊｌから
の細菌菌体を５．００Ｏｒ、ｇ、ｒｅ、、４°で１０分
間沈降させる６次に沈降物を１０１１の溶菌綬街液（５
０ｎＨＮａＣＪ　　、５０　　ｌ１４　　ＥＤＴＡ、３
０　　ｎ）４　　Ｉｒ１ｓ−ＨＣ，Ｑ　　、ｐＨ７，９
）にとり、４０■のリソチームを添加し、そしてその混
合物を３７°で４５分間インキュベートする。その懸濁
液をＳＯ３濃度が１％となるよう調整し、５■の１０テ
イナーゼＫを添加し、そしてその混合物を更に３０分間
３７°に放置する。

次にそれをＴＥ飽和フェノールで数回、そしてクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２４；１）で数回抽出す
る。常法により、核酸を沈殿させ、洗浄しそして乾燥す
る。

なおも存在するＲＮＡを加水分解するために、沈降物を
５１１ｊのＴＥ綬街液中に注意深く再懸濁し、１０μｓ
　／ｍｊのＲＮａｓｅを添加し、そしてその混合物を３
７°で３０分間インキュベートする。

次にその溶液をＳＯ３濃度が１％、プロテイナーゼに濃
度が５０μｇ　／ｎｊとなるように調節し、そして３７
°で更に３０分間処理する０次に、それを前述の如くフ
ェノール、およびクロロホルム／イソアミルアルコール
で抽出し、そしてＴＥ［街液に対して透析する。この方
法による染色体収量は２〜４■である。

実施例５　：　ＤＮＡの連結 隣接３°−ヒドロキシルおよび５゛−ホスフェート基間
のホスホジエステル結合の形成はＴ４　ＯＮ＾リガーゼ
により触媒される。

反応はＴ４　ＤＮＡリガーゼＭ衝液中、挿入されるべき
ＤＮＡをベクターＤＮＡに対して５倍過剰に用いて行う
、容量は２０μ」である。

突出一本鎖端を有するＤＮＡ断片に対しては、連結を４
°でＤＮＡ　１μｇあたりＩＵの酵素を用いて４〜１６
時間行う、二本鎖末端の結合は２０゜でＤＮＡ　１μｇ
あたりＩＯＵの酵素を用いて４時間行う。

次にその反応混合物を直接形質転換に用いる（実施例６
参照）。

Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼｙ１街液：　０．４　ｎＨ＾ＴＰ
６６ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　　ｐＨ７，６６，６ｌＨ
ｈＣＪ□ １０　ｎｔ４０ＴＴ 実施例６：大腸菌の形質転換（塩化カルシウム法） ａ）能力大腸菌菌体の調製 大腸菌菌体を光学密度が約０．５　Ａｓｙａ　　Ｕに達
するまで２０　ｌ１ｉｌのＬＢ培地で培養する。その懸
濁液を予冷されな遠沈管に移し、次いで水中に１０分間
入れる。細菌を８，０００　ｒ、ｐ、ｎ＋、、４°テ１
゜分間沈降させる。上清を傾瀉後、菌体を２０　ｍＮの
水冷０．ＩＨＨＱＣｊ２　　溶液で洗浄しそして前述の
如く遠心分離する０次にそれらを１１の水冷０、ＩＨＣ
ａＣＪ１２　　溶液にとり、そして少くとも２時間水中
に放置する。

ｂ）能力大腸菌菌体の形質転換 形質転換を行うために、２００μｍの有能菌体を５０ｎ
ｇのプラスミドＤＮＡと混合し、そして３０分間水中に
置く６次いでその混合物を水浴（４２°）で２分間加熱
する（ヒートパルス）、１１ｍＪの［Ｂ培地添加後、そ
の混合物を３７゛で１時間インキュベートする（リカバ
リー・フェーズ）。

この細菌懸濁液の２００μ」サンプルを次に選択栄養培
地にプレート・アウトする。それらプレートを３７℃に
１６〜２４時間インキュベートする。

感熱性大腸菌株Ｎ１００ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓの形質転
換には、すべてのインキュベーション工程を２８°に行
う、ヒートパルスは３４°、５分間で有効である。

実施例７　：　ＤＮＡの放射性標識 １０’　ｃｐｉ　／μｇより大きい比活性を有する放射
性像ｍ　ＤＮＡ断片を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■を用
いてαゝ２Ｐ−デオキシヌクレオチドの存在下に修復合
成にツクトランスレーション）により調製する。

混合物： ０．２μＱのＤＮＡ ２μｍの１０ｘ　ＤＮＡポリメラーゼＭ街液各１μｍの
１．２ｎＨｄＮＴＰ類（ヌクレオチド１〜５μｍのα３
２Ｐ−ｄＮＴＰ　（３，０００Ｃｉ／ミリモル、１０μ
Ｃｉ／μｍ）　（ヌクレオチド４）０．５μｊのＤＮａ
ｓｅ　Ｉ　（６０Ｄｏ／μｊ　）２０’で１分間反応さ
せ、そして１０ＵのＤＮＡポリメラーゼ■を添加する。

１０ＸＤＮＡポリメラーゼ緩衝液： ５００　ＩＨＴｒｉｓ−１１ｃｊ　、　ｐｔｌ　７．８
ＳＯＩＩＨＨｑＣ６２ １００ｎＨβ−メルカプトエタノール ０．０５％　ＢＳＡ 反応は、ＤＮＡポリメラーゼＩを添加後１４゛で２〜４
時間行い、そして２０μｍの６０　ｉＨＥＤＴＡ、ｐＨ
８，０、で止める。容量を次いでＨ２Ｏを用いて１００
μｍまで増量する。

未反応ヌクレオチドを除去するために、サンプルを１０
０μ」の５Ｍ酢酸アンモニウム溶液および４００μｍの
無水エタノールと混合し、そして液体窒素中で２分間凍
結する０次に放射性標識ＤＮＡ断片をベンチ遠心分離器
で１５分間沈降させ、７０％エタノールで洗浄しそして
乾燥する。

未反応ヌクレオチドは上清に残る。

ＤＮＡを１００μｓのＨ２Ｏにとり、次いでハイブリダ
イゼーション実験に用いる。

実施例８：フィルター結合ＤＮＡのハイブリダイゼーシ
ョン フィルター結合ＤＮＡのハイブリダイゼーションを５０
％ホルムアミド含有溶液中で行う、非特異的結合部位を
ブロックするために、ＤＮＡ断片テ被覆されたニトロセ
ルロースフィルターをそれらを覆うプレハイブリダイゼ
ーション溶液と共に気泡を入れずにプラスチックフィル
ム中にシールし、そして４２°で３時間インキュベート
する。

プレハイブリダイゼーション溶液： ５０％　ホルムアミド ５Ｘ　濃デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）溶液５×　
濃ＳＳＣ＜下記参照） ０．５％　５Ｏ３ １００μｇ／Ｉｌｊ　　酵母ｔＲＮＡ デンハルト溶液： ０．０２％　ＢＳＡ ０１０２％　ポリビニルピロリドン ０．０２％　フィコール（ポリスクロース）ＳＳＣ： １５０ｎＨＮａＣＪｌ １５ｉＭ　　クエン酸ナトリウム、Ｉ）Ｈ７，２ハイブ
リダイゼーシヨンには、まず、放射性標識二本Ｑ　ＤＮ
Ａプローブを８０゛で１０分間加熱することにより変性
し、次いで直ちに水冷する。

次いで核酸（この段階では一本鎖の形になっている）を
２０〜２０１ｊに移す、これを用いてプレハイブリダイ
ゼーション溶液と差し換え、そして更に２０時間４２°
でインキュベートする。

ハイブリダイゼーション溶液： ５０％　ホルムアミド ５×　濃デンハルト溶液 ５Ｘ　濃５ＳＣ ０，５％　５Ｏ３ １０ｎＨＥＤＴＡ ｉｏｏμｇ　／ｎｊ　　酵母ｔＲＮＡ １０’　ｃｐｎ／　ｎｊ　　放射性標識ＤＮＡ非特異的
に結合したＤＮＡを除去するために、ハイブリダイゼー
ション後、フィルターをまず２００　ｎｊの２Ｘ濃ＳＳ
Ｃ、０，１％ＳＯ３を用いて２０°で数回、次いで１０
％ＳＳＣ、０，１％ＳＤＳを用いて４２９で数回洗浄す
る。

実施例９ニゲルコースＤＨの酵素アッセイこのアッセイ
のために、非螢光性クロマトグラフィ紙に９２１１のイ
ンジケーター溶液を一様に噴震し、次いで２０”で乾燥
する。

インジケーター溶液： ６０．５　ｉＪの燐酸ナトリウム緩衝液（０，１２Ｍ　
：ＤＨ７，６） ３０　ｍｊのＤ−グルコース溶液（１０％Ｗ／Ｖ）１□
！ｌ＋ｎ、ｌｌのＮＡＤ＋溶液（７０■／１１）酵素ア
ッセイを行う前に、調製されたクロマトグラフィ紙を栄
養培地プレート（直径約８個）の正しいサイズに合わせ
て切断する。

ファージ溶菌液に対するアッセイを行うために、容易に
肉視できるプラーク（６００〜８００／プレート）の形
成直後に、プレートをインキュベーターから取り出す、
まずベトリ皿をラベルし、そして同様にマークされたア
ッセイ・フィルターを置いてきちっとカバーする。２分
後それらを取り出し、熱空気流中で乾燥し、次いで波長
３６６　ｎｎの光の下で検査する。活性グルコースＤＨ
がアッセイ・フィルター上に移っていれば、その場合に
はこれらの場所でＮＡＯ＋は螢光により明確に検出され
得るＮＡＤＨに還元することができる６次にフィルター
・ラベルを用いて栄養培地プレート上の陽性ファージ・
クローンを同定し単離する。

細菌クローンに対するアッセイを行うために、菌体を同
じ方法で２個の栄養培地プレートに移す（１００〜２０
０コロニー／プレート）、それら、プレートのうちの一
つを基準プレート（「マスタープレート」）とし、他を
酵素アッセイに用いる。これは細菌をアルミ箔に移し、
そして約５μｍの消化溶液を各コロニーにピペットで注
ぐことにより行われる。溶菌させるために、菌体をモイ
スチャー・チェンバー（ｎｏｉｓｔｕｒｅ　ｃｈａ−ｎ
ｂｅｒ）内で２０”で３０分間インキュベートする。

次いで前述の如く、テスト・フィルターを載せ、乾燥し
、そして酵素反応の位置を同定する。基準プレート上で
の対応する陽性細菌は次いでプラスミド単離に用いるこ
とができる（実施例３参照）。

消化溶液： １００　ｎＨ燐酸ナトリウムＭＩｌｒ液、ｐＨ６，５２
０ｎＨＥＤＴＡ ５■／１ｊ！　　リソチーム 活性は分光光度計で２５°で測定する。

アッセイ溶液： １２０　ｎＨ燐酸ナトリウム緩衝液、Ｉ）Ｈ７，６１０
０１１Ｈグルコース ２ｎＨＮＡＤ＋ 酵素活性（Ｕ／ＩＩＪＩ）は１分間あたり転化される基
質量（μモル）として報告される。

実施例１０：大腸菌Ｎ１００１０Ｒに２４８／ＤＪ旧１
５で発現されたグルコースＤＨの調製 １０ｊ容実験室用発酵槽に７．５１のＬ８培地を装填し
、滅菌後、過剰生産株の定常期培養液２００ｎＪで接種
する。菌体を２８°で通気しながら培養する。光学密度
が約０．５Ａｓｙａ　　Ｕに達した後、温度を４２゛に
上げ、そして培養液を更に５時間通気しながらインキュ
ベートする。

グルコース叶を調製するために、細菌（湿潤量的１０ｇ
　＞を沈降させた後、４″で等量のアルミナと共に、乳
鉢内で磨砕することにより破砕する。　１２．５１ｕの
ＰｓｏＭＩｔ液（５０＋Ｈ燐酸カリウム、ｐＨ６，５；
　０．Ｉ　ｎ＋８２−メルカプトエタノール；２ｕｇの
フェニルメチルスルホニルフルオライド）および５０Ｈ
ｇのＤＮａｓｅ　Ｉを添加後、その混合物を４°で１時
間インキュベートする。

アルミナを８．００Ｏｒ、ｐ、＋ａ、および４°で遠心
分離することにより除去する。水性上清を次いで１５．
０ＯＯｒ、　Ｉ）、ｌ’１．および４°で３０分間遠心
分離することにより清澄化する。

その菌体破砕溶液を次いでＩ　ＱＱｎｊのＰ５゜緩衝液
と混合し、そしてＤＥ−５２カラムに吸着する。

１００ＩＩｊのＰ、Ｊ！衝液で洗浄後、Ｐ、、Ｍ衝液中
０．０５〜０．５８　ＫＣＪの直線濃度勾配を用いてタ
ンパクを溶出し、そして各５　ｎｊ画分として集める。

溶出量は１ｊである。溶出プロフィールを作るために、
個々の両分中の２８０　ｎ１１における吸収およびグル
コース叶活性を測定する。

タンパク精製結果を次表にまとめる。

グルコースＯＨの 比活性　総タンパク　　比活性 精　　　　　　　　　Ｕ　　　　　　　　　　　　　　
　Ｕ細菌破砕５２８００　　１１３０　　　４６．７硫
酸アンモ　４９５００　　１０００　　　　４９．５ニ
ウム沈殿 ＤＥ−５２カラ　　６８８０　　２９．４　　　　　２
３４ム（画分 酵素の均質度をチェックするために、サンプルを１２．
５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析する。

【図面の簡単な説明】

第１図は巨大面からのグルコース・デヒドロゲナーゼ遺
伝子のＤＮＡ配列である。 第２図はＤＪＨｌｌｌおよびｐＪＨ１１５の発現産生物
のアミノ酸配列である。 第３図はプラスミド・ベクターｐＪＨ１０７の制限地図
である。 第４図はプラスミド・ベクターｐＪＨ１０８の制限地図
である。 第５図はＤＪ旧１１からの１１２７ｂｐ断片の配列決定
を行うための手法を示す図である。 第６図はプラスミド・ベクターｐＪ１１１１５の構築を
示す図である。 第７図は１１００ｂｐ断片に基づくグルコースＤＨ（ａ
）と２１００ｂｐ断片に基づくグルコースＤＨ（ｂ；既
知配列）の間のタンパク配列比較を示す図である。 第８図は大腸菌８１００／ｐＲに２４８／ｐＪＨ１１５
の増殖・発現曲線である。 第９図は大腸菌８１００／Ｉ）Ｒに２４８１０ＪＨ１１
５におけるグルコース・デヒドロゲナーゼの過剰産生を
示す図面に代る写真である。 第１０図は巨大面の染色体ＤＮＡをｐＪＨｌｌｌまたは
０ＪＨ１１５ノ放射性標識１１００ｂｌ）　ＤＮＡＩＪ
ｉ片でハイブリダイズしたものの１２時間［１ｇ　後の
オートラジオグラフを表わす図面に代る写真である。 第１１図はｐＪｌ１２１１の制限地図である。 第１２図はｐＪ）１２１５の制限地図である。 特許出願人　メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミツ
ト・ベシュ レンクテル・ハツシング ＦＩＧ、Ｉ ＴＡＣ−ＣＣＴ−ＴＣＴ−ＴＴＣ−ＣＡＡ−ＧＣＡ−Ｇ
ＧＡ−ＡＧＡ−（Ｘ；Ｃ−ＴＡＡ−ＴＡＧＦＩＧ、２ Ｖａｌ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−＾
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ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−４１
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）組換えＤＮＡで形質転換された微生物宿主生物を栄
   養培地中で培養しそしてその発現によって産生されたポ
   リペプチドを単離することによりグルコース・デヒドロ
   ゲナーゼを製造する方法であって、巨大菌（Ｂａｃｉｌ
   ｌｕｓ　ｍｅｇａ−ｔｅｒｉｕｍ）のゲノムから単離さ
   れかつ酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの生物活性を
   有するポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む宿主
   生物を用いることを特徴とする前記方法。 ２）請求項４に記載のＤＮＡ配列を有する宿主生物を用
   いる請求項１記載の方法。 ３）形質転換される宿主生物として大腸菌を用いる請求
   項１または２のいずれかに記載の方法。 ４）酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの生物活性を有
   するポリペプチドをコードする下記に示すＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 ５）微生物、特に巨大菌、のゲノムを起源とする請求項
   ４記載のＤＮＡ配列。 ６）請求項４または５に記載のＤＮＡ配列またはグルコ
   ース・デヒドロゲナーゼをコードする他の配列とハイブ
   リダイズするか、またはこれらＤＮＡ配列に対し突然変
   異により関連付けられ、そして酵素グルコース・デヒド
   ロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチドをコードす
   ることを特徴とするＤＮＡ配列。 ７）請求項４〜６のいずれかに記載のＤＮＡ配列、また
   はグルコース・デヒドロゲナーゼをコードする他のＤＮ
   Ａ配列を含有し、そして少くとも一つの発現調節系と機
   能的に組み合わせられたＤＮＡ分子。 ８）発現調節系が大腸菌および／または巨大菌からのプ
   ロモーターを含む請求項７記載の ＤＮＡ分子。 ９）ｐＪＨ１１１の呼称およびＤＳＭ４０５２Ｐの受託
   番号を有する、請求項４に記載のＤＮＡ配列および巨大
   菌プロモーター系を含むプラスミドおよびその突然変異
   体。 １０）ｐＪＨ１１５の呼称およびＤＳＭ４０５１Ｐの受
   託番号を有する、請求項４に記載のＤＮＡ配列および巨
   大菌プロモーター系を含むプラスミドおよびその突然変
   異体。 １１）請求項７〜１０のいずれかに記載の少くとも一つ
   の組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを含む、形質転換
   宿主生物。 １２）大腸菌である請求項１１記載の宿主生物。 １３）大腸菌Ｎ１００／ｐＲＫ２４８／ｐＪＨ１１５の
   呼称およびＤＳＭ４０４７の受託番号を有するプラスミ
   ドｐＪＨ１１５、および／またはこのプラスミドの突然
   変異体を含む、請求項１２記載の宿主生物。 １４）酵素グルコース・デヒドロゲナーゼの生物活性を
   有し、アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を有するポリペプチド。 １５）請求項５に記載のＤＮＡ配列によりコードされる
   かまたは請求項６に記載のＤＮＡ配列とハイブリダイズ
   するかまたは突然変異により関係付けられるＤＮＡ配列
   によりコードされることを特徴とする酵素グルコース・
   デヒドロゲナーゼの生物活性を有するポリペプチド。 １６）請求項１４記載のポリペプチドを用いることを特
   徴とするグルコースの酵素的測定方法。