JPS594115B2 - 新核酸分解酵素及びその製造法 - Google Patents
新核酸分解酵素及びその製造法Info
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- JPS594115B2 JPS594115B2 JP56033321A JP3332181A JPS594115B2 JP S594115 B2 JPS594115 B2 JP S594115B2 JP 56033321 A JP56033321 A JP 56033321A JP 3332181 A JP3332181 A JP 3332181A JP S594115 B2 JPS594115 B2 JP S594115B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子内の塩基配
列を認識し、ＤＮＡ鎖の特定の部位を切断して特定のＤ
ＮＡ断片を生成する基質特異性を有するエンドヌクレア
ーゼ（Ｂｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ）型新核酸分解酵素
Ａ及びその製造法に関するものである。
列を認識し、ＤＮＡ鎖の特定の部位を切断して特定のＤ
ＮＡ断片を生成する基質特異性を有するエンドヌクレア
ーゼ（Ｂｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ）型新核酸分解酵素
Ａ及びその製造法に関するものである。
本発明において、エンドヌクレアーゼ型新核酸分解酵素
Ａとは、後述の理化学的性質における作用及び基質特異
性を有する本発明の酵素を呼称する。
Ａとは、後述の理化学的性質における作用及び基質特異
性を有する本発明の酵素を呼称する。
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）を分解する酵素（ＤＮａ
ｓｅ ）は、生物の各種材料に存在し、ＤＮＡの代謝、
分解、合成、組換えなどの生命現象の重要な過程に関与
しており、近年、特にその酵素化学的特性や生物学的機
能が重要視されるようになっている。
ｓｅ ）は、生物の各種材料に存在し、ＤＮＡの代謝、
分解、合成、組換えなどの生命現象の重要な過程に関与
しており、近年、特にその酵素化学的特性や生物学的機
能が重要視されるようになっている。
一方、遺伝子ＤＮＡの構造と機能を研究するために、特
異的な作用をもつ酵素を産生分離し、これを生化学試薬
として、特に遺伝子の人工変換手段として利用し、生物
の育種改良を行うことが極めて重要視されてきている。
異的な作用をもつ酵素を産生分離し、これを生化学試薬
として、特に遺伝子の人工変換手段として利用し、生物
の育種改良を行うことが極めて重要視されてきている。
ＤＮＡ分解酵素は、その作用様式からエキソヌクレアー
ゼとエンドヌクレアーゼに大別されている。
ゼとエンドヌクレアーゼに大別されている。
前者はＤＮＡ分子のポリヌクレオチド鎖にその末端から
作用し、逐次ヌクレオチドを遊離してポリヌクレオチド
鎖を分解する型の酵素であり、後者は、ＤＮＡ分子内の
ホスホジエステル結合を切断してＤＮＡ断片、或いはオ
リゴヌクレオチドを生成する型の酵素である。
作用し、逐次ヌクレオチドを遊離してポリヌクレオチド
鎖を分解する型の酵素であり、後者は、ＤＮＡ分子内の
ホスホジエステル結合を切断してＤＮＡ断片、或いはオ
リゴヌクレオチドを生成する型の酵素である。
近年、エンドヌクレアーゼ型の酵素の研究分野において
、ＤＮＡの構造、特にヌクレオチド配列や天然に存在し
、或いは人工的に導入された構造変化に特異性を示す酵
素、特定の生物種のＤＮＡを認識して作用する酵素、ま
た生物学的に重要な機能を有する酵素の研究が進んでい
る（安藤忠彦：化学と生物、１３巻、６号、３４２；１
９７５参照）。
、ＤＮＡの構造、特にヌクレオチド配列や天然に存在し
、或いは人工的に導入された構造変化に特異性を示す酵
素、特定の生物種のＤＮＡを認識して作用する酵素、ま
た生物学的に重要な機能を有する酵素の研究が進んでい
る（安藤忠彦：化学と生物、１３巻、６号、３４２；１
９７５参照）。
本発明者は、一連の研究による酵素の製造法として、２
本鎖ＤＮＡに作用せず、１本鎖ＤＮＡを特異的に分解す
る酵素をアスペルギルス・オリゼ−（Ａｓｐｅｒｇｌｌ
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ ）の培養物から製造する方法（特
許第５９３３６８号）、ＤＮＡ分子内のプリン−プリン
結合を優先的に分解する酵素をアスペルギルス・オリゼ
ーの菌体から製造する方法（特許第６２１２０５号）、
バクテリオファージ感染を受けた大腸菌からＤＮＡに切
れ目を入れる酵素を製造する方法（特許第７６４９１９
号）、バクテリオファージの感染或いは誘発によって大
腸菌からＲＮＡに作用してヌクレオシド環状酸を製造す
る方法（特許第８２９３３４号）、ＤＮＡ分子内のグア
ニン−グアニン結合を優先的に分解する酵素を好アルカ
リ性細菌の培養液から製造する方法（特許第８３１１７
１号）、ＤＮ、Ａと２本鎖構造を形成するＲＮＡを特異
的に分解する酵素を枯草菌菌体から製造する方法（特許
第８７７６６８号）及び特定の生物種のＤＮＡを認識し
てＤＮＡ分子内の特定の部位で切断し、特定の大きさの
ＤＮＡ断片を生成する特性を有する３種のエンドヌクレ
アーゼ型のＤＮＡ分解酵素をバチルス属に属する有胞子
好気性桿菌菌体から製造する方法（特許１００８４１６
号）などの研究を行い、それぞれの製造法をすでに確立
した。
本鎖ＤＮＡに作用せず、１本鎖ＤＮＡを特異的に分解す
る酵素をアスペルギルス・オリゼ−（Ａｓｐｅｒｇｌｌ
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ ）の培養物から製造する方法（特
許第５９３３６８号）、ＤＮＡ分子内のプリン−プリン
結合を優先的に分解する酵素をアスペルギルス・オリゼ
ーの菌体から製造する方法（特許第６２１２０５号）、
バクテリオファージ感染を受けた大腸菌からＤＮＡに切
れ目を入れる酵素を製造する方法（特許第７６４９１９
号）、バクテリオファージの感染或いは誘発によって大
腸菌からＲＮＡに作用してヌクレオシド環状酸を製造す
る方法（特許第８２９３３４号）、ＤＮＡ分子内のグア
ニン−グアニン結合を優先的に分解する酵素を好アルカ
リ性細菌の培養液から製造する方法（特許第８３１１７
１号）、ＤＮ、Ａと２本鎖構造を形成するＲＮＡを特異
的に分解する酵素を枯草菌菌体から製造する方法（特許
第８７７６６８号）及び特定の生物種のＤＮＡを認識し
てＤＮＡ分子内の特定の部位で切断し、特定の大きさの
ＤＮＡ断片を生成する特性を有する３種のエンドヌクレ
アーゼ型のＤＮＡ分解酵素をバチルス属に属する有胞子
好気性桿菌菌体から製造する方法（特許１００８４１６
号）などの研究を行い、それぞれの製造法をすでに確立
した。
一方、ＤＮＡの一次構造（塩基配列）や高次構造の特徴
を認識して作用するＤＮＡ分解酵素の研究は、近年、Ｄ
ＮＡの複製、組換え、損傷の修復、制限修飾などの細胞
内における重要な過程における機能を解明する方向と、
ＤＮＡの構造解析、ＤＮＡ分子内の特定領域を欠失した
変異株の作製、試験管内での組換えＤＮＡ技術などに活
用される酵素を探索しこれを利用する方向とにおいて研
究が発展しつつある。
を認識して作用するＤＮＡ分解酵素の研究は、近年、Ｄ
ＮＡの複製、組換え、損傷の修復、制限修飾などの細胞
内における重要な過程における機能を解明する方向と、
ＤＮＡの構造解析、ＤＮＡ分子内の特定領域を欠失した
変異株の作製、試験管内での組換えＤＮＡ技術などに活
用される酵素を探索しこれを利用する方向とにおいて研
究が発展しつつある。
ＤＮＡ分子内の特定の塩基配列を認識し、その配列内或
いはその近傍でＤＮＡを切断して特定のＤＮＡ断片を生
成する酵素（５ｉｔｅ ５ｐｅｃｉｆｉｃｅｎｄｏｎｕ
ｃｌｅａｓｅ ）として、原核生物における制限、修飾
に関与する制限酵素（■型）や、これに類似する作用特
性を有する多種の酵素が発見され、その多くが分離され
ている〔安藤忠彦＝「制限酵素」化学と生物、１７（５
）３１１（１９７９）；安藤忠彦：「制限酵素とは何か
一制限酵素の特異性とその利用−」化学、ザ（１）２０
（１９８０）参照〕。
いはその近傍でＤＮＡを切断して特定のＤＮＡ断片を生
成する酵素（５ｉｔｅ ５ｐｅｃｉｆｉｃｅｎｄｏｎｕ
ｃｌｅａｓｅ ）として、原核生物における制限、修飾
に関与する制限酵素（■型）や、これに類似する作用特
性を有する多種の酵素が発見され、その多くが分離され
ている〔安藤忠彦＝「制限酵素」化学と生物、１７（５
）３１１（１９７９）；安藤忠彦：「制限酵素とは何か
一制限酵素の特異性とその利用−」化学、ザ（１）２０
（１９８０）参照〕。
しかしながら、真核生物においては、前記の型の酵素の
存在は全く認められていなかった。
存在は全く認められていなかった。
本発明者は、各種微生物のうちで真核生物に属する各種
酵母類について前記特異的作用を有する新規なりＮＡ分
解酵素の研究を鋭意行った結果、サツカロミセス・ウバ
ルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、
サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）などのサツカロミセス
属に属する酵母及びピヒア・メンプラナファシェンス（
Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂ ｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ ）
などのピヒア属に属する酵母などの有胞子酵母類（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の菌体の無細胞抽
出液から、ＤＮＡ分子内の特定の塩基配列を認識し、Ｄ
ＮＡ鎖の特定の部位を切断して特定のＤＮＡ断片を生成
する基質特異性を有する新規な核酸分解酵素Ａを分離、
採取することに成功し、その製造法を確立してこメに本
発明を完成するに至った。
酵母類について前記特異的作用を有する新規なりＮＡ分
解酵素の研究を鋭意行った結果、サツカロミセス・ウバ
ルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、
サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）などのサツカロミセス
属に属する酵母及びピヒア・メンプラナファシェンス（
Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂ ｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ ）
などのピヒア属に属する酵母などの有胞子酵母類（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の菌体の無細胞抽
出液から、ＤＮＡ分子内の特定の塩基配列を認識し、Ｄ
ＮＡ鎖の特定の部位を切断して特定のＤＮＡ断片を生成
する基質特異性を有する新規な核酸分解酵素Ａを分離、
採取することに成功し、その製造法を確立してこメに本
発明を完成するに至った。
本発明のエンドヌクレアーゼ型新核酸分解酵素Ａは、前
述の如く、遺伝子ＤＮＡの構造と機能を研究するための
生化学試薬として用いられる他、生物の育種改良を目的
とする遺伝子の人工変換に広く利用し得るものである。
述の如く、遺伝子ＤＮＡの構造と機能を研究するための
生化学試薬として用いられる他、生物の育種改良を目的
とする遺伝子の人工変換に広く利用し得るものである。
以下に、本発明のエンドヌクレアーゼ型新核酸分解酵素
Ａ及びその製造法について詳述する。
Ａ及びその製造法について詳述する。
まず、本発明方法において用いる微生物は、有胞子酵母
類（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のサツカ
ロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）属またはピ
ヒア（Ｐｉｃｈｉａ ）属に属し、且つ本発明の酵素の
生産能を有する菌種であり、例えばサツカロミセス属に
属する菌種としては、サツカロミセス・ウバルム・ペイ
シュリンク（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕ
ｍ Ｂｅ１ｊｅｒｉｎｃｋ ）、サツカロミセス・セレ
ビシェ−・ハンセン／Ｉ６．１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ Ａ １
）及びサツカロミセス・セレビシェ−・ハンセンＡ２
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｈａｎｓｅｎ Ａ２ ）など、又ピヒア属に属する菌
種としては、ピヒア・メンプラナファシェンス・ハンセ
ン（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂ −ｒａｎａｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｈａｎｓｅｎ ）を挙げることができる。
類（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のサツカ
ロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）属またはピ
ヒア（Ｐｉｃｈｉａ ）属に属し、且つ本発明の酵素の
生産能を有する菌種であり、例えばサツカロミセス属に
属する菌種としては、サツカロミセス・ウバルム・ペイ
シュリンク（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕ
ｍ Ｂｅ１ｊｅｒｉｎｃｋ ）、サツカロミセス・セレ
ビシェ−・ハンセン／Ｉ６．１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ Ａ １
）及びサツカロミセス・セレビシェ−・ハンセンＡ２
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｈａｎｓｅｎ Ａ２ ）など、又ピヒア属に属する菌
種としては、ピヒア・メンプラナファシェンス・ハンセ
ン（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂ −ｒａｎａｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｈａｎｓｅｎ ）を挙げることができる。
例示の前記微生物は、いずれも東京大学応用微生物研究
所（ＩＡＭ）の保存菌株であり、それぞれＩＡＭ４２０
６．ＩＡＭ４２７４．ＩＡＭ４５１２及びＩＡＭ４９８
６としてＪＦＣＯカタログに記載され、伺人も入手可能
である〔添付参考資料Ｉ（Ｊ Ｆ ＯＣｔ ｃａｔａｌ
ｏｇｕｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｓ （１９７９）第２
５０頁、第２６９〜２７０頁及び第２８１頁）参照〕。
所（ＩＡＭ）の保存菌株であり、それぞれＩＡＭ４２０
６．ＩＡＭ４２７４．ＩＡＭ４５１２及びＩＡＭ４９８
６としてＪＦＣＯカタログに記載され、伺人も入手可能
である〔添付参考資料Ｉ（Ｊ Ｆ ＯＣｔ ｃａｔａｌ
ｏｇｕｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｓ （１９７９）第２
５０頁、第２６９〜２７０頁及び第２８１頁）参照〕。
また、前記微生物のうち、サツカロミセス・ウバルム・
ペイシュリンクは、米国寄託機関のジ・アメリカン・タ
イプカルチュア・コレクション（Ｔｈｃ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）の保存菌株であり、ＡＴＣＣ９０８０としてＡＴＣ
Ｃ！カタログに記載されている〔添付参考資料■（Ｔｈ
ｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ 。
ペイシュリンクは、米国寄託機関のジ・アメリカン・タ
イプカルチュア・コレクション（Ｔｈｃ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）の保存菌株であり、ＡＴＣＣ９０８０としてＡＴＣ
Ｃ！カタログに記載されている〔添付参考資料■（Ｔｈ
ｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ 。
ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ（１９７４
）第１１版、第２３１頁）参照〕。
）第１１版、第２３１頁）参照〕。
また、前記微生物は、いずれも工業技術院微生物工業技
術研究所に昭和５６年３月６日付寄屁され、その微生物
受託番号は、サツカロミセス・ウバルム・ペイシュリン
ク、サツカロミセス・セレビシェ−・ハンセンＡ６１
、サツカロミセス・セレビシェ−・ハンセン７ｇ６２及
びピヒア・メンプラナファシェンス・ハンセンがそれぞ
れ第５９０２号、第５８９８号、第５８９９号及び第５
９００号である。
術研究所に昭和５６年３月６日付寄屁され、その微生物
受託番号は、サツカロミセス・ウバルム・ペイシュリン
ク、サツカロミセス・セレビシェ−・ハンセンＡ６１
、サツカロミセス・セレビシェ−・ハンセン７ｇ６２及
びピヒア・メンプラナファシェンス・ハンセンがそれぞ
れ第５９０２号、第５８９８号、第５８９９号及び第５
９００号である。
次に、本発明方法における微生物の培養方法は、一般の
培養方法に準じて行うことができ、例えばアミノ酸、カ
ゼイン分解物、ブドウ糖などを含有する液体培地に前記
微生物を接種して約３０〜３７℃で１５〜２０時間通気
培養（前培養）し、更に２０倍容の同一培地に接種して
３０℃、８時間、通気攪拌培養後、遠心分離により集菌
し、フレンチプレス法によって菌体細胞を破砕して無細
胞抽出液を調製する。
培養方法に準じて行うことができ、例えばアミノ酸、カ
ゼイン分解物、ブドウ糖などを含有する液体培地に前記
微生物を接種して約３０〜３７℃で１５〜２０時間通気
培養（前培養）し、更に２０倍容の同一培地に接種して
３０℃、８時間、通気攪拌培養後、遠心分離により集菌
し、フレンチプレス法によって菌体細胞を破砕して無細
胞抽出液を調製する。
この無細胞抽出液から、ポリミンＰ処理によって核酸画
分を沈澱除去した後、硫酸アンモニウム分画ならびにホ
スホセルロース・カラムクロマト法、ＤＥＡＥ−セルロ
ース・カラムクロマト法等のイオン交換クロマト法及び
ゲル沖過法、又はこれらの組合せによりエンドヌクレア
ーゼ型新核酸分解酵素Ａを分離、精製して採取すること
ができる（以下、本発明のエンドヌクレアーゼ型新核酸
分解酵素Ａを「本酵素」という。
分を沈澱除去した後、硫酸アンモニウム分画ならびにホ
スホセルロース・カラムクロマト法、ＤＥＡＥ−セルロ
ース・カラムクロマト法等のイオン交換クロマト法及び
ゲル沖過法、又はこれらの組合せによりエンドヌクレア
ーゼ型新核酸分解酵素Ａを分離、精製して採取すること
ができる（以下、本発明のエンドヌクレアーゼ型新核酸
分解酵素Ａを「本酵素」という。
）。かくして得られた本酵素は、以下に記載する如き理
化学的性質を有する新規な核酸分解酵素である。
化学的性質を有する新規な核酸分解酵素である。
本酵素の理化学的性質
（１） 作用及び基質特異性
酵素反応の基質ＤＮＡとして、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）で増殖したプ
ラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡを用い、各種の制限酵素
（Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）と本酵素を
混合して処理した。
ラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡを用い、各種の制限酵素
（Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）と本酵素を
混合して処理した。
酵素反応後、断片化した基質ＤＮＡの大きさと切断個所
の数を調べるため、生成物をアガ爾−ス（１％）・ゲル
電気泳動にかけたところ第１図の如き電気泳動図が得ら
れた。
の数を調べるため、生成物をアガ爾−ス（１％）・ゲル
電気泳動にかけたところ第１図の如き電気泳動図が得ら
れた。
すなわち、第１図は、本酵素で処理した基質ＤＮＡ（ｐ
ＢＲ３２２）のアガロース（１％）・ゲル電気泳動図で
あり、図中、番号１〜３及び７．８は、以下に示す制限
酵素及び本酵素を併用して処理した際に得られるｐ Ｂ
Ｒ３２２ＤＮＡの断片化を示し、番号４〜６は、以下
に示す制限酵素のみで処理した際に得られる各種ＤＮＡ
の断片化を示すもので、分子量マーカーとして示したも
のである。
ＢＲ３２２）のアガロース（１％）・ゲル電気泳動図で
あり、図中、番号１〜３及び７．８は、以下に示す制限
酵素及び本酵素を併用して処理した際に得られるｐ Ｂ
Ｒ３２２ＤＮＡの断片化を示し、番号４〜６は、以下
に示す制限酵素のみで処理した際に得られる各種ＤＮＡ
の断片化を示すもので、分子量マーカーとして示したも
のである。
（使用した制限酵素は、いずれも公知の酵素である。
）（番号）（基質ＤＮＡ） （制限酵素）１
ｐＢＲ３２２＋ Ｐｓｔｌ ＋ 本酵素第１図から
、本酵素により基質ＤＮＡ （ｐＢ Ｒ３２２）は、特
定の大きさで断片化されることが明らかにされたが、更
に第１図の結果からその切断位置を明らかにしたものが
第２図の切断地図であり、ｐＢＲ３２２分子量（ドルト
ン単位）＝（２，６Ｘ １０６ｄ、）上の切断位置を矢
印で示した。
ｐＢＲ３２２＋ Ｐｓｔｌ ＋ 本酵素第１図から
、本酵素により基質ＤＮＡ （ｐＢ Ｒ３２２）は、特
定の大きさで断片化されることが明らかにされたが、更
に第１図の結果からその切断位置を明らかにしたものが
第２図の切断地図であり、ｐＢＲ３２２分子量（ドルト
ン単位）＝（２，６Ｘ １０６ｄ、）上の切断位置を矢
印で示した。
第１図及び第２図から、本酵素は基質ＤＮＡ鎖の特定の
部位を切断すること、即ち基質ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）
の制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［切断部位の近傍に１個所切断
を入れることが明らかにされた。
部位を切断すること、即ち基質ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）
の制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［切断部位の近傍に１個所切断
を入れることが明らかにされた。
また、第３図及び第４図は、それぞれ本酵素の処理によ
って得られる各種基質ＤＮＡの切断パターンを示す図面
である。
って得られる各種基質ＤＮＡの切断パターンを示す図面
である。
即ち、第３図は、本酵素が次のとおり各種基質ＤＮＡを
切断することを示している 第４図は、本酵素が次のとおり、各種基質ＤＮＡを切断
することを示している。
切断することを示している 第４図は、本酵素が次のとおり、各種基質ＤＮＡを切断
することを示している。
第３図及び第４図の結果から、本酵素は基質ＤＮＡのφ
１０５Ｃファージ（ｐｈａｇｅ ） ＤＮＡ 。
１０５Ｃファージ（ｐｈａｇｅ ） ＤＮＡ 。
Ｍ２ファージＤＮＡをそれぞれ数個所で切断し、またλ
フアージＤＮＡ、φＮＲ２ファージＤＮＡ。
フアージＤＮＡ、φＮＲ２ファージＤＮＡ。
φ１ファージＤＮＡ、５ＰＰ１フアージＤＮＡ及びρ１
１ファージＤＮＡをそれぞれ多数の部位で切断すること
が明らかにされた。
１ファージＤＮＡをそれぞれ多数の部位で切断すること
が明らかにされた。
第１〜第４図の結果から、本酵素は、各種基質ＤＮＡの
分子内の特定の塩基配列を認識し、ＤＮＡ鎖の特定の部
位を１箇所ないし複数個所切断して特定のＤＮＡ断片を
生成する基質特異性を有するエンドヌクレアーゼ型ＤＮ
Ａ分解酵素であることが決定された。
分子内の特定の塩基配列を認識し、ＤＮＡ鎖の特定の部
位を１箇所ないし複数個所切断して特定のＤＮＡ断片を
生成する基質特異性を有するエンドヌクレアーゼ型ＤＮ
Ａ分解酵素であることが決定された。
（２）至適ｐＨ
ｐＨ４〜５は酢酸塩、ｐＨ５，２〜７．５は、トリス・
マレイド−苛性ソーダ、ｐＨ７、２〜９．０は、トリス
塩酸、ｐＨ９〜１１はグリシン苛性ソーダの各ｐＨで得
られた本酵素試料を、後述の（６）力価の測定方法と同
様の処理を行って活性を調べたところ、本酵素はｐＨ６
、５〜１０．０の間で活性を示し、特にｐＨ６，８〜８
，５の範囲において最も高い活性が認められた。
マレイド−苛性ソーダ、ｐＨ７、２〜９．０は、トリス
塩酸、ｐＨ９〜１１はグリシン苛性ソーダの各ｐＨで得
られた本酵素試料を、後述の（６）力価の測定方法と同
様の処理を行って活性を調べたところ、本酵素はｐＨ６
、５〜１０．０の間で活性を示し、特にｐＨ６，８〜８
，５の範囲において最も高い活性が認められた。
（３）安定ｐＨ
（２）と同様にｐＨを調整し、各ｐＨで得られた酵素試
料を３７℃で１０分間処理した後、至適ｐＨ範囲内のｐ
Ｈ７、５に反応液を調整した。
料を３７℃で１０分間処理した後、至適ｐＨ範囲内のｐ
Ｈ７、５に反応液を調整した。
次いで、後述の（６）力価の測定法と同様の処理を行っ
て活性を調べたところ、本酵素の安定ｐＨはｐＨ７，０
〜８．０の範囲にあることが分った。
て活性を調べたところ、本酵素の安定ｐＨはｐＨ７，０
〜８．０の範囲にあることが分った。
（４）作用適温の範囲
温度を２０〜５０℃に変化させた以外は、後述の（６）
力価の測定と同様の処理を行って活性を調べたところ、
本酵素の作用適温は、はぼ３０〜３７℃であることが分
った。
力価の測定と同様の処理を行って活性を調べたところ、
本酵素の作用適温は、はぼ３０〜３７℃であることが分
った。
（５）失活の条件（温度安定性）
本酵素試料溶液をｐＨ７、５に調整し、５５℃で１０分
間処理した後、後述の（６）力価の測定法と同様の処理
を行って活性を調べたところ、本酵素は、５５℃で完全
に失活することが分った。
間処理した後、後述の（６）力価の測定法と同様の処理
を行って活性を調べたところ、本酵素は、５５℃で完全
に失活することが分った。
（６）力価の測定法
本酵素試料を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）、５ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭＫＯｔ
、１０ｍＭＭｇＣ１２並びに各種のバクテリオファージ
ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡを含有する反応液に加え、
３７℃で６０分間反応させた。
）、５ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭＫＯｔ
、１０ｍＭＭｇＣ１２並びに各種のバクテリオファージ
ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡを含有する反応液に加え、
３７℃で６０分間反応させた。
反応生成物を０．７％又は１％アガロース・ゲル電気泳
動にかけ、泳動後のアガロース板を臭化エチジウム存在
下で紫外線照射し、発生する螢光を写真撮影することに
より、泳動帯をバンドとして検出し、そのバンドの数と
各バンドの泳動値及び量を測定した。
動にかけ、泳動後のアガロース板を臭化エチジウム存在
下で紫外線照射し、発生する螢光を写真撮影することに
より、泳動帯をバンドとして検出し、そのバンドの数と
各バンドの泳動値及び量を測定した。
（力 阻害、活性化及び安定化
本酵素は、金属イオンの効果として、酵素活性の発現に
Ｍｇ＋＋を必要とするが、他の２価金属イオン、特に扁
十干によって代替させることができる。
Ｍｇ＋＋を必要とするが、他の２価金属イオン、特に扁
十干によって代替させることができる。
また、塩濃度の効果として、０．２Ｍ以上のＮａ０を又
はＫＯｔの存在によって活性が阻害される。
はＫＯｔの存在によって活性が阻害される。
（８）精製方法
サツカロミセス属またはピヒア属に属する本酵素生産菌
を培養し、その菌体より得られる無細胞抽出液からポリ
ミンＰ処理などによって核酸画分を沈澱除去し、硫酸ア
ンモニウム分画、ならびにホスホセルロース・カラムク
ロマト法、ＤＥＡＥセルロース・カラムクロマト法など
のイオン交換クロマト法及びゲルｐ過法、又はこれらの
組合せにより本酵素を分離精製する。
を培養し、その菌体より得られる無細胞抽出液からポリ
ミンＰ処理などによって核酸画分を沈澱除去し、硫酸ア
ンモニウム分画、ならびにホスホセルロース・カラムク
ロマト法、ＤＥＡＥセルロース・カラムクロマト法など
のイオン交換クロマト法及びゲルｐ過法、又はこれらの
組合せにより本酵素を分離精製する。
（９）分子量
本酵素は、ウルトロゲルＡ ＯＡ ４４ （Ｕｌｔｒｅ
ｇｅｌＡＯＡ４４）を用いるゲル瀘過法によって、その
分子量は、約ｓｏ、ｏｏｏであることが認められた。
ｇｅｌＡＯＡ４４）を用いるゲル瀘過法によって、その
分子量は、約ｓｏ、ｏｏｏであることが認められた。
（１０）元素分析
本酵素の特性を示すには至らないので、元素分析値の測
定は行っていない。
定は行っていない。
以上に詳述したように、本酵素は、大腸菌、バクテリオ
ファージなど生物種のＤＮＡ分子内の特定の塩基配列を
認識し、ＤＮＡ鎖の特定の部位を切断して特定のＤＮＡ
切断を生成するところの既知文献未載の高度の基質特異
性を有するエンドヌクレアーゼ型新核酸分解酵素Ａであ
り、本発明方法により、本酵素を有利に製造することが
できる。
ファージなど生物種のＤＮＡ分子内の特定の塩基配列を
認識し、ＤＮＡ鎖の特定の部位を切断して特定のＤＮＡ
切断を生成するところの既知文献未載の高度の基質特異
性を有するエンドヌクレアーゼ型新核酸分解酵素Ａであ
り、本発明方法により、本酵素を有利に製造することが
できる。
以下に、本発明方法を実施例によって具体的に説明する
。
。
実施例 １
無細胞抽出液の調製
前記サツカロミセス・セレビシュー・ハンセン７４６．
１（微工研・微生物受託番号第５８９８号）を２％グル
コース、２％ポリペプトン、１％酵母エキスを含む液体
培地５００罰に接種して３０℃で１夜通気培養により前
培養した後、同一培地１０ｔに接種し、３０℃、８時間
通気攪拌培養する。
１（微工研・微生物受託番号第５８９８号）を２％グル
コース、２％ポリペプトン、１％酵母エキスを含む液体
培地５００罰に接種して３０℃で１夜通気培養により前
培養した後、同一培地１０ｔに接種し、３０℃、８時間
通気攪拌培養する。
この培養液を高速遠心器で１０，０ＯＯｒｆ１１１，２
０分間遠心分離し、蒸留水で２回洗滌すると、菌体約２
００．９（１８〜２０ ｇ／を培地）が得られる（この
菌体は、−８０℃で凍結保存が可能である。
０分間遠心分離し、蒸留水で２回洗滌すると、菌体約２
００．９（１８〜２０ ｇ／を培地）が得られる（この
菌体は、−８０℃で凍結保存が可能である。
）。次いで、この菌体２００ｇを、０．３Ｍの硫酸アン
モニウムを含む緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５） 、１ｍＭのＢＤＴＡ、１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）５０１
１Ｌｌに懸濁し、フレンチプレス（１，８００ｋｇ／ｃ
ｙｓｔ圧）で細胞を破砕した後、０．３Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含む前記緩衝液Ａ２００ｍに懸濁して０℃で３０
分間攪拌し、１３，０００ｒｐＩＩ、 ６０分間、２℃
で高速遠心すると、上澄の画分■が３５０ｄ得られる。
モニウムを含む緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５） 、１ｍＭのＢＤＴＡ、１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）５０１
１Ｌｌに懸濁し、フレンチプレス（１，８００ｋｇ／ｃ
ｙｓｔ圧）で細胞を破砕した後、０．３Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含む前記緩衝液Ａ２００ｍに懸濁して０℃で３０
分間攪拌し、１３，０００ｒｐＩＩ、 ６０分間、２℃
で高速遠心すると、上澄の画分■が３５０ｄ得られる。
この画分Ｉには本酵素の活性が認められる。
実施例 ２
精製
実施例１で得られた画分Ｉに、ポリミンＰ液（１０％、
ｐＨ８，０）を攪拌しながら最終濃度０．４％となるよ
うに添加し、０℃で４０分間攪拌する。
ｐＨ８，０）を攪拌しながら最終濃度０．４％となるよ
うに添加し、０℃で４０分間攪拌する。
１３．０００ｒｌ）ｍ、 ３０分間、２℃で高速遠心し
て沈澱を捨て、上澄を集める。
て沈澱を捨て、上澄を集める。
この上澄に粉砕した硫酸アンモニウムを７０％飽和とな
るように添加し、０°Ｃ２５０分間攪拌する。
るように添加し、０°Ｃ２５０分間攪拌する。
更に、ｉ ６．００ ｏｒｐｍ。３０分間、２℃で高速
遠心して沈澱を１０ Ｑ７７１７１！の緩衝液Ｂ（２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８） ｔ １ｍＭのＥＤＴ
Ａ 、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％グ
リセロール〕に溶解し、０．１５ＭＫＯ，！を含む緩衝
液ＢＡｔ中で４時間透析すると、画分■が１５４ＴＬｌ
得られる。
遠心して沈澱を１０ Ｑ７７１７１！の緩衝液Ｂ（２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８） ｔ １ｍＭのＥＤＴ
Ａ 、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％グ
リセロール〕に溶解し、０．１５ＭＫＯ，！を含む緩衝
液ＢＡｔ中で４時間透析すると、画分■が１５４ＴＬｌ
得られる。
得られた画分■を、０．１５ＭＫＯ７を含む緩衝液Ｂで
平衡化したホスホセルロースのカラム（φ３．２Ｘ２３
ｃｒＩＬ）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗うと、活性画分は
カラムを通過して画分■が２３０ｍ１得られる。
平衡化したホスホセルロースのカラム（φ３．２Ｘ２３
ｃｒＩＬ）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗うと、活性画分は
カラムを通過して画分■が２３０ｍ１得られる。
得られた画分■を緩衝液Ｂで２倍に希釈し、ホスホセル
ロースのカラム（φ’３．２ Ｘ ２５ｃｒＩＬ）に吸
着させて４００１ｒＬｌの緩衝液Ｂで洗い、Ｏ〜０．８
ＭのＫＯＡの濃度勾配で溶出させると、活性画分は０
．３Ｍ前後のＫＯＡで溶出され、画分■が１６６属得ら
れる。
ロースのカラム（φ’３．２ Ｘ ２５ｃｒＩＬ）に吸
着させて４００１ｒＬｌの緩衝液Ｂで洗い、Ｏ〜０．８
ＭのＫＯＡの濃度勾配で溶出させると、活性画分は０
．３Ｍ前後のＫＯＡで溶出され、画分■が１６６属得ら
れる。
得られた画分■に硫安を７０％飽和となるように添加し
、０°Ｃ２３０分間攪拌する。
、０°Ｃ２３０分間攪拌する。
２７．００Ｏｒｐｍ、２０分間、２℃で高速遠心して得
られる沈澱を６１Ｌｌの前記緩衝液Ａに溶解し、ＩＭＫ
ＯＡを含む緩衝液Ａで平衡化したカラム（Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ ＨＷ６５Ｆ；φ１．９Ｘ４５ＣｒｒＬ）に吸着
させて緩衝液Ａで溶出する。
られる沈澱を６１Ｌｌの前記緩衝液Ａに溶解し、ＩＭＫ
ＯＡを含む緩衝液Ａで平衡化したカラム（Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ ＨＷ６５Ｆ；φ１．９Ｘ４５ＣｒｒＬ）に吸着
させて緩衝液Ａで溶出する。
活性画分を集め、５０％のグリセロールを含む緩衝液Ａ
２７で４時間透析すると、本酵素の画分■が６ゴ得られ
る。
２７で４時間透析すると、本酵素の画分■が６ゴ得られ
る。
得られた本酵素は、−２０℃で保存可能である。
実施例 ３
前記サツカロミセス・ウバルム・ベイジエリンク（微工
研・微生物受託番号第５９０２号）を、実施例１及び２
と同様に無細胞抽出液の調製及び精製を行うことにより
、本酵素の画分■が５ｒＩＬｌ得られる。
研・微生物受託番号第５９０２号）を、実施例１及び２
と同様に無細胞抽出液の調製及び精製を行うことにより
、本酵素の画分■が５ｒＩＬｌ得られる。
得られた本酵素は、−２０℃で保存可能である。
実施例 ４
前記サツカロミセス・セレビシェ−・ハンセンＡ２（微
工研・微生物受託番号５８９９号）を実施例１及び２と
同様に無細胞抽出液の調製及び精製を行うことにより本
酵素の画分■が３ＴＬｌ得られる。
工研・微生物受託番号５８９９号）を実施例１及び２と
同様に無細胞抽出液の調製及び精製を行うことにより本
酵素の画分■が３ＴＬｌ得られる。
得られた本酵素は、−２０℃で保存可能である。
実施例 ５
無細胞抽出液の調製
前記ピヒア・メンプラナファシェンス・ハンセン（微工
研・微生物受託番号第５９００号）を２％グルコース、
２％ポリペプトン、１％酵母エキスを含む液体培地５０
０ＴＬｌに接種して３０℃で１夜通気培養により前培養
した後、同一培地１０ｔに接種し、３０℃、１６時間通
気攪拌培養する。
研・微生物受託番号第５９００号）を２％グルコース、
２％ポリペプトン、１％酵母エキスを含む液体培地５０
０ＴＬｌに接種して３０℃で１夜通気培養により前培養
した後、同一培地１０ｔに接種し、３０℃、１６時間通
気攪拌培養する。
この培養液を高速遠心器で１０，０００ｒｌ）１１．２
０分間遠心分離し、蒸留水で２回洗滌すると、菌体約２
４０ｇ（２０〜２３９／を培地）が得られる（この菌体
は、−８０℃で凍結保存が可能である。
０分間遠心分離し、蒸留水で２回洗滌すると、菌体約２
４０ｇ（２０〜２３９／を培地）が得られる（この菌体
は、−８０℃で凍結保存が可能である。
）。次いで、この菌体２４０ｇを、０．３Ｍの硫酸アン
モニウムを含む緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの２−
メルカプトエタノール、１０％グリセロール）５０ＴＬ
ｌに懸濁し、フレンチプレス（１，８００ｋｇ／ｃｒｉ
ｔ圧）で細胞を破砕した後、０．３Ｍ硫酸アンモニウム
を含む前記緩衝液Ａ２００１ｒＬｌに懸濁して０℃で３
０分間攪拌し、１３．０００ｒｌ）ｆｆｉ、 ６０分間
、２℃で高速遠心すると、上澄の画分Ｉが３００属得ら
れる。
モニウムを含む緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの２−
メルカプトエタノール、１０％グリセロール）５０ＴＬ
ｌに懸濁し、フレンチプレス（１，８００ｋｇ／ｃｒｉ
ｔ圧）で細胞を破砕した後、０．３Ｍ硫酸アンモニウム
を含む前記緩衝液Ａ２００１ｒＬｌに懸濁して０℃で３
０分間攪拌し、１３．０００ｒｌ）ｆｆｉ、 ６０分間
、２℃で高速遠心すると、上澄の画分Ｉが３００属得ら
れる。
この画分１には本酵素の活性が認められる。
実施例 ６
精製
実施例５で得られた画分Ｉに、ポリミンＰ液（１０％、
ｐＨ８，０）を攪拌しながら最終濃度０．４％となるよ
うに添加し、０℃で４０分間攪拌する。
ｐＨ８，０）を攪拌しながら最終濃度０．４％となるよ
うに添加し、０℃で４０分間攪拌する。
１３．００．０ｒｌ）ＩＩＩ、 ３０分間、２℃で高速
遠心して沈澱を捨て＼上澄を集める。
遠心して沈澱を捨て＼上澄を集める。
この上澄に粉砕した硫酸アンモニウムを７０％飽和とな
るように添加し、０°Ｃ２５０分間攪拌する。
るように添加し、０°Ｃ２５０分間攪拌する。
更に、１６．０００１ｐ１１ 。３０分間、２℃で高速
遠心して沈澱を１００ｒｒＬｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，８） 、１ｍＭのＥ Ｄ Ｔ Ａ
、１０ ｒｎ Ｍの２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール〕に溶解し、０．１５ＭのＫＯＡを含む
緩衝液Ｂ４を中で４時間透析すると、画分■が１４０属
得られる。
遠心して沈澱を１００ｒｒＬｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，８） 、１ｍＭのＥ Ｄ Ｔ Ａ
、１０ ｒｎ Ｍの２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール〕に溶解し、０．１５ＭのＫＯＡを含む
緩衝液Ｂ４を中で４時間透析すると、画分■が１４０属
得られる。
得られた画分■を、前記緩衝液Ｂで２倍に希釈する。
これをホスホセルロース・カラム（φ３．２×４０ｃｒ
ｒＬ）に吸着させ、５００７７１１の緩衝液Ｂで洗い、
０〜０．８ＭのＫＯＡの直線濃度勾配で溶出させると、
活性画分は０．３〜０．４ Ｍ ＫＯｔで溶出され、画
分■が２００ｙＶｌ！得られる。
ｒＬ）に吸着させ、５００７７１１の緩衝液Ｂで洗い、
０〜０．８ＭのＫＯＡの直線濃度勾配で溶出させると、
活性画分は０．３〜０．４ Ｍ ＫＯｔで溶出され、画
分■が２００ｙＶｌ！得られる。
得られた画分■に硫酸アンモニウムを７０％飽和となる
ように添加し、０℃、３０分間攪拌する。
ように添加し、０℃、３０分間攪拌する。
２７．０００ｒｌ）Ｉｎ、 ２０分間、２℃で高速遠心
して得られる沈澱を６罰の前記緩衝液Ａに溶解し、ＩＭ
ＫＣＪｆ−を含む緩衝液Ａで平衡化したカラム（Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ＨＷ ６５ Ｆ ＋φ２．６ Ｘ ４３
ｃｍ）に吸着させて、緩衝液Ａで溶出する。
して得られる沈澱を６罰の前記緩衝液Ａに溶解し、ＩＭ
ＫＣＪｆ−を含む緩衝液Ａで平衡化したカラム（Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ＨＷ ６５ Ｆ ＋φ２．６ Ｘ ４３
ｃｍ）に吸着させて、緩衝液Ａで溶出する。
活性画分を集め、５０％のグリセロールを含む緩衝液Ａ
２７で４時間透析すると、本酵素の画分■が６ＴＬｌ得
られる。
２７で４時間透析すると、本酵素の画分■が６ＴＬｌ得
られる。
得られた本酵素は、−２０℃で保存可能である。
第１図は、本発明の酵素で処理された基質ＤＮＡ（ｐＢ
Ｒ３２２）のアガロース・ゲル電気泳動図であり、第２
図は、本発明の酵素で処理された基質ＤＮＡ（ｐＢＲ３
２２）の切断部位を示す切断地図であり、第３図及び第
４図は、それぞれ本発明の酵素で処理された各種基質Ｄ
ＮＡの切断パターンを示す図面である。
Ｒ３２２）のアガロース・ゲル電気泳動図であり、第２
図は、本発明の酵素で処理された基質ＤＮＡ（ｐＢＲ３
２２）の切断部位を示す切断地図であり、第３図及び第
４図は、それぞれ本発明の酵素で処理された各種基質Ｄ
ＮＡの切断パターンを示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するエンドヌクレアーゼ（
Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ）型新核酸分解酵素Ａ１、
作用及び基質特異性 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ ｃｏｉｌ ）プラス
ミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ［Ｉ切
断部位の近傍を１個所切断する。 バチルス属細菌のファージφ１０５Ｃ，Ｍ２゜φＮＲ２
，φ１，５ＰＰ１．ρ１１のＤＮＡ。 及び大腸菌のファージλＤＮＡに作用し、切断して断片
化する。 ２、至適ｐＨ ｐＨ６、５〜１０．０の範囲に至適ｐＨを有する。 ３、安定ｐＨ ｐＨ７、０〜８．０の範囲に安定ｐＨを有する。 ４、作用適温の範囲 はぼ３０〜３７°Ｃの範囲に作用適温を有する。 ５、失活の条件（温度安定性） ５５°Ｃ２１０分で完全に失活する。 ６、阻害、活性化及び安定化 金属イオンＭｇ ＋＋、 Ｍｎ＋＋によって活性化され
、０，２Ｍ以上のＮａ０１又はＫＯ７によって阻害され
る。 ７、分子量 ゲル沖過法による分子量は、約ｇｏ、ｏｏｏである。 ２ サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）
属に属するエンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａ
ｓｅ ）型新核酸分解酵素Ａ生産菌を培養し、該菌体よ
り得られる無細胞抽出液からエンドヌクレアーゼ型新核
酸分解酵素Ａを分離、採取することを特徴とするエンド
ヌクレアーゼ型新核酸分解酵素Ａの製造法。 ３ ピヒア（Ｐｌｃｈｌａ ）属に属するエンドヌクレ
アーゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ）型新核酸分解酵
素Ａ生産菌を培養し、該菌体より得られる無細胞抽出液
からエンドヌクレアーゼ型新核酸分解酵素Ａを分解・採
取することを特徴とするエンドヌクレアーゼ型新核酸分
解酵素Ａの製造法。 ４ 無細胞抽出液から核酸画分を除去し、硫酸アンモニ
ウム分画、イオン交換クロマト法、ゲル濾過法又はそれ
らの組合せによってエンドヌクレアーゼ型新核酸分解酵
素Ａを分離、採取することを特徴とする特許請求の範囲
第２項又は第３項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56033321A JPS594115B2 (ja) | 1981-03-09 | 1981-03-09 | 新核酸分解酵素及びその製造法 |
| US06/353,226 US4430432A (en) | 1981-03-09 | 1982-03-01 | Endo-deoxyribonuclease and process for the production thereof |
| DE8282101758T DE3276582D1 (en) | 1981-03-09 | 1982-03-05 | Novel endo-deoxyribonuclease and process for the production thereof |
| EP82101758A EP0060465B1 (en) | 1981-03-09 | 1982-03-05 | Novel endo-deoxyribonuclease and process for the production thereof |
| DK102882A DK157036C (da) | 1981-03-09 | 1982-03-09 | Endo-deoxyribonuklease a samt fremgangsmaade til fremstilling af samme |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56033321A JPS594115B2 (ja) | 1981-03-09 | 1981-03-09 | 新核酸分解酵素及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57146575A JPS57146575A (en) | 1982-09-10 |
| JPS594115B2 true JPS594115B2 (ja) | 1984-01-27 |
Family
ID=12383290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56033321A Expired JPS594115B2 (ja) | 1981-03-09 | 1981-03-09 | 新核酸分解酵素及びその製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4430432A (ja) |
| EP (1) | EP0060465B1 (ja) |
| JP (1) | JPS594115B2 (ja) |
| DE (1) | DE3276582D1 (ja) |
| DK (1) | DK157036C (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775619A (en) * | 1984-10-16 | 1988-10-04 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
| US5430136A (en) * | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
| SE452708B (sv) * | 1985-05-23 | 1987-12-14 | Jede Automater Ag | Anordning for beredning och utskenkning av drycker |
| EP0555797A1 (en) * | 1992-02-10 | 1993-08-18 | Becton, Dickinson and Company | General buffer for restriction endonucleases |
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